Valutazione del ruolo dell'espressione di IRS-1 nel differenziamento osteoblastico di cellule di osteosarcoma ed MSCs

L’osteosarcoma (OS) è il tumore primitivo dell’osso più comune in età pediatrica e adolescenziale. L’OS è stato recentemente riconsiderato come una patologia da de-differenziamento, legata all’interruzione del processo cui vanno incontro i precursori osteoblastici, quali le cellule staminali mesenchimali (MSCs), per trasformarsi in osteoblasti maturi. Il sistema IGF è coinvolto nella regolazione della proliferazione e del differenziamento di cellule di OS. IRS-1 è un mediatore critico di tale via di segnalazione e il suo livello di espressione modula il differenziamento di cellule ematopoietiche. Lo scopo di questa tesi è stato quello di definire il ruolo di IRS-1 nel differenziamento osteoblastico di MSCs e cellule di OS. Il potenziale differenziativo di cellule di OS umano e murino e di MSCs derivate da midollo osseo è stato valutato tramite Alizarin Red staining e Real Time-PCR. Dai dati ottenuti è emerso come i livelli di espressione di IRS-1 diminuiscano durante il differenziamento osteoblastico. Conseguentemente, i livelli di espressione di IRS-1 sono stati manipolati utilizzando shRNA per down-regolare l’espressione della proteina o un plasmide per sovra-esprimerla. Sia la down-regolazione sia la sovra-espressione di IRS-1 hanno inibito il differenziamento osteoblastico delle linee cellulari considerate. Allo scopo di valutare il contributo di IRS-1 nella via di segnalazione di IGF-1R è stato utilizzato l’inibitore di tale recettore, αIR-3. Anche in questo caso è stata osservata una riduzione della capacità differenziativa. L’inibitore del proteasoma MG-132 ha portato ad un aumento dei livelli di IRS-1, portando nuovamente all’inibizione del differenziamento osteoblastico e suggerendo che l’ubiquitinazione di questa proteina potrebbe avere un ruolo importante nel mantenimento di appropriati livelli di espressione di IRS-1. I risultati ottenuti indicano la criticità dei livelli di espressione di IRS-1 nella determinazione della capacità differenziativa sia di cellule di OS umano e murino, sia delle MSCs.

Genexpressionsanalyse der fötalen Wachstumsfuge des Rindes

Erkrankungen des Skelettapparats wie beispielsweise die Osteoporose oder Arthrose gehören neben den Herz-Kreislauferkrankungen und Tumoren zu den Häufigsten Erkrankungen des Menschen. Ein besseres Verständnis der Bildung und des Erhalts von Knochen- oder Knorpelgewebe ist deshalb von besonderer Bedeutung. Viele bisherige Ansätze zur Identifizierung hierfür relevanter Gene, deren Produkte und Interaktionen beruhen auf der Untersuchung pathologischer Situationen. Daher ist die Funktion vieler Gene nur im Zusammenhang mit Krankheiten beschrieben. Untersuchungen, die die Genaktivität bei der Normalentwicklung von knochen- und knorpelbildenden Geweben zum Ziel haben, sind dagegen weit weniger oft durchgeführt worden. rnEines der entwicklungsphysiologisch interessantesten Gewebe ist die Epiphysenfuge der Röhrenknochen. In dieser sogenannten Wachstumsfuge ist insbesondere beim fötalen Gewebe eine sehr hohe Aktivität derjenigen Gene zu erwarten, die an der Knochen- und Knorpelbildung beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde daher aus der Epiphysenfuge von Kälberknochen RNA isoliert und eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Von dieser wurden ca. 4000 Klone im Rahmen eines klassischen EST-Projekts sequenziert. Durch die Analyse konnte ein ungefähr 900 Gene umfassendes Expressionsprofil erstellt werden und viele Transkripte für Komponenten der regulatorischen und strukturbildenden Bestandteile der Knochen- und Knorpelentwicklung identifiziert werden. Neben den typischen Genen für Komponenten der Knochenentwicklung sind auch deutlich Bestandteile für embryonale Entwicklungsprozesse vertreten. Zu ersten gehören in erster Linie die Kollagene, allen voran Kollagen II alpha 1, das mit Abstand höchst exprimierte Gen in der fötalen Wachstumsfuge. Nach den ribosomalen Proteinen stellen die Kollagene mit ca. 10 % aller auswertbaren Sequenzen die zweitgrößte Gengruppe im erstellten Expressionsprofil dar. Proteoglykane und andere niedrig exprimierte regulatorische Elemente, wie Transkriptionsfaktoren, konnten im EST-Projekt aufgrund der geringen Abdeckung nur in sehr geringer Kopienzahl gefunden werden. Allerdings förderte die EST-Analyse mehrere interessante, bisher nicht bekannte Transkripte zutage, die detaillierter untersucht wurden. Dazu gehören Transkripte die, die dem LOC618319 zugeordnet werden konnten. Neben den bisher beschriebenen drei Exonbereichen konnte ein weiteres Exon im 3‘-UTR identifiziert werden. Im abgeleiteten Protein, das mindestens 121 AS lang ist, wurden ein Signalpeptid und eine Transmembrandomäne nachgewiesen. In Verbindung mit einer möglichen Glykosylierung ist das Genprodukt in die Gruppe der Proteoglykane einzuordnen. Leicht abweichend von den typischen Strukturen knochen- und knorpelspezifischer Proteoglykane ist eine mögliche Funktion dieses Genprodukts bei der Interaktion mit Integrinen und der Zell-Zellinteraktion, aber auch bei der Signaltransduktion denkbar. rnDie EST-Sequenzierungen von ca. 4000 cDNA-Klonen können aber in der Regel nur einen Bruchteil der möglichen Transkripte des untersuchten Gewebes abdecken. Mit den neuen Sequenziertechnologien des „Next Generation Sequencing“ bestehen völlig neue Möglichkeiten, komplette Transkriptome mit sehr hoher Abdeckung zu sequenzieren und zu analysieren. Zur Unterstützung der EST-Daten und zur deutlichen Verbreiterung der Datenbasis wurde das Transkriptom der bovinen fötalen Wachstumsfuge sowohl mit Hilfe der Roche-454/FLX- als auch der Illumina-Solexa-Technologie sequenziert. Bei der Auswertung der ca. 40000 454- und 75 Millionen Illumina-Sequenzen wurden Verfahren zur allgemeinen Handhabung, der Qualitätskontrolle, dem „Clustern“, der Annotation und quantitativen Auswertung von großen Mengen an Sequenzdaten etabliert. Beim Vergleich der Hochdurchsatz Blast-Analysen im klassischen „Read-Count“-Ansatz mit dem erstellten EST-Expressionsprofil konnten gute Überstimmungen gezeigt werden. Abweichungen zwischen den einzelnen Methoden konnten nicht in allen Fällen methodisch erklärt werden. In einigen Fällen sind Korrelationen zwischen Transkriptlänge und „Read“-Verteilung zu erkennen. Obwohl schon simple Methoden wie die Normierung auf RPKM („reads per kilo base transkript per million mappable reads“) eine Verbesserung der Interpretation ermöglichen, konnten messtechnisch durch die Art der Sequenzierung bedingte systematische Fehler nicht immer ausgeräumt werden. Besonders wichtig ist daher die geeignete Normalisierung der Daten beim Vergleich verschieden generierter Datensätze. rnDie hier diskutierten Ergebnisse aus den verschiedenen Analysen zeigen die neuen Sequenziertechnologien als gute Ergänzung und potentiellen Ersatz für etablierte Methoden zur Genexpressionsanalyse.rn

Genexpressionsanalyse boviner mesenchymaler Stammzellen und deren in-vitro-differenzierten Folgelinien

Mesenchymale Stamzellen (MSC) sind Vertreter der adulten Stammzellen. Sie bergen durch ihre große Plastizität ein immenses Potential für die klinische Nutzung in Form von Stammzelltherapien. Zellen dieses Typs kommen vornehmlich im Knochenmark der großen Röhrenknochen vor und können zu Knochen, Knorpel und Fettzellen differenzieren. MSC leisten einen wichtigen Beitrag im Rahmen regenerativer Prozesse, beispielsweise zur Heilung von Frakturen. Breite Studien demonstrieren bereits jetzt auch bei komplexeren Erkrankungen (z.B. Osteoporose) therapeutisch vielversprechende Einsatzmöglichkeiten. Oft kommen hierbei aus MSC gezielt differenzierte Folgelinien aus Zellkulturen zum Einsatz. Dies bedingt eine kontrollierte Steuerung der Differenzierungsprozesse in vitro. Der Differenzierung einer Stammzelle liegt eine komplexe Veränderung ihrer Genexpression zugrunde. Genexpressionsmuster zur Erhaltung und Proliferation der Stammzellen müssen durch solche, die der linienspezifischen Differenzierung dienen, ersetzt werden. Die mit der Differenzierung einhergehende, transkriptomische Neuausrichtung ist für das Verständnis der Prozesse grundlegend und wurde bislang nur unzureichend untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine transkriptomweite und vergleichende Genexpressionsanalyse Mesenchymaler Stammzellen und deren in vitro differenzierten Folgelinien mittels Plasmid - DNA Microarrays und Sequenziertechniken der nächsten Generation (RNA-Seq, Illumina Plattform). In dieser Arbeit diente das Hausrind (Bos taurus) als Modellorganismus, da es genetisch betrachtet eine hohe Ähnlichkeit zum Menschen aufweist und Knochenmark als Quelle von MSC gut verfügbar ist. Primärkulturen Mesenchymaler Stammzellen konnten aus dem Knochenmark von Rindern erfolgreich isoliert werden. Es wurden in vitro Zellkultur - Versuche durchgeführt, um die Zellen zu Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zu differenzieren. Zur Genexpressionsanalyse wurde RNA aus jungen MSC und einer MSC Langzeitkultur („alte MSC“), sowie aus den differenzierten Zelllinien isoliert und für nachfolgende Experimente wo nötig amplifiziert. Der Erfolg der Differenzierungen konnte anhand der Genexpression von spezifischen Markergenen und mittels histologischer Färbungen belegt werden. Hierbei zeigte sich die Differenzierung zu Osteoblasten und Adipozyten erfolgreich, während die Differenzierung zu Chondrozyten trotz diverser Modifikationen am Protokoll nicht erfolgreich durchgeführt werden konnte. Eine vergleichende Hybridisierung zur Bestimmung differentieller Genexpression (MSC vs. Differenzierung) mittels selbst hergestellter Plasmid - DNA Microarrays ergab für die Osteogenese mit Genen wie destrin und enpp1, für die undifferenzierten MSC mit dem Gen sema3c neue Kandidatengene, deren biologische Funktion aufzuklären in zukünftigen Experimenten vielversprechende Ergebnisse liefern sollte. Die Analyse der transkriptomweiten Genexpression mittels NGS lieferte einen noch umfangreicheren Einblick ins Differenzierungsgeschehen. Es zeigte sich eine hohe Ähnlichkeit im Expressionsprofil von jungen MSC und Adipozyten, sowie zwischen den Profilen der alten MSC (eine Langzeitkultur) und Osteoblasten. Die alten MSC wiesen deutliche Anzeichen für eine spontane Differenzierung in die osteogene Richtung auf. Durch Analyse der 100 am stärksten exprimierten Gene jeder Zelllinie ließen sich für junge MSC und Adipozyten besonders Gene der extrazellulären Matrix (z.B col1a1,6 ; fn1 uvm.) auffinden. Sowohl Osteoblasten, als auch die alten MSC exprimieren hingegen verstärkt Gene mit Bezug zur oxidativen Phosphorylierung, sowie ribosomale Proteine. Eine Betrachtung der differentiellen Genexpression (junge MSC vs. Differenzierung) mit anschließender Pathway Analyse und Genontologie Anreicherungsstatistik unterstützt diese Ergebnisse vor allem bei Osteoblasten, wo nun jedoch zusätzlich auch Gene zur Regulation der Knochenentwicklung und Mineralisierung in den Vordergrund treten. Für Adipozyten konnte mit Genen des „Jak-STAT signaling pathway“, der Fokalen Adhäsion, sowie Genen des „Cytokine-cytokine receptor interaction pathway“ sehr spannende Einsichten in die Biologie dieses Zelltyps erlangt werden, die sicher weiterer Untersuchungen bedürfen. In undifferenzierten MSC konnte durch differentielle Genexpressionsanalyse die Rolle des nicht kanonischen Teils des WNT Signalweges als für die Aufrechterhaltung des Stammzellstatus potentiell äußerst einflussreich ermittelt werden. Die hier diskutierten Ergebnisse zeigen beispielhaft, dass besonders mittels Genexpressionsanalyse im Hochdurchsatzverfahren wertvolle Einblicke in die komplexe Biologie der Stammzelldifferenzierung möglich sind. Als Grundlage für nachfolgende Arbeiten konnten interessante Gene ermittelt und Hypothesen zu deren Einfluss auf Stammzelleigenschaften und Differenzierungsprozesse aufgestellt werden. Um einen besseren Einblick in den Differenzierungsverlauf zu ermöglichen, könnten künftig NGS Analysen zu unterschiedlichen Differenzierungszeitpunkten durchgeführt werden. Zudem wären weitere Anstrengungen zur erfolgreichen Etablierung der chondrogenen Differenzierung zur vollständigen Analyse der Genexpression des trilinearen Differenzierungspotentials von MSC wünschenswert.

Arachnomelia in Brown Swiss cattle maps to chromosome 5

Arachnomelia in Brown Swiss cattle is a monogenic autosomal recessive inherited congenital disorder of the skeletal system giving affected calves a spidery look (OMIA ID 000059). Over a period of 20 years 15 cases were sampled in the Swiss and Italian Brown cattle population. Pedigree data revealed that all affected individuals trace back to a single acknowledged carrier founder sire. A genome scan using 240 microsatellites spanning the 29 bovine autosomes showed homozygosity at three adjacent microsatellite markers on bovine Chr 5 in all cases. Linkage analysis confirmed the localization of the arachnomelia mutation in the region of the marker ETH10. Fine-mapping and haplotype analysis using a total of 34 markers in this region refined the critical region of the arachnomelia locus to a 7.19-Mb interval on bovine Chr 5. The disease-associated IBD haplotype was shared by 36 proven carrier animals and allows marker-assisted selection. As the corresponding human and mouse chromosome segments do not contain any clear functional candidate genes for this disorder, the mutation causing arachnomelia in the Brown Swiss cattle might help to identify an unknown gene in bone development.

Ribozyme-mediated reduction of wild-type and mutant cartilage oligomeric matrix protein (COMP) mRNA and protein.

Dominant-negative mutations in the homopentameric extracellular matrix glycoprotein cartilage oligomeric matrix protein (COMP) result in inappropriate intracellular retention of misfolded COMP in the rough endoplasmic reticulum of chondrocytes, causing chondrocyte cell death, which leads to two skeletal dysplasias: pseudoachondroplasia (PSACH) and multiple epiphyseal dysplasia (EDM1). COMP null mice show no adverse effects on normal bone development and growth, suggesting a possible therapy involving removal of COMP mRNA. The goal of this study was to assess the ability of a hammerhead ribozyme (Ribo56, designed against the D469del mutation) to reduce COMP mRNA expression. In COS7 cells transfected with plasmids that overexpress wild-type or mutant COMP mRNA and Ribo56, the ribozyme reduced overexpressed normal COMP mRNA by 46% and mutant COMP mRNA by 56% in a dose-dependent manner. Surprisingly, the use of recombinant adenoviruses to deliver wild-type or mutant COMP mRNA and Ribo56 simultaneously into COS7 cells proved problematic for the activity of the ribozyme to reduce COMP expression. However, in normal human costochondral cells (hCCCs) infected only with adenoviruses expressing Ribo56, expression of endogenous wild-type COMP mRNA was reduced in a dose-dependent manner by 50%. In chondrocytes that contain heterozygous COMP mutations (D469del, G427E and D511Y) that cause PSACH, Ribo56 was more effective at reducing COMP mRNA (up to 70%). These results indicate that Ribo56 is effective at reducing mutant and wild-type COMP levels in cells and suggests a possible mode of therapy to reduce the mutant protein load.

Deletion in the EVC2 gene causes chondrodysplastic dwarfism in Tyrolean Grey cattle.

During the summer of 2013 seven Italian Tyrolean Grey calves were born with abnormally short limbs. Detailed clinical and pathological examination revealed similarities to chondrodysplastic dwarfism. Pedigree analysis showed a common founder, assuming autosomal monogenic recessive transmission of the defective allele. A positional cloning approach combining genome wide association and homozygosity mapping identified a single 1.6 Mb genomic region on BTA 6 that was associated with the disease. Whole genome re-sequencing of an affected calf revealed a single candidate causal mutation in the Ellis van Creveld syndrome 2 (EVC2) gene. This gene is known to be associated with chondrodysplastic dwarfism in Japanese Brown cattle, and dwarfism, abnormal nails and teeth, and dysostosis in humans with Ellis-van Creveld syndrome. Sanger sequencing confirmed the presence of a 2 bp deletion in exon 19 (c.2993_2994ACdel) that led to a premature stop codon in the coding sequence of bovine EVC2, and was concordant with the recessive pattern of inheritance in affected and carrier animals. This loss of function mutation confirms the important role of EVC2 in bone development. Genetic testing can now be used to eliminate this form of chondrodysplastic dwarfism from Tyrolean Grey cattle.

Alteration of ZnT5-mediated zinc import into the early secretory pathway affects the secretion of growth hormone from rat pituitary cells

BACKGROUND Aggregation of growth hormone (GH) required for its proper storage in granules is facilitated by zinc (Zn(2+)) transported by specific zinc transporters in and out of the regulated secretory pathway. Slc30a5 (ZnT5) was reported to have the highest gene expression among all zinc transporters in primary mouse pituitary cells while ZnT5-null mice presented with abnormal bone development and impaired growth compared to wild-type counterparts. METHODS In vitro studies performed in GH3 cells, a rat pituitary cell line that endogenously produces rat GH (rGH), included analysis of: cytoplasmic Zn(2+) pool changes after altering rSlc30a5 expression (luciferase assay), rZnT5 association with different compartments of the regulated secretory pathway (confocal microscopy), and the rGH secretion after rSlc30a5 knock-down (Western blot). RESULTS Confocal microscopy demonstrated high co-localization of rZnT5 with ER and Golgi (early secretory pathway) while siRNA-mediated knock-down of rSlc30a5 gene expression led to a significant reduction in rGH secretion. Furthermore, altered expression of rSlc30a5 (knock-down/overexpression) evoked changes in the cytoplasmic Zn(2+) pool indicating its important role in mediating Zn(2+) influx into intracellular compartments of the regulated secretory pathway. CONCLUSION Taken together, these results suggest that ZnT5 might play an important role in regulated GH secretion that is much greater than previously anticipated.

Studies of pseudoachondroplasia chondrocytes and knockdown of the cartilage oligomeric matrix protein

Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) is a large, homopentameric, extracellular matrix glycoprotein. Mutations in COMP cause two skeletal dysplasias: pseudoachondroplasia (PSACH) and multiple epiphyseal dysplasia (EMD1). These dwarfing conditions are caused by retention of misfolded mutant COMP with type IX collagen and matrilin-3 (MATN3) in the rough endoplasmic reticulum (rER) of the chondrocyte. These proteins form a matrix in the rER that continues to expand until it fills the entire cell, eventually causing cell death. Interestingly, loss of COMP in COMP null mice does not affect normal bone development or growth, suggesting that elimination of COMP (wildtype and mutant) expression may prevent PSACH. The hypothesis of these studies was that a hammerhead ribozyme could eliminate or knockdown COMP mRNA expression in PSACH chondrocytes . To test this hypothesis, a human chondrocyte model system that recapitulates the PSACH chondrocyte phenotype was developed by over-expressing mutant (mt-) COMP in normal chondrocytes using a recombinant adenovirus. Chondrocytes over-expressing mt-COMP developed giant rER cisternae containing COMP, type IX collagen and MATN3. Deconvolution microscopy and computer modeling showed that these proteins formed an ordered matrix surrounding a type II pro-collagen core. Additionally, the results show that a hammerhead ribozyme, ribozyme 56 (Ribo56) reduced over-expressed mt-COMP in COS cells and endogenous COMP in normal chondrocytes and mt-COMP in three PSACH chondrocytes cell line (with different mutations) by 40-70%. Altogether, these studies show that the PSACH cellular phenotype can be created in vitro and that the mt-COMP protein burden can be reduced by the presence of a COMP-specific ribozyme. Future studies will focus on designing ribozymes or short interfering RNA (siRNA) technologies that will result in better knockdown of COMP expression as well as the temporal constraints imposed by the PSACH phenotype. ^

Phosphate is a specific signal for induction of osteopontin gene expression

Osteopontin is a phosphorylated glycoprotein secreted to the mineralizing extracellular matrix by osteoblasts during bone development. It is believed to facilitate the attachment of osteoblasts and osteoclasts to the extracellular matrix, allowing them to perform their respective functions during osteogenesis. Several other functions have been suggested for this protein, and its up-regulation is associated with various disease states related to calcification, including arterial plaque formation and the formation of kidney stones. Although expression of this gene has been demonstrated in multiple tissues, its regulation is not well understood. Our previous studies on the roles of the retinoblastoma protein (pRB) and p300/CBP in the regulation of osteoblast differentiation revealed a link between osteopontin induction and the synthesis of alkaline phosphatase. In this paper, we describe results specifically linking induction of osteopontin to the enzymatic activity of alkaline phosphatase in the medium, which results in the generation of free phosphate. This elevation of free phosphate in the medium is sufficient to signal induction of osteopontin RNA and protein. The strong and specific induction of osteopontin in direct response to increased phosphate levels provides a mechanism to explain how expression of this product is normally regulated in bone and suggests how it may become up-regulated in damaged tissue.

Mice with a targeted mutation in the thyroid hormone β receptor gene exhibit impaired growth and resistance to thyroid hormone

Patients with mutations in the thyroid hormone receptor β (TRβ) gene manifest resistance to thyroid hormone (RTH), resulting in a constellation of variable phenotypic abnormalities. To understand the molecular basis underlying the action of mutant TRβ in vivo, we generated mice with a targeted mutation in the TRβ gene (TRβPV; PV, mutant thyroid hormone receptor kindred PV) by using homologous recombination and the Cre/loxP system. Mice expressing a single PVallele showed the typical abnormalities of thyroid function found in heterozygous humans with RTH. Homozygous PV mice exhibit severe dysfunction of the pituitary–thyroid axis, impaired weight gains, and abnormal bone development. This phenotype is distinct from that seen in mice with a null mutation in the TRβ gene. Importantly, we identified abnormal expression patterns of several genes in tissues of TRβPV mice, demonstrating the interference of the mutant TR with the gene regulatory functions of the wild-type TR in vivo. These results show that the actions of mutant and wild-type TRβ in vivo are distinct. This model allows further study of the molecular action of mutant TR in vivo, which could lead to better treatment for RTH patients.

Identification of two novel transmembrane γ-carboxyglutamic acid proteins expressed broadly in fetal and adult tissues

The proline-rich γ-carboxyglutamic acid (Gla) proteins (PRGPs) 1 and 2 are the founding members of a family of vitamin K-dependent single-pass integral membrane proteins characterized by an extracellular amino terminal domain of approximately 45 amino acids that is rich in Gla. The intracellular carboxyl terminal region of these two proteins contains one or two copies of the sequence PPXY, a motif present in a variety of proteins involved in such diverse cellular functions as signal transduction, cell cycle progression, and protein turnover. In this report, we describe the cloning of the cDNAs for two additional human transmembrane Gla proteins (TMG) of 20–24 kDa named TMG3 and TMG4. These two proteins possess extracellular Gla domains with 13 or 9 potential Gla residues, respectively, followed by membrane-spanning hydrophobic regions and cytoplasmic carboxyl terminal regions that contain PPXY motifs. This emerging family of integral membrane Gla proteins includes proline-rich Gla protein (PRGP) 1, PRGP2, TMG3, and TMG4, all of which are characterized by broad and variable distribution in both fetal and adult tissues. Members of this family can be grouped into two subclasses on the basis of their gene organization and amino acid sequence. These observations suggest novel physiological functions for vitamin K beyond its known role in the biosynthesis of proteins involved in blood coagulation and bone development. The identification and characterization of these proteins may allow a more complete understanding of the teratogenic consequences of exposure in utero to vitamin K antagonists, such as warfarin-based anticoagulants.

Suivi longitudinal de la densité osseuse et du statut en vitamine D chez des enfants prépubères avec une allergie au lait de vache non résolue

Problématique : L'allergie au lait de vache (ALV) est reconnue comme une condition transitoire qui disparaît chez la majorité des enfants avant l’âge de 3-5 ans, mais des données récentes révèlent une persistance de l’ALV. Les enfants souffrant d’une ALV sont à risque d’apports insuffisants en calcium et en vitamine D, deux nutriments impliqués dans la santé osseuse. Une première étude transversale portant sur la santé osseuse d’enfants prépubères ALV a observé que la densité osseuse (DMO) lombaire était significativement inférieure à celle d’enfants sans allergie au lait de vache (SALV). Objectifs : Sur la base de ces résultats, nous désirons documenter l’évolution longitudinale de la santé osseuse, du statut en vitamine D, des apports en calcium et en vitamine D et de l’adhérence à la supplémentation des enfants ALV (n=36) et de comparer ces données aux enfants SALV (n=19). Résultats : Le gain annualisé de la DMO lombaire est similaire entre les enfants ALV et SALV. Bien qu’il n’y ait pas de différence significative entre les deux groupes, la DMO lombaire des enfants ALV demeure cependant inférieure à celle des témoins. Qui plus est, le score-Z de la DMO du corps entier tend à être inférieur chez les enfants-cas comparé aux témoins. Au suivi, la concentration de 25OHD et le taux d’insuffisance en vitamine D sont similaires entre les deux groupes tout comme les apports en calcium et en vitamine D. Davantage d’enfants ALV prennent un supplément de calcium au suivi comparativement au temps initial (42% vs. 49%, p<0,05), mais le taux d’adhérence à la supplémentation a diminué à 4 jours/semaine. Conclusion : Une évaluation plus précoce ainsi qu’une prise en charge de la santé osseuse des enfants ALV pourraient être indiquées afin de modifier l’évolution naturelle de leur santé osseuse. Les résultats justifient aussi le suivi étroit des apports en calcium et vitamine D par une nutritionniste et la nécessité d'intégrer la supplémentation dans le plan de traitement de ces enfants et d’assurer une surveillance de l’adhérence à la supplémentation.

Evidence for a Myotomal Hox/Myf Cascade Governing Nonautonomous Control of Rib Specification within Global Vertebral Domains

Hox genes are essential for the patterning of the axial skeleton. Hox group 10 has been shown to specify the lumbar domain by setting a rib-inhibiting program in the presomitic mesoderm (PSM). We have now produced mice with ribs in every vertebra by ectopically expressing Hox group 6 in the PSM, indicating that Hox genes are also able to specify the thoracic domain. We show that the information provided by Hox genes to specify rib-containing and rib-less areas is first interpreted in the myotome through the regional-specific control of Myf5 and Myf6 expression. This information is then transmitted to the sclerotome by a system that includes FGF and PDGF signaling to produce vertebrae with or without ribs at different axial levels. Our findings offer a new perspective of how Hox genes produce global patterns in the axial skeleton and support a redundant nonmyogenic role of Myf5 and Myf6 in rib formation.

Runx2 and Vascular Calcification

Thesis (Ph.D.)--University of Washington, 2016-06

Sexual dimorphism of the femoral neck during the adolescent growth spurt: a structural analysis

Before puberty, there are only small sex differences in body shape and composition. During adolescence, sexual dimorphism in bone, lean, and fat mass increases, giving rise to the greater size and strength of the male skeleton. The question remains as to whether there are sex differences in bone strength or simply differences in anthropometric dimensions. To test this, we applied hip structural analysis (HSA) to derive strength and geometric indices of the femoral neck using bone densitometry scans (DXA) from a 6-year longitudinal study in Canadian children. Seventy boys and sixty-eight girls were assessed annually for 6 consecutive years. At the femoral neck, cross-sectional area (CSA, an index of axial strength), subperiosteal width (SPW), and section modulus (Z, an index of bending strength) were determined, and data were analyzed using a hierarchical (random effects) modeling approach. Biological age (BA) was defined as years from age at peak height velocity (PHV). When BA, stature, and total-body lean mass (TB lean) were controlled, boys had significantly higher Z than girls at all maturity levels (P < 0.05). Controlling height and TB lean for CSA demonstrated a significant independent sex by BA interaction effect (P < 0.05). That is, CSA was greater in boys before PHV but higher in girls after PHV The coefficients contributing the greatest proportion to the prediction of CSA, SPW, and Z were height and lean mass. Because the significant sex difference in Z was relatively small and close to the error of measurement, we questioned its biological significance. The sex difference in bending strength was therefore explained by anthropometric differences. In contrast to recent hypotheses, we conclude that the CSA-lean ratio does not imply altered mechanosensitivity in girls because bending dominates loading at the neck, and the Z-lean ratio remained similar between the sexes throughout adolescence. That is, despite the greater CSA in girls, the bone is strategically placed to resist bending; hence, the bones of girls and boys adapt to mechanical challenges in a similar way. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.