Aventures de Télémaque : édition collationnée sur les trois manuscrits connus a Paris.

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Guide pratique de l'amateur de fruits; description et culture de plus de 5000 variétés de fruits classées par séries de mérite, composant les collections pomologiques de l'établissement horticole des Frères Simon-Louis. Suivi d'une table générale alphabétique de tous les synonymes connus français et étrangers, appartenant a chaque variété,

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Nouveaux éclaircissements sur l'assemblée de 1682 d'après les Mémoires inédits du Marquis de Sourches ... et autres documents peu connus /

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Le triomphe de l'innocence; ou particularités peu connuës; aussi honorables aux reformés de France, qu'elles le sont peu à leurs adversaires.

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Coordination of phosphido-boratabenzene ligands to transition metals

Environ 90% des composés produits industriellement sont fabriqués à l’aide de catalyseurs. C’est pourquoi la conception de catalyseurs toujours plus performants pour améliorer les procédés industriels actuels est toujours d’intérêt. De la grande variété de complexes avec des métaux de transition rapportés jusqu’à présent, les complexes zwitterioniques attirent notre attention par leurs activités catalytiques souvent supérieures aux complexes cationiques normaux. Un complexe métallique zwitterionique est un fragment métal-ligand neutre où la charge positive est située sur le centre métallique et où la charge négative est délocalisée sur un des ligands liés au métal. Nous proposons la synthèse de ligands anioniques phosphine comportant des groupements borates et boratabenzènes. Cette dernière espèce est un cycle à 6 membres où l’un des atomes de carbone est remplacé par un atome de bore et qui est négativement chargé. La capacité de ces phosphines anioniques à se lier à un centre métallique à l’aide de la paire libre du phosphore est due à la nature du lien P-B qui défavorise l’interaction entre la paire libre du phosphore et l’orbitale p vide du bore. Les propriétés de di-tert-butylphosphido-boratabenzène (DTBB) comme ligand phosphine anionique hautement donneur et encombré ainsi que la découverte de ses modes de coordination inhabituels pour stabiliser les métaux de transition insaturés ont été étudiés au cours de ce travail. De nouvelles perspectives sur les modes de coordination de phosphido-boratabenzène et la force de l’interaction du lien P-B seront discutées ainsi que les applications catalytiques. Nous avons d’abord étudié la coordination η1 avec des complexes de fer, ce qui nous a fourni des données quantitatives précieuses sur la capacité du DTBB d’agir comme ligand très donneur par rapport aux autres ligands donneurs bien connus. La capacité du DTBB à changer de mode de coordination pour soutenir les besoins électroniques du métal a été démontrée par la découverte d’une nouvelle espèce ferrocenyl phosphido-boratabenzène et sa nucléophilie a été étudiée. Au meilleur de notre connaissance, aucun exemple d’un ligand boratabenzène coordonné aux métaux du groupe 11 n’existe dans la littérature. Voilà pourquoi nous avons décidé d’explorer les modes de coordination du ligand DTBB avec Cu(I), Ag(I) et Au(I). A notre grande surprise, le ligand DTBB est capable de stabiliser les métaux du groupe 11 aux états d’oxydation faibles par une liaison MP qui est une coordination du type η1, un mode de coordination guère observé pour les ligands boratabenzène. Pendant nos travaux, notre attention s’est tournée vers la synthèse d’un complexe de rhodium(I) afin de tester son utilité en catalyse. A notre grande satisfaction, le complexe Rh-DTBB agit comme un précatalyseur pour l’hydrogénation des alcènes et alcynes à la température ambiante et à pression atmosphérique et son activité est comparable à celle du catalyseur de Wilkinson. Dans un désir d’élargir les applications de notre recherche, notre attention se tourna vers l’utilisation des composés du bore autres que le boratabenzène. Nous avons décidé de synthétiser une nouvelle espèce phosphido-borate encombrée. Lorsqu’elle réagit avec des métaux, l’espèce phosphido-borate subit un clivage de la liaison P-B. Toutefois, cette observation met en évidence la singularité et les avantages de la stabilité de la liaison P-B lors de l’utilisation du fragment boratabenzène. Ces observations enrichissent notre compréhension des conditions dans lesquelles la liaison P-B du ligand DTBB peut être clivée. Ces travaux ont mené à la découverte d’un nouveau ligand ansa-boratabenzène avec une chimie de coordination prometteuse.

Prevalência do consumo de drogas ilícitas nas Forças Armadas estudo epidemiológico num dos ramos

RESUMO: Desde 1976 que as Forças Armadas desenvolvem acções de prevenção do consumo de drogas e álcool. Na década de 80 foi criada capacidade laboratorial e deu-se início a um programa de rastreios toxicológicos. No quinquénio 2001 a 2005, as proporções de resultados positivos, associando todos os tipos de rastreio, variaram entre 3,7% e 1,5%. De Outubro de 2006 a Julho de 2007 realizou-se um estudo analítico transversal, para estimar a prevalência do consumo de drogas (canabinóides, opiáceos, cocaína e anfetaminas) num dos Ramos das Forças Armadas, com base nos despistes realizados pelo seu laboratório. Foi utilizada uma amostra aleatória simples de 1039 militares, profissionais (QP) e contratados (RC), no activo e de ambos os sexos. Desde a nomeação dos militares a rastrear, passando pela cadeia de custódia das amostras até à obtenção do resultado foi utilizado apoio informático específico. O processo de pesquisa utilizou duas técnicas de triagem por imunoensaio e tecnologia de confirmação por GC/MS, de acordo com as recomendações europeias, permitindo estabelecer uma metodologia standard para organizações e empresas. A prevalência estimada, de consumidores de droga, foi de 3,8/1.000, para um erro de 0,37%. O número de casos registado (4) não permitiu a utilização de testes estatísticos que conduzissem à identificação de características determinantes da positividade, mas não deixou de revelar aspectos inesperados. A observação de séries de casos e a realização regular de estudos epidemiológicos, que ajudem a redefinir grupos alvo e a perceber a dimensão, as determinantes e as consequências do consumo de drogas é sugerida, em conclusão.--------------------------------------- RÉSUMÉ: Depuis 1976, les Forces Armées mettent au point des mesures visant à prévenir la consommation de drogues et d'alcool. En 1980, fut créé capacité laboratoriel et ont ensuite commencé un programme de dépistage toxicologique. Au cours des cinq années allant de 2001 à 2005, les proportions de consommateurs, impliquant tous les types de dépistage, allaient de 3,7% à 1,5 %. D'octobre 2006 à juillet 2007, une étude analytique transversale a été organisée pour évaluer la prévalence de l’usage de drogues (cannabis, opiacés, cocaïne et amphétamines) dans une branche de les Forces Armées, basée sur les dépistages faites par un laboratoire militaire, à l'aide d'un échantillon aléatoire de 1039 militaires, professionnels (QP) et sous contract (RC), à l’actif et des deux sexes. Tout au long du procès, de la nomination des donneurs, en passant par la chaine de garde des échantillons, jusqu’à obtention du résultat, il fut employé un appui informatique sécurisé. Le processus de recherche employa deux techniques de tri par imunoessay et la technologie de confirmation GC/MS, selon les recommandations européennes, permettant d'établir une méthodologie standard pour les organisations et les entreprises. La prévalence estimée fut de 3,8/1.000 pour une marge d’erreur de 0,37%. Le nombre de cas enregistrés (4) n'autorise pas l'utilisation de testes statistiques de menant à l'identification de caractéristiques déterminant de la positivité, mais il permet à révéler des aspects inattendus. L'observation de séries de cas et la tenue régulière d’études épidémiologiques, qui contribuent à redéfinir les groupes cibles et de comprendre l'ampleur, les déterminants et les conséquences de l'usage de drogues, est suggéré, en fin de compte.--------------------------------------- ABSTRACT: Since 1976, the Armed Forces, have been developing measures to prevent the use of drugs and alcohol. In 1980, was created laboratory facility which then started a program of toxicological screenings. In the five years running from 2001 to 2005, the proportions of consumers, involving all types of screening, ranged from 3,7% to 1,5%. From October 2006 to July 2007, a cross-sectional study was held to estimate the prevalence of drug use (cannabinoids, opiates, cocaine and amphetamines) in one branch of the Portuguese Armed Forces, based on laboratory screenings, using a random sample of 1039 military, professional (QP) and enlisted (RC), active-duty and of both sexes. Specific computer support was used all the way, from the appointment, including the chain of custody of samples, to the obtaining of the result. The process of search used two techniques for sorting by immunoassay and confirmation technology GC/MS, according to European recommendations, allowing to establish a standard methodology for organizations and companies. The estimated prevalence of drug users was 3.8/1.000 for a 0.37% error (95% confidence interval). The number of cases registered (4) does not permit use of statistical testing leading to the identification of characteristics weighing in the establishing to extrapolate for the population, but it allows revealing unexpected aspects. The observation of series of cases and the regular holding of epidemiological studies, which help redefine target groups and to understand the extent, the determinants and consequences of drug use, is suggested, in conclusion.

Exposição a fungos dos trabalhadores dos ginásios com piscina

RESUMO - Os trabalhadores dos ginásios com piscinas apresentam maior prevalência de lesões fúngicas, como a Tinea pedis e a onicomicose, devido às características intrínsecas da sua actividade profissional, pois apresentam mais horas por dia de exposição à contaminação fúngica das superfícies. Esta situação verifica-se não só por serem os que mais frequentam os locais possíveis de estarem contaminados, como é o caso de balneários, vestiários e zona envolvente às piscinas, mas também porque algumas das actividades desenvolvidas são realizadas com os pés descalços. Além disso, a utilização de roupa sintética e de calçado ocluso, que retêm a sudação excessiva, favorece o desenvolvimento fúngico. Constituiu objectivo deste trabalho conhecer o risco de infecção e/ou lesão (Tinea pedis e onicomicose) nos trabalhadores dos ginásios com piscina e a sua eventual relação com a exposição à contaminação fúngica (ar e superfícies) dos locais de trabalho. Foram descritas as variáveis ambientais e biológicas que influenciam a infecção e/ou lesão fúngica em ambiente profissional e exploradas eventuais associações entre essas mesmas variáveis. Foram também conhecidas as diferenças da contaminação fúngica das superfícies entre as duas principais estações do ano (Verão e Inverno) e entre antes e depois da lavagem e desinfecção. O estudo realizado possui uma componente transversal, em que se pretendeu descrever os fenómenos ambientais e biológicos da contaminação fúngica em ambiente profissional e explorar eventuais associações entre variáveis; uma componente longitudinal, em que foram conhecidas as diferenças sazonais da contaminação fúngica das superfícies; e, ainda, uma componente quase experimental, em que foi analisada a distribuição fúngica nas superfícies antes e depois da lavagem e desinfecção. Na vertente transversal foi considerada uma amostra de 10 ginásios com piscina e outra amostra de, pelo menos, 10 profissionais de cada estabelecimento, perfazendo um total de 124 trabalhadores (75 Homens - 60,48% e 49 Mulheres - 39,52%). Foram realizadas 258 colheitas biológicas aos pés dos trabalhadores, efectuada a avaliação ambiental da contaminação fúngica dos estabelecimentos através de 50 colheitas de amostras de ar e 120 colheitas de amostras de superfícies (60 antes e 60 depois da lavagem e desinfecção) e efectuados os respectivos processamento laboratorial e identificação fúngica. Foram também avaliadas as variáveis ambientais temperatura, humidade relativa e velocidade do ar, preenchidas 10 grelhas de observação, com o objectivo de efectuar o registo de informação sobre as variáveis que xx influenciam a exposição ocupacional às espécies fúngicas e, ainda, completadas 124 grelhas de observação inerentes à colheita de material biológico, de modo a realizar o registo dos profissionais com lesão e outras informações pertinentes para a análise laboratorial. Todos os 124 trabalhadores responderam a um questionário, em simultâneo à realização das colheitas biológicas, de modo a conhecer algumas das variáveis individuais e profissionais com pertinência para o presente estudo. Num dos estabelecimentos, foram também estudadas as diferenças da contaminação fúngica das superfícies entre antes e depois da lavagem e desinfecção e, ainda, entre as duas estações do ano (Verão e Inverno). Nesse estabelecimento, foram realizadas 36 colheitas de superfícies antes e 36 colheitas depois da lavagem e desinfecção, em 6 dias diferentes da semana, durante 6 semanas sequenciais em cada estação do ano, completando um total de 72 colheitas de superfícies. Foi ainda criado e aplicado um método para estabelecer um padrão de exposição profissional a fungos nas superfícies, de modo a permitir definir níveis semi-quantitativos de estimação do risco de infecção fúngica dos trabalhadores dos ginásios com piscinas. Para o critério da Gravidade, considerou-se que a gravidade da contaminação e, consequentemente, da possível lesão, está intimamente relacionada com a espécie fúngica envolvida. Foram calculadas as médias da contaminação fúngica por cada estabelecimento antes da lavagem e desinfecção, de modo a estabelecer os níveis de Frequência e, em relação à Exposição, foram estabelecidos intervalos para agrupar as horas semanais de trabalho. Dos 124 trabalhadores que participaram no estudo, 58 (46,8%) possuíam lesões visíveis. Nesses 58, as Leveduras foram as mais isoladas (41,4%), seguidas dos Dermatófitos (24,1%) e de Fungos Filamentosos Não Dermatófitos (6,9%). Candida parapsilosis e Rhodotorula sp. foram as Leveduras mais frequentemente isoladas (20,2%); no caso dos Dermatófitos, Trichophyton rubrum foi a espécie mais frequente (55,5%) e, relativamente aos Fungos Filamentosos Não Dermatófitos, Penicillium sp. foi o mais isolado (15,6%), seguido do género Fusarium (12,5%). No que concerne à contaminação fúngica das superfícies, 37 fungos filamentosos foram isolados. Fusarium foi o género mais frequente, antes e depois da lavagem e desinfecção (19,1% - 17,2%). Em relação aos fungos leveduriformes, 12 leveduras diferentes foram identificadas, tendo sido os géneros Cryptococcus (40,6%) e Candida (49,3%) os mais frequentes antes e depois da lavagem e desinfecção, respectivamente. Em relação à contaminação fúngica do ar, foram identificados 25 fungos filamentosos diferentes, em que os 3 géneros mais frequentemente isolados foram Cladosporium (36,6%), Penicillium (19,0%) e Aspergillus (10,2%). Relativamente às leveduras, foi identificado o género xxi Rhodotorula (87,5%) e as espécies Trichosporon mucoides e Cryptococcus unigutulattus (12,5%). Verificou-se associação, ao nível de significância de 5%, entre lesão visível e horas semanais e entre lesão visível e tempo de profissão, comprovando a influência da duração da exposição ao factor de risco (contaminação fúngica do ambiente profissional), para a presença de lesão visível nos trabalhadores expostos (Tinea pedis e onicomicose), ficando demonstrada a relação entre a exposição ao factor de risco em estudo – exposição profissional a fungos – com os efeitos para a saúde. As variáveis ambientais avaliadas (temperatura, humidade relativa e velocidade do ar) não influenciaram a contaminação fúngica do ar e das superfícies, não tendo sido evidenciada nenhuma relação estatisticamente significativa (p>0,05). Contudo, verificou-se influência do número de ocupantes que frequentaram cada um dos estabelecimentos nas médias das unidades formadoras de colónias por metro quadrado nas superfícies antes da lavagem e desinfecção. Não se verificou correlação entre os resultados quantitativos da contaminação fúngica do ar e a das superfícies dos 10 estabelecimentos monitorizados. No entanto, verificaram-se diferenças significativas, ao nível de significância de 10%, entre a contaminação fúngica das superfícies e a contaminação fúngica do ar (p<0,1), tendo-se constatado que apesar de 50% dos valores mais baixos terem sido superiores na contaminação fúngica do ar, a contaminação fúngica das superfícies apresentou-se com maior variabilidade quantitativa. Em relação às diferenças significativas na contaminação fúngica das superfícies nos 10 estabelecimentos entre antes e depois da lavagem e desinfecção, apenas se verificou redução significativa (p<0,05) da contaminação fúngica depois da lavagem e desinfecção nos balneários e vestiários masculinos em relação aos fungos leveduriformes. No estabelecimento seleccionado, verificou-se que a relação entre a contaminação fúngica e a temperatura e humidade relativa não foi significativa (p>0,05) em ambas as estações do ano e também não se constatou influência dos ocupantes nos valores médios das unidades formadoras de colónias por metro quadrado das superfícies antes da lavagem e desinfecção em ambas as estações de ano. Em quase todas as situações em que se verificaram diferenças significativas entre as duas estações do ano, verificou-se um aumento das unidades formadoras de colónias por metro quadrado no Inverno, com excepção do total das unidades formadoras de colónias por metro quadrado antes da lavagem e desinfecção nos balneários e vestiários masculinos em que se verificou aumento no Verão. Constatou-se também que apenas ocorreu redução da xxii contaminação fúngica depois da lavagem e desinfecção nas escadas de acesso no Inverno e nos balneários e vestiários masculinos no Verão. Com a aplicação do método para estabelecer um padrão de exposição profissional a fungos nas superfícies obteve-se, nos 10 estabelecimentos, com Nível de Risco Mínimo 65 locais (54,2%), com Nível de Risco Médio 23 locais (19,2%) e com Nível de Risco Elevado 32 locais (26,6%). Próximo do jacuzzi e junto ao tanque foram os locais com mais classificações de Nível de Risco Elevado. No estabelecimento seleccionado verificou-se que, no Verão, depois da lavagem e desinfecção, ocorreu um maior número de locais classificados no Nível de Risco Elevado e, no Inverno, constatou-se a situação inversa, tendo sido observado maior número de locais com Nível de Risco Elevado antes da lavagem e desinfecção. Junto ao tanque e nas escadas de acesso à zona envolvente ao jacuzzi e tanque foram os locais com mais classificações de Nível de Risco Elevado, no Verão e no Inverno. Foram isolados nas superfícies fungos comuns aos isolados nos trabalhadores. Antes da lavagem e desinfecção, 30,3% dos fungos foram isolados nas superfícies e nos trabalhadores e depois desses procedimentos 45,5% dos fungos foram também isolados comummente. As Leveduras foram as mais isoladas comummente e as que se verificaram mais frequentes antes e depois da lavagem e desinfecção da superfícies e, também, nos resultados das colheitas biológicas realizadas aos trabalhadores, foram o género Rhodotorula e a espécie Candida parapsilosis, permitindo confirmar que a infecção fúngica dos trabalhadores está relacionada com a contaminação fúngica das superfícies. Concluiu-se que é necessária a intervenção em Saúde Ocupacional no âmbito da vigilância ambiental e da vigilância da saúde, com o intuito de diminuir a prevalência das infecções fúngicas. Para a prossecução desse objectivo, sugere-se a implementação de medidas preventivas, nomeadamente: o controlo da contaminação fúngica das superfícies mediante procedimentos de lavagem e desinfecção eficazes, de modo a minimizar a contaminação fúngica das superfícies; a identificação precoce da infecção através da realização de colheitas biológicas periódicas aos trabalhadores, inseridas num protocolo de vigilância da saúde; e, ainda, a sensibilização para a aplicação de medidas de higiene pessoal e o tratamento das patologias. A aplicação do método criado para estabelecer um padrão de exposição profissional a fungos nas superfícies servirá não só para a estimação do risco de infecção fúngica dos trabalhadores de ginásios com piscinas, mas também para facilitar o estabelecimento de valores fúngicos de referência, a implementação de medidas correctivas adequadas e imediatas e, ainda, a prevenção de infecções fúngicas, não só nos ginásios com piscina, mas também noutros contextos profissionais. ------------ SUMMARY - Gyms with swimming pools workers have higher prevalence of fungal injuries, such as Tinea pedis and onychomycosis. This is due to their work intrinsic characteristics, since they have more hours per day of exposure to surfaces fungal contamination. This occurs not only because they attend sites most likely to be contaminated, such as showers, changing rooms and pool surrounding area, but also because some of the activities are done barefoot. Furthermore, synthetic clothing and occluded footwear use, which retain the excessive sweating, promotes fungal development. The aim of this study was to know gymnasiums with swimming pool workers infection and/or injury (Tinea pedis and onychomycosis) risk, and its possible relationship with exposure to workplace fungal contamination (air and surfaces). This study describes environmental and biological variables that influence infection and/or fungal injury in a professional setting and explored possible associations between these variables. Differences in surfaces fungal contamination between the two main seasons (summer and winter), as well between before and after cleaning and disinfection were known. It was developed a study with an cross-sectional perspective, that aimed to describe the biological and environmental phenomena of fungal contamination in a professional environment and explore possible associations between variables; an longitudinal perspective in which were known surfaces fungal contamination seasonal differences; and also with an almost experimental perspective that analyzed surfaces fungal distribution before and after cleaning and disinfection. The cross-sectional perspective comprised 10 gyms with swimming pool sample, and another sample of, at least, 10 professionals in each establishment totalling 124 workers (75 men – 60,48%, and 49 women – 39,52%). Were performed 258 biological samples at workers feet, environmental fungal contamination evaluation from the establishments through 50 air samples and 120 surfaces samples (60 before and 60 after cleaning and disinfection) and conducted their laboratory processing and fungal identification. Were also evaluated environmental variables, such as temperature, relative humidity and air velocity completed 10 observation grids, in order to obtain data about variables that affect occupational exposure to fungal species, and also completed 124 observation grids inherent to biological material collection, in order to know the professionals with injury and other relevant information for laboratory analysis. All 124 workers answered to a questionnaire at the same time that occur biological samples collection, in order to xxv obtain information about some of the individual and professional variables with relevance to this study. In one of the establishments were also studied differences concerning surfaces fungal contamination between before and after cleaning and disinfection, and also between two main seasons (summer and winter). In this setting, there were performed 36 surfaces samples before and 36 surfaces samples after cleaning and disinfection on 6 different week days for 6 sequential weeks in each season, totalling 72 surfaces samples. It was also created and implemented a method to establish a pattern for surfaces fungal occupational exposure, in order to help define semi-quantitative levels estimation to fungal infection risk in gyms with swimming pools workers. For Gravity criterion it was considered that contamination severity and, thus, the possible injury are closely related to implicate fungal species. Was calculated fungal contamination average by each establishment prior cleaning and disinfection, in order to establish Frequency levels. Regarding Exposure, were established weekly hours group intervals spent in professional activity. From the 124 professionals tested, 58 (46,8%) had visible injuries. In the 58 workers, Yeasts were the most isolated (41,4%), followed by Dermatophytes (24,1%) and Other Filamentous Fungi Besides Dermatophytes (6,9%). Candida parapsilosis and Rhodotorula sp. were the most frequently isolated Yeasts (20,2% for each), from Dermatophytes, Trichophyton rubrum was the most frequently isolated species (55,5%) and from Other Filamentous Fungi Besides Dermatophytes, Penicillium sp. was the most frequent (15,6%), followed by Fusarium genera (12,5%). Regarding surfaces fungal contamination, 37 filamentous fungi were isolated. Fusarium genera was the most frequent, before and after cleaning and disinfection (19,1% - 17,2%). Considering yeasts, 12 different yeasts were identified, being Cryptococcus (40,6%) and Candida (49,3%) genera the more frequent before and after cleaning and disinfection, respectively. In relation to air fungal contamination, 25 different filamentous fungi were identified and the 3 most frequently isolated genera were Cladosporium (36,6%), Penicillium (19,0%) and Aspergillus (10,2%). For yeasts, were identified Rhodotorula genera (87,5%), and also the species Trichosporon mucoides and Cryptococcus unigutulattus (12,5%). Was found association with 5% significance level, between visible injury and weekly hours and between visible injury and occupation time, confirming exposure duration influence to risk factor (work environment fungal contamination) for the visible injury presence in exposed workers (Tinea pedis and onychomycosis), being confirmed the relation between the study exposure risk - occupational exposure to fungi - with health effects. xxvi Environmental variables evaluated (temperature, relative humidity and air velocity) did not affect air and surfaces fungal contamination and wasn’t found no statistically significant relation (p>0,05). However, there was evidence that occupant’s number influence surfaces colony forming units mean per square meter before cleaning and disinfection. There was no correlation between quantitative data from air fungal contamination and surfaces fungal contamination from the 10 establishments monitored. However, there were significant differences with 10% significance level, between surfaces and air fungal contamination (p<0,1), and despite 50% of the lowest rates were higher in air fungal contamination, it was found that surfaces fungal contamination had more quantitative variability. Regarding differences from the 10 establishments surfaces fungal contamination, between before and after cleaning and disinfection, there was only a significant reduction (p<0,05) in fungal contamination after cleaning and disinfection in male changing rooms for yeasts. In the selected establishment, it was found that relation between fungal contamination and temperature and relative humidity was not significant (p>0,05) in both seasons, and also there wasn’t no influence observed from occupants in surfaces colony forming units mean per square meters before cleaning and disinfection in both seasons. In almost all situations where significant differences between the two seasons were shown, there was a colony-forming units per square meter increase in winter. There was an exception in total colony forming units per square meter before cleaning and disinfection in male changing room’s exception, where there was an increase in summer. Furthermore, was found that only occur a reduction in fungal contamination after cleaning and disinfection, on access stairs in winter, as well as in male changing rooms in summer. With application from the method to establish pattern for surfaces fungal occupational exposure, it was obtained, in the 10 establishments, 65 sites with Low Risk Level (54,2%), 23 sites with Average Risk Level (19,2%) and 32 sites with High Risk Level (26,6%). Near swimming pool and jacuzzi were the places with more High Risk Level classifications. In the selected establishment, was found that in the summer, after cleaning and disinfection, there were a greater number of sites classified as High Risk Level, and in winter it was found the opposite situation, being noted more places with High Risk Level before cleaning and disinfection. Next to swimming pool and access stairs to swimming pool and jacuzzi were the places with more High Risk Level classifications in Summer and Winter. Were isolated common fungi in surfaces and in workers. Prior to cleaning and disinfection 30,3% of fungi were isolated on surfaces and workers, and after 45,5% of fungi were also xxvii commonly isolated. The Yeasts were the most commonly isolated and the most frequent before and after surfaces cleaning and disinfection, and also in workers biological samples, were Rhodotorula genera and Candida parapsilosis, allowing confirming that workers fungal infection is related with surfaces fungal contamination. It was concluded that Occupational Health intervention it is necessary, in environmental monitoring and health surveillance perspective, in order to reduce fungal infections prevalence. To achieve this objective, preventive measures implementation it’s recommended, including: surfaces fungal contamination control, through effective cleaning and disinfecting in order to minimize surfaces fungal contamination; early infection identification by performing periodic biological sampling from workers, included in a health surveillance protocol; and also personal hygiene and diseases treatment awareness. Application of the created method to establish pattern for surfaces fungal occupational exposure, will be useful not only for estimating workers from gymnasiums with swimming pools fungal infection risk, but also to facilitate fungal reference values stipulation, effective and corrective measures implementation, and also, fungal infections prevention, not only in gymnasiums with swimming pool, but also in other professional settings.----------------- RÉSUMÉ - Les travailleurs des gymnases avec des piscines présentent souvent des infections fongiques, telles que Tinea pedis et aussi des onychomycoses, dues à leur activité professionnel, parce qu’ils restent plus longtemps tout prés des surfaces avec une certaine contamination fongique. Toute cette situation est due non seulement parce qu’ils sont ceux qui fréquentent plus souvent les places plus contaminées: des balnéaires, des vestiaires et des zones autour des piscines, mais aussi ils réalisent des activités aux pieds nus ou avec des chaussures très fermés et encore quelques fois avec des vêtements synthétiques. Tout cela emmène à une grande sudation ce qui aidera au développement fongique. Un objective de ce travaille a été connaître le risque d’infection et/ou présence de lésion (Tinea pedis et des onychomycoses) dans les travailleurs des gymnases avec des piscines et leur éventuel rapport avec l’exposition à la contamination fongique (de l’air et des surfaces) dans leurs locaux de travaille. On a décrit aussi des variables d’environnement et biologiques qui ont une certaine influence dans les infections fongiques dans tout l’environnement professionnel et aussi approfondir des éventuels associations entre ces même variables. On a encore reconnu des différences de la contamination fongique avant et après des lavages et désinfection de ces surfaces. Aussi on a trouvé des différences de contamination en Été et en Hiver. Cet étude a un composante transversale, en visant la description des phénomènes de contamination fongique biologique et de l'environnement dans un environnement professionnel et l’étude des associations possibles entre les variables; une composante longitudinale dans laquelle ils étaient connus comme des variations saisonnières de la contamination fongique des surfaces, et même; un quasi-composante expérimentale, où elle a examiné la répartition des champignons surfaces avant et après le lavage et la désinfection. Dans la composante transversale on été considérés 1 échantillons de 10 gymnases avec des piscines et un autre échantillon de au moins 10 professionnels de chaque établissement dans un total 124 travailleurs (75 hommes - 60,48% et 49 femmes - 39,52%). On a réalisé 258 prélèvements aux pieds des travailleurs et on a effectué en simultané la validation par contamination fongique de l’environnement par 50 prélèvements de l’air et par 120 prélèvements de surfaces (60 avant et 60 après des lavages et des désinfections) et on a effectué leur traitement en laboratoire et l’identification fongique. On a fait aussi l’évaluation des variables de l’environnement, la température, l’humidité relative et la vitesse de l’air. On a remplie 10 tableaux xxix d’observation, avec l’objective d’obtenir des informations sur les variables qu’influenceront l’exposition occupationnel aux souches fongiques, et encore 124 tableaux d’observation liée au prélèvement du matériel biologique, pour réaliser le registre des professionnels avec des lésions et des autres informations pertinentes pour une analyse laboratoire. Tous ces 124 travailleurs ont rempli un questionnaire au même temps que les prélèvements biologiques, afin de connaître quelques variables individuels et professionnels importants pour cet étude. Dans un des établissements on a aussi étudié les différences fongiques des surfaces parmi avant et après les lavages et de la désinfection et encore parmi l’Été et l’Hiver. Dans ce même établissement on a réalisé 36 prélèvements des surfaces avant et 36 après des lavages et de la désinfection, pendant 6 jours différents de la semaine, pendant 6 semaines en chaque saison de l’année, dans un total de 72 prélèvements des surfaces. On a encore crié et appliqué une méthode pour établir un standard d’exposition professionnelle au fungi sur les surfaces, afin de permettre la définition des niveaux semi quantitative d’estimation des risques d’infection fongique des travailleurs des gymnases avec des piscines. Pour le critère de Gravité, il a été considéré que la gravité de la contamination, et donc les possibles dommages, est étroitement liée aux espèces fongiques impliquées. Nous avons calculé la moyenne de la contamination fongique par chaque établissement avant le lavage et la désinfection afin d'établir les niveaux de Fréquence et, par rapport à l'Exposition, ont été crées pour regrouper les intervalles d'heures hebdomadaires consacrées à l'activité professionnelle en question. Sur les 124 travailleurs qui ont participé à l'étude, 58 (46,8%) avaient des lésions visibles. Parmi ces 58, les Levures ont été les plus isolées (41,4%), suivis par des Dermatophytes (24,1%) et des Filamenteux Non Dermatophytes (6,9%). Candida parapsilosis and Rhodotorula sp. ont été les Levures les plus fréquemment isolées (20,2%); dans le cas des Dermatophytes, Trichophyton rubrum est le plus fréquent (55,5%) et pour les Filamenteux Non Dermatophytes, Penicillium sp. a été le plus isolé (15,6%), suivi par Fusarium sp. (12,5%). En ce qui concerne la contamination fongique des surfaces, 37 champignons filamenteux ont été isolés. Le genre Fusarium est le plus fréquent avant et après le lavage et la désinfection (19,1% - 17,2%). Pour la levure, 12 levures différentes ont été identifiées, ayant été Cryptococcus sp. (40,6%) et Candida sp. (49,3%) les plus fréquents avant et après le lavage et la désinfection, respectivement. En ce qui concerne la contamination fongique de l'air, on a identifié 25 différents champignons filamenteux, où les 3 genres les plus fréquemment isolés étaient Cladosporium (36,6%), Penicillium (19,0%) et Aspergillus (10,2%). Pour les levures, il a été identifié le genre xxx Rhodotorula (87,5%) et les espèces Trichosporon mucoides et Cryptococcus unigutulattus (12,5%). On a vérifié une association, au niveau de signification de 5%, entre les lésions visibles et les heures hebdomadaires et entre les lésions visibles et la durée d’occupation, ce qui confirme l'influence de la durée de l'exposition aux facteurs de risque (contamination fongique dans le milieu de travail) pour la présence des lésions visibles chez les travailleurs exposés (Tinea pedis et onychomycose), en démontrant une relation entre l'exposition au facteur de risque dans ces études - l'exposition professionnelle aux champignons - avec les effets sur la santé. Les variables environnementales évalué (température, humidité relative et la vitesse de l'air) ne modifient pas la contamination fongique de l'air et des surfaces; donc, n'a pas été démontré aucune relation statistiquement significative (p>0,05). Cependant, il y a une influence du nombre d'occupants qui ont participé à chacun des établissements en moyenne des unités formant colonie par mètre carré sur la surface avant le lavage et la désinfection. Il n'y avait pas de corrélation entre les résultats quantitatifs de la contamination fongique de l'air et des surfaces des 10 établissements surveillés, cependant il existe des différences importantes, au niveau de signification de 10% entre la contamination fongique des surfaces et de la contamination fongique de l'air (p <0,1), on a constaté que malgré 50% des niveaux les plus bas étaient plus élevés dans la contamination fongique de l'air, la contamination fongique des surfaces présentée une plus grande variabilité quantitativement. En ce qui concerne les différences de la contamination fongique des surfaces dans les 10 établissements entre avant et après le lavage et la désinfection, il y avait seulement une réduction significative (p<0,05) de la contamination fongique après le lavage et la désinfection dans les balnéaires et vestiaires pour les hommes par rapport aux levures. Lors de l'établissement choisi, on a constaté que le rapport entre la contamination fongique et la température et l'humidité relative n'était pas significatif (p>0,05) dans les deux saisons et aussi on n’a pas observé l'influence des occupants en moyenne des unités formant colonie par mètres carrés de surfaces avant le lavage et la désinfection dans les deux saisons de l'année. Dans presque toutes les situations ou on a vérifié des différences significatives entre les deux saisons, il ya eu une augmentation des unités formant des colonies par mètre carré en Hiver, à l'exception du total des unités formant des colonies par mètre carré avant le lavage et désinfection dans les balnéaires et vestiaires des hommes où il y a eu une augmentation en Été. On a également été constaté que seulement a eu une réduction de la contamination des xxxi champignons après la désinfection de l'escalier d'accès en Hiver et dans les balnéaires et vestiaires des hommes en Été. Avec la méthode pour établir standard d’exposition professionnelle au fungi sur les surfaces on a obtenu dans les 10 établissements, avec le Niveau de Risque Faible de 65 places (54,2%), avec le Niveau de Risque Moyen 23 places (19,2%) et 32 places avec le Niveau de Risque Élevé (26,6%). Près du jacuzzi et près de la piscine sont les lieux avec des plus évaluations de Niveau de Risque Élevé. Lors de l'établissement choisi, il a été constaté que, dans l'Été, après le lavage et la désinfection, un plus grand nombre de places évaluées comme présentant un Niveau de Risque Élevé et en Hiver on a constaté la situation inverse avec de nombreux points de Niveau de Risque Élevé avant le lavage et la désinfection. A côté de la piscine et les escaliers ont été les lieux avec plus grands classifications de Niveau de Risque Élevé en Été et en Hiver. On a isolé, chez les travailleurs, des champignons communs aux isolés sur les surfaces. Avant le lavage et la désinfection, 30,3% des champignons ont été isolés sur les travailleurs et sur les surfaces et, après ces procédures, 45,5% des champignons ont été isolés fréquemment. Les levures les plus souvent isolées et les plus fréquentes avant et après le lavage et la désinfection des surfaces, et aussi dans les résultats d'échantillons biologiques prélevés sur les travailleurs, étaient du genre Rhodotorula et les espèces de Candida parapsilosis, ce qui permet confirmer que l'infection fongique des travailleurs est liée à la contamination fongique des surfaces. On a conclu qu’il est nécessaire l'intervention en Santé Occupationnelle sous la surveillance de l'environnement et sous la surveillance de la santé, afin de réduire la prévalence des infections fongiques. Pour atteindre cet objectif, nous suggérons la mise en oeuvre de mesures préventives, y compris: le contrôle de la contamination fongique des surfaces par des méthodes de lavage et de désinfection afin de minimiser la contamination fongique des surfaces, l'identification précoce de l'infection avec des prélèvements biologiques périodiques, notamment un protocole pour la surveillance de la santé, et aussi la conscience du sens de l'hygiène personnelle et le traitement des pathologies. La méthode mise en place pour l’établissement d’un standard d’exposition professionnelle au fungi sur les surfaces, servira à estimer non seulement le risque d'infection fongique des travailleurs dans les gymnases avec des piscines, mais aussi pour faciliter l'établissement de valeurs de référence de champignons, l'application des mesures correctives immédiates et appropriées, et aussi la prévention des infections fongiques, non seulement dans les gymnases avec piscine, mais aussi dans d'autres contextes professionnels.

A regulação endócrina dos balanços de cálcio

RESUMO: As concentrações circulantes de cálcio são notavelmente constantes a despeito das variações diárias na absorção intestinal e na eliminação renal deste elemento. A regulação da calcémia é um sistema complexo que compreende vários factores controladores (a calcémia, a fosforémia, as concentrações circulantes de paratormona (PTH) e calcitriol além de muitos outros factores como hormonas esteróides em geral, outros iões como o magnésio e outros factores hormonais) e vários órgãos alvo (glândulas paratiroideias, osso, rim e intestino). As respostas dos órgãos alvo também são muito variadas. No caso mais simples, a cristalização de sais de cálcio corresponde a uma mudança de fase em que participam moléculas orgânicas que a iniciam, aceleram ou inibem. Em geral a combinação de um factor controlador com o respectivo receptor de membrana (para polipeptídeos ou iões) ou intracelular (hormonas esteróides) é apenas o primeiro passo de uma cadeia bioquímica que introduz uma enorme amplificação na resposta. A esta variedade de mecanismos de resposta correspondem grandes diferenças nos tempos de resposta que podem ser de minutos a semanas. É hoje possível “observar” (medir) com apreciável rigor nos líquidos biológicos (sangue, urina, fezes, etc.) os factores mais importantes do sistema de regulação da calcémia (cálcio, fósforo, paratormona e calcitriol) assim como administrar estes factores em experiências agudas. Esta possibilidade reflecte – se na literatura neste campo que tem vindo a crescer. O advento das técnicas da biologia molecular tem permitido a caracterização molecular de algumas das disfunções da homeostase do cálcio e é de esperar um diagnóstico fisiopatológico cada vez mais rigoroso dessas disfunções. Com o avanço dos conhecimentos nesta área que não cessa de aumentar temos cada vez maiores capacidades para fazer diagnósticos e é cada vez mais difícil interpretar com rigor os correspondentes quadros metabólicos. A análise ou síntese de sistemas complexos é a actividade mais nobre dos engenheiros que lhes permite desenhar pontes, diques, barcos, aviões ou automóveis. Com o aparecimento de computadores de médio ou grande porte foi – lhes possível utilizar descrições matemáticas não só para desenhar sistemas como ainda para interpretar eventuais falhas na sua operação. Essas descrições matemáticas consistem numa sequência de operações realizadas num computador segundo um “programa informático” que receberam a designação genérica de modelos, por analogia com as famosas leis (equações) da física que foram deduzidas a partir de um certo número de postulados e que permitem representar matematicamente processos físicos. As famosas leis de Newton são talvez os exemplos mais famosos de “modelos” de sistemas físicos. A introdução de modelos matemáticos em biologia e particularmente em medicina só se deu recentemente.MÉTODOS No trabalho que aqui se apresenta construiu - se um modelo simplificado da homeostase do cálcio destinado ao cálculo de variáveis observáveis (concentrações de cálcio, fósforo, PTH e calcitriol) de modo a poderem comparar-se valores calculados com valores observados. A escolha dos componentes do modelo foi determinada pela nossa experiência clínica e pela informação fisiopatológica e clínica publicada. Houve a preocupação de construir o modelo de forma modular de modo a ser possível a sua expansão sem grandes transformações na descrição matemática (e informática) já existente. Na sua fase actual o modelo não pode ser usado como instrumento de diagnóstico. É antes uma ferramenta destinada a esclarecer “em princípio” mecanismos fisiopatológicos. Usou – se o modelo para simular um certo número de observações publicadas e para exemplificar a sua eventual aplicação clínica na simulação de situações hipotéticas e na análise de possíveis mecanismos fisiopatológicos responsáveis por situações de hipo ou hipercalcémias. Simultaneamente fez – se uma análise dos dados acumulados relativos a doentes vistos no Serviço de Endocrinologia do Instituto Português de Oncologia de Francisco Gentil – Centro Regional Oncológico de Lisboa, S.A. CONCLUSÕES Numa população de 894 doentes com patologias variadas do Instituto Português de Oncologia de Lisboa os valores da calcémia tiveram uma distribuição normal unimodal com uma média de 9.56 mg/dl, e um erro padrão de 0.41 mg/dl. Estas observações sugerem que a calcémia está sujeita a regulação. A partir dos resultados publicados em que o metabolismo do cálcio foi perturbado por infusões de cálcio, calcitriol ou PTH, de estudos bioquímicos e fisiológicos sobre os mecanismos de acção de factores controladores da calcémia e do estudo do comportamento de órgãos alvo (paratiroideias, intestino, osso e rim) foi possível construir um modelo matemático de parâmetros concentrados do sistema de regulação da calcémia. As expressões analíticas usadas foram baseadas na cinética enzimática de modo a que os seus parâmetros tivessem um significado físico ou fisiológico simples. O modelo revelou apreciável robustez e flexibilidade. É estável quando não perturbado e transita entre estados estacionários quando perturbado. Na sua forma actual gera simulações que reproduzem satisfatoriamente um número apreciável de dados experimentais colhidos em doentes. Isto não significa que possa ser usado como instrumento de diagnóstico aplicável a doentes individuais. O desenho do modelo comporta a adição posterior de novas relações quando surgirem situações para as quais se revele insuficiente. A utilização exaustiva do modelo permitiu explicitar aspectos do metabolismo do cálcio que ou não estão contidas na sua formulação actual – o aparecimento de hipertrofia ou de adenomas das paratiroideias e as alterações na estrutura óssea , a participação de outros factores controladores – magnésio, ou estão insuficientemente descritas – alterações do metabolismo do fósforo nos hipoparatiroidismos. A análise dos dados relativos aos doentes do Serviço de Endocrinologia do IPO permitiu o início da caracterização dos tipos de patologia que representam e de possíveis mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Estas observações são o ponto de partida para análises futuras. São exemplos das relações encontradas: a distribuição dos doentes por dois grandes grupos conforme a calcémia é determinada pelas concentrações circulantes de PTH ou estas são determinadas pela calcémia; a distribuição sazonal das concentrações de Vit. D25. no sangue; a correlação negativa entre estas e as concentrações de PTH no sangue. Também foi possível extrair a cinética do controlo da PTH sobre a síntese de calcitriol. O estudo dos níveis circulantes de PTH no pós-operatório imediato de doentes paratiroidectomizados permitiu determinar as suas taxas de degradação metabólica. O modelo permitiu simular as relações Ca/PTH no sangue, Ca/Fracção excretada da carga tubular, Ca/P no sangue para valores normais ou altos de Ca. Foram feitas simulações de situações fisiopatológicas (em “doentes virtuais”): infusões crónicas de cálcio, PTH e calcitriol; alterações no comportamento de receptores. Estas simulações correspondem a experiências que não podem ser realizadas em humanos. São exemplos da utilização do modelo na exploração de possíveis mecanismos fisiopatológicos através da observação de resultados quantitativos inacessíveis à intuição. O modelo foi útil em duas fases do trabalho: Primeiro, durante a sua síntese implicou uma escolha criticamente selectiva de informação, sua análise quantitativa e processamento, uma explicitação rigorosa (analítica) das relações funcionais entre os controladores e as variáveis e da sua integração numa estrutura global; Segundo, a simulação de situações experimentais ou clínicas (dados do Serviço de Endocrinologia do IPO) em doentes obrigou a explicitar raciocínios fisiopatológicos habitualmente formulados em bases puramente intuitivas. Esta prática revelou comportamentos óbvios após as simulações – acção reduzida das infusões PTH (simulação de hiperparatiroidismos primários) enquanto não há inibição total da respectiva secreção, necessidade de aumento da massa secretora da paratiroideia nas insuficiências renais avançadas, etc. A síntese e utilização do modelo não implicaram uma preparação matemática avançada e foram possíveis mercê da disponibilidade de “software” interactivo especificamente desenhado para a simulação de sistemas dinâmicos em que os programas se escrevem em inglês usando a simbologia simples da álgebra elementar. A função nobre de modelos desta natureza é semelhante à dos modelos usados pelos físicos desde o século XVII: permitir explicações de carácter geral funcionando como uma ferramenta intelectual para manipulação de conceitos e para a realização de “experiências pensadas” (“thought experiments”) respeitando certos princípios físicos (princípios de conservação) que estabelecem as fronteiras da realidade. -------ABSTRACT: Calcium blood levels are remarkably constant despite great variations in calcium daily intake, intestinal absorption and renal excretion. The regulation of the calcium concentration in the blood is achieved by a complex system that includes several controller factors (mainly the serum levels of calcium, phosphorus, parathyroid hormone (PTH) and calcitriol but also of steroid hormones, ions such as magnesium and other hormonal factors) and several target organs (parathyroid glands, bone, kidney and intestine). The functional response to the controlling factors obeys a variety of kinetics. The precipitation of calcium salts is a simple phase transition in which organic molecules may provide nucleation centres or inhibit the process. The combination of a controller factor with its receptor located in the cell membrane (for peptides or ions) or in the nucleus (for steroid hormones) is only the first step of a biochemical chain that introduces a huge amplification in the response. To this great variability of response we have to add the times of response that vary from minutes to weeks. It is possible to “observe” (measure) with great accuracy in biological fluids (blood, urine, faeces, etc.) the most important factors intervening in the calcium regulation (calcium, phosphorus, PTH and calcitriol). The response of the system to acute infusions of the controlling factors has also been studied. Using molecular biology techniques it has been possible to characterize some calcium homeostasis dysfunctions and better physiopathological diagnosis are expected. With the increasingly new knowledge in this area we have better capacity to diagnose but it is harder to explain correctly the underlying metabolic mechanisms. The analysis or synthesis of complex systems is the noble activity of engineers that enables them to draw bridges, dams, boats, airplanes or cars. With the availability of medium-large frame computers it was possible to use mathematical descriptions not only to draw systems but also to explain flaws in its operations. These mathematical descriptions are generally known as models by analogy with the laws (equations) of physics that allow the mathematical description of physical processes. In practice it is not possible to find general solutions for the mathematical descriptions of complex systems but (numeric) computations for specific situations can be obtained with digital computers. The introduction of mathematical models in biology and particularly in medicine is a recent event. METHODS In this thesis a simplified model of calcium homeostasis was built that enables the computation of observable variables (concentrations of calcium, phosphorus, PTH and calcitriol) and allows the comparison between the simulation values and observed values. The choice of the model’s components was made according to our clinical experience and to the published clinical and physiopathological data. The model has a modular design that allows future expansions with minor alterations in its structure. In its present form the model cannot be used for diagnosis. It is a tool designed to enlighten physiopathological processes. To exemplify its possible clinical application in the simulation of hypothetical situations and in the analysis of possible mechanisms responsible for hypo or hypercalcemias the model was used to simulate a certain number of published observations. An analysis of clinical and laboratory data from the Endocrinology Department of the Portuguese Cancer Institute (I.P.O.F.G.-C.R.O.L.,S.A.) is also presented. CONCLUSIONS In a population of 188 patients without an identifiable disease of the calcium metabolism at the Portuguese Cancer Institute the calcemia levels had a unimodal distribution with an average of 9.56 mg/dL and a S.E.M of 0.41 mg/dL. This observation confirms that serum calcium is regulated. Using published data; in which calcium metabolism was disrupted by calcium, PTH or calcitriol infusions; from biochemical and physiological studies of the action of controller factors on the calcemia; in which the response of target organs (parathyroid glands, intestine, bone, kidney) was studied it was possible to build a mathematical model of concentrated parameters of the calcium homeostasis. Analytical expressions used were based on enzymatic kinetics. The model is flexible and robust. It is stable when not disturbed and changes between steady states when disturbed. In its present form it provides simulations that reproduce closely a number of experimental clinical data. This does not mean that it can be used as a diagnostic tool for individual patients. The exhaustive utilisation of the model revealed the need of future expansions to include aspects of the calcium metabolism not included in its present form –hypertrophy or adenomas of the parathyroid glands, bone structure changes, participation of other controller factors such as magnesium – or insufficiently described – phosphate metabolism in hypoparathyroidism. The analysis of the data collected from the I.P.O.’s Endocrinology Department allowed the initial characterization of the different pathologies represented and of their possible physiopathological mechanisms. These observations are a starting point for future analysis. As examples of the relations found were: the distribution of patients in two groups according to the dependency of calcium by PTH levels or PTH levels by calcium concentration; the seasonal distribution of the serum concentrations of D25; its negative correlation with PTH concentration. It was also possible to extract the kinetics of the control of the synthesis of calcitriol by PTH. The analysis of immediate post-surgical levels of PTH in parathyroidectomized patients allowed the determination of its metabolic clearance. The model also allowed the simulation of the relations between Ca/PTH in blood, serum Ca/Fraction of tubular load excreted and Ca/P in blood for normal and high values of calcium. Simulations were made of pathological situations (in “virtual patients”): chronic infusions of calcium, PTH and calcitriol; changes in the characteristics of receptors. These simulations are not possible in real persons. They are an example of the use of this model in exploring possible mechanisms of disease through the observation of quantitative results not accessible to simple intuition. This model was useful in two phases: Firstly, its construction required a careful choice of data, its quantitative analysis and processing, an analytical description of the relations between controller factors and variables and their integration in a global structure. Secondly, the simulation of experimental or clinical (I.P.O.’s Endocrinology Department) data implied testing physiopathological explanations that previously were based on intuition. The construction and utilisation of the model didn’t demand an advanced mathematical preparation since user-friendly interactive software was used. This software was specifically designed for the simulation of dynamic systems. The programs are written in English using elementary algebra symbols. The essential function of this type of models is identical to that of those used by physicists since the XVII century which describe quantitatively natural processes and are an intellectual tool for the manipulation of concepts and the performance of “thought experiments” based in certain physical principles (conservation principles) that are the frontiers of reality.------------------RESUMÉE: Les concentrations circulantes de calcium sont constantes même pendant des variations de l’absorption intestinale et de l’élimination rénale de cet élément. La régulation de la calcémie est un système complexe qui comprend plusieurs éléments contrôleurs (la calcémie, la phosphorémie, les concentrations circulantes de l’hormone parathyroïdienne (PTH) e du calcitriol et d’autres comme les hormones stéroïdes ou des ions comme le magnésium) et plusieurs organes (glandes parathyroïdiennes, l’os, le rein et l’intestin). Les réponses de ces organes sont variées. Dans le cas plus simple, la cristallisation des sels de calcium correspond à un changement de phase dans lequel y participent des molécules organiques que la débutent, l’accélèrent ou l’inhibent. Généralement la combinaison d’un élément contrôleur avec leur récepteur de membrane (pour les peptides ou les ions) ou intracellulaire (pour les hormones stéroïdes) n’est que le premier pas d’une chaîne biochimique qu’introduit une grande amplification de la réponse. A cette variété de réponses correspondent des grandes différences des temps de réponses qu’y vont des minuits a semaines. Il est possible « observer » (mesurer) dans les fluides biologiques (sang, urine, fèces, etc.) les éléments plus importants du système de régulation de la calcémie (calcium, phosphate, PTH et le calcitriol) et les administrer en expérimentes aigus. Cette possibilité est visible dans la littérature publiée dans ce domaine qui est en croissance permanente. L’avenir des techniques de biologie moléculaire a permis caractériser des nombreuses dysfonctions de la régulation de la calcémie et on attend un diagnostique physiopathologique de ces dysfonctions chaque fois plus rigoureuses. Les connaissances dans ce domaine s’agrandissent et on a de plus de capacités pour faire des diagnostiques et il est chaque fois plus difficile les interpréter. L’analyse ou synthèse de systèmes complexes est l’activité plus noble des ingénieurs qui les permit dessiner des ponts, bateaux, avions ou automobiles. Avec des ordinateurs de médium ou grand port il les est possible utiliser descriptions mathématiques pour dessiner les systèmes et interpréter des éventuelles fautes d’opération. Ces descriptions mathématiques sont une séquence d’opérations réalisées dans un ordinateur selon « un programme informatique » qui ont reçu la désignation générique de modèles, pour analogie avec les équations de la physique qui ont été déduits d’un nombre de postulées et qu’ont permit représenter des processus physiques en équations mathématiques. Les fameuses équations de Newton sont peut-être les exemples plus connus des systèmes physiques. L’introduction des modèles mathématiques en biologie et en particulier en médecine est un évènement récent. Dans ce travaille, on a construit un modèle simplifié de l’homéostasie du calcium pour calculer les variables observables (concentrations de calcium, phosphate, PTH et calcitriol) pour les comparer. Les choix des components a été déterminés par notre expérience clinique et par l’information physiopathologique et clinique publiée. Le modèle a été construit de façon modulaire ce que permit leur postérieur expansion sans des grandes altérations dans la description mathématique et informatique déjà existante. Dans cette forme le modèle ne peut être utilisé comme un instrument de diagnostique. Il est un outil pour éclairer la physiopathologie. Le modèle a été utilisé pour simuler un certain nombre d’observations publiées et pour exemplifier leur possible utilisation clinique dans la simulation des hypothèses et de la physiopathologie des situations d’hypo ou hypercalcémie. On a fait une analyse des éléments des procès cliniques des malades observées dans le Service d’Endocrinologie de l’IPOFG-CROL, SA. Dans une population de 894 malades avec des différentes pathologies les valeurs de calcémie on une distribution uni modale avec une Médie de 9.56 mg/dL et une erreur standard de 0.41 mg/dL. Ces observations suggèrent que la calcémie soit sujette de régulation. En utilisant des résultats de travaux publiés dans lesquels le métabolisme du calcium a été changé par des infusions de calcium, calcitriol ou PTH, des études biochimiques et physiologiques sur des mécanismes d’action des éléments contrôleurs de la calcémie et de l’étude du comportement des organes cible (parathyroïdes, intestin, rein, os), il a été possible de construire un modèle mathématique de paramètres concentrés du système de régulation de la calcémie. Les expressions analytiques utilisées ont été basées sur la cinétique enzymatique de façon à que les paramètres aient eu une signification physique ou biologique. Le modèle est stable quand il n’est pas perturbé et transit entre états stationnaires quand il est sujet a des perturbations. A ce moment il fait des simulations qui reproduisent de façon satisfaisant un nombre d’observations expérimentales. La construction du modèle permit l’addiction de nouvelles relations dans les cas ou il est insuffisant. L’utilisation exhaustive du modèle a permit expliciter des aspects du métabolisme du calcium qui y ne sont pas compris – l’hyperplasie ou la formation des adénomes des parathyroïdes, les altérations de la structure des os, la participation d’outres éléments régulateurs (magnésium), ou sont insuffisamment décrites – les altérations du métabolisme des phosphates dans l’hypoparathyroidism. L’analyse de l’information des malades du Service d’Endocrinologie a permit caractériser les pathologies représentées et leurs possibles mécanismes physiopathologiques. Ces observations sont le point de départ pour les analyses futures. Sont des exemples des relations trouvées: la distribution des malades par deux groupes: ceux dans lequel la calcémie est déterminée par la PTH ou ceux dans lesquels la PTH est déterminée par la calcémie; la distribution sazonale de la concentration de la vitamine D; la corrélation négative entre la vitamine D et la PTH. On a eu la possibilité de déduire la cinétique de control de la PTH sur la synthèse du calcitriol. L’étude des niveaux circulants de PTH sur des sujets parathyroidectomisées a permit déduire leur taux de dégradation métabolique. Le modèle a permit simuler les relations Ca/PTH dans le sang, Ca/fraction éliminée par le rein, Ca/P dans le sang pour des valeurs normales ou hautes de calcium. On a fait des simulations de situations physiopathologiques (dans “malades virtuelles”): Infusions chroniques de calcium, PTH ou calcitriol; altérations des récepteurs. Ces simulations ne peuvent pas être réalisées dans les humains. Sont des exemples d’utilisation du modèle dans l’exploration des possibles mécanismes de la physiopathologie en observant des résultats quantitatifs inaccessibles à l’intuition. Le modèle a été utile pendant deux étapes des travaux: La première, dans sa construction on a choisi l’information disponible, son analyse quantitative, l’explicitation rigoureuse (analytique) des relations fonctionnelles entre les contrôleurs et les variables et sa intégration dans une structure globale. La deuxième, la simulation de situations expérimentales ou cliniques (du Service d’Endocrinologie) a obligé d’expliciter des raisonnements physiopathologiques généralement formulés utilisant l’intuition. Cette pratique a montré des comportements – action réduite des infusions de PTH (jusqu’à l’inhibition totale de leur respective sécrétion), nécessité d’augmenter la masse sécréteuse de la parathyroïde dans les insuffisants rénales, etc. La synthèse et utilisation du modèle n’ont pas besoin d’une formation avancée en mathématique et sont possibles grâce à un programme interactif qui a été conçu pour la simulation des systèmes dynamiques dans lesquels le programme se construit en anglais en utilisant la symbolique élémentaire de l’algèbre. La fonction noble de ces modèles est semblable à celles des physiques du XVII siècle: Permettre établir explications générales en fonctionnant comme un outil intellectuel pour manipuler des concepts et pour la réalisation d’expérimentes pensées en respectant certains principes de la physique (principe de la conservation) qu’établissent les frontières de la réalité.

Exposição profissional ao chumbo : análise da indução de efeitos genotóxicos

RESUMO - A exposição contínua a substâncias químicas tem consequências para a saúde humana, algumas das quais não estão ainda totalmente estabelecidas. A toxicologia ocupacional é uma área interdisciplinar que envolve conhecimentos de higiene e de medicina ocupacional, de epidemiologia e de toxicologia e que tem por principal objectivo prevenir a ocorrência de efeitos adversos decorrentes do ambiente ocupacional sendo um dos seus principais papéis fornecer o máximo de dados que possam contribuir para o conhecimento dos potenciais efeitos na saúde. O chumbo é um tóxico de características cumulativas que provoca na saúde efeitos principalmente sistémicos, ou seja, o efeito tóxico manifesta-se em locais afastados do contacto inicial que resultam essencialmente de exposições crónicas, resultantes de períodos de exposição mais ou menos longos ao metal (entre meses e anos). Pode interagir com diferentes órgãos e tecidos, ligando-se a moléculas e constituintes celulares. Uma vez que não possui qualquer função fisiológica, a presença do chumbo no organismo humano resulta numa série de efeitos prejudiciais que afectam diversos órgãos e sistemas. A toxicidade do chumbo manifesta-se em diversos órgãos e tecidos, nomeadamente no sistema hematopoiético, no sistema nervoso, no rim, no aparelho reprodutor, no sistema cardiovascular, no sistema endócrino e no sistema imunitário. Da interferência do chumbo com o funcionamento de alguns sistemas biológicos resultam um conjunto de alterações fundamentais ao nível dos processos de transporte através das membranas, da integridade estrutural e funcional das enzimas e de várias vias metabólicas, em especial da fosforilação oxidativa e da síntese do heme sendo os primeiros efeitos bioquímicos do chumbo detectados a partir de valores de plumbémia inferiores a 10 μg/dL. As medidas de higiene e segurança actualmente em vigor nos países desenvolvidos asseguram que os casos de intoxicação grave são cada vez menos frequentes. No entanto, o risco de exposição a nível ocupacional existe em todas as actividades que envolvem materiais que o contenham como as explorações mineiras, as fundições primária e secundária, a produção de baterias de chumbo ácido, a produção de vidro com pigmentos de chumbo, as soldaduras de reparação automóvel e a instrução de tiro. Desde 2006 o chumbo é considerado pela International Agency for Research on Cancer (IARC) uma substância carcinogénica do grupo 2A (provável carcinogénio para o ser humano). Considera-se, assim, que o chumbo tem, inequivocamente, capacidade de induzir cancro em animais experimentais mas que, embora haja fortes indícios de que os mecanismos que medeiam a carcinogénese desses compostos ocorrem no ser humano, os dados disponíveis ainda não podem assegurar essa relação. Com este estudo pretendeu-se contribuir para o conhecimento da toxicidade do chumbo através do estudo da exposição ao chumbo e da influência da susceptibilidade individual (em industrias sem co-exposição significativa a outros agentes conhecidos ou suspeitos de serem carcinogénicos). Pretendeu-se estudar o caso através de uma abordagem múltipla que permitisse relacionar diferentes tipos de marcadores biológicos uma vez que a monitorização biológica integra todas as possíveis vias de entrada no organismo (para além da via respiratória), eventuais exposições fora do contexto estritamente profissional assim como uma série de factores intrínsecos individuais (relacionados com modos de via, de natureza fisiológica e comportamentais). Sendo a co-exposição a outros compostos com propriedades genotóxicas e carcinogénicas uma questão difícil de tornear quando se quer avaliar o potencial genotóxico do chumbo em populações expostas, ocupacional ou ambientalmente este estudo tem a vantagem de ter sido efectuado em populações sem co-exposição conhecida a outras substâncias deste tipo, permitindo concluir sobre os efeitos resultantes apenas da exposição a chumbo na população humana, contribuindo para explicar algumas das aparentes inconsistências e contradições entre diferentes estudos sobre este tema. Os indicadores de exposição usados foram: indicadores de dose interna (doseamento de chumbo e de PPZ no sangue), indicadores de efeitos adversos no heme e genotóxicos (actividade da ALAD, teste do cometa e mutação em TCR) e indicadores de susceptibilidade (polimorfismos genéticos de ALAD e VDR) através de uma abordagem estatística de comparação directa de sub-grupos previamente definidos na população e da aplicação de um modelo de regressão múltipla. Este estudo revelou que os níveis de plumbémia na população portuguesa baixaram significativamente nos últimos 10 anos, tanto na população ocupacionalmente exposta como na população em geral e que a presença do genótipo B-B (do gene VDR) é preditiva das variações de plumbémia, quando comparada com o genótipo mais frequente na população, B-b; ao contrário, o genótipo b-b não aparenta ter influência em nenhum dos marcadores estudados. No que diz respeito a efeitos genotóxicos concluiu-se que estes não se manifestaram na população estudada, levando a concluir que nos níveis de exposição estudados, o chumbo não tem capacidade de induzir este tipo de efeitos per si levando ao reforço da hipótese, já levantada por outros autores, de que o mecanismo de genotoxicidade do chumbo seja essencialmente de promoção de processos de genotoxicidade desencadeados por outros agentes. A realização de estudos de efeitos genotóxicos e de stress oxidativo desenhados de forma a comparar grupos de trabalhadores expostos apenas a chumbo com grupos de trabalhadores com o mesmo nível de exposição a chumbo, mas com co-exposição a outros agentes reconhecidamente carcinogénicos poderá ajudar a aumentar o conhecimento deste efeito do chumbo na saúde humana.

The role of the hypothalamic kisspeptin/GPR54 system in the control of GnRH neurons

Summary : The hypothalamus represents less than 1 % of the total volume of the brain tissue, yet it plays a crucial role in endocrine regulations. Puberty is defined as a process leading to physical, sexual and psychosocial maturation. The hypothalamus is central to this process, via the activation of GnRH neurons. Pulsatile GnRH secretion, minimal during childhood, increases with the onset of puberty. The primary function of GnRH is to regulate the growth, development and function of testes in boys and ovaries in girls, by stimulating the pituitary gland secretion of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). Several factors contribute to the timing of puberty, including sex and ethnicity, genetics, dietary intake and energy expenditure. Kisspeptins constitute a family of small peptides arising from the proteolytic cleavage of metastin, a peptide with 54 amino acids initially purified from human placenta. These kisspeptins were the subject of much attention following their discovery because of their antimetastatic properties, but it was more recently that their determining role in the reproductive function was demonstrated. It was shown that kisspeptins are ligands of a receptor, GPR54, whose natural inactivating mutation in humans, or knockout in the mouse, lead to infertility. GnRH neurons play a pivotal role in the central regulation of fertility. Kisspeptin greatly increases GnRH release and GnRH neuron firing activity, but the neurobiological mechanisms for these actions are unknown. Gprotein-coupled receptor 54, the receptor for kisspeptin, is expressed by GnRH neurons as well as other hypothalamic neurons, suggesting that both direct and indirect effects are possible. In the first part of my thesis, we investigated a possible connection between the acceleration of sexual development induced by leptin and hypothalamic metastin neurons. However, the data generated by our preliminary experiments confirmed that the commercially available antibodies are non-specific. This finding constituted a major drawback for our studies, which relied heavily upon the neuroanatomical study of the hypothalamic metastinergic pathways to elucidate their sensitivity to exogenous leptin. Therefore, we decided to postpone any further in vivo experiment until a better antibody becomes available, and focused on in vitro studies to better understand the mechanisms of action of kisspeptins in the modulation of the activity of GnRH neurons. We used two GnRH-expressing neuronal cell lines to investigate the cellular and molecular mechanisms of action of metastin in GnRH neurons. We demonstrated that kisspeptin induces an early activation of the MAP kinase intracellular signaling pathway in both cell lines, whereas the SAP/JNK or the Akt pathways were unaffected. Moreover, we found an increase in GnRH mRNA levels after 6h of metastin stimulation. Thus, we can conclude that kisspeptin regulates GnRH neurons both at the secretion and the gene expression levels. The MAPK pathway is the major pathway activated by metastin in GnRH expressing neurons. Taken together, these data provide the first mechanism of action of kisspeptin on GnRH neurons. Résumé : L'hypothalamus est une zone située au centre du cerveau, dont il représente moins de 1 du volume total. La puberté est la période de transition entre l'enfance et l'age adulte, qui s'accompagne de transformations somatiques, psychologiques, métaboliques et hormonales conduisant à la possibilité de procréer. La fonction principale de la GnRH est la régulation de la croissance, du développement et de la fonction des testicules chez les hommes, et des ovaires chez les femmes en stimulant la sécrétion de l'hormone lutéinisante (LH) et de l'hormone folliculostimulante (FSH) par la glande hypophysaire. Plusieurs facteurs contribuent au déclanchement de la puberté, y compris le sexe et l'appartenance ethnique, la génétique, l'apport alimentaire et la dépense énergétique. Les Kisspeptines constituent une famille de peptides résultant de la dissociation proteolytique de la métastine, un peptide de 54 acides aminés initialement purifié à partir de placenta humain. Ces kisspeptines ont fait l'objet de beaucoup d'attention à la suite de leur découverte en raison de leurs propriétés anti-metastatiques, et c'est plus récemment que leur rôle déterminant dans la fonction reproductive a été démontré. Les kisspeptines sont des ligands du récepteur GPR54, dont la mutation inactivatrice chez l'homme, ou le knockout chez la souris, conduisent à l'infertilité par hypogonadisme hypogonadotrope. Les neurones à GnRH jouent un rôle central dans le règlement des fonctions reproductrices et la kisspeptine stimule l'activité des neurones à GnRH et la libération de GnRH par ces neurones. Toutefois, les mécanismes neurobiologiques de ces actions ne sont pas connus. Dans la première partie de ma thèse, nous avons étudié le lien potentiel entre l'accélération du développement sexuel induite par la leptine et les neurones hypothalamiques à metastine. Les données générées dans cette première série d'expériences ont malheureusement confirmé que les anticorps anti-metastine disponibles dans le commerce sont aspécifiques. Ceci a constitué un inconvénient majeur pour nos études, qui devaient fortement s'appuyer sur l' étude neuroanatomique des neurones hypothalamiques à metastine pour évaluer leur sensibilité à la leptine exogène. Nous avons donc décidé de focaliser nos travaux sur une étude in vitro des mécanismes d'action de la kisspeptine pour moduler l'activité des neurones à GnRH. Nous avons utilisé deux lignées de cellules neuronales exprimant la GnRH pour étudier les mécanismes d'action cellulaires et moléculaires de la metastine dans des neurones. Nous avons ainsi pu démontrer que la kisspeptine induit une activation précoce de la voie f de signalisation de la MAP kinase dans les deux lignées cellulaires, alors que nous n'avons observé aucune activation de la voie de signalisation de la P13 Kinase et de la SAP/JNK. Nous avons en outre démontré une augmentation de l'expression de la GnRH par la stimulation avec la Kisspeptine. L'ensemble de ces données contribue à élucider le mécanisme d'action avec lequel la kisspeptine agit dans les neurones à GnRH, en démontrant un effet sur l'expression génique de la GnRH. Nous pouvons également conclure que la voie de la MAPK est la voie principale activée par la metastine dans les neurones exprimant la GnRH.

HARNESSING iNKT CELLS WITH RECOMBINANT CD1d FUSION PROTEINS TO REDIRECT INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY TO THE TUMOR

Les thérapies du cancer, comme la radiothérapie et la chimiothérapie, sont couramment utilisées mais ont de nombreux effets secondaires. Ces thérapies invasives pour le patient nécessitent d'être améliorées et de nombreuses avancées ont été faites afin d'adapter et de personnaliser le traitement du cancer. L'immunothérapie a pour but de renforcer le système immunitaire du patient et de le rediriger de manière spécifique contre la tumeur. Dans notre projet, nous activons les lymphocytes Invariant Natural Killer T (iNKT) afin de mettre en place une immunothérapie innovatrice contre le cancer. Les cellules iNKT sont une unique sous-population de lymphocytes T qui ont la particularité de réunir les propriétés de l'immunité innée ainsi qu'adaptative. En effet, les cellules iNKT expriment à leur surface des molécules présentes aussi sur les cellules tueuses NK, caractéristique de l'immunité innée, ainsi qu'un récepteur de cellules T (TCR) qui représente l'immunité adaptative. Les cellules iNKT reconnaissent avec leur TCR des antigènes présentés par la molécule CD1d. Les antigènes sont des protéines, des polysaccharides ou des lipides reconnus par les cellules du système immunitaire ou les anticorps pour engendrer une réponse immunitaire. Dans le cas des cellules iNKT, l'alpha-galactosylceramide (αGC) est un antigène lipidique fréquemment utilisé dans les études cliniques comme puissant activateur. Après l'activation des cellules iNKT avec l'αGC, celles-ci produisent abondamment et rapidement des cytokines. Ces cytokines sont des molécules agissant comme des signaux activateurs d'autres cellules du système immunitaire telles que les cellules NK et les lymphocytes T. Cependant, les cellules iNKT deviennent anergiques après un seul traitement avec l'αGC c'est à dire qu'elles ne peuvent plus être réactivées, ce qui limite leur utilisation dans l'immunothérapie du cancer. Dans notre groupe, Stirnemann et al ont publié une molécule recombinante innovante, composée de la molécule CD1d soluble et chargée avec le ligand αGC (αGC/sCD1d). Cette protéine est capable d'activer les cellules iNKT tout en évitant l'anergie. Dans le système immunitaire, les anticorps sont indispensables pour combattre une infection bactérienne ou virale. En effet, les anticorps ont la capacité de reconnaître et lier spécifiquement un antigène et permettent l'élimination de la cellule qui exprime cet antigène. Dans le domaine de l'immunothérapie, les anticorps sont utilisés afin de cibler des antigènes présentés seulement par la tumeur. Ce procédé permet de réduire efficacement les effets secondaires lors du traitement du cancer. Nous avons donc fusionné la protéine recombinante αGC/CD1d à un fragment d'anticorps qui reconnaît un antigène spécifique des cellules tumorales. Dans une étude préclinique, nous avons démontré que la protéine αGC/sCD1d avec un fragment d'anticorps dirigé contre la tumeur engendre une meilleure activation des cellules iNKT et entraîne un effet anti-tumeur prolongé. Cet effet anti-tumeur est augmenté comparé à une protéine αGC/CD1d qui ne cible pas la tumeur. Nous avons aussi montré que l'activation des cellules iNKT avec la protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur améliore l'effet anti- tumoral d'un vaccin pour le cancer. Lors d'expériences in vitro, la protéine αGC/sCD1d-anti- tumeur permet aussi d'activer les cellules humaines iNKT et ainsi tuer spécifiquement les cellules tumorales humaines. La protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur représente une alternative thérapeutique prometteuse dans l'immunothérapie du cancer. - Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT), dont les effets anti-tumoraux ont été démontrés, sont de puissants activateurs des cellules Natural Killer (NK), des cellules dendritiques (DC) et des lymphocytes T. Cependant, une seule injection du ligand de haute affinité alpha-galactosylceramide (αGC) n'induit une forte activation des cellules iNKT que durant une courte période. Celle-ci est alors suivie d'une longue phase d'anergie, limitant ainsi leur utilisation pour la thérapie. Comme alternative prometteuse, nous avons montré que des injections répétées d'αGC chargé sur une protéine recombinante de CD1d soluble (αGC/sCD1d) chez la souris entraînent une activation prolongée des cellules iNKT, associée à une production continue de cytokine. De plus, le maintien de la réactivité des cellules iNKT permet de prolonger l'activité anti-tumorale lorsque la protéine αGC/sCD1d est fusionnée à un fragment d'anticorps (scFv) dirigé contre la tumeur. L'inhibition de la croissance tumorale n'est optimale que lorsque les souris sont traitées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv ciblant la tumeur, la protéine αGC/sCD1d-scFv non-appropriée étant moins efficace. Dans le système humain, les protéines recombinantes αGC/sCD1d-anti-HER2 et anti-CEA sont capables d'activer et de faire proliférer des cellules iNKT à partir de PBMCs issues de donneurs sains. De plus, la protéine αGC/sCD1d-scFv a la capacité d'activer directement des clones iNKT humains en l'absence de cellules présentatrices d'antigènes (CPA), contrairement au ligand αGC libre. Mais surtout, la lyse des cellules tumorales par les iNKT humaines n'est obtenue que lorsqu'elles sont incubées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv anti- tumeur. En outre, la redirection de la cytotoxicité des cellules iNKT vers la tumeur est supérieure à celle obtenue avec une stimulation par des CPA chargées avec l'αGC. Afin d'augmenter les effets anti-tumoraux, nous avons exploité la capacité des cellules iNKT à activer l'immunité adaptive. Pour ce faire, nous avons combiné l'immunothérapie NKT/CD1d avec un vaccin anti-tumoral composé d'un peptide OVA. Des effets synergiques ont été obtenus lorsque les traitements avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 étaient associés avec le CpG ODN comme adjuvant pour la vaccination avec le peptide OVA. Ces effets ont été observés à travers l'activation de nombreux lymphocytes T CD8+ spécifique de la tumeur, ainsi que par la forte expansion des cellules NK. Les réponses, innée et adaptive, élevées après le traitement avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 combinée au vaccin OVA/CpG ODN étaient associées à un fort ralentissement de la croissance des tumeurs B16- OVA-HER2. Cet effet anti-tumoral corrèle avec l'enrichissement des lymphocytes T CD8+ spécifiques observé à la tumeur. Afin d'étendre l'application des protéines αGC/sCD1d et d'améliorer leur efficacité, nous avons développé des fusions CD1d alternatives. Premièrement, une protéine αGC/sCD1d dimérique, qui permet d'augmenter l'avidité de la molécule CD1d pour les cellules iNKT. Dans un deuxième temps, nous avons fusionné la protéine αGC/sCD1d avec un scFv dirigé contre le récepteur 3 du facteur de croissance pour l'endothélium vasculaire (VEGFR-3), afin de cibler l'environnement de la tumeur. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que la thérapie médiée par la protéine recombinante αGC/sCD1d-scFv est une approche prometteuse pour rediriger l'immunité innée et adaptive vers le site tumoral. - Invariant Natural Killer T cells (iNKT) are potent activators of Natural Killer (NK), dendritic cells (DC) and T lymphocytes, and their anti-tumor activities have been well demonstrated. However, a single injection of the high affinity CD1d ligand alpha-galactosylceramide (αGC) leads to a strong but short-lived iNKT cell activation followed by a phase of long-term anergy, limiting the therapeutic use of this ligand. As a promising alternative, we have demonstrated that when αGC is loaded on recombinant soluble CD1d molecules (αGC/sCD1d), repeated injections in mice led to the sustained iNKT cell activation associated with continued cytokine secretion. Importantly, the retained reactivity of iNKT cell led to prolonged antitumor activity when the αGC/sCD1d was fused to an anti-tumor scFv fragments. Optimal inhibition of tumor growth was obtained only when mice were treated with the tumor-targeted αGC/CD1d-scFv fusion, whereas the irrelevant αGC/CD1d-scFv fusion was less efficient. When tested in a human system, the recombinant αGC/sCD1d-anti-HER2 and -anti-CEA fusion proteins were able to expand iNKT cells from PBMCs of healthy donors. Furthermore, the αGC/sCD1d-scFv fusion had the capacity to directly activate human iNKT cells clones without the presence of antigen-presenting cells (APCs), in contrast to the free αGC ligand. Most importantly, tumor cell killing by human iNKT cells was obtained only when co- incubated with the tumor targeted sCD1d-antitumor scFv, and their direct tumor cytotoxicity was superior to the bystander killing obtained with αGC-loaded APCs stimulation. To further enhance the anti-tumor effects, we exploited the ability of iNKT cells to transactivate the adaptive immunity, by combining the NKT/CD1d immunotherapy with a peptide cancer vaccine. Interestingly, synergistic effects were obtained when the αGC/sCD1d- anti-HER2 fusion treatment was combined with CpG ODN as adjuvant for the OVA peptide vaccine, as seen by higher numbers of activated antigen-specific CD8 T cells and NK cells, as compared to each regimen alone. The increased innate and adaptive immune responses upon combined tumor targeted sCD1d-scFv treatment and OVA/CpG vaccine were associated with a strong delay in B16-OVA-HER2 melanoma tumor growth, which correlated with an enrichment of antigen-specific CD8 cells at the tumor site. In order to extend the application of the CD1d fusion, we designed alternative CD1d fusion proteins. First, a dimeric αGC/sCD1d-Fc fusion, which permits to augment the avidity of the CD1d for iNKT cells and second, an αGC/sCD1d fused to an anti vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) scFv, in order to target tumor stroma environment. Altogether, these results demonstrate that the iNKT-mediated immunotherapy via recombinant αGC/sCD1d-scFv fusion is a promising approach to redirect the innate and adaptive antitumor immune response to the tumor site.

Multiple paternity and its consequences in the white campion " Silene latifolia "

Summary Several studies have demonstrated that the number of pollen donors siring seeds of individual fruits is frequently greater than one and, consequently, that plants have multiple mates. Multiple paternity can have important consequences at the population level. It influences the genetic variability of a population, the reproductive success of males and the fitness of females and future generations. It also influences male-male interactions for fertilization and it is fundamental in providing opportunity of female choice. I investigated the occurrence and the importance of multiple paternity within fruits in natural populations of the dioecious Silene latifolia using microsatellite DNA markers, especially developed for this study. I found that multiple paternity occurs in all populations investigated in the European range of the species, varying from one to nine sires per fruit with a mean of three, suggesting that multiple paternity is highly prevalent in natural populations. In the presence of multiple paternity I investigated if there was a female genotype influence on siring success of the males. I used the same pollen mixture from two males and applied it to three replicate females of different relatedness (two full sisters and one unrelated). I found female genotype influence in one of the two populations investigated, which might reflect different population history. Since these results suggested some degree of female choice, we investigated whether the occurrence of multiple paternity and post-pollination selection could provide opportunity for inbreeding avoidance. First, I measured inbreeding depression at different life-cycle stages for offspring obtained by single-donor crosses with brothers or unrelated males replicated on distinct flowers on the same female plant. To address inbreeding avoidance, I determined paternity in crosses using mixed pollen loads of the two males. I found significant inbreeding depression in the studied population, even under benign experimental conditions, and although the unrelated male did not sire significantly more offspring, there was an effect of genetic dissimilarity on paternity. This suggests that paternity is affected by relatedness among mates, but maybe additionally affected by other factors such as pollen competitive ability or male-female interactions. Using inbred and outbred crosses, I further investigated sex ratio bias inheritance in this species, and found that sex ratio bias of the parental generation was significantly correlated to pollen germination success of the F2 generation, which suggests that sex ratio bias in this species results from the specific X/Y combination and not only on Y performance. An effect of X and Y is consistent with sex chromosome meiotic drive. In conclusion, I found multiple paternity to be widespread in the study species and that females of similar genotype produce similar paternity shares. I found that inbreeding depression is substantial, therefore receiving pollen from several donors might lead to fewer inbred offspring, I also found an effect of genetic dissimilarity on paternity shares, which indicates that there is some ability to discriminate against related pollen, although this seems not to be the only determinant of paternity outcome. Finally I found sex ratio bias to be dependent on both X and Y chromosomes as predicted by sex chromosome meiotic drive. Résumé Plusieurs études ont démontré qu'il n'était pas rare que les graines contenues dans un même fruit soient issues de la fécondation par plusieurs pollens provenant de mâles différents, ce qui sous-entend que les plantes peuvent avoir plusieurs partenaires sexuels. La paternité multiple peut avoir d'importantes conséquences au niveau populationnel dans la mesure où elle peut influencer le degré de variabilité génétique de la population, le succès reproducteur des mâles, la fitness des femelles et des futures générations. La paternité multiple peut également avoir un impact sur les interactions mâle-mâle lors de la fertilisation et peut être considérée comme fondamentale vis-à-vis de la femelle, qui y trouve alors une opportunité de choisir son ou ses partenaires. Dans le cadre de ce travail de thèse j'ai cherché à déterminer si la paternité multiple était un phénomène observable et important dans les populations naturelles de l'espèce dioïque, Silene latifolia. Pour ce faire, j'ai utilisé des marqueurs microsatellites, spécialement développés pour cette étude. J'ai observé des phénomènes de paternité multiple dans toutes les populations de l'étude, réparties dans l'aire de distribution européenne de l'espèce. Le nombre de pères par fruit varie de un à neuf, avec un nombre moyen de trois, ce qui signifie que la paternité multiple est très répandue dans les populations naturelles. En raison de ces résultats, je me suis demandée si le génotype de la femelle influence le succès de paternité des mâles. J'ai alors réalisé des pollinisations manuelles sur la base d'un mélange de pollens issus de deux mâles, que j'ai appliqué sur trois femelles (réplicats) présentant différents degrés d'apparentement (deux soeurs. et une femelle étrangère). Il ressort de cette expérience que le génotype de la femelle peut influencer la paternité dans l'une des deux populations étudiées, ce qui pourrait refléter des différences en terme d'histoire des populations. Dans la mesure où ces résultats suggèrent un certain degré de choix chez la femelle, j'ai cherché à savoir si la paternité multiple et la sélection post-pollinisation pouvaient être des moyens d'éviter les croisements consanguins. Dans un premier temps, j'ai évalué la dépression de consanguinité à différentes étapes du cycle de vie chez des descendants issus de croisements à un seul donneur, celui-ci étant alternativement un frère ou un étranger, répliqués sur plusieurs fleurs d'une même plante femelle. Afin d'estimer l'évitement de croisements consanguins, j'ai effectué des croisements dont le pollen était un mélange des deux mâles (frère et étranger), puis j'ai déterminé la paternité dans les fruits obtenus. J'ai pu mettre en évidence un effet de dépression de consanguinité- significatif dans les populations étudiées, même dans des conditions expérimentales moins rudes qu'à l'extérieur. Bien que le mâle étranger n'ait pas engendré un nombre significativement plus important de graines, il y avait un effet de dissimilarité génétique sur la paternité. Ceci suggère que la paternité est affectée par le degré d'apparentement entre les partenaires, mais qu'elle peut aussi être affectée par d'autres facteurs tels que la compétitivité du pollen ou encore par les interactions mâles-femelles. L'utilisation de croisements consanguins et hybrides m'a également permis d'étudier l'héritabilité du biais de sex ratio chez cette espèce. Il s'est avéré que le biais de sex ratio de la génération parentale était significativement corrélé au succès de germination du pollen de la génération F2, ce qui signifie que, chez cette espèce, le biais de sex ratio résulte d'une combinaison spécifique de X/Y et non uniquement de la performance de Y. Un effet de X et Y est compatible avec l'hypothèse de distorsion de ségrégation méiotique des chromosomes sexuels. En conclusion, il ressort de mes résultats que la paternité multiple est un phénomène largement répandu chez S. latifolia et la paternité accomplie par un mâle est plus similaire entre soeurs qu'avec une femelle étrangère J'ai également mis en évidence que la dépression de consanguinité a un impact considérable; aussi, recevoir du pollen de plusieurs donneurs différents pourrait permettre à la femelle de produire moins de descendants consanguins. J'ai aussi trouvé un effet de la dissimilarité génétique sur le partage de paternité, ce qui indique que la discrimination contre le pollen d'apparentés est possible, bien que cela ne semble pas être le seul facteur déterminant dans le résultat de la paternité. Enfin, j'ai trouvé que le biais de sex ratio est dépendant des deux chromosomes X et Y, conformément à la théorie de distorsion de ségrégation méiotique des chromosomes sexuels.

Politiques migratoires et cinéma. Entretien

Cet entretien apporte un éclairage sur une catégorie de films mal connus, réalisés dans le cadre de campagnes de prévention contre les dangers de la migration clandestine. Pour ce faire il interroge une représentante du bureau de coordination de l'Organisation Internationale pour les Migrations (OIM) et un employé de l'Office fédéral des migrations (ODM), afin de comprendre quels sont le contextes de production et de diffusions de tels films, et surtout comment ils déconstruisent les représentations dominantes de l'exil dans les pays concernés. L'utilisation par ces campagnes de prévention de productions filmiques indépendantes, dénonçant les réalités de la migration irrégulière à l'instar des "Martyrs du Golfe d'Aden" (Daniel Grandclément, 2007) ou de "Paris à tout prix" (Joséphine Ndagnou, 2007) est aussi questionnée.

Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow-derived mesenchymal stem cells

SUMMARY : Ewing's sarcoma is a member of Ewing's family tumors (ESPY) and the second most common solid bone and soft tissue malignancy of children and young adults. It is associated in 85% of cases with the t(11;22)(q24:q12) chromosomal translocation that generates fusion of the 5' segment of the EWSR1 gene with the 3' segment of the ETS family gene FLI-1. The EWSR1-FLI-1 fusion protein behaves as an aberrant transcriptional activator and is believed to contribute to ESFT development. However, EWSR1-FLI-1 induces growth arrest and apoptosis in normal fibroblasts, and primary cells that are pemissive for its putative oncogenic properties have not been discovered, hampering basic understanding of ESFT biology. Here, we show that EWSR1-FLI-1 alone can transform mouse primary bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and generate tumors that display hallmarks of Ewing's sarcoma, including a small round cell phenotype, expression of ESFT-associated markers, insulin like growth factor-I dependence, and induction or repression of numerous EWSR1-FLI-1 target genes. Consistent with this finding, we tested the possibility that human mesenchymal stem cells (hMSC) might also provide a permissive cellular environment for EWSR1-FLI-1, and could represent the first adequate primary human cellular background for the oncogenic properties of the fusion protein. Indeed, expression of EWSR1-FLI-1 in human mesenchymal stem cells (hMSC) was not only stably maintained without inhibiting proliferation, but induced a gene expression profile bearing striking similarity to that of ESFT, including genes that are among the highest ESFT discriminators. Expression of EWSR1-FLI-1 in hMSCs may recapitulate the initial steps of Ewing's sarcoma development, allowing identification of genes that play an important role early in its pathogenesis. Among relevant candidate transcripts induced by EWSR1-FL/-1 in hMSC we found the polycomb group gene EZH2 which we show to play a critical role in Ewing's sarcoma growth. These observations provide the first identification of candidate primary cells from which ESFTs originate and suggest that EWSR1-FLI-1 expression may constitute the initiating event in ESFT pathogenesis. Le sarcome d' Ewing est un membre de la famille des tumeurs Ewing (ESFT) et représente la deuxième tumeur maligne solide de l'os et des tissus mous chez les enfants et les jeunes adultes. Cette tumeur est associée dans 85% des cas avec la translocation chromosomique t(11;22)(g24:g12), qui génère la fusion entre le segment 5' du gène EWSR1 avec le segment 3' du gène FLI-1, appartenant à la famille des facteurs de transcription ETS. La protéine de fusion EWSR1-FLI-1 qui en dérive joue le rSle d'un facteur de transcription aberrant, et est supposée contribuer de manière décisive au processus de développement des ESFTs. Néanmoins, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des fibroblastes normaux induit un arrêt de croissance et leur apoptose, et les cellules primaires permissives pour les propriétés oncogéniques attribuées à la translocation n'ont pas encore été identifiées, empêchant la compréhension de la biologie de base du sarcome d'Ewing. Dans ce travail on montre que l'expression de EWSR1-FLI-1 uniquement est capable de transformer des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse de la souris, pour générer des tumeurs qui présentent les caractéristiques du sarcome d' Ewing humain, et notamment une morphologie de petites cellules bleues et rondes, l'expression de marqueurs associés aux ESFTs, une dépendance du facteur de croissance IGF-1, et l'induction ou la répression de nombreux gènes cibles connus de EWSR1-FLI-1. Sur la base de ces observations, on a testé la possibilité que les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) puissent aussi fournir un environnement cellulaire permissif pour EWSR1-FLI-1 ; et représenter le premier background cellulaire humain adéquat pour la manifestation du pouvoir oncogénique de la protéine de fusion. En effet, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des cellules souches mésenchymateuses humaines s'est révélée non seulement maintenue, mais elle a induit un profil d'expression génétique étonnamment similaire à celui des ESFTs humains, incluant les gènes qui ont été rapportés comme étant les plus discriminatifs pour ces tumeurs. L'expression de EWSR1-FLI-1 dans les hMSCs pourrait récapituler les étapes initiales du développement du sarcome d' Ewing, et de ce fait consentir à identifier les gènes qui jouent un rôle crucial dans sa pathogenèse précoce. Parmi les transcrits relevant indults par EWSR1-FL/-9 dans les hMSCs nous avons découvert le gène du groupe des polycomb EZH2, que nous avons par la suite démontré jouer un rôle essentiel dans la croissance du sarcome de Ewing. Ces observations apportent pour la première fois l'identification d'une cellule primaire candidate pour représenter la cellule d'origine des ESFTs, et en même temps suggèrent que l'expression de EWSR1-FLI-1 peut constituer l'événement initial dans la pathogenèse du sarcome d' Ewing.

Les thromboses veineuses mésentériques : facteurs associés à une évolution chronique et prévalence et importance clinique dans la Swiss Inflammatory Bowel Disease Cohort

Ce projet de thèse consiste en deux travaux sur le thème commun des thromboses veineuses mésentériques. Dans le premier travail, préliminaire au deuxième, nous avons décrit les signes d'évolution chronique des thromboses veineuses mésentériques. Les signes aigus sont bien connus et bien décrits (défaut de remplissage intra-luminal) contrairement aux signes chroniques dont la description manquait dans la littérature. Nous avons de plus cherché quels étaient les facteurs prédicateurs pour une évolution chronique. Pour se faire, nous avons sélectionné un collectif de patients avec un diagnostic de thromboses veineuses mésentériques aiguës et avons revu tous les scanners abdominaux en phase veineuse de ces patients à la recherche des signes d'évolution des thromboses. Cette étude a permis de mettre en évidence que les signes d'évolution chronique des thromboses veineuses mésentériques sont la sténose ou l'obstruction complète de la veine thrombosée et le développement d'un réseau de collatérales permettant de contourner la veine thrombosée. D'autre part, nous avons mis en évidence que la plupart des cas de thrombose veineuse mésentérique présente une évolution chronique, indépendamment de si le patient a reçu un traitement anticoagulant. Les thromboses étendues, situées dans des veines de petit calibre, auquel s'associe une infiltration de la graisse mésentérique au moment du diagnostic sont des facteurs favorisants pour une évolution chronique. La seconde étude a été réalisée grâce et avec la collaboration de la « Swiss Inflammatory Bowel Disease Cohort study » (SIBDCS). Les patients atteints de maladie inflammatoire chronique de l'intestin (MICI) présentent un risque augmenté de complications thromboemboliques, principalement de thrombose veineuse périphérique et d'embolie pulmonaire mais également de thrombose veineuse mésentérique. La littérature à ce sujet est pauvre et la prévalence de cette complication n'est pas connue dans cette population. Les buts de cette étude étaient donc d'évaluer la prévalence des thromboses veineuses mésentériques chez les patients atteints de MICI et de corréler leur survenue avec l'évolution clinique des patients. Parmi les patients inclus dans la SIBDCS, suivis au CHUV, nous avons revu tous les scanners abdominaux réalisés en phase veineuse à la recherche de signes (aigus ou chroniques) de thrombose veineuse mésentérique. Nous avons ainsi créé deux groupes de patients : les patients avec ou sans thrombose veineuse mésentérique. Ces deux collectifs ont ensuite été corrélés à la présence de signes radiologiques d'activité de la maladie inflammatoire de l'intestin et à la survenue aux complications liées à la MICI. Ainsi, nous avons mis en évidence que les thromboses veineuses mésentériques sont fréquentes chez les patients atteints de MICI, soit près de 30% chez les patients atteints de maladie de Crohn et 20% chez les patients atteints de RCUH. D'autre part, dans le groupe de patients atteints de maladie de Crohn, nous avons trouvé une association entre la survenue de thrombose veineuse mésentérique et une évolution de la maladie de Crohn plus sévère (plus de signes d'activité radiologique) et plus compliquée (plus de sténose et de nécessité de recours à la chirurgie). Ces deux articles ont été publiés dans l'American Journal of Roentgenology au mois de juillet 2014 dans la rubrique Gastrointestinal imaging.