Influencia del tipo de filtrado y tratamiento con Stomacher del fluido ruminal de ovejas en las poblaciones microbianas del inóculo

Four rumen-fistulated sheep fed a 66:34 alfalfa hay:concentrate diet were used as donors to investigate the effect of rumen contents’ treatment on microbial populations in the resulting fluid. Rumen contents were sampled from each individual sheep and subjected to the following treatments: SQ: squeezed through 4 layers of cheesecloth; FIL: SQ treatment and further filtration through a 100-μm nylon cloth; STO: reated with a Stomacher® for 3 min at 230 rev min-1 and followed by SQ. Microbial populations in the fluid were analysed by real-time PCR and bacterial diversity was assessed by the automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) of the 16S ribosomal DNA. Bacterial DNA concentrations and relative abundance of Ruminococcus flavefaciens, arqueal and fungal DNA did not differ (P>0.05) between treatments. In contrast, STO treatment decreased (P<0.05) protozoal DNA concentrations and increased (P<0.05) the relative abundance of Fibrobacter succinogenes compared with SQ method. There were no differences (P>0.05) between treatments either in the Shannon index or in the number of peaks in the ARISA electropherograms, indicating no effect on bacterial diversity. Studies analyzing the influence on the tested methods on fermentation characteristics of different substrates when the fluid is used as inoculum is required.

Análise da microbiota intestinal em adultos com hábitos alimentares distintos e de associações com a inflamação e resistência à insulina

Introdução: A microbiota intestinal possui grande diversidade de bactérias, predominantemente dos filos Bacteroidetes e Firmicutes, com múltiplas funções. A alimentação pode alterar sua composição e função. Alto teor de gordura saturada altera a permeabilidade intestinal, eleva os lipopolissacarídeos e predispõe à inflamação subclínica crônica. Dieta rica em fibras, como a vegetariana, induz elevação de ácidos graxos de cadeia curta e benefícios metabólicos. Objetivos: Para analisar a composição da microbiota intestinal de adventistas com diferentes hábitos alimentares e associá-los à inflamação subclínica e resistência à insulina, esta tese incluiu: 1) revisão dos mecanismos que associam a alimentação à microbiota intestinal e ao risco cardiometabólico; 2) verificação da composição da microbiota intestinal segundo diferentes hábitos alimentares e de associações com biomarcadores de doenças cardiometabólicas; 3) avaliação da associação entre a abundância de Akkermansia muciniphila e o metabolismo da glicose; 4) análise da presença de enterótipos e de associações com características clínicas. Métodos: Este estudo transversal incluiu 295 adventistas estratificados segundo hábitos alimentares (vegetariano estrito, ovo-lacto-vegetariano e onívoro). Foram avaliadas associações com dados clínicos, bioquímicos e inflamatórios. O perfil da microbiota foi obtido por sequenciamento do gene 16S rRNA (Illumina® Miseq). Resultados: 1) Há evidências de que as relações entre dieta, inflamação, resistência à insulina e risco cardiometabólico são em parte mediadas pela composição da microbiota intestinal. 2) Vegetarianos apresentaram melhor perfil clínico quando comparados aos onívoros. Confirmou-se maior abundância de Firmicutes e Bacteroidetes, que não diferiram segundo a adiposidade corporal. Entretanto, vegetarianos estritos apresentaram mais Bacteroidetes, menos Firmicutes e maior abundância do gênero Prevotella quando comparados aos outros dois grupos de hábitos alimentares. Entre os ovo-lactovegetarianos verificou-se maior proporção de Firmicutes especialmente do gênero Faecalibacterium. Nos onívoros, houve super-representação do filo Proteobacteria (Succinivibrio e Halomonas) comparados aos vegetarianos. 3) Indivíduos normoglicêmicos apresentaram maior abundância de Akkermansia muciniphila que aqueles com glicemia alterada. A abundância desta bactéria correlacionou-se inversamente à glicemia e hemoglobina glicosilada. 4) Foram identificados três enterótipos (Bacteroides, Prevotella e Ruminococcaceae), similares àqueles previamente descritos. As concentrações de LDL-C foram menores no enterótipo 2, no qual houve maior frequência de vegetarianos estritos. Discussão: 1) Conhecimentos sobre participação da microbiota na fisiopatologia de doenças poderão reverter em estratégias para manipulá-la para promover saúde. 2) Apoia-se a hipótese de que hábitos alimentares se associam favorável ou desfavoravelmente a características metabólicas e inflamatórias do hospedeiro via alterações na composição da microbiota intestinal. Sugerimos que a exposição a alimentos de origem animal possa impactar negativamente nas proporções de comunidades bacterianas. 3) Sugerimos que a abundância da Akkermansia muciniphila possa participar do metabolismo da glicose. 4) Reforçamos que a existência de três enterótipos não deva ser específica de certas populações/continentes. Apesar de desconhecido o significado biológico destes agrupamentos, as correlações com o perfil lipídico podem sugerir sua utilidade na avaliação do risco cardiometabólico. Conclusões: Nossos achados fortalecem a ideia de que a composição da microbiota intestinal se altera mediante diferentes hábitos alimentares, que, por sua vez, estão associados a alterações nos perfis metabólicos e inflamatórios. Estudos prospectivos deverão investigar o potencial da dieta na prevenção de distúrbios cardiometabólicos mediados pela microbiota.

Impacto da diversidade bacteriana sob a degradação clorotalonil no solo manejado com biochar

A diversidade microbiana é geralmente considerada por seu papel nos principais processos do ecossistema, tais como a decomposição da matéria orgânica e ciclos biogeoquímicos. No entanto, informações sobre o impacto da diversidade em funções menores, como degradação de xenobióticos são escassas. Nós estudamos a partir da abordagem da \'diluição para extinção\', o papel da diversidade sobre a capacidade da comunidade microbiana em degradar o fungicida clorotalonil (organoclorado). Também estudamos o comportamento da comunidade bacteriana após aplicação do pesticida no solo com e sem biochar. A diversidade microbiana do solo natural foi alterada artificialmente por diluição, constituindo um gradiente de diversidade (SN > 10-1 > 10-3 > 10-6), seguido pela inoculação em amostras de solo estéril e posterior reestruturação (15 dias). Após a reestruturação da comunidade, as amostras foram manejadas com biochar (1% m/m) e tratadas com a dose de campo do CHT. O comportamento da comunidade bacteriana foi estudo por PCR-DGGE e qPCR do gene 16S rDNA através de um experimento com molécula fria (não radiomarcada). Enquanto a capacidade de degradação do CHT foi estudada por radiorespirometria (14C-CHT). Inicialmente, a comunidade de bactérias foi influenciada pelo gradiente de diversidade obtido por diluição. A separação dos grupos bacterianos se mostrou bastante similar nos três primeiros períodos pré-aplicação do CHT (SN > 10-1 - 10-3 > 10-6), enquanto que no período de 15 dias, a dinâmica de grupos foi alterada (SN > 10-1 > 10-3 - 10-6). O fungicida e o biochar não exerceram efeitos na comunidade bacteriana no tempo zero (imediatamente após a aplicação), a modificação no perfil da comunidade foi atribuído à diluição. Nos períodos de 21 e 42 dias, o perfil comunidade bacteriana apresentou forte modificação. Os grupos bacterianos se mostraram mais dispersos quando considerado somente o CHT. Embora, a análise de ANOSIM indicou não haver diferença nas amostras com e sem biochar, sugerindo que o clorotalonil foi quem mais contribuiu na dispersão dos grupos bacterianos. No período de 42 d, a comunidade apresentou resposta positiva, sendo observado aumentos no número de bandas e no índice de Shannon em todos tratamentos. Isto possivelmente, devido a menor concentração do fungicida disponível na solução do solo, diminuindo assim, os efeitos deletérios sobre a comunidade. Os dados de qPCR não apresentaram alteração no número de copias do gene 16S rDNA em todos os tratamentos. A remoção da diversidade impactou fortemente a capacidade da comunidade bacteriana de degradar o clorotalonil. Apesar da capacidade de degradar não ter sido perdida, a mínima alteração na diversidade promoveu elevada redução na taxa de mineralização do CHT. A dissipação do CHT se mostrou rápida (D50 < 1 dia) em todos os tratamentos, além disso, a formação de 14C-resíduos não extraíveis foi constituiu um dos principais mecanismos de dissipação do CHT. A partir da degradação do fungicida, foram detectados três metabólitos. Conclui-se que a modificação por diluição da diversidade bacteriana promoveu impacto negativo na mineralização do clorotalonil. E que a formação de resíduos não extraíveis consistiu no principal mecanismo de dissipação do CHT em ambos solos.

Certain observations concerning the effects of epistasis on complex traits and the evolution of genomes.

Thesis (Ph.D.)--University of Washington, 2016-05

Multiplex PCR for Assessment of Tetracycline Resistance (tet) Genes in Antibiotic-Resistant Soil Bacteria and the Ecological Implications

Antibiotics are becoming increasingly prevalent in bacterial communities due to clinical and agricultural misuse and overuse in their environment. As exposure increases, so does the incidence of microbial resistance. Such is the case with bacterial resistance to tetracyclines, a phenotype often acquired through the horizontal gene transfer of tet genes between bacteria. The objective of this project was to analyze the bacterial diversity of tet resistance genes in soil from Miami-Dade County. Bacterial isolates were Gram-stained and the Kirby-Bauer antibiotic disk diffusion test was performed to determine each bacterium’s degree of resistance. The 16S rRNA gene from antibiotic-resistant isolates was amplified by PCR and sequenced to identify the isolates. All isolates’ tet genes were amplified by multiplex PCR, sequenced, and compared. Among eight isolates, three distinct species were positively identified based on their 16S rRNA sequences and four distinct tet genes were identified, though all tested susceptible to tetracycline via the Kirby-Bauer test. This project clarifies some aspects of the ecology of antibiotic resistance genes, their natural ecological function and the potential for the expansion of intrinsic multi-antibiotic resistance into new ecosystems and/or hosts.

Diversity and Distribution of Sediment NirS-Encoding Bacterial Assemblages in Response to Environmental Gradients in the Eutrophied Jiaozhou Bay, China

A gene-clone-library-based molecular approach was used to study the nirS-encoding bacteria-environment relationship in the sediments of the eutrophic Jiaozhou Bay. Diverse nirS sequences were recovered and most of them were related to the marine cluster I group, ubiquitous in estuarine, coastal, and marine environments. Some NirS sequences were unique to the Jiaozhou Bay, such as the marine subcluster VIIg sequences. Most of the Jiaozhou Bay NirS sequences had their closest matches originally detected in estuarine and marine sediments, especially from the Chesapeake Bay, indicating similarity of the denitrifying bacterial communities in similar coastal environments in spite of geographical distance. Multivariate statistical analyses indicated that the spatial distribution of the nirS-encoding bacterial assemblages is highly correlated with environmental factors, such as sediment silt content, NH4+ concentration, and OrgC/OrgN. The nirS-encoding bacterial assemblages in the most hypernutrified stations could be easily distinguished from that of the least eutrophic station. For the first time, the sedimentological condition was found to influence the structure and distribution of the sediment denitrifying bacterial community.

Abundance and diversity of sedimentary bacterial communities in a coastal productive setting in the Western Irish Sea

The bacterial community composition and biomass abundance from a depositional mud belt in the western Irish Sea and regional sands were investigated by phospholipid ester-linked fatty acid profiling, denaturing gradient gel electrophoresis and barcoded pyrosequencing of 16S rRNA genes. The study area varied by water depth (12-111 m), organic carbon content (0.09-1.57% TOC), grain size, hydrographic regime (well-mixed vs. stratified), and water column phytodetrital input (represented by algal polyunsaturated PLFA). The relative abundance of bacterial-derived PLFA (sum of methyl-branched, cyclopropyl and odd-carbon number PLFA) was positively correlated with fine-grained sediment, and was highest in the depositional mud belt. A strong association between bacterial biomass and eukaryote primary production was suggested based on observed positive correlations with total nitrogen and algal polyunsaturated fatty acids. In addition, 16S rRNA genes affiliated to the classes Clostridia and Flavobacteria represented a major proportion of total 16S rRNA gene sequences. This suggests that benthic bacterial communities are also important degraders of phytodetrital organic matter and closely coupled to water column productivity in the western Irish Sea.

Comparisons of host mitochondrial, nuclear and endosymbiont bacterial genes reveal cryptic fig wasp species and the effects of Wolbachia on host mtDNA evolution and diversity

Background Figs and fig-pollinating wasp species usually display a highly specific one-to-one association. However, more and more studies have revealed that the "one-to-one" rule has been broken. Co-pollinators have been reported, but we do not yet know how they evolve. They may evolve from insect speciation induced or facilitated by Wolbachia which can manipulate host reproduction and induce reproductive isolation. In addition, Wolbachia can affect host mitochondrial DNA evolution, because of the linkage between Wolbachia and associated mitochondrial haplotypes, and thus confound host phylogeny based on mtDNA. Previous research has shown that fig wasps have the highest incidence of Wolbachia infection in all insect taxa, and Wolbachia may have great influence on fig wasp biology. Therefore, we look forward to understanding the influence of Wolbachia on mitochondrial DNA evolution and speciation in fig wasps. Results We surveyed 76 pollinator wasp specimens from nine Ficus microcarpa trees each growing at a different location in Hainan and Fujian Provinces, China. We found that all wasps were morphologically identified as Eupristina verticillata, but diverged into three clades with 4.22-5.28% mtDNA divergence and 2.29-20.72% nuclear gene divergence. We also found very strong concordance between E. verticillata clades and Wolbachia infection status, and the predicted effects of Wolbachia on both mtDNA diversity and evolution by decreasing mitochondrial haplotypes. Conclusions Our study reveals that the pollinating wasp E. verticillata on F. microcarpa has diverged into three cryptic species, and Wolbachia may have a role in this divergence. The results also indicate that Wolbachia strains infecting E. verticillata have likely resulted in selective sweeps on host mitochondrial DNA.

Long-term cultivation-independent microbial diversity analysis demonstrates that bacterial communities infecting the adult cystic fibrosis lung show stability and resilience.

Whilst not true in all cases, the microbial communities that chronically infect the airways of patients with CF can vary little over a year despite antibiotic perturbation. The species present tended to vary more between than within subjects, suggesting that each CF airway infection is unique, with relatively stable and resilient bacterial communities. The inverse relationship between community richness and disease severity is similar to findings reported in other mucosal infections.

Diversity and Localization of Bacterial Endosymbionts from Whitefly Species Collected in Brazil

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)