多环芳烃胁迫下稻田土壤细菌及分支杆菌种群多样性研究

多环芳烃(PAHs)污染对土壤微生物群落特别是微生物功能群的影响一直备受关注。本文应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,从群落和功能群多样性两个角度,分析了PAHs胁迫条件下稻田土壤细菌遗传多样性及与PAHs降解有密切关系的分支杆菌种群多样性变化。结果表明,PAHs污染对稻田土壤细菌群落多样性指数无显著影响,但造成土壤细菌群落结构的改变,重度PAHs造成一些对污染敏感的细菌种类消失,而使一些与PAHs降解有关的细菌种类丰度增加。而对与多环芳烃降解有密切关系的分支杆菌而言,中度PAHs污染稻田土壤分支杆菌种群多样性指数较重度和轻度PAHs污染土壤的略高,不同PAHs污染程度稻田土壤的优势分支杆菌种类不尽相同,PAHs污染造成稻田土壤1种或几种分支杆菌得到富集。长期PAHs污染造成土壤细菌群落和分支杆菌种群结构的变化,将直接影响土壤生态系统功能的发挥,间接改变土壤质量。

高浓度CO_2对红松根际及根外土壤微生物群落结构的影响

采用DGGE(DenaturingGradientGelElectrophoresis)技术,于2003年的7~9月中旬对高浓度CO2(700和500μmo·lmol-1)处理下的红松幼苗根际和根外0~10cm土壤微生物群落结构进行了研究.结果表明,大气CO2浓度升高对红松根际和非根际土壤细菌群落结构产生了较大的影响,主要表现为部分细菌物种的出现,或原有细菌数量的丰富以及原有物种的消失或其数量被削弱的现象,但主要建群种未变.

含油废水处理工艺中细菌多样性

从辽河油田曙光污水处理厂含油废水样品中直接抽提细菌总DNA,并对总DNA中16SrRNAV3可变区序列作PCR扩增、变性梯度凝胶电泳(DGGE),与常规水质分析相结合对系统中不同处理阶段细菌种群多样性和水质之间的关系进行分析。结果表明,处理系统的不同处理阶段细菌的多样性有明显差异,既存在共同的细菌种属,也存在着各自独特的细菌种属,且细菌种群的多样性与水质CODcr和总石油烃(TPH)的浓度呈负相关,细菌种群的多样性越高,CODcr和TPH的浓度越低,反之则越高。在处理过程中,随着样品中细菌多样性的增加,种群结构之间的相似性指数(Cs)逐渐升高,最后形成了稳定的种群结构。

Profiling of Complex Microbial Populations by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Genes Coding for 16S rRNA

We describe a new molecular approach to analyzing the genetic diversity of complex microbial populations. This technique is based on the separation of polymerase chain reaction-amplified fragments of genes coding for 16S rRNA, all the same length, by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). DGGE analysis of different microbial communities demonstrated the presence of up to 10 distinguishable bands in the separation pattern, which were most likely derived from as many different species constituting these populations, and thereby generated a DGGE profile of the populations. We showed that it is possible to identify constituents which represent only 1% of the total population. With an oligonucleotide probe specific for the V3 region of 16S rRNA of sulfate-reducing bacteria, particular DNA fragments from some of the microbial populations could be identified by hybridization analysis. Analysis of the genomic DNA from a bacterial biofilm grown under aerobic conditions suggests that sulfate-reducing bacteria, despite their anaerobicity, were present in this environment. The results we obtained demonstrate that this technique will contribute to our understanding of the genetic diversity of uncharacterized microbial populations.

Soil microbial community analysis using denaturing gradient gel electrophoresis

The most biological diversity on this planet is probably harbored in soils. Understanding the diversity and function of the microbiological component of soil poses great challenges that are being overcome by the application of molecular biological approaches. This review covers one of many approaches being used: separation of polymerase chain reaction (PCR) amplicons using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Extraction of nucleic acids directly from soils allows the examination of a community without the limitation posed by cultivation. Polymerase chain reaction provides a means to increase the numbers of a target for its detection on gels. Using the rRNA genes as a target for PCR provides phylogenetic information on populations comprising communities. Fingerprints produced by this method have allowed spatial and temporal comparisons of soil communities within and between locations or among treatments. Numerous samples can be compared because of the rapid high throughput nature of this method. Scientists now have the means to begin addressing complex ecological questions about the spatial, temporal, and nutritional interactions faced by microbes in the soil environment.

杉木连栽土壤微生物多样性的比较研究

分析了位于湖南会同广坪镇1～4代人工杉木林根际土壤微生物数量变化情况,结果表明,随杉木连栽代数的增加,根际土壤中三大类群微生物数量发生显著变化,细菌和放线菌数量明显减少,真菌数量显著增加.利用PCR和DGGE技术分析了1～4代杉木林根际土壤细菌区系和真菌区系.结果表明,细菌生物多样性在不同连栽代数杉木根际土壤中变化不明显,各代杉木土壤之间细菌的遗传相似性为87%.而真菌随连栽代数的增加,DGGE图谱带逐渐减少,真菌生物多样性降低,各代杉木土壤之间真菌的遗传相似性也较低,仅为45%.对各代杉木土壤主要真菌类群的分析表明,随连栽代数的增加,病原真菌及产毒真菌增加显著.

树木外生菌根真菌多样性研究方法进展

树木外生菌根真菌在森林生态系统中发挥着重要的作用,其多样性研究能反映外生菌根真菌的种群结构。随着分子生物学技术在多样性研究中的应用,打破了传统方法诸如大多数微生物处于不可培养状态的局限性,提高了人们对外生菌根真菌群落结构的认识。本文主要介绍了几种外生菌根真菌多样性研究常用的方法,综述了它们在菌根研究中的应用状况,为森林生态系统生物多样性研究提供参考。

提取北方土壤真菌DNA的一种方法

由于土壤理化性质的复杂性和真菌细胞壁结构的特殊性,从土壤样品中提取真菌基因组DNA比较困难。中国北方土壤与其它地区土壤相比有其自身的特点,因此,有必要优化一种适合于北方土壤真菌DNA提取的方法。本实验向灭菌黑土中分别投加12种在系统分类上差别较大的真菌,以传统土壤总DNA提取方法及纯菌DNA提取方法为基础,分别与蜗牛酶,纤维素酶进行组合、优化,得到7种不同的土壤真菌基因组DNA提取方法。利用真菌28SrDNA通用引物U1/U2-GCPCR-DGGE分析方法分别考察了7种不同方法所提取土壤真菌基因组DNA的多样性和代表性。结果表明:1)液氮研磨,纤维素酶、蜗牛酶和溶菌酶(浓度分别为6、3和1mg.ml-1)37℃作用60min,2%SDS于65℃裂解30min;2)-65℃～65℃冻融3次,纤维素酶、蜗牛酶和溶菌酶(浓度分别为6、3和1mg.ml-1)37℃作用180min,2%SDS于65℃裂解30min的组合具有较好的提取效果。利用后一种方法分别对3种理化性质差异较大的中国北方自然土壤样品真菌DNA进行提取并分析,表明所提取土壤基因组DNA真菌特异性PCR-DGGE图谱条带丰富,该方法可用于多种北方土壤真菌多样性研究。

土壤抑真菌作用与细菌群落结构的关系

自然清洁土壤所具有的抑真菌作用,是健康土壤的一种自然属性,也是土壤质量的重要指标之一,对控制农作物土传病原真菌的爆发具有积极的生态学意义.本试验以中国科学院沈阳生态实验站近10年未受农药和肥料影响的撂荒地土壤作为自然清洁土壤样品,通过高温(对照、100℃、110℃、121℃)处理得到具有不同抑真菌作用的土壤模型,采用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)方法对上述土壤样品的细菌群落结构进行分析.结果表明:土壤抑真菌作用与土壤细菌群落结构紧密相关;对照清洁土壤抑真菌作用最强,处理后土壤细菌群落结构偏离自然清洁土壤愈远,土壤抑真菌能力愈差;DGGE特异性条带切胶测序结果表明,Sphingomonas asaccharolytica、Nitrospira sp.、Hyphomicrobiaceae sp.、Bacillus megaterium和Micro-coccus sp.可能与土壤抑真菌作用密切相关.

乙草胺、甲胺磷及其复合对土壤真菌种群的毒性效应

农药的施用会对土壤非靶向微生物的数量、种群结构产生影响,目前关于这方面的研究主要集中在土壤细菌,而真菌的较少。以从中科院海伦生态站采集的农田黑土作为实验土壤,采用室内模拟和PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)的方法,考察北方常用的除草剂乙草胺和杀虫剂甲胺磷对真菌多样性和种群结构的影响。设定对照,乙草胺3个浓度单独处理(50、150、250mg·kg-1),甲胺磷3个浓度单独处理(50、150、250mg·kg-1)和它们复合的9个处理,共16个处理。结果表明,乙草胺单独作用时,增加了土壤真菌的多样性,并且对真菌多样性和种群结构的影响在第1周尤为显著,处理8周后呈恢复的趋势。甲胺磷单独作用时对土壤真菌多样性起抑制作用,使真菌种群结构发生了改变,随着培养时间的延长,其对真菌影响也逐渐减弱,真菌种群多样性和结构在处理8周后可部分恢复。乙草胺与甲胺磷相复合时,土壤真菌多样性的变化因两种农药浓度组合的不同而不同。在培养初期多数复合处理降低了土壤真菌的多样性,至末期时多数处理可增加真菌的多样性。对种群结构的影响在第1周时,中、高浓度甲胺磷与乙草胺的复合以甲胺磷为主导因子,第8周时乙草胺与低、中浓度甲胺磷复合时起到主导作用,经8周培养后,各复合处理土壤真菌种群结构并未恢复到对照水平,复合处理比单因子的生态效应要强,作用方式更复杂。

乙草胺和甲胺磷对农田黑土可培养真菌数量及种群结构的影响

应用传统及PCRDGGE方法(denaturinggradientgelelectrophoresis),分别对不同浓度乙草胺、甲胺磷胁迫下黑土中可培养真菌CFU(colonyformingunits)、种群丰富度(richness)及种群结构动态变化规律进行了研究.结果表明,在实验室微域条件下,乙草胺对黑土可培养真菌CFU的影响随处理浓度的增加而抑制作用增强,表现出由低浓度(50mg·kg-1)时的刺激生长到高浓度(250mg·kg-1)时的长期抑制效应;250mg·kg-1甲胺磷在8周处理过程中对土壤可培养真菌生长具有显著的刺激效应,使可培养真菌CFU比对照增加10倍,但50和150mg·kg-1甲胺磷处理对土壤可培养真菌CFU无显著影响.种群丰富度系数分析结果表明,高、中浓度乙草胺处理可使土壤可培养真菌种群丰富度不可逆地降低.土壤真菌rDNA特异PCRDGGE聚类分析结果表明,不同浓度乙草胺、甲胺磷处理均不同程度地对土壤可培养真菌的种群组成和结构造成影响,其中甲胺磷尤为显著.

乙草胺胁迫对土壤真菌拮抗功能和假单胞菌以及芽胞杆菌群落结构的影响

真菌拮抗功能是自然健康土壤对病原真菌所具有的免疫能力,这种能力与土壤中许多可分泌拮抗物质的细菌有关,而假单胞菌和芽胞杆菌是目前研究最多的具拮抗功能的种群。乙草胺是北方使用量最大的除草剂,目前它的施用对土壤真菌拮抗能力的影响还未见报道。本文通过室内模拟培养,考察不同浓度乙草胺(0、50、150、250mg·kg-1土)对土壤真菌拮抗能力的影响,并运用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)方法研究真菌拮抗功能逐渐下降的土壤样品中假单胞菌和芽胞杆菌群落结构变化情况。结果表明,在实验室微宇宙条件下,乙草胺的施用会降低土壤真菌拮抗能力,在处理第12d时可以得到土壤真菌拮抗功能差异显著的土壤样品。土壤芽胞杆菌多样性随乙草胺浓度的升高而下降,而假单胞菌多样性变化不大。乙草胺胁迫下芽胞杆菌和假单胞菌群落结构都发生明显改变,尤其是芽胞杆菌(处理土壤样品与对照的群落结构相似性为0.60),且施加浓度越高,群落结构组成偏离自然土壤越远。真菌拮抗能力的降低与假单胞菌和芽胞杆菌多样性和结构的改变相关。

油松阔叶混交林不同层次优势植被根区土壤真菌的群落结构

采用真菌的28SrDNA的特异性引物对千山油松阔叶混交林中乔木层、灌木层和草本层优势植被根区土壤中提取的真菌总DNA进行PCR扩增,并通过DGGE技术对PCR产物进行分析,结果表明:乔木层针叶树(油松、红松)根区土壤真菌的多样性最低,草本层植被根区土壤真菌的多样性最高。乔木层阔叶树根区土壤真菌群落结构与灌木层相似,草本层与二者差异较大。

油污土壤生物修复高效菌筛选鉴定

针对油污土壤生物修复技术特点,从不同污染程度土壤中分离和鉴定高效石油降解菌,并结合DGGE技术分析油污土壤中微生物种群动态,最终提出生物修复剂的配制方案.结果表明:石油污染土壤中存在主要的优势细菌包括微球菌属、节细菌属、芽孢杆菌属、产碱菌属、醋酸细菌属和黄杆菌属;优势真菌主要有黑曲霉、杂色曲霉、产黄青霉、常现青霉、绿色木霉、粉红头孢霉、出芽短梗霉和镰刀菌属;放线菌主要为链霉菌属.真菌菌株的降解活性高于细菌和放线菌,石油污染土壤的生物修复中真菌起着主要的降解作用.土壤性质影响微生物的生长,适量石油烃促进优势菌生长,过多石油烃则对优势菌有抑制作用.黑曲霉菌和镰刀菌适于轻度和中度油污土壤修复,出芽短梗霉适于重度油污土壤修复.油污土壤生物修复剂应包括石油降解优势菌剂、生物营养素、生物表面活性剂和土壤活化剂.

Particle-attached and free-living bacterial communities in a contrasting marine environment: Victoria Harbor, Hong Kong

Diversity of particle-attached and free-living marine bacteria in Victoria Harbor, Hong Kong, and its adjacent coastal and estuarial environments was investigated using DNA fingerprinting and clone library analysis. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of 16S rRNA genes showed that bacterial communities in three stations of Victoria Harbor were similar, but differed from those in adjacent coastal and estuarine stations. Particle-attached and free-living bacterial community composition differed in the Victoria Harbor area. DNA sequencing of 28 bands from DGGE gel showed Alphaproteobacteria was the most abundant group, followed by the Bacteroidetes, and other Proteobacteria. Bacterial species richness (number of DGGE bands) differed among stations and populations (particle-attached and free-living; bottom and surface). BIOENV analysis indicated that the concentrations of suspended solids were the major contributing parameter for the spatial variation of total bacterial community structure. Samples from representative stations were selected for clone library (548 clones) construction and their phylogenetic distributions were similar to those of sequences from DGGE. Approximately 80% of clones were affiliated to Proteobacteria, Bacteroidetes and Cyanobacteria. The possible influences of dynamic pollution and hydrological conditions in the Victoria Harbor area on the particle-attached and free-living bacterial community structures were discussed.