P-glycoprotein-mediated resistance to chemotherapy in cancer cells: using recombinant cytosolic domains to establish structure-function relationships

Resistance to chemotherapy in cancer cells is mainly mediated by overexpression of P-glycoprotein (Pgp), a plasma membrane ATP-binding cassette (ABC) transporter which extrudes cytotoxic drugs at the expense of ATP hydrolysis. Pgp consists of two homologous halves each containing a transmembrane domain and a cytosolic nucleotide-binding domain (NBD) which contains two consensus Walker motifs, A and B, involved in ATP binding and hydrolysis. The protein also contains an S signature characteristic of ABC transporters. The molecular mechanism of Pgp-mediated drug transport is not known. Since the transporter has an extraordinarily broad substrate specificity, its cellular function has been described as a "hydrophobic vacuum cleaner". The limited knowledge about the mechanism of Pgp, partly due to the lack of a high-resolution structure, is well reflected in the failure to efficiently inhibit its activity in cancer cells and thus to reverse multidrug resistance (MDR). In contrast to the difficulties encountered when studying the full-length Pgp, the recombinant NBDs can be obtained in large amounts as soluble proteins. The biochemical and biophysical characterization of recombinant NBDs is shown here to provide a suitable alternative route to establish structure-function relationships. NBDs were shown to bind ATP and analogues as well as potent modulators of MDR, such as hydrophobic steroids, at a region close to the ATP site. Interestingly, flavonoids also bind to NBDs with high affinity. Their binding site partly overlaps both the ATP-binding site and the steroid-interacting region. Therefore flavonoids constitute a new promising class of bifunctional modulators of Pgp.

Régulation de l'activité transcriptionnelle de PPARgamma via l'activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a : potentiel anti-athérosclérotique

Les sécrétines peptidiques de l’hormone de croissance (GHRPs) constituent une classe de peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance (GH). Cette activité est médiée par leur liaison à un récepteur couplé aux protéines G : le récepteur des sécrétines de l’hormone de croissance (GHS-R1a), identifié subséquemment comme le récepteur de la ghréline. La ghréline est un peptide de 28 acides aminés sécrété principalement par les cellules de la muqueuse de l’estomac, qui exerce de nombreux effets périphériques indépendamment de la sécrétion de l’hormone de croissance. Les effets indépendants de la sécrétion de GH incluent, entre autres, des actions sur le contrôle de la prise de nourriture, le métabolisme énergétique, la fonction cardiaque, le système immunitaire et la prolifération cellulaire. L’étude de la distribution périphérique des sites de liaison des GHRPs nous a permis d’identifier un second site, le CD36, un récepteur scavenger exprimé dans plusieurs tissus dont le myocarde, l’endothélium de la microvasculature et les monocytes/macrophages. Le CD36 exprimé à la surface du macrophage joue un rôle clé dans l’initiation du développement de l’athérosclérose par la liaison et l’internalisation des lipoprotéines de faible densité oxydées (LDLox) dans l’espace sous-endothélial de l’artère. L’hexaréline, un analogue GHRP, a été développé comme agent thérapeutique pour stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance par l’hypophyse. Sa propriété de liaison aux récepteurs GHS-R1a et CD36 situés en périphérie et particulièrement sa capacité d’interférer avec la liaison des LDLox par le CD36 nous ont incité à évaluer la capacité de l’hexaréline à moduler le métabolisme lipidique du macrophage. L’objectif principal de ce projet a été de déterminer les effets de l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a, par l’hexaréline et la ghréline, le ligand endogène du GHS-R1a, sur la physiologie du macrophage et de déterminer son potentiel anti-athérosclérotique. Les résultats montrent premièrement que l’hexaréline et la ghréline augmentent l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1, impliqués dans le transport inverse du cholestérol, via un mécanisme contrôlé par le récepteur nucléaire PPARγ. La régulation de l’activité transcriptionnelle de PPARγ par l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a se fait indépendamment de la présence du domaine de liaison du ligand (LBD) de PPARγ et est conséquente de changements dans l’état de phosphorylation de PPARγ. Une étude plus approfondie de la signalisation résultant de la liaison de la ghréline sur le GHS-R1a révèle que PPARγ est activé par un mécanisme de concertation entre les voies de signalisation Gαq/PI3-K/Akt et Fyn/Dok-1/ERK au niveau du macrophage. Le rôle de PPARγ dans la régulation du métabolisme lipidique par l’hexaréline a été démontré par l’utilisation de macrophages de souris hétérozygotes pour le gène de Ppar gamma, qui présentent une forte diminution de l’activation des gènes de la cascade métabolique PPARγ-LXRα-transporteurs ABC en réponse à l’hexaréline. L’injection quotidienne d’hexaréline à un modèle de souris prédisposées au développement de l’athérosclérose, les souris déficientes en apoE sous une diète riche en cholestérol et en lipides, se traduit également en une diminution significative de la présence de lésions athérosclérotiques correspondant à une augmentation de l’expression des gènes cibles de PPARγ et LXRα dans les macrophages péritonéaux provenant des animaux traités à l’hexaréline. L’ensemble des résultats obtenus dans cette thèse identifie certains nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de PPARγ et du métabolisme du cholestérol dans le macrophage via les récepteurs CD36 et GHS-R1a. Ils pourraient servir de cibles thérapeutiques dans une perspective de traitement des maladies cardiovasculaires.

Biogénèse des lipoprotéines de haute densité (HDL): implication du transporteur ABCA1

Les patients atteints de la maladie de Tangier présentent des niveaux très bas de lipoprotéines de haute densité (HDL), un facteur de risque pour le développement des maladies cardiovasculaires. In vivo, les HDL ont un effet protecteur important contre l’athérosclérose puisqu’elles effectuèrent le transport à rebours du cholestérol des tissus périphériques vers le foie. Or, la maladie de Tangier est causée par des mutations dans le gène du transporteur « ATP-binding cassette A1 » (ABCA1). Le modèle actuel stipule que ce transporteur assure la lipidation de l’apolipoprotéine A-I (apoA-I), la composante protéique majeure des HDL, pour former des particules HDL naissantes discoïdales. Un défaut dans la lipidation de l’apoA-I par l’ABCA1 abolit la biogénèse des HDL. Nous avons voulu étudier les sites d’interaction de l’ABCA1 avec son ligand (l’apoA-I), les voies de biogénèse impliquées, et l’implication des pré-β-HDL dans l’efflux du cholestérol par la voie de l’ABCA1. D’abord, nous avons utilisé un système de culture cellulaire (fibroblastes humaines et BHK-ABCA1-inductible) afin de déterminer les sites de liaison cellulaires de l’apoA-I, leurs localisations et l’implication de l’ABCA1. Nous avons trouvé que la majorité de l’apoA-I n’est pas associée à l’ABCA1 et, deux tiers de cet apoA-I, était à la membrane plasmique. Ensuite, Une étude plus détaillée examinait les voies de lipidation de l’apoA-I, soit au niveau de la membrane plasmique (MP), soit aux compartiments intracellulaires (CICs). Nous avons montré que la lipidation de l’apoA-I a lieu aux deux niveaux (MP et CICs) selon deux voies différentes cinétiquement. Finalement, nous avons montré que les pré-β-HDL effluent aussi (efficacement que l’apoA-I) le cholestérol par la voie de l’ABCA1. Ces observations réunies démontrent que 1) la majorité de l’apoA-I s’est trouvé non-associée à l’ABCA1; 2) deux tiers de l’apoA-I s’associent a la membrane plasmique; 3) la lipidation de l’apoA-I se fait en partie à la membrane plasmique et, par la voie de retro-endocytose du complexe apoA-I/ABCA1.

Régulation du métabolisme et du transport des lipides dans les macrophages : potentiel anti-athérosclérotique des ligands du CD36

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés. Le récepteur CD36, exprimé à la surface des macrophages, joue un rôle déterminant dans l’internalisation des lipoprotéines oxydées menant à la formation des cellules spumeuses dans l’espace sous endothélial, première étape du développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons montré précédemment que les sécrétines de l’hormone de croissance sont des ligands du récepteur CD36 qui possèdent un site de liaison qui chevauche celui des lipoprotéines oxydées. Cependant, aucune étude n’avait rapporté les effets potentiels des ligands sélectifs du CD36 sur la progression des lésions athérosclérotiques et le métabolisme lipidique au niveau des macrophages. Ainsi, ce projet de doctorat visait à évaluer le potentiel anti-athérosclérotique du EP 80317, un ligand sélectif du CD36, et élucider les mécanismes à l’origine de ses effets sur le métabolisme et le transport des lipides au niveau des macrophages. À cette fin, des souris déficientes en apolipoprotéine E (apoE-/-), nourries avec une diète riche en lipides et en cholestérol, ont été traitées quotidiennement pendant 12 semaines avec le EP 80317, montrant un puissant effet anti-athérosclérotique associé à une réduction de 51% des lésions aortiques et de 30% du taux plasmatique de cholestérol total. Cette même étude a permis de montrer une réduction de l’internalisation des lipoprotéines oxydées ainsi qu’une augmentation de l’expression des gènes/protéines impliqués dans l’efflux du cholestérol au niveau des macrophages, comme le peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), liver x receptor α (LXRα) et les transporteurs ABCA1 et ABCG1, entraînant une réduction de la formation des cellules spumeuses. Ces observations nous ont conduits à élucider les mécanismes moléculaires engendrés par la liaison d’un ligand sélectif au récepteur CD36 dans les macrophages. Les études ont permis de montrer que les ligands du CD36 entraînent une augmentation de l’efflux du cholestérol vers les transporteurs ABCA1 et ABCG1 en augmentant l’expression protéique de la cyclooxygénase 2 (COX-2) consécutive à la phosphorylation de la MAP kinase ERK1/2. L’activation de COX-2 stimule la production intracellulaire de la prostaglandine 15d-PGJ2, cette dernière conduisant à l’activation du PPARγ. Finalement, une troisième étude nous a permis de mettre en évidence les effets du EP 80317 sur le transport inverse du cholestérol in vivo. L’injection de macrophages J774 radiomarqués avec du cholestérol tritié dans la cavité péritonéale de souris avec le EP 80317 nous a permis de montrer que le EP 80317 entraîne une réduction de la radioactivité retrouvée dans le foie tandis qu’il augmente celle retrouvée dans les fèces par comparaison aux souris contrôles, sans néanmoins modifier le profil plasmatique du radiotraceur entre les deux groupes. De plus, l’expression des gènes impliqués dans le transport du cholestérol au niveau intestinal comme le LXRα, ABCA1, ABCG5 ainsi que ABCG8 ont été régulés à la hausse par le EP 80317 tandis que l’expression de NPC1L1, un transporteur impliqué dans l’absorption du cholestérol, a été régulé à la baisse. Toutefois, les gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol au niveau du foie ne sont pas modulés par le EP 80317. En conclusion, les travaux effectués dans le cadre de cette thèse nous ont permis de montrer que l’activation du récepteur CD36 par le EP 80317 pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l’athérosclérose. Les effets anti-athérosclérotiques et hypocholestérolémiants des ligands synthétiques du récepteur CD36 sont en partie engendrés par 1) la régulation du métabolisme des lipides au niveau des macrophages en réponse à l’activation du PPARγ par son ligand endogène, le 15d-PGJ2 et 2) par une augmentation du transport inverse du cholestérol, particulièrement par une augmentation de l’efflux transintestinal.

A "Trojan horse" strategy to reverse drug-resistance in brain tumors

Los gliomas malignos representan una de las formas más agresivas de los tumores del sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con la clasificación de los tumores cerebrales de la Organización Mundial de la Salud (OMS), los astrocitomas han sido categorizados en cuatro grados, determinados por la patología subyacente. Es así como los gliomas malignos (o de alto grado) incluyen el glioma anaplásico (grado III) así como el glioblastoma multiforme (GBM, grado IV),estos últimos los más agresivos con el peor pronóstico (1). El manejo terapéutico de los tumores del SNC se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, dependiendo de las características del tumor, el estadio clínico y la edad (2),(3), sin embargo ninguno de los tratamientos estándar es completamente seguro y compatible con una calidad de vida aceptable (3), (4). En general, la quimioterapia es la primera opción en los tumores diseminados, como el glioblastoma invasivo y el meduloblastoma de alto riesgo o con metástasis múltiple, pero el pronóstico en estos pacientes es muy pobre (2),(3). Solamente nuevas terapias dirigidas (2) como las terapias anti-angiogénicas (4); o terapias génicas muestran un beneficio real en grupos limitados de pacientes con defectos moleculares específicos conocidos (4). De este modo, se hace necesario el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas para atacar los tumores cerebrales. Frente a las terapias los gliomas malignos son con frecuencia quimioresistentes, y esta resistencia parece depender de al menos dos mecanismos: en primer lugar, la pobre penetración de muchas drogas anticáncer a través de la barrera hematoencefálica (BBB: Blood Brain Barrier), la barrera del fluido sangre-cerebroespinal (BCSFB: Blood-cerebrospinal fluid barrier) y la barrera sangre-tumor (BTB: blood-tumor barrier). Dicha resistencia se debe a la interacción de la droga con varios transportadores o bombas de eflujo de droga ABC (ABC: ATP-binding cassette) que se sobre expresan en las células endoteliales o epiteliales de estas barreras. En segundo lugar, estos transportadores de eflujo de drogas ABC propios de las células tumorales confieren un fenotipo conocido como resistencia a multidrogas (MDR: multidrug resistance), el cual es característico de varios tumores sólidos. Este fenotipo también está presente en los tumores del SNC y su papel en gliomas es objeto de investigación (5). Por consiguiente el suministro de medicamentos a través de la BBB es uno de los problemas vitales en los tratamientos de terapia dirigida. Estudios recientes han demostrado que algunas moléculas pequeñas utilizadas en estas terapias son sustratos de la glicoproteína P (Pgp: P-gycoprotein), así como también de otras bombas de eflujo como las proteínas relacionadas con la resistencia a multidrogas (MRPs: multidrug resistance-related proteins (MRPs) o la proteína relacionada con cáncer de seno (BCRP: breast-cancer resistance related protein)) que no permiten que las drogas de este tipo alcancen el tumor (1). Un sustrato de Pgp y BCRP es la DOXOrubicina (DOXO), un fármaco utilizado en la terapia anti cáncer, el cual es muy eficaz para atacar las células del tumor cerebral in vitro, pero con un uso clínico limitado por la poca entrega a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y por la resistencia propia de los tumores. Por otra parte las células de BBB y las células del tumor cerebral tienen también proteínas superficiales, como el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR), que podría utilizarse como blanco terapéutico en BBB y tumores cerebrales. Es asi como la importancia de este estudio se basa en la generación de estrategias terapéuticas que promuevan el paso de las drogas a través de la barrera hematoencefalica y tumoral, y a su vez, se reconozcan mecanismos celulares que induzcan el incremento en la expresión de los transportadores ABC, de manera que puedan ser utilizados como blancos terapéuticos.Este estudio demostró que el uso de una nueva estrategia basada en el “Caballo de Troya”, donde se combina la droga DOXOrubicina, la cual es introducida dentro de un liposoma, salvaguarda la droga de manera que se evita su reconocimiento por parte de los transportadores ABC tanto de la BBB como de las células del tumor. La construcción del liposoma permitió utilizar el receptor LDLR de las células asegurando la entrada a través de la BBB y hacia las células tumorales a través de un proceso de endocitosis. Este mecanismo fue asociado al uso de estatinas o drogas anticolesterol las cuales favorecieron la expresión de LDLR y disminuyeron la actividad de los transportadores ABC por nitración de los mismos, incrementando la eficiencia de nuestro Caballo de Troya. Por consiguiente demostramos que el uso de una nueva estrategia o formulación denominada ApolipoDOXO más el uso de estatinas favorece la administración de fármacos a través de la BBB, venciendo la resistencia del tumor y reduciendo los efectos colaterales dosis dependiente de la DOXOrubicina. Además esta estrategia del "Caballo de Troya", es un nuevo enfoque terapéutico que puede ser considerado como una nueva estrategia para aumentar la eficacia de diferentes fármacos en varios tumores cerebrales y garantiza una alta eficiencia incluso en un medio hipóxico,característico de las células cancerosas, donde la expresión del transportador Pgp se vió aumentada. Teniendo en cuenta la relación entre algunas vías de señalización reconocidas como moduladores de la actividad de Pgp, este estudio presenta no solo la estrategia del Caballo de Troya, sino también otra propuesta terapéutica relacionada con el uso de Temozolomide más DOXOrubicina. Esta estrategia demostró que el temozolomide logra penetrar la BBB por que interviene en la via de señalización de la Wnt/GSK3/β-catenina, la cual modula la expresión del transportador Pgp. Se demostró que el TMZ disminuye la proteína y el mRNA de Wnt3 permitiendo plantear la hipótesis de que la droga al disminuir la transcripción del gen Wnt3 en células de BBB, incrementa la activación de la vía fosforilando la β-catenina y conduciendo a disminuir la β-catenina nuclear y por tanto su unión al promotor del gen mdr1. Con base en los resultados este estudio permitió el reconocimiento de tres mecanismos básicos relacionados con la expresión de los transportadores ABC y asociados a las estrategias empleadas: el primero fue el uso de las estatinas, el cual condujo a la nitración de los transportadores disminuyendo su actividad por la via del factor de transcripción NFκB; el segundo a partir del uso del temozolomide, el cual metila el gen de Wnt3 reduciendo la actividad de la via de señalización de la la β-catenina, disminuyendo la expresión del transportador Pgp. El tercero consistió en la determinación de la relación entre el eje RhoA/RhoA quinasa como un modulador de la via (no canónica) GSK3/β-catenina. Se demostró que la proteína quinasa RhoA promovió la activación de la proteína PTB1, la cual al fosforilar a GSK3 indujo la fosforilación de la β-catenina, lo cual dio lugar a su destrucción por el proteosoma, evitando su unión al promotor del gen mdr1 y por tanto reduciendo su expresión. En conclusión las estrategias propuestas en este trabajo incrementaron la citotoxicidad de las células tumorales al aumentar la permeabilidad no solo de la barrera hematoencefálica, sino también de la propia barrera tumoral. Igualmente, la estrategia del “Caballo de Troya” podría ser útil para la terapia de otras enfermedades asociadas al sistema nervioso central. Por otra parte estos estudios indican que el reconocimiento de mecanismos asociados a la expresión de los transportadores ABC podría constituir una herramienta clave en el desarrollo de nuevas terapias anticáncer.

Effects of ABCA1 SNPs, including the C-105T novel variant, on serum lipids of Brazilian individuals

Background: ABCA1 plays an important role in HDL metabolism. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in ABCA1 gene were associated with variation in plasina HDL-c. Methods: The effect of the ABCA1 SNPs C-14T, R219K and of a novel variant C-105T on serum lipids was investigated in 367 unrelated Brazilian individuals (224 hypercholesterolemic and 143 normolipidemic). The relation between ABCA1 SNPs and the lipid-lowering response to atorvastatin (10 mg/day/4 weeks) was also evaluated in 141 hypercholesterolemic (HC) individuals. The polymorphisms were detected by PCRR_FLP and confirmed by DNA sequencing. Results: Linkage disequilibrium was found between the SNPs C-105T and C-14T in the HC group. HC individuals carrying - 105CT/TT genotypes had higher serum HDL-c and lower triglyceride and VLDL-c concentrations as well as lower TG/HDL-c ratio compared to the -105CC carriers (p<0.05). The R219K SNP was associated with reduced serum triglyceride, VLDL-c and TG/HDL-c ratio in the HC group (p<0.05), and with an increased serum apoAI in NL individuals. The effects of ABCA1 SNPs on basal serum lipids of HC individuals were not modified by atorvastatin treatment. Conclusions: The ABCA1 SNPs R219K and C-105T were associated with a less atherogenic lipid profile but not with the lowering-cholesterol response to atorvastatin in a Brazilian population. (C) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Human ABCB1 confers cells resistance to cytotoxic guanidine alkaloids from Pterogyne nitens

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Valutazione del coinvolgimento dell'oncogene c-myc e dei trasportatori abc nella farmacoresistenza dell'osteosarcoma ad alto grado

L’insorgenza di fenomeni coinvolti nello sviluppo della farmacoresistenza costituisce al momento la principale causa di mancata risposta al trattamento chemioterapico nell’osteosarcoma. Questo è in parte dovuto ad una sovraespressione di diversi trasportatori ABC nelle cellule tumorali che causano un aumento dell’efflusso extracellulare del chemioterapico e pertanto una ridotta risposta al trattamento farmacologico. L'oncogene C-MYC è coinvolto nella resistenza al metothrexate, alla doxorubicina e al cisplatino ed è un fattore prognostico avverso, se sovraespresso al momento della diagnosi, in pazienti affetti da osteosarcoma. C-MYC è in grado di regolare l'espressione di diversi trasportatori ABC, probabilmente coinvolti nella resistenza ai farmaci nell’osteosarcoma, e questo potrebbe spiegare l’impatto prognostico avverso dell’oncogene in questo tumore. L’espressione genica di C-MYC e di 16 trasportatori ABC, regolati da C-MYC e / o responsabili dell'efflusso di diversi chemioterapici, è stata valutata su due diverse casistiche cliniche e su un pannello di linee cellulari di osteosarcoma umano mediante real-time PCR. L'espressione della proteina è stata valutata per i 9 trasportatori ABC risultati più rilevanti.Infine l'efficacia in vitro di un inibitore, specifico per ABCB1 e ABCC1, è stata valutata su linee cellulari di osteosarcoma. ABCB1 e ABCC1 sono i trasportatori più espressi nelle linee cellulari di osteosarcoma. ABCB1 è sovraespresso al momento della diagnosi in circa il 40-45% dei pazienti affetti da osteosarcoma e si conferma essere un fattore prognostico avverso se sovraespresso al momento della diagnosi. Pertanto ABCB1 diventa il bersaglio di elezione per lo sviluppo di strategie terapeutiche alternative, nel trattamento dell’osteosarcoma, atte al superamento della farmacoresistenza. L’inibizione dell'attività di tale trasportatore causa un aumento della sensibilità al trattamento chemioterapico nelle linee cellulari di osteosarcoma farmacoresistenti, indicando questo approccio come una possibile strategia per superare il problema della mancata risposta al trattamento farmacologico nei pazienti con osteosarcoma che sovraesprimono ABCB1.

Expression, localization, and functional model of cholesterol transporters in lactating and nonlactating mammary tissues of murine, bovine, and human origin

Members of the ATP-binding cassette (ABC) transporters play a pivotal role in cellular lipid efflux. To identify candidate cholesterol transporters implicated in lipid homeostasis and mammary gland (MG) physiology, we compared expression and localization of ABCA1, ABCG1, and ABCA7 and their regulatory genes in mammary tissues of different species during the pregnancy-lactation cycle. Murine and bovine mammary glands (MGs) were investigated during different functional stages. The abundance of mRNAs was determined by quantitative RT-PCR. Furthermore, transporter proteins were localized in murine, bovine, and human MGs by immunohistochemistry. In the murine MG, ABCA1 mRNA abundance was elevated during nonlactating compared with lactating stages, whereas ABCA7 and ABCA1 mRNA profiles were not altered. In the bovine MG, ABCA1, ABCG1, and ABCA7 mRNAs abundances were increased during nonlactating stages compared with lactation. Furthermore, associations between mRNA levels of transporters and their regulatory genes LXRalpha, PPARgamma, and SREBPs were found. ABCA1, ABCG1, and ABCA7 proteins were localized in glandular MG epithelial cells (MEC) during lactation, whereas during nonlactating stages, depending on species, the proteins showed distinct localization patterns in MEC and adipocytes. Our results demonstrate that ABCA1, ABCG1, and ABCA7 are differentially expressed between lactation and nonlactating stages and in association with regulatory genes. Combined expression and localization data suggest that the selected cholesterol transporters are universal MG transporters involved in transport and storage of cholesterol and in lipid homeostasis of MEC. Because of the species-specific expression patterns of transporters in mammary tissue, mechanisms of cholesterol homeostasis seem to be differentially regulated between species.

PP141. The lipid transporters ABCA1 and ABCG1 are differentially expressed in preeclamptic and IUGR placentas

INTRODUCTION The ATP-binding cassette (ABC) transporter A1 (ABCA1) and ABCG1 are highly expressed in the placenta in various compartments, including the villous syncytiotrophoblast (V-STB) and foetal endothelial cells. Among other not yet characterized functions, they play a role in the foeto-maternal transport of cholesterol and other lipophilic molecules. In humans, preliminary data suggest expressional changes of ABCA1 and ABCG1 in pathologic gestation, particularly under hypoxic conditions, but a systematic expression analysis in common human pregnancy diseases has never been performed. OBJECTIVES The aim of the present study was to characterize ABCA1 and ABCG1 expression in a large series of pathologic placentas, in particular from preeclampsia (PE) and intrauterine growth restriction (IUGR) which are associated with placental hypoxia. METHODS Placentas from 152 pathological pregnancies, including PE and/or HELLP (n=24) and IUGR (n=21), and 20 normal control placentas were assessed for their ABCA1 and ABCG1 mRNA and protein expression with quantitative RT-PCR and semi-quantitative immunohistochemical analysis, respectively. RESULTS ABCA1 protein expression in the V-STB was significantly less extensive in PE compared with normal controls (<10% of V-STB stained for ABCA1 in 58% PE placentas vs. 25% controls; p=0.035). Conversely, it was significantly more wide-spread in IUGR (>75% of V-STB stained in 57% IUGR placentas vs. 15% controls; p=0.009). Moreover, there was an insignificant trend for increased ABCA1 expression in fetal endothelial cells of stem villi in PE (p=0.0588). ABCA1 staining levels in V-STB were significantly associated with placental histopathological features related with hypoxia: they were decreased in placentas exhibiting syncytial knotting (p=0.033) and decidual vasculopathy (p=0.0437) and increased in low weight placentas (p=0.015). The significant and specific alterations in ABCA1 protein expression found at a specific cellular level were not paralleled by changes in ABCA1 mRNA abundance of total placental tissue. ABCG1 staining was universally extensive in the V-STB of normal placentas, always affecting more than 90% of V-STB surface. In comparison, ABCG1 staining of the V-STB was generally often reduced in pregnancy diseases. In particular, less than 90% of V-STB exhibited ABCG1 staining in 26% of PE placentas (p=0.022) and 35% of IUGR placentas (p=0.003). Similarly to ABCA1, ABCG1 mRNA expression in total placental tissue was not significantly different between controls and PE or IUGR. CONCLUSION ABCA1 and ABCG1 proteins are differentially expressed, with either down- or up-regulation, in the V-STB of placentas exhibiting features of chronic hypoxia, such as in PE and IUGR. This suggests that other factors in addition to hypoxia regulate the expression of placental lipid transporters. The specific changes on a cellular level were masked when only total tissue mRNA was analysed underlining the importance of cell specific expression analysis. The potential effects of decreased placental ABCA1 and ABCG1 expression on foetal nutrition and development remain to be elucidated.

Apoptotic neutrophils release macrophage migration inhibitory factor upon stimulation with tumor necrosis factor-alpha

Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is an important cytokine involved in the regulation of innate immunity and present at increased levels during inflammatory responses. Here we demonstrate that mature blood and tissue neutrophils constitutively express MIF as a cytosolic protein not associated with azurophil granules. Functionally active MIF, but not proteases stored in azurophil granules, was released from apoptotic neutrophils following short term tumor necrosis factor (TNF)-alpha stimulation in a caspase-dependent manner and prior to any detectable phagocytosis by monocyte-derived macrophages. Moreover, TNF-alpha-mediated MIF release was blocked by glyburide and propenicide, both inhibitors of ATP-binding cassette-type transporters, suggesting that this transporter system is activated during neutrophil apoptosis. Taken together, apoptotic mature neutrophils release MIF upon short term TNF-alpha stimulation. Therefore, apoptosis may not always occur without the induction of pro-inflammatory mechanisms.

Differential expression of ABC transporters and their regulatory genes during lactation and dry period in bovine mammary tissue

ATP-binding cassette (ABC) transporters play a pivotal role in human physiology, and mutations in these genes often result in severe hereditary diseases. ABC transporters are expressed in the bovine mammary gland but their physiological role in this organ remains elusive. Based on findings in the context of human disorders we speculated that candidate ABC transporters are implicated in lipid and cholesterol transport in the mammary gland. Therefore we investigated the expression pattern of selected genes that are associated with sterol transport in lactating and nonlactating mammary glands of dairy cows. mRNA levels from mammary gland biopsies taken during lactation and in the first and second week of the dry period were analysed using quantitative PCR. Five ABC transporter genes, namely ABCA1, ABCA7, ABCG1, ABCG2 and ABCG5, their regulating genes LXRalpha, PPARgamma, SREBP1 and the milk proteins lactoferrin and alpha-lactalbumin were assessed. A significantly enhanced expression in the dry period was observed for ABCA1 while a significant decrease of expression in this period was detected for ABCA7, ABCG2, SREBP1 and alpha-lactalbumin. ABCG1, ABCG5, LXRalpha, PPARgamma and lactoferrin expression was not altered between lactation and dry period. These results indicate that candidate ABC transporters involved in lipid and cholesterol transport show differential mRNA expression between lactation and the dry period. This may be due to physiological changes in the mammary gland such as immigration of macrophages or the accumulation of fat due to the loss of liquid in the involuting mammary gland. The current mRNA expression analysis of transporters in the mammary gland is the prerequisite for elucidating novel molecular mechanisms underlying cholesterol and lipid transfer into milk.

Interaction between cell division proteins FtsE and FtsZ.

FtsE and FtsX, which are widely conserved homologs of ABC transporters and interact with each other, have important but unknown functions in bacterial cell division. Coimmunoprecipitation of Escherichia coli cell extracts revealed that a functional FLAG-tagged version of FtsE, the putative ATP-binding component, interacts with FtsZ, the bacterial tubulin homolog required to assemble the cytokinetic Z ring and recruit the components of the divisome. This interaction is independent of FtsX, the predicted membrane component of the ABC transporter, which has been shown previously to interact with FtsE. The interaction also occurred independently of FtsA or ZipA, two other E. coli cell division proteins that interact with FtsZ. In addition, FtsZ copurified with FLAG-FtsE. Surprisingly, the conserved C-terminal tail of FtsZ, which interacts with other cell division proteins, such as FtsA and ZipA, was dispensable for interaction with FtsE. In support of a direct interaction with FtsZ, targeting of a green fluorescent protein (GFP)-FtsE fusion to Z rings required FtsZ, but not FtsA. Although GFP-FtsE failed to target Z rings in the absence of ZipA, its localization was restored in the presence of the ftsA* bypass suppressor, indicating that the requirement for ZipA is indirect. Coexpression of FLAG-FtsE and FtsX under certain conditions resulted in efficient formation of minicells, also consistent with an FtsE-FtsZ interaction and with the idea that FtsE and FtsX regulate the activity of the divisome.

A trilocus sequence typing scheme for hospital epidemiology and subspecies differentiation of an important nosocomial pathogen, Enterococcus faecalis.

In this study, we present a trilocus sequence typing (TLST) scheme based on intragenic regions of two antigenic genes, ace and salA (encoding a collagen/laminin adhesin and a cell wall-associated antigen, respectively), and a gene associated with antibiotic resistance, lsa (encoding a putative ABC transporter), for subspecies differentiation of Enterococcus faecalis. Each of the alleles was analyzed using 50 E. faecalis isolates representing 42 diverse multilocus sequence types (ST(M); based on seven housekeeping genes) and four groups of clonally linked (by pulsed-field gel electrophoresis [PFGE]) isolates. The allelic profiles and/or concatenated sequences of the three genes agreed with multilocus sequence typing (MLST) results for typing of 49 of the 50 isolates; in addition to the one exception, two isolates were found to have identical TLST types but were single-locus variants (differing by a single nucleotide) by MLST and were therefore also classified as clonally related by MLST. TLST was also comparable to PFGE for establishing short-term epidemiological relationships, typing all isolates classified as clonally related by PFGE with the same type. TLST was then applied to representative isolates (of each PFGE subtype and isolation year) of a collection of 48 hospital isolates and demonstrated the same relationships between isolates of an outbreak strain as those found by MLST and PFGE. In conclusion, the TLST scheme described here was shown to be successful for investigating short-term epidemiology in a hospital setting and may provide an alternative to MLST for discriminating isolates.

Importance of cholesterol and cholesterol transporters in the placental trophoblast during pregnancy

Membrane transporters are essential during pregnancy, being a core component of the exchange of nutrients, gases, and metabolic products between the mother and the developing fetus. Important compounds to be transported include vitamins and minerals, amino acids, glucose, as well as cholesterol. Cholesterol transport across the plasma membrane is mediated mainly by members of the ATP-binding cassette (ABC) transporter family. Cholesterol is present in every cell of the body, where it helps maintain the integrity of cell membranes and also plays an important role in cell signaling events. Cholesterol also acts as a precursor for the biosynthesis of steroids that include sex hormones, glucocorticoids, mineralcorticoids, as well as bile acids and oxysterols. Cholesterol transport is therefore crucial for a host of different physiological processes. The following chapter addresses the involvement and importance of ABC transporters in these different processes. The critical role that ABC transporters Play for a successful pregnancy outcome is highlighted by pathological processes that result malfunction of cholesterol transport during pregnancy. Avenues of future research are also described, which may help to further delineate the function and mechanism of action of ABC transporters.