Doseamento da Azadiractina e avaliação da atividade antimicrobiana em produtos contendo óleo de Neem

O Neem (Azadirachta indica) é uma árvore indiana conhecida pela atividade pesticida e por várias atividades farmacológicas. De entre os vários compostos já isolados e estudados, a Azadiractina (AZA) foi identificada como o principal composto bioativo desta planta. Este composto apresenta uma grande diversidade de localizações nesta planta, porém assume a sua máxima concentração ao nível das sementes, porção que se apresenta também como a principal fonte de obtenção do óleo de Neem. O óleo apresenta-se como a porção menos estudada do Neem, quer ao nível do seu teor em AZA, quer ao nível das suas propriedades, nomeadamente antimicrobianas. Neste sentido, os objetivos primordiais deste estudo foram o doseamento da Azadiractina e a avaliação da atividade antimicrobiana em produtos contendo óleo de Neem. Um método analítico rápido, sensível e seletivo utilizando HPLC-UV foi desenvolvido para a identificação e quantificação da Azadiractina-A (AZA-A) e 3-tigloylazadirachtol (AZA-B) em diferentes amostras de óleo de Neem. O teor de AZA-A, B e A+B determinado nas amostras de óleo de Neem apresentou valores entre 58,53-843,42 mg/kg, 12,52-800,223 mg/kg e 104,20-1642,17 mg/kg, respetivamente. Na generalidade, os valores obtidos foram inferiores aos descritos na literatura. A partir dos resultados obtidos, verificou-se ainda que o teor destes compostos não é similar em todas as amostras, sendo este condicionado pela qualidade das sementes que deram origem ao óleo e pelo processo extrativo utilizado. Para além disso, foi possível inferir que duas das amostras testadas teriam qualidade inferior, dados os teores reduzidos de AZA que apresentavam. As diferentes amostras de óleo de Neem, bem como formulações comerciais contendo óleo de Neem, foram testadas em 14 microrganismos de forma a avaliar o seu potencial antimicrobiano. Após a análise, verificou-se atividade antimicrobiana de todas as amostras sobre todos os microrganismos testados, observando-se atividade tanto em bactérias Gram+ como Gram-. Os resultados alcançados mostraram que o óleo de Neem e as formulações comerciais contendo óleo de Neem têm um potencial antimicrobiano interessante, principalmente sobre bactérias comuns em patologias da pele. Para além disso, foi possível comprovar que, no caso do óleo de Neem, a AZA não será a principal responsável por esta atividade. Por outro lado, verificou-se que a atividade antimicrobiana das formulações comerciais não se deverá exclusivamente à presença do óleo de Neem, Doseamento da Azadiractina e avaliação da atividade antimicrobiana em produtos contendo óleo de Neem X uma vez que os valores dos halos de inibição obtidos com as formulações tenderam a ser superiores aos verificados apenas com o óleo, além de que os valores de inibição mais elevados foram observados para as formulações contendo menor percentagem de óleo de Neem incorporado. Em suma, os resultados alcançados para os diferentes produtos analisados são promissores e, na sua maioria, convergem com o que está descrito na literatura. No entanto, apesar destes resultados serem um grande contributo, mais estudos são necessários e importantes para conhecer melhor os produtos analisados e assim poder tirar o maior proveito deles.

Desenvolvimento de métodos de extração de resíduos de antimicrobianos e quantificação em amostras alimentares

O leite é um alimento complexo, pela sua composição rico em água, proteínas, lípidos, vitaminas e minerais. Devido ao seu alto valor nutricional é fundamental para a amamentação de crianças e animais em crescimento, pois fornece componentes fundamentais para o desenvolvimento e manutenção da saúde. Os antimicrobianos são amplamente utilizados como uma medida terapêutica no tratamento de infeções bacterianas, profilaxia e como promotores de crescimento (aditivos). A presença de resíduos de antimicrobianos no leite pode representar riscos para a saúde humana, como reações alérgicas em indivíduos hipersensíveis e resistências. Os objetivos deste estudo são o desenvolvimento de novos métodos de limpeza e de pré- concentração para amostras de leite, por meio de extração em fase sólida (SPE), com a finalidade de realizar uma melhor identificação e quantificação de antimicrobiana por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). Todos os métodos desenvolvidos são de fácil execução, com taxas de recuperação dos agentes antimicrobianos viáveis, com uma percentagem de recuperação a partir de 85%. O método cromatográfico utilizado para a deteção e quantificação (HPLC-DAD) têm os limites de deteção (LD) entre 2.43ng / mL e 1.62ng / mL e os limites de quantificação (LQ) entre 7,36 ng / mL e 4.92 ng / mL, o que significa este método vai de encontro às diretrizes estipuladas pela União Europeia para os agentes antimicrobianos estudados. A combinação dos métodos propostos de limpeza e pré-concentração por SPE e multirresíduo por HPLC-DAD permite, por conseguinte, a deteção e quantificação de resíduos de antibióticos no leite, tornando esta uma alternativa importante e útil no processo de controlo de qualidade para a indústria de alimentos e outras área.

New sensing materials of molecularly-imprinted polymers for the selective recognition of Chlortetracycline

As a result of the stressful conditions in aquaculture facilities there is a high risk of bacterial infections among cultured fish. Chlortetracycline (CTC) is one of the antimicrobials used to solve this problem. It is a broad spectrum antibacterial active against a wide range of Gram-positive and Gram-negative bacteria. Numerous analytical methods for screening, identifying, and quantifying CTC in animal products have been developed over the years. An alternative and advantageous method should rely on expeditious and efficient procedures providing highly specific and sensitive measurements in food samples. Ion-selective electrodes (ISEs) could meet these criteria. The only ISE reported in literature for this purpose used traditional electro-active materials. A selectivity enhancement could however be achieved after improving the analyte recognition by molecularly imprinted polymers (MIPs). Several MIP particles were synthesized and used as electro-active materials. ISEs based in methacrylic acid monomers showed the best analytical performance according to slope (62.5 and 68.6 mV/decade) and detection limit (4.1 × 10−5 and 5.5 × 10−5 mol L−1). The electrodes displayed good selectivity. The ISEs are not affected by pH changes ranging from 2.5 to 13. The sensors were successfully applied to the analysis of serum, urine and fish samples.

Elétrodo de pasta de carbono molecularmente impresso para deteção voltamétrica de Furazolidona

A furazolidona é uma substância ativa do medicamento Giarlam que contém um espetro anti-bacteriano relativamente amplo e que é frequentemente usado para tratar certas doenças bacterianas e protozoárias no homem. A maioria dos fármacos exige uma dosagem que garanta os níveis de segurança e eficácia de atuação. A necessidade de dosear os medicamentos e os seus metabólitos exige o desenvolvimento constante de métodos analíticos eficientes. Neste trabalho desenvolveu-se um novo sensor eletroquímico para a deteção da furazolidona, baseado num elétrodo de pasta de carbono modificado com um polímero molecularmente impresso. A procura de novos materiais que permitam uma melhor seletividade e sensibilidade aos sistemas de deteção é especialmente importante no desenvolvimento de métodos analíticos. Os polímeros molecularmente impressos enquadram-se nesse perfil e o seu uso tem vindo a ser cada vez mais frequente como ferramenta importante em química analítica. Assim, sintetizou-se um polímero com cavidades seletivas para a Furazolidona. Este polímero foi, misturado com grafite e perafina de modo a produzir uma pasta de carbono. Uma seringa de plástico foi usada como suporte da pasta de carbono. O comportamento eletroquímico do sensor foi avaliado e diversas condições de utilização foram estudadas e otimizadas. O sensor apresenta um comportamento linear entre a intensidade do pico e a concentração numa gama de concentrações entre 1 e 100 μM, um limite de deteção de 1 μM e uma precisão (repetibilidade) inferior a 7%. A aplicabilidade do sensor fabricado em amostras complexas foi avaliada pela deteção do fármaco em amostras de urina.

Immunological response in cases of complicated and uncomplicated bartonellosis during pregnancy

Bartonellosis (Carrion's Disease) during pregnancy is associated with high rates of maternal and perinatal mortality. We report the immunological patterns in two cases of human bartonellosis during pregnancy. One patient had an uncomplicated course while the second patient developed life threatening anasarca and cardiac tamponade. The patient with a complicated course had a Th1 response with a higher elevation of IL-10. This elevation has been associated with poor outcome pregnancies during bacterial infections.

Insights into cell wall synthesis and cell division in Staphylococcus aureus

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Effects of betamethasone on the course of experimentai. Infection with Trypanosoma cruzi

In this experiment, the effect of betamethasone administered in the early post- acute infection of mice by Trypanosoma cruzi was studied. This drug was administered during 30 days after the 42nd day of infection in a dose of 0.15 mg/day. The betamethasone treatment did not cause fresh outbreaks of parasitemia and the histopathological findings in the chronic phase were not different from those in the control group. The higher cumulative mortality after treatment in the experimental group was due to superimposed bacterial infections. Outbred albino mice infected with low numbers ofY strain Trypanosoma cruzi trypomastigotes were not suitable models for Chagas' disease, since after 7 months of observation only mild histological lesions developed in all the animais. Prolonged betamethasone treatment of mice infected with low numbers o/Trypanosoma cruzi of the Y strain, during the post-acute phase did not aggravate the course of infection.

Novel insights into the action of antimicrobial agents against human pathogens

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biochemistry

Is severe visceral leishmaniasis a systemic inflammatory response syndrome? A case control study

INTRODUCTION: The objective of the study is to identify the main risk factors for death by New World visceral leishmaniasis and establish a coherent pathogenic substrate of severe disease based on clinical findings. METHODS: Seventy-six deceased inpatients and 320 successfully treated inpatients with VL were studied in a case control study. RESULTS: Bacterial infection and bleeding were mutually exclusive events leading to death. Five risk factors were unique for death by bacterial infection (malnutrition, pulmonary rales, severe anemia, severe absolute neutropenia and higher neutrophil count), while another six were unique for death by bleeding (jaundice, severe relative neutropenia, severe thrombocytopenia, liver injury, kidney failure, higher bone marrow parasite load). Bacterial infection, bleeding, severe anemia, diarrhea, dyspnea, edema, jaundice and bone marrow parasite load were the main syndromes of visceral leishmaniasis among successfully treated patients. CONCLUSIONS: The data support the idea that bacterial infections are due to immune paralysis. Broad organ and system involvement is plausibly due to the high production of proinflammatory cytokines, whose actions fit well with visceral leishmaniasis. The syndromes and causative mediators are typical of a slowly developing systemic inflammatory response syndrome.

Injuries and envenoming by aquatic animals in fishermen of Coxim and Corumbá municipalities, state of Mato Grosso do Sul, Brazil: identification of the causative agents, clinical aspects and first aid measures

INTRODUCTION: The fishes of continental Brazil have socioeconomic importance due to their potential for sport fishing and commercial and subsistence uses, as seen in the Upper Paraguay River Basin, particularly in the municipalities of the Pantanal region, where it is the second largest economic activity. Injuries caused in professional fishermen are common and poorly studied, as in other regions of the country. METHODS: Data were obtained from questionnaires and interviews with 100 professional fishermen, 50 in each municipality, between December 2008 and October 2009. RESULTS: All the fishermen reported some kind of injury caused by fish stings (78% of injuries) and fish, alligator and snake bites (22%) on the hands (46% of cases) and feet (35% of cases). Most of the patients had mild symptoms. The most severe cases were associated with secondary bacterial infections and required specific treatment and prolonged recovery associated with social and economic losses. CONCLUSIONS: The results of this study indicate that the stressful work conditions, inattention to basic preventive measures and carelessness were factors that contributed to accidents and that the toxicity and ability to inflict mechanical trauma of some aquatic species, plus the ineffective use of first aid and hospital treatment, contributed to the high morbidity and complications in many cases. Data from this study are relevant to the fishing communities of the Pantanal region, since they reveal high rates of accidents, lack of knowledge concerning first aid, initial treatment, injury prevention and lack of medical follow-up of the population.

Neurological involvement in visceral leishmaniasis: case report

Visceral leishmaniasis is a severe and potentially fatal vector-borne disease. The most typical symptoms are fever, hepatosplenomegaly, weight loss, bleeding and bacterial infections. Neurological changes are rarely reported. This paper describes a child who presented with neurological signs as the first symptoms of leishmaniasis; tone was diminished and tremors in the extremities were observed. A diagnosis of visceral leishmaniasis was confirmed by parasite detection in the bone marrow. Symptoms were reversed by specific treatment. The nature of a possible mechanism of neurological involvement in visceral leishmaniasis remains unexplained.

Avaliação da monitorização diária da proteína C-Reativa no doente crítico

RESUMO: O objectivo desta Tese de Doutoramento foi estudar o valor da Proteína CReactiva(PCR) como marcador de infecção e sepsis. Por definição, um marcador da infecção não está presente se o doente não está infectado, deve aparecer concomitantemente ou idealmente preceder a instalação da infecção, deve desaparecer com a instituição de terapêutica antimicrobiana adequada e permanecer elevado se a infecção for refractária ao tratamento. Do ponto de vista biológico, a PCR é o protótipo das proteínas de fase aguda, com uma marcada elevação da sua concentração sérica em resposta a diversos estímulos inflamatórios em particular infecções bacterianas. A sua concentração sérica depende apenas da intensidade do estímulo e da velocidade de síntese hepática, não sendo influenciada por nenhum factor ou tratamento a não ser que este tenha influência directa sobre o estímulo desencadeante, o que a torna um marcador de infecção com grande potencial. Nesta Tese comparou-se a PCR com marcadores clássicos de infecção, temperatura e contagem leucocitária, em diversas situações clínicas analisando doentes com infecções documentadas e doentes controlos, sem infecção. Globalmente os resultados dos trabalhos desta Tese mostram que a PCR é um bom marcador de infecção de acordo com a definição previamente apresentada. Em conjunto com a restante avaliação clínica e laboratorial, a monitorização diária da PCR nos doentes sem infecção mostrou ser útil como sentinela da infecção, isto é, apresenta valores baixos nos doentes sem infecção e sobe precocemente nos doentes que desenvolvem uma infecção. Nos doentes com infecção documentada revelou um ser bom marcador de resposta à terapêutica e evolução clínica, diminuindo naqueles que melhoravam e persistindo elevada nos que tinham mau prognóstico, bem assim como identificar diferentes perfis evolutivos. Em suma, a monitorização diária da PCR mostrou utilidade ao longo de todo o internamento na Unidade de Cuidados Intensivos, quer na presença quer na ausência de infecção. Deste todo, a monitorização diária da PCR pode a possibilitar uma utilização mais racional e judiciosa da terapêutica antimicrobiana, contribuindo dessa forma para uma diminuição da toxicidade e da pressão antibiótica, menor risco de emergência de resistências e finalmente diminuição dos custos. Uma vez que, os doentes internados nas Unidades de Cuidados Intensivos apresentam as mesmas doenças que os restantes doentes admitidos no hospital apenas se distinguindo pela sua maior gravidade, poder-se-á extrapolar que a PCR também é potencialmente um bom marcador de infecção nestes doentes. ----------------ABSTRACT: The aim of this PhD Thesis was to assess the value of C-Reactive Protein (CRP) as a marker of infection and sepsis. A marker of infection should be absent in a non-infected patient, should increase alongside or ideally precede the development of an infection, and finally should assess the therapeutic response, that is to say decrease or even disappear with adequate antimicrobial therapy or on the opposite remain elevated if the infection is refractory to the prescribed treatment. The biology of CRP makes it the prototype of acute phase proteins, with marked and sharp elevations of its serum concentration in response to several inflammatory stimulus in particular bacterial infections. Besides, CRP level depends only of the intensity of the stimulus and the rate of hepatic synthesis. Its concentration is not modified by any therapy or intervention. Only those interventions affecting the inflammatory process responsible for the acute phase reaction can change the CRP level. These properties make CRP a potentially good marker of infection. In this Thesis the value of CRP was studied in comparison to traditional markers of infection, like temperature and white cell count, in different clinical situations analysing patients with documented infections and a control group without infection. The aggregated results of the analysis presented in this Thesis illustrate that CRP could be used as a marker of infection. In conjunction with other clinical and laboratory manifestations of sepsis, daily CRP measurement in patients without infection was useful in prediction of infection as its concentration remains low in patients without infection whereas if an infection appears its levels raise markedly. In addition, in patients with documented infections CRP was useful as a marker of therapeutic response and follow-up, with marked decreases in patients with good outcome and remaining elevated in those with poor prognosis, as well as the recognition of different patterns of evolution. In summary, daily CRP measurement was helpful in critical ill patients along the entire Intensive Care Unit stay, both in the presence and in the absence of infection. As a result, daily CRP measurement can assure a better and more rational use of antibiotics and consequently contribute to a decrease in the antibiotic toxicity and demand, reducing the risks of emergence of resistant strains aas well as costs. Provided that patients admitted to an Intensive Care Unit presented the same clinical diagnosis as those admitted to the wards but with higher severity, one can speculate that CRP is also a potentially good marker of infection in these of patients.

Genes that encodes NAGT, MIF1 and MIF2 are not virulence factors for kala-azar caused by Leishmania infantum

IntroductionKala-azar is a disease resulting from infection by Leishmania donovani and Leishmania infantum. Most patients with the disease exhibit prolonged fever, wasting, anemia and hepatosplenomegaly without complications. However, some patients develop severe disease with hemorrhagic manifestations, bacterial infections, jaundice, and edema dyspnea, among other symptoms, followed by death. Among the parasite molecules that might influence the disease severity are the macrophage migration inhibitory factor-like proteins (MIF1 and MIF2) and N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase (NAGT), which act in the first step of protein N-glycosylation. This study aimed to determine whether MIF1, MIF2 and NAGT are virulence factors for severe kala-azar.MethodsTo determine the parasite genotype in kala-azar patients from Northeastern Brazil, we sequenced the NAGT genes of L. infantum from 68 patients as well as the MIF1 and MIF2 genes from 76 different subjects with diverse clinical manifestations. After polymerase chain reaction (PCR), the fragments were sequenced, followed by polymorphism identification.ResultsThe nucleotide sequencing of the 144 amplicons revealed the absence of genetic variability of the NAGT, MIF1 and MIF2 genes between the isolates. The conservation of these genes suggests that the clinical variability of kala-azar does not depend upon these genes. Additionally, this conservation suggests that these genes may be critical for parasite survival.ConclusionsNAGT, MIF1 and MIF2 do not alter the severity of kala-azar. NAGT, MIF1 and MIF2 are highly conserved among different isolates of identical species and exhibit potential for use in phylogenetic inferences or molecular diagnosis.

Antibacterial, anti-swarming and anti-biofilm formation activities of Chamaemelum nobile against Pseudomonas aeruginosa

AbstractINTRODUCTION:Chamomile ( Chamaemelum nobile ) is widely used throughout the world, and has anti-inflammatory, deodorant, bacteriostatic, antimicrobial, carminative, sedative, antiseptic, anti-catarrhal, and spasmolytic properties. Because of the increasing incidence of drug-resistant bacteria, the development of natural antibacterial sources such as medical herbs for the treatment of infectious diseases is necessary. Extracts from different plant parts such as the leaves, flowers, fruit, and bark of Combretum albiflorum, Laurus nobilis , and Sonchus oleraceus were found to possess anti-quorum sensing (QS) activities. In this study, we evaluated the effect of C. nobile against Pseudomonas aeruginosa biofilm formationMETHODS:The P. aeruginosa samples were isolated from patients with different types of infection, including wound infection, septicemia, and urinary tract infection. The flowers of C. nobile were dried and the extract was removed using a rotary device and then dissolved in dimethyl sulfoxide at pH 7.4. The microdilution method was used to evaluate the minimum inhibitory concentration (MIC) of this extract on P. aeruginosa , and biofilm inhibition was assayed.RESULTS:Eighty percent of the isolated samples (16/20) could form a biofilm, and most of these were isolated from wound infections. The biofilm inhibitory concentration of the C. nobile extract was 6.25-25mg/ml, whereas the MIC was 12.5-50mg/ml.CONCLUSIONS:The anti-QS property of C. nobile may play an important role in its antibacterial activity, thus offering an additional strategy in the fight against bacterial infections. However, molecular investigation is required to explore the exact mechanisms of the antibacterial action and functions of this phytocompound.

Pharmacokinetic/pharmacodynamic target attainment of intravenous β-lactam regimens against Gram-negative bacteria isolated in a Brazilian teaching hospital

ABSTRACTINTRODUCTION: Monte Carlo simulations have been used for selecting optimal antibiotic regimens for treatment of bacterial infections. The aim of this study was to assess the pharmacokinetic and pharmacodynamic target attainment of intravenous β-lactam regimens commonly used to treat bloodstream infections (BSIs) caused by Gram-negative rod-shaped organisms in a Brazilian teaching hospital.METHODS: In total, 5,000 patients were included in the Monte Carlo simulations of distinct antimicrobial regimens to estimate the likelihood of achieving free drug concentrations above the minimum inhibitory concentration (MIC; fT > MIC) for the requisite periods to clear distinct target organisms. Microbiological data were obtained from blood culture isolates harvested in our hospital from 2008 to 2010.RESULTS: In total, 614 bacterial isolates, including Escherichia coli, Enterobacterspp., Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Pseudomonas aeruginosa, were analyzed Piperacillin/tazobactam failed to achieve a cumulative fraction of response (CFR) > 90% for any of the isolates. While standard dosing (short infusion) of β-lactams achieved target attainment for BSIs caused by E. coliand Enterobacterspp., pharmacodynamic target attainment against K. pneumoniaeisolates was only achieved with ceftazidime and meropenem (prolonged infusion). Lastly, only prolonged infusion of high-dose meropenem approached an ideal CFR against P. aeruginosa; however, no antimicrobial regimen achieved an ideal CFR against A. baumannii.CONCLUSIONS:These data reinforce the use of prolonged infusions of high-dose β-lactam antimicrobials as a reasonable strategy for the treatment of BSIs caused by multidrug resistant Gram-negative bacteria in Brazil.