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Les microARNs sont des petits ARNs non codants d'environ 22 nuclotides qui rgulent ngativement la traduction de l'ARN messager cible (ARNm) et ont donc des fonctions cellulaires. Le microARN-16 (miR-16) est connu pour ses effets antiprolifratifs. Nous avons observ que lexpression de miR-16 est diminue dans les cellules endothliales humaines snescentes et quiescentes en comparaison des cellules prolifratives. Une analyse informatique des sites potentiels de liaison de miR-16 prvoit que GLUT-4, un transporteur du glucose insulinodpendant, pourrait tre une cible potentielle du miR-16. Nous avons donc test l'hypothse que miR-16 rgule ngativement le mtabolisme du glucose cellulaire. Dans des HUVEC, l'inhibition de miR-16 endogne avec des anti-miRNA oligonuclotides (AMO) augmente les niveaux protiques de GLUT-4 de 1,7 0,4 fois (p=0,0037 ; n=9). Dans des souris nourries avec un rgime alimentaire normal ou riche en graisse et en sucre, lexpression de GLUT-4 dans le muscle squelettique a tendance corrler ngativement avec les niveaux de miR-16 (p=0,0998, r2=0,3866, n=4). Ces rsultats suggrent que miR-16 est un rgulateur ngatif de GLUT-4 et quil pourrait tre impliqu dans la rgulation du mtabolisme cellulaire du glucose.
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Lhypertrophie du ventricule gauche (HVG) est un processus adaptif et compensatoire qui se dveloppe consquemment lhypertension artrielle pour sopposer llvation chronique de la pression artrielle. LHVG est caractrise par une hypertrophie des cardiomyocytes suite laugmentation de la synthse dADN, une prolifration des fibroblastes, une augmentation du dpt de collagne et une altration de la matrice extracellulaire (MEC). Ces changements gnrent des troubles de relaxation et mnent au dysfonctionnement diastolique, ce qui diminue la performance cardiaque. La suractivit du systme nerveux sympathique (SNS) joue un rle essentiel dans le dveloppement de lhypertension artrielle et de lHVG cause de la libration excessive des catcholamines et de leurs effets sur la scrtion des cytokines pro-inflammatoires et sur les diffrentes voies de signalisation hypertrophiques et prolifratives. Le traitement antihypertenseur avec de la moxonidine, un compos sympatholytique daction centrale, permet une rgression de lHVG suite une rduction soutenue de la synthse d'ADN et dune stimulation transitoire de la fragmentation de l'ADN qui se produit au dbut du traitement. En raison de linteraction entre lHVG, les cytokines inflammatoires, le SNS et leurs effets sur les protines de signalisation hypertrophiques, lobjectif de cette tude est de dtecter dans un modle animal dhypertension artrielle et dHVG, les diffrentes voies de signalisation associes la rgression de lHVG et la performance cardiaque. Des rats spontanment hypertendus (SHR, 12 semaines) ont reu de la moxonidine 0, 100 et 400 g/kg/h, pour une priode de 1 et 4 semaines, via des mini-pompes osmotiques implantes dune faon sous-cutane. Aprs 4 semaines de traitement, la performance cardiaque a t mesure par cho-doppler. Les rats ont ensuite t euthanasis, le sang a t recueilli pour mesurer les concentrations des cytokines plasmatiques et les curs ont t prlevs pour la dtermination histologique du dpt de collagne et de l'expression des protines de signalisation dans le ventricule gauche. Le traitement de 4 semaines na eu aucun effet sur les paramtres systoliques mais a permis damliorer les paramtres diastoliques ainsi que la performance cardiaque globale. Par rapport au vhicule, la moxonidine (400 g/kg/h) a permis daugmenter transitoirement la concentration plasmatique de lIL-1 aprs une semaine et de rduire la masse ventriculaire gauche. De mme, on a observ une diminution du dpt de collagne et des concentrations plasmatiques des cytokines IL-6 et TNF-, ainsi quune diminution de la phosphorylation de p38 et dAkt dans le ventricule gauche aprs 1 et 4 semaines de traitement, et cela avec une rduction de la pression artrielle et de la frquence cardiaque. Fait intressant, les effets anti-hypertrophiques, anti-fibrotiques et anti-inflammatoires de la moxonidine ont pu tre observs avec la dose sous-hypotensive (100 g/kg/h). Ces rsultats suggrent des effets cardiovasculaires bnfiques de la moxonidine associs une amlioration de la performance cardiaque, une rgulation de l'inflammation en diminuant les niveaux plasmatiques des cytokines pro-inflammatoires ainsi quen inhibant la MAPK p38 et Akt, et nous permettent de suggrer que, outre l'inhibition du SNS, moxonidine peut agir sur des sites priphriques.
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Nous avons rcemment dmontr que les espces ractives oxygnes induisent une augmentation de lexpression des protines Gi dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant daortes de rats spontanment hypertendus (SHR, de langlais spontaneously hypertensive rats). La prsente tude a pour but dtudier les effets du peroxyde dhydrogne (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur lexpression de Gi et sur lactivit de ladnylate cyclase, et dexplorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette rponse. Nos rsultats montrent que H2O2 induit une augmentation de lexpression des protines Gi-2 et Gi-3 de manire dose- et temps-dpendante avec une augmentation maximale de 40-50% 100 M aprs 1 heure, sans affecter lexpression de Gs. Lexpression des protines Gi a t maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs dEGF-R (de langlais epidermal growth factor receptor), PDGFR- (de langlais platelet-derived growth factor receptor ), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de langlais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de langlais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degr de phosphorylation dEGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a t maintenue au niveau tmoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs dEGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degr de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de langlais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR- a attnu la surexpression des protines Gi-2 et Gi-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protines Gi induite par H2O2 a t corrle avec une augmentation de la fonction de la protine Gi. Linhibition de lactivit de ladnylate cyclase par de faibles concentrations de GTPS aprs stimulation par la forskoline a augment de 20% dans les cellules traites au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru linhibition de lactivit de ladnylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que langiotensine II, oxotrmorine et C-ANP4-23. Dautre part, la stimulation de ladnylate cyclase induite par GTPS, glucagon, isoprotrnol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a t attnue de faon significative dans les cellules traites au H2O2. Ces rsultats suggrent que H2O2 induit la surexpression des protines Gi-2 and Gi-3 via la transactivation des rcepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR- et lactivation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protines Gi, peroxyde dhydrogne, stress oxydant, rcepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adnylate cyclase, hypertension
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Le rcepteur B1 des kinines (RB1) joue un rle important dans l'inflammation et la nociception. Les sites de liaison du RB1 sont augments dans la moelle pinire et le ganglion de la racine dorsale (GRD) chez le rat aprs la ligature partielle du nerf sciatique (LPNS). Dans ce modle classique de douleur neuropathique, le traitement aigu avec des antagonistes slectifs du RB1 renverse l'hyperalgsie thermique mais non pas lallodynie. Cette tude vise dfinir dans ce modle de LPNS: 1- les effets de traitements aigu et chronique avec des antagonistes du RB1 sur lhyperalgsie thermique et les allodynies tactile et au froid; 2- la contribution du TRPV1 et du stress oxydatif dans la composante de la douleur neuropathique associe au RB1; 3- lexpression du RB1 au niveau de la moelle pinire lombaire, le GRD et le nerf sciatique par RT-PCR quantitatif (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction); 4- la localisation cellulaire du RB1 dans la moelle pinire lombaire par microscopie confocale. Lhyperalgsie thermique et les allodynies tactile et au froid ont t mesures par le rflexe de retrait de la patte arrire aprs lapplication la surface plantaire dune source radiante de chaleur (mthode Hargreaves), de filaments de Von Frey et dune goutte dactone qui produit une sensation de froid par vaporation. Nous avons montr, dans un premier temps, que l'hyperalgsie thermique et les allodynies tactile et au froid sont renverses par un traitement chronique avec lantagoniste du RB1, SSR240612, administr par gavage raison de 10 mg /kg/jr entre le 15 e et le 20 e jour aprs la ligature du nerf sciatique et par un traitement antioxydant, la N-actyl-L-cystine, administre par gavage la dose de 1g/kg/jr, 4jours prcdant la ligature et pendant les 2 semaines aprs la ligature. Un traitement aigu avec le ii SSR240612 (10 mg/kg) ou avec un antagoniste du RB1 qui ne traverse pas la barrire hmato-encphalique, le R-954 (2mg/kg, s.c.), na bloqu que lhyperalgsie thermique. Dans un second temps, lantagoniste du TRPV1, le SB366791, administr raison de 1 mg/kg/jr par voie sous-cutane du j-1 au j-14 a renvers lallodynie tactile et lhyperalgsie thermique. De plus, nous avons not deux semaines aprs la LPNS, des augmentations significatives des niveaux d'ARNm du RB1 dans la moelle pinire lombaire, le nerf sciatique et le GRD du ct ipsilatral la ligature. Ces augmentations ont t renverses par le traitement avec la N-actyl-L-cystine et lantagoniste du TRPV1. Le RB1 a t localis au niveau des fibres de type C avec le marquage au CGRP (Calcitonin Gene-Related Peptide) et au niveau de la microglie utilisant le marquage au Iba-1 dans la moelle pinire lombaire des rats ayant subi une LPNS, 2 semaines plus tt. Au terme de cette tude, nous avons suggr que la surexpression du RB1 sur les fibres de type C contribuerait lhyperalgsie thermique alors que le RB1 sur la microglie dans la moelle pinire contribuerait aux allodynies tactile et au froid dans le modle LPNS chez le rat. Le stress oxydatif pourrait tre impliqu dans linduction du RB1. Bien que le rle du TRPV1 semble plutt limit la douleur thermique, il pourrait cependant agir via le RB1 sur les fibres de type C.
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La greffe de sang de cordon est de plus en plus utilise et a permis de traiter avec succs chez lenfant des dficits immunitaires ainsi que des hmopathies malignes comme les leucmies. Malgr dimportants avantages tels que labsence de risque pour le donneur ou la plus faible incidence de maladie du greffon contre lhte (GvHD), utiliser le sang de cordon comporte certains inconvnients. En effet, une reconstitution immunitaire retarde, des infections opportunistes en plus grand nombre et un risque de rechute sont des complications qui peuvent survenir et engendrer un risque pour le pronostic vital du patient. Par consquent, de nouvelles stratgies dimmunothrapies doivent tre envisages. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes particulirement intresss aux cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) dont les fonctions sont importantes pour linitiation des rponses immunitaires inne et adaptative et particulirement pour leur capacit activer les cellules NK. Afin dlucider le rle et limpact de ces cellules dans les greffes de sang de cordon, le nombre et la fonction des pDC et des NK a t suivi longitudinalement chez des patients ayant subi une greffe de sang de cordon comparativement des patients transplants avec de la moelle osseuse. Nous avons ainsi dmontr que les pDC et les NK apparaissent prcocement suite une greffe de sang de cordon et que ces cellules sont fonctionnelles. Ces rsultats mettent donc en lumire que ces cellules pourraient tre de bons outils pour ltablissement dune immunothrapie aprs greffe de sang de cordon. De plus, la caractrisation fonctionnelle des pDC du greffon de sang de cordon a permis de rvler une plus faible production dIFN- par les pDC, comparativement aux pDC de sang dadulte. Cette diffrence pourrait jouer un rle dans la plus faible incidence de GvHD aprs les greffes de sang de cordon. Dans le but de prciser les mcanismes molculaires de rgulation ngative de la production dIFN- par les pDC de sang de cordon, nous avons tudi les protines de la voie de signalisation TLR9-IRF7. Lexpression similaire de lARN du TLR9, MyD88, IRAK1 et IRF7 contraste avec la plus faible expression des protines correspondantes. De plus, lexpression des MicroARNs miR-146a et miR-155 est plus lev dans les pDC de sang de cordon comparativement aux pDC de sang dadultes. Ensemble, ces donnes pointent une rgulation ngative post-transcriptionnelle de la voie TLR9-IRF7 qui pourrait expliquer la plus faible production dIFN- des pDC du sang de cordon. Lensemble des ces travaux suggre que les pDC pourraient reprsenter une cible de choix dans le dveloppement de nouvelles approches thrapeutiques dans les greffes de sang de cordon.
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Durant une infection pulmonaire, les porcs sont souvent infects par plus dun microorganisme. Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) sont des pathognes qui peuvent infecter de manire simultane les porcs. Lobjectif du prsent projet est dtudier linteraction entre ces pathognes. Les deux lignes cellulaires permissives au VSRRP utilises sont les cellules St-Jude porcine lung (SJPL) et MARC-145. Les cellules ont t pr-infectes avec le VSRRP, puis infectes avec A. pleuropneumoniae. Un dosage de la lactate dshydrognase a montr quune co-infection VSRRP-A. pleuropneumoniae compare une infection simple augmente significativement la cytotoxicit. Dans les mmes conditions exprimentales, une pr-infection virale ne semble pas affecter ladhrence dA. pleuropneumoniae aux cellules. laide de tests ELISA, il a t possible de dmontrer la production dIL-8 et dINF- lorsquil y a infection des cellules. Pour ce qui est du TNF-, dIL-6 et dIL-10, ces cytokines ne sont pas dtectes en prsence des pathognes tudis. Des expriences de pr-infection bactrienne suivie dinfection virale ont galement t ralises. Il a t dmontr que la pr-infection avec A. pleuropneumoniae diminuait la rplication du VSRRP chez la ligne cellulaire SJPL, mais cela nest pas observ avec la ligne cellulaire MARC-145. Les rsultats prliminaires ont dmontr que cette diminution de la rplication serait cause par une molcule de faible poids molculaire scrte dans le surnageant bactrien et celle-ci serait rsistante la chaleur. Les lignes cellulaires SJPL et MARC-145 reprsentent de bons modles pour ltude des infections mixtes des voies respiratoires du porc.
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Ladministration de fer dextran 10 mg/kg intramusculaire (IM) est un traitement empirique couramment recommand en mdecine aviaire lors dhmorragie ou danmie. Lobjectif principal de cette tude tait dvaluer les effets de ce traitement sur lanmie chez les oiseaux de proie. Deux types dindividus ont t utiliss : des crcerelles dAmrique (Falco sparverius) o une anmie par perte de sang externe aigu a t cre (deux phlbotomies de 20-40 % du volume sanguin total un intervalle de 6 h) et des oiseaux de proie sauvages de diffrentes espces souffrant danmies diverses. Lensemble des oiseaux a t subdivis alatoirement en groupe traitement (fer dextran 10 mg/kg IM) et contrle (NaCl 0,9% IM). Un suivi dans le temps a t ralis afin dtudier leur rcupration de lanmie, la prsence deffets secondaires au traitement et limpact dune administration de fer sur ces rserves. Aucune diffrence significative na t observe entre les deux groupes en ce qui concerne les signes cliniques, lhmatocrite, le pourcentage des polychromatophiles/rticulocytes, la densit cellulaire et le fer de la moelle osseuse, la cratine kinase et le fer plasmatique. La majorit des crcerelles ont prsent une myosite au site dinjection du fer. Nos rsultats suggrent quune administration de 10 mg/kg de fer dextran IM na pas deffet sur lrythropose des rapaces souffrant danmie par perte de sang externe aigu, quelle provoque une lgre inflammation au site dinjection et quelle ninfluence pas les rserves de fer. Le comptage des rticulocytes en anneau et des polychromatophiles semble tre deux mthodes quivalentes.
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La phagocytose est un processus cellulaire par lequel de larges particules sont internalises dans une vsicule, le phagosome. Lorsque form, le phagosome acquiert ses proprits fonctionnelles travers un processus complexe de maturation nomm la biognse du phagolysosome. Cette voie implique une srie dinteractions rapides avec les organelles de lappareil endocytaire permettant la transformation graduelle du phagosome nouvellement form en phagolysosome partir duquel la dgradation protolytique seffectue. Chez lamibe Dictyostelium discoideum, la phagocytose est employe pour ingrer les bactries de son environnement afin de se nourrir alors que les organismes multicellulaires utilisent la phagocytose dans un but immunitaire, o des cellules spcialises nommes phagocytes internalisent, tuent et dgradent les pathognes envahissant de lorganisme et constitue la base de limmunit inne. Chez les vertbrs mchoire cependant, la transformation des mcanismes molculaires du phagosome en une organelle perfectionne pour lapprtement et la prsentation de peptides antigniques place cette organelle au centre de limmunit inne et de limmunit acquise. Malgr le rle crucial auquel participe cette organelle dans la rponse immunitaire, il existe peu de dtails sur la composition protique et lorganisation fonctionnelles du phagosome. Afin dapprofondir notre comprhension des divers aspects qui relient limmunit inne et limmunit acquise, il devient essentiel dlargir nos connaissances sur les fonctions molculaire qui sont recrutes au phagosome. Le profilage par protomique haut dbit de phagosomes isols fut extrmement utile dans la dtermination de la composition molculaire de cette organelle. Des tudes provenant de notre laboratoire ont rvl les premires listes protiques identifies partir de phagosomes murins sans toutefois dterminer le ou les rle(s) de ces protines lors du processus de la phagocytose (Brunet et al, 2003; Garin et al, 2001). Au cours de la premire tude de cette thse (Stuart et al, 2007), nous avons entrepris la caractrisation fonctionnelle du protome entier du phagosome de la drosophile en combinant diverses techniques danalyses haut dbit (protomique, rseaux dintractions protique et ARN interfrent). En utilisant cette stratgie, nous avons identifi 617 protines phagosomales par spectromtrie de masse partir desquelles nous avons accru cette liste en construisant des rseaux dinteractions protine-protine. La contribution de chaque protine linternalisation de bactries fut ensuite teste et valide par ARN interfrent haut dbit et nous a amen identifier un nouveau rgulateur de la phagocytose, le complexe de lexocyst. En appliquant ce modle combinatoire de biologie systmique, nous dmontrons la puissance et lefficacit de cette approche dans ltude de processus cellulaire complexe tout en crant un cadre partir duquel il est possible dapprofondir nos connaissances sur les diffrents mcanismes de la phagocytose. Lors du 2e article de cette thse (Boulais et al, 2010), nous avons entrepris la caractrisation molculaire des tapes volutives ayant contribu au remodelage des proprits fonctionnelles de la phagocytose au cours de lvolution. Pour ce faire, nous avons isol des phagosomes partir de trois organismes distants (lamibe Dictyostelium discoideum, la mouche fruit Drosophila melanogaster et la souris Mus musculus) qui utilisent la phagocytose des fins diffrentes. En appliquant une approche protomique grande chelle pour identifier et comparer le protome et phosphoprotome des phagosomes de ces trois espces, nous avons identifi un cur protique commun partir duquel les fonctions immunitaires du phagosome se seraient dveloppes. Au cours de ce dveloppement fonctionnel, nos donnes indiquent que le protome du phagosome fut largement remodel lors de deux priodes de duplication de gnes concidant avec lmergence de limmunit inne et acquise. De plus, notre tude a aussi caractrise en dtail lacquisition de nouvelles protines ainsi que le remodelage significatif du phosphoprotome du phagosome au niveau des constituants du cur protique ancien de cette organelle. Nous prsentons donc la premire tude approfondie des changements qui ont engendr la transformation dun compartiment phagotrophe une organelle entirement apte pour la prsentation antignique.
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La dihyrofolate rductase de type II R67 (DHFR R67) est une enzyme bactrienne encode par un plasmide donc aisment transmissible. Elle catalyse la raction de rduction du dihydrofolate (DHF) en ttrahydrofolate (THFA) essentiel pour la prolifration cellulaire. La DHFR R67 est une enzyme qui dpend du cofacteur NADPH. La DHFR R67 est diffrente, structurellement et gntiquement, de lenzyme DHFR chromosomale prsente chez tous les organismes et elle est rsistante au trimthoprime (TMP) qui est largement utilis dans les traitements antibactriens chez lHomme. Aucun inhibiteur slectif contre la DHFR R67 nest actuellement rpertori. Le but de cette tude a t didentifier des molcules qui pourront inhiber la DHFR R67 slectivement, sans affecter la DHFR humaine (DHFRh). La vrification de la qualit des essais enzymatiques en conditions dtermines pour le criblage dinhibiteurs sur plusieurs lectrices plaques a identifi des appareils appropris pour lanalyse. Ltude de lactivit enzymatique de la DHFR R67 et de la DHFRh en prsence des solvants organiques et liquides ioniques (LIs), comme des co-solvants pour le criblage rationnel dinhibiteurs, a montr que certains LIs peuvent servir de milieu alternatif pour les essais enzymatiques. Le criblage rationnel bas sur lapproche du design dun inhibiteur partir de petites molcules, a rvl des molcules primaires qui inhibent la DHFR R67 de faon faible, mais slective. Le test des composs biologiquement actifs qui comprennent des petits fragments, a montr laugmentation de laffinit entre la DHFR R67 et les composs tests. Trois composs ont t dtermins comme des inhibiteurs slectifs prometteurs pour la DHFR R67.
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La consultation de bases de donnes publiques en bio-informatique est essentielle pour quiconque a un intrt pour la biologie cellulaire, la gntique ou la biologie des systmes. Les notices de ces bases contiennent surtout des donnes spcialises: squences de nuclotides ou dacides amins, structures de protines en trois dimensions, ou encore composantes de sentiers biologiques. Cependant, il peut tre difficile de localiser linformation souhaite parmi les centaines de bases de donnes disponibles. La Bibliothque de la sant de lUniversit de Montral offre depuis janvier 2010 une activit de dcouverte des bases de donnes du National Center for Biotechnology Information; on y explore une vingtaine de bases et doutils laide dexercices pratiques. Les moyens utiliss pour raliser, publiciser et valuer cette nouvelle activit de formation seront prsents.
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Plusieurs tudes ont montr que la perturbation des fonctions du systme cardiovasculaire constitue un risque majeur de dveloppement du trouble dpressif chez l'homme. De plus, suite un infarctus du myocarde, 15-30% de la population dveloppe la dpression majeure dans les 6 8 mois suivant cet vnement suggrant un lien entre les maladies cardiovasculaires et la dpression. Cette dpression est caractrise par une srie de troubles du sommeil. Approximativement 80% des patients hospitaliss et 70% des malades en consultation externe avec une dpression majeure rapportent des difficults dinitiation et de maintient du sommeil. Les travaux effectus dans les laboratoires de Roger Godbout et Guy Rousseau ont montr que suite un infarctus aigu du myocarde chez le rat, on observait de l'anhdonie, de la dtresse comportementale et de la mort cellulaire par apoptose dans le systme limbique. Cette apoptose suivait un dcours spatial et temporel et avait t prvenue par ladministration dantidpresseurs. De plus, le facteur de ncrose tumorale alpha (TNF-) serait un composant majeur dans lactivation de la voie extrinsque conduisant la mort cellulaire observe dans le systme limbique. Les rsultats de cette thse montrent que les rats ayant subi un infarctus du myocarde (IM) prsentaient la fois des troubles du sommeil, de l'anhdonie et de la dtresse comportementale comparables ceux des autres modles animaux de dpression. Les symptmes de dpression ont t prvenus par l'administration la fois d'un antidpresseur (escitalopram) et d'un inhibiteur de la synthse des cytokines proinflammatoires (pentoxifylline). Les troubles du sommeil et l'apoptose avaient aussi t prvenus par l'admistration respective de l'escitalopram et de la pentoxifylline. De plus, les animaux ayant subi un IM prsentaient une diminution du nombre de cellules cholinergiques dans le gnrateur du sommeil paradoxal expliquant en partie la rduction de la dure du sommeil paradoxal observe dans cette thse. Les animaux ayant subi un IM montraient une augmentation systmique du TNF-, l'interleukine-1 (IL-1), et la prostaglandine E2 (PGE2). Le traitement par l'escitalopram bloquait l'augmentation des niveaux plasmatiques du TNF-, de l'IL-1, et de la PGE2 sans affecter celui de la corticostrone et de l'IL-6. Finalement, pour la premire fois, nous avons mis vidence qu'un traitement autre qu'un antidpresseur (pentoxifylline) pouvait rduire le comportement dpressif dans la dpression post-infarctus du myocarde lorsqu'il est administr quelques minutes avant la priode ischmique. Il apparait donc important dintervenir rapidement chez les patients la suite d'un IM et ce ds les premiers jours et avant mme lapparition des premiers signes dinsomnie et de dpression. Une combinaison de traitements pharmacologique et comportemental serait une voie intressante considrer dans la prise en charge de ces patients.
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Limmunothrapie tumorale mdiation cellulaire est un traitement qui utilise le systme immunitaire des patients afin dinduire une rponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette rponse est produite suite la reconnaissance des antignes par les T CD8+. Ces cibles sont appeles antignes tumoraux (TAA) et dfinies comme des protines exprimes par les cellules cancreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifi Dickkopf-1 (DKK1), une protine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothrapie mdiation cellulaire efficace requiert lidentification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothrapie pourrait galement tre amliores par laugmentation de la puissance daction anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spcifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractrisation de lexpression de DKK1 dans les cancers communs et la dtermination de son immunognicit afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints dun cancer commun, vers un phnotype moins diffrenti afin daugmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractris lexpression de DKK1 dans le cancer du sein et dans dautres cancers communs. Le profil dexpression de DKK1 a t tudi par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignes cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. Lexpression de DKK1 a aussi t tudie dans des chantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant dun cancer du sein exprimaient DKK1. La moiti des tumeurs DKK1(+) tait triple ngative, donc pas de rcepteurs dstrogne et de progestrone et tait Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilits de traitements trs restreintes). De plus, 50% des chantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectues dans le cancer du poumon ont t, par la suite, corrobores par d'autres groupes qui ont montr une corrlation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Aprs avoir confirme lexpression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons valu limmunognicit de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectu des stimulations in vitro de cellules mononucles du sang priphrique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s dun cancer du sein ou du poumon avec des peptides drivs de DKK1 pouvant tre prsents par les complexes majeurs dhistocompatibilit (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont t identifis et isols. Par essai multiplex et cytomtrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalit dun ces clones T CD8+ spcifiques DKK1 a t tudie et a rvle un profil effecteur, renforant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans lensemble, les rsultats obtenus dans cette premire partie de thse suggrent une possible utilisation de DKK1 en immunothrapie contre les cancers communs, attribuable son expression dans ces cancers et la possibilit de faire prolifrer des T CD8+ effecteurs spcifiques DKK1 partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thse, je dcrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints dun cancer commun, afin daugmenter la force et la dure de leurs fonctions anti-tumorales. Il a t dmontr que des lymphocytes moins diffrentis sont capables dune rponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons bas ce projet sur lutilisation dun inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur confrer un phnotype moins diffrenti, partageant des caractristiques de la cellule nave et de la cellule mmoire. Des cultures de T CD8+, spcifiques des antignes viraux, en prsence de linhibiteur ont permis daugmenter la scrtion dinterfron (IFN)- et leur activit cytotoxique. Ces rsultats indiquent un effet de lactivation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportes pour la premire fois chez les T CD8+ humains et suggrent une nouvelle stratgie, applicables limmunothrapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activit anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont men la ralisation dune tape trs importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la dmonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux drivs dorganes importants. Ces travaux ont galement men la dmonstration de limmunognicit de DKK1, par lidentification dun peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, ltude de la polyfonctionnalit des T CD8+ spcifiques DKK1 a rvle un profil effecteur favorable pour lobtention dune rponse anti-tumorale efficace. Ces dcouvertes pourraient servir llaboration dune stratgie dimmunothrapie mdiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, ltude phnotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donn lieu lobservation dun phnotype encore jamais rapport chez lhumain, confrant aux T CD8+ un aspect moins diffrenti avec des caractristiques propre un phnotype mmoire. Ces rsultats sont pertinents dans lamlioration de limmunothrapie du cancer, passant par laugmentation de la persistance des lymphocytes. En rsum, les rsultats prsents dans cette thse de doctorat fournissent des vidences indniables quant la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothrapie mdiation cellulaire des cancers communs. Ces rsultats fournissent galement des preuves quant la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par lactivation de la voie de la voie de Wnt, afin de gnrer des lymphocytes mdiateurs plus efficaces pour ce type de thrapie.
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Limmunit adaptive et la discrimination entre le soi et le non-soi chez les vertbrs mchoire reposent sur la prsentation de peptides par les rcepteurs dhistocompatibilit majeur de classe I. Les peptides antigniques, prsents par les molcules du complexe dhistocompatibilit (CMH), sont scruts par les lymphocytes T CD8 pour une rponse immunitaire approprie. Le rpertoire des peptides du CMH de classe I, aussi appel immunopeptidome, est gnr par la dgradation protosomale des protines endognes, et a un rle essentiel dans la rgulation de limmunit cellulaire. La composition de limmunopeptidome dpend du type de cellule et peut prsenter des caractristiques lies des maladies comme le cancer. Les peptides antigniques peuvent tre utiliss des fins immunothrapeutiques notamment dans le traitement voire la prvention de certains cancers. La spectromtrie de masse est un outil de choix pour lidentification, le squenage et la caractrisation de ces peptides. Cependant, la composition en acides amins, la faible abondance et la diversit de ces peptides compliquent leur dtection et leur squenage. Nous avons dvelopp un programme appel StatPeaks qui permet de calculer un certains nombres de statistiques relatives la fragmentation des peptides. laide de ce programme, nous montrons sans quivoque que les peptides du CMH classe I, en mode de fragmentation par dissociation induite par collision (CID), fragmentent trs diffremment des peptides trypsiques communment utiliss en protomique. Nanmoins, la fragmentation par dcomposition induite par collision plus haute nergie (HCD) propose par le spectromtre LTQ-Orbitrap Velos amliore la fragmentation et fournit une haute rsolution qui permet dobtenir une meilleure confiance dans lidentification des peptides du CMH de classe I. Cet avantage permet deffectuer le squenage de novo pour identifier les variants polymorphes qui ne sont normalement pas identifis par les recherches utilisant des bases de donnes. La comparaison des programmes de squenage Lutefisk, pepNovo, pNovo, Vonode et Peaks met en vidence que le dernier permet didentifier un plus grand nombre de peptides du CMH de classe I. Ce programme est intgr dans une chane de traitement de recherche dantignes mineurs dhistocompatibilit. Enfin, une base de donnes contenant les informations spectrales de plusieurs centaines de peptides du CMH de classe I accessible par Internet a t dveloppe.
Resumo:
Les habitudes de consommation de substances psychoactives, le stress, lobsit et les traits cardiovasculaires associs seraient en partie relis aux mmes facteurs gntiques. Afin dexplorer cette hypothse, nous avons effectu, chez 119 familles multi-gnrationnelles qubcoises de la rgion du Saguenay-Lac-St-Jean, des tudes dassociation et de liaison pangnomiques pour les composantes gntiques : de la consommation usuelle dalcool, de tabac et de caf, de la rponse au stress physique et psychologique, des traits anthropomtriques relis lobsit, ainsi que des mesures du rythme cardiaque (RC) et de la pression artrielle (PA). 58000 SNPs et 437 marqueurs microsatellites ont t utiliss et lannotation fonctionnelle des gnes candidats identifis a ensuite t ralise. Nous avons dtect des corrlations phnotypiques significatives entre les substances psychoactives, le stress, lobsit et les traits hmodynamiques. Par exemple, les consommateurs dalcool et de tabac ont montr un RC significativement diminu en rponse au stress psychologique. De plus, les consommateurs de tabac avaient des PA plus basses que les non-consommateurs. Aussi, les hypertendus prsentaient des RC et PA systoliques accrus en rponse au stress psychologique et un indice de masse corporelle (IMC) lev, comparativement aux normotendus. Dautre part, lutilisation de tabac augmenterait les taux corporels dpinphrine, et des niveaux levs dpinphrine ont t associs des IMC diminus. Ainsi, en accord avec les corrlations inter-phnotypiques, nous avons identifi plusieurs gnes associs/lis la consommation de substances psychoactives, la rponse au stress physique et psychologique, aux traits relis lobsit et aux traits hmodynamiques incluant CAMK4, CNTN4, DLG2, DAG1, FHIT, GRID2, ITPR2, NOVA1, NRG3 et PRKCE. Ces gnes codent pour des protines constituant un rseau dinteractions, impliques dans la plasticit synaptique, et hautement exprimes dans le cerveau et ses tissus associs. De plus, lanalyse des sentiers de signalisation pour les gnes identifis (P = 0,03) a rvl une induction de mcanismes de Potentialisation Long Terme. Les variations des traits tudis seraient en grande partie lies au sexe et au statut dhypertension. Pour la consommation de tabac, nous avons not que le degr et le sens des corrlations avec lobsit, les traits hmodynamiques et le stress sont spcifiques au sexe et la pression artrielle. Par exemple, si des variations ont t dtectes entre les hommes fumeurs et non-fumeurs (anciens et jamais), aucune diffrence na t observe chez les femmes. Nous avons aussi identifi de nombreux traits relis lobsit dont la corrlation avec la consommation de tabac apparat essentiellement plus lie des facteurs gntiques quau fait de fumer en lui-mme. Pour le sexe et lhypertension, des diffrences dans lhritabilit de nombreux traits ont galement t observes. En effet, des analyses gntiques sur des sous-groupes spcifiques ont rvl des gnes additionnels partageant des fonctions synaptiques : CAMK4, CNTN5, DNM3, KCNAB1 (spcifique lhypertension), CNTN4, DNM3, FHIT, ITPR1 and NRXN3 (spcifique au sexe). Ces gnes codent pour des protines interagissant avec les protines de gnes dtects dans lanalyse gnrale. De plus, pour les gnes des sous-groupes, les rsultats des analyses des sentiers de signalisation et des profils dexpression des gnes ont montr des caractristiques similaires celles de lanalyse gnrale. La convergence substantielle entre les dterminants gntiques des substances psychoactives, du stress, de lobsit et des traits hmodynamiques soutiennent la notion selon laquelle les variations gntiques des voies de plasticit synaptique constitueraient une interface commune avec les diffrences gntiques lies au sexe et lhypertension. Nous pensons, galement, que la plasticit synaptique interviendrait dans de nombreux phnotypes complexes influencs par le mode de vie. En dfinitive, ces rsultats indiquent que des approches bases sur des sous-groupes et des rseaux amlioreraient la comprhension de la nature polygnique des phnotypes complexes, et des processus molculaires communs qui les dfinissent.
Resumo:
La mmoire et lapprentissage sont des phnomnes complexes qui demeurent encore incertains quant aux origines cellulaire et molculaire. Il est maintenant connu que des changements au niveau des synapses, comme la plasticit synaptique, pourraient dterminer la base cellulaire de la formation de la mmoire. Alors que la potentialisation long-terme (LTP) reprsente un renforcement de lefficacit de transmission synaptique, la dpression long-terme (LTD) constitue une diminution de lefficacit des connexions synaptiques. Des tudes ont mis jour certains mcanismes qui participent ce phnomne de plasticit synaptique, notamment, les mcanismes dinduction et dexpression, ainsi que les changements morphologiques des pines dendritiques. La grande majorit des synapses excitatrices glutamatergiques se situe au niveau des pines dendritiques et la prsence de la machinerie traductionnelle prs de ces protubrances suggre fortement lexistence dune traduction locale dARNm. Ces ARNm seraient dailleurs achemins dans les dendrites par des protines pouvant lier les ARNm et assurer leur transport jusquaux synapses actives. Le rle des protines Staufen (Stau1 et Stau2) dans le transport, la localisation et dans la rgulation de la traduction de certains ARNm est bien tabli. Toutefois, leur rle prcis dans la plasticit synaptique demeure encore inconnu. Ainsi, cette thse de doctorat value limportance des protines Staufen pour le transport et la rgulation dARNm dans la plasticit synaptique. Nous avons identifi des fonctions spcifiques chaque isoforme; Stau1 et Stau2 tant respectivement impliques dans la late-LTP et la LTD dpendante des rcepteurs mGluR. Cette spcificit sapplique galement au rle que chaque isoforme joue dans la morphogense des pines dendritiques, puisque Stau1 semble ncessaire au maintien des pines dendritiques matures, alors que Stau2 serait davantage implique dans le dveloppement des pines. Dautre part, nos travaux ont permis de dterminer que la morphogense des pines dendritiques dpendante de Stau1 tait rgule par une plasticit synaptique endogne dpendante des rcepteurs NMDA. Finalement, nous avons prcis les mcanismes de rgulation de lARNm de la Map1b par Stau2 et dmontr limportance de Stau2 pour la production et lassemblage des granules contenant les transcrits de la Map1b ncessaires pour la LTD dpendante des mGluR. Les travaux de cette thse dmontrent les rles spcifiques des protines Stau1 et Stau2 dans la rgulation de la plasticit synaptique par les protines Stau1 et Stau2. Nos travaux ont permis dapprofondir les connaissances actuelles sur les mcanismes de rgulation des ARNm par les protines Staufen dans la plasticit synaptique. MOTS-CLS EN FRANAIS: Staufen, hippocampe, plasticit synaptique, granules dARN, traduction, pines dendritiques.
