Caracterização molecular dos componentes do veneno de lonomia obliqua : genes expressos e princípios ativos envolvidos nos distúrbios da coagulação e da fibrinólise

A hemostasia é um processo multifuncional, complexo e finamente regulado que envolve diversos componentes celulares e moleculares, incluindo plaquetas, parede vascular, cascata da coagulação sangüínea e fibrinólise. O desequilíbrio desses componentes pode desencadear condições patológicas, tais como hemorragias, hipercoagulopatias e a conseqüente trombose vascular. O descobrimento de novos princípios ativos e o desenvolvimento de drogas como instrumentos de intervenção antitrombótica constituem estratégias de eleição para a prevenção e o tratamento do quadro trombo-embólico. Muitos desses princípios ativos são obtidos de fontes naturais, incluindo os conhecidos anti-hemostáticos presentes em venenos de serpentes e na saliva de artrópodos hematófagos. Por afetarem o sistema hemostático humano, essas moléculas são alvo de estudos para o desenvolvimento de anti-venenos, testes laboratoriais e novas drogas terapêuticas. As lagartas do gênero Lonomia são conhecidas por produzirem proteínas tóxicas que estão associadas a uma severa síndrome hemorrágica em humanos, cujo quadro clínico é caracterizado por distúrbios da coagulação, insuficiência renal aguda, hematúria, sangramentos, dentre outros sintomas. O veneno é constituído por diversos princípios ativos, incluindo atividades pró-coagulantes e fibrinolíticas Apesar da importância social e científica desses envenenamentos e do conhecimento sobre a natureza dessas toxinas, as informações sobre as características moleculares do veneno ainda são escassas, o que limita o melhor entendimento das bases moleculares da síndrome hemorrágica e o desenvolvimento de um diagnóstico e de um tratamento mais adequados para os pacientes. O presente trabalho teve por objetivo analisar as proteínas mais abundantes e os genes expressos em maior proporção na taturana L. obliqua durante a fase larval (fase em que ocorrem os acidentes), visando identificar moléculas potencialmente envolvidas no envenenamento. As etapas realizadas foram: análise dos princípios ativos presentes em tecidos utilizados para a construção de bibliotecas de cDNA, seqüenciamento em massa das bibliotecas e análise dos transcritos utilizando ferramentas de bioinformática. Mais de mil seqüências de cDNA foram obtidas e agrupadas gerando um catálogo com informações sobre os transcritos encontrados, incluindo seqüências completas de cDNAs que codificam para proteínas provavelmente envolvidas no envenenamento, além de novas seqüências de função biológica desconhecida O conteúdo protéico do veneno foi analisado por SDS-PAGE seguido por seqüenciamento da região N-terminal das proteínas mais abundantes, possibilitando a correlação entre o cDNA e a proteína por ele codificada. As seqüências completas de cDNA foram enviadas para o GenBank (NCBI/NIH, EUA) e os resultado estão disponíveis em um sítio eletrônico específico no NCBI: http://www.ncbi.nih.gov/projects/omes. O cDNA mais abundante da lagarta, que codifica para uma lipocalina, foi clonado e obteve-se a proteína recombinante. Demonstramos que essa lipocalina liga o grupamento heme e participa da oxidação acoplada desse ligante, levando à formação de biliverdina γ, sugerindo uma nova função para as proteínas ligadoras de bilina em insetos. Os resultados obtidos colaboram para o maior entendimento das bases moleculares do envenenamento por L. obliqua, além de apontarem moléculas candidatas para o desenvolvimento de kits de diagnóstico para o envenenamento com Lonomia e para a melhora na especificidade do soro anti-lonômico, bem como para estudos mais aprofundados dos processos hemostáticos.

Caracterização de genes de quitanases do entomopatógeno e acaricida Metarhizium anisopliae

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.

Desenvolvimento de ferramentas moleculares para indução de tolerância imunológica em transplante

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

Desenvolvimento de uma estratégia de fusão gênica visando à localização de proteínas em plantas

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos.

Obtenção e avaliação da proteína BYC (Boophilus Yolk pro-Cathepsin) recombinante em uma vacina contra o carrapato Boophilus microplus

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grande prejuízo à pecuária. O principal método de controle deste parasita baseia-se no uso de acaricidas, entretanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle promissor. A Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese que foi anteriormente testada como imunógeno vacinal. Neste estudo, o cDNA da BYC foi amplificado por PCR e clonado em dois vetores de expressão para produção de duas formas da proteína recombinante com cauda de histidina, rBYC e rBYC-Trx (fusionada com tioredoxina). As duas formas foram expressas em Escherichia coli na forma de corpúsculos de inclusão (CI) e comparadas quanto ao nível de expressão, solubilidade e rendimento na purificacão. Três agentes desnaturantes (N-lauroil sarcosina, hidrocloreto de guanidina e uréia) foram testados para solubilização dos CIs. Sarcosina foi o agente mais eficiente, solubilizando mais de 90 % de rBYC-Trx e rBYC. As duas proteínas recombinantes foram purificadas em cromatografia de afinidade por metal (Ni2+), sob condições desnaturantes. O rendimento na purificação da proteína solúvel foi de 84 % para r-BYC-Trx e 6 % para rBYC. As duas formas foram reconhecidas por soro de coelhos, camundongos e bovinos previamente imunizados com BYC nativa, demonstrando a existência de epítopos comuns entre a BYC nativa e as formas recombinantes expressas em E. coli. Para verificar o potencial vacinal da proteína recombinante, um grupo de bovinos Hereford foi imunizado com rBYC e desafiado com 20.000 larvas de B. microplus por animal. Os soros dos bovinos imunizados reconheceram a BYC nativa em ELISA e “Western blot”, com títulos entre 500 e 4.000. Os resultados do desafio mostraram uma proteção parcial contra a infestação, com 25 % de proteção global. O perfil de expressão de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ) foi verificado por RT-PCR, porém os resultados não permitiram identificar a polarização da resposta imune em Th1 ou Th2. Os resultados de imunoproteção obtidos com a BYC recombinante foram similares aos obtidos na imunização de bovinos com BYC nativa, indicando a possibilidade de uso da forma recombinante como imunógeno vacinal.

Estudo molecular e confirmação do aspecto patogênico de mutações novas em pacientes brasileiros com a Síndrome de Morquio A

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.

Caracterização e comparação de genes expressos em ápices meristemáticos de cana-de-açúcar cultivados em SP e RN

In this work, we used sugarcane as a model due to its importance for sugar and ethanol production. Unlike the current plant models, sugarcane presents a complex genetics and an enormous allelic variation. Here, we report the analysis of SAGE libraries produced using the shoot apical meristem from contrasted genotypes by flowering induction (non-flowering vs. early-flowering varieties) grown under São Paulo state conditions. The expression pattern was analyzed using samples from São Paulo (SP) and Rio Grande do Norte (RN) states. These results showed that cDNAs identified by SAGE libraries had differential expression only in São Paulo state samples. Furthermore, the cDNA identified CYP (Citocrome P450) was chosen for in silico and genome characterization because it was found in SAGE libraries and subtractive libraries from samples from RN. Phylogenetic trees showed the relationship for these sequences. Furthermore, the qRT-PCR for CYP showed a potential role as flowering indutor for RN samples considering different isophorms. Considering the results present here, it can be consider that CYP gene may be used as molecular marker

Caracterização funcional de dois cDNAs homólogos à ciclofilina e à proteína reprimida por auxina (ARP) identificados em bibliotecas subtrativas a para floração em tomateiro

Flowering is a fundamental process in the life cycle for plant. This process is marked by vegetative to reproductive apical meristem conversion, due to interactions between several factors, both internal and external to plant. Therefore, eight subtractive libraries were constructed using apical meristem induced or not induced for two contrasting species: Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom and Solanum pimpinellifolium. Several cDNAs were identified and among these, were selected two cDNAs: one homologous cDNA to cyclophilin (LeCYP1) and the other to Auxin repressed protein (ARP). It has observed that LeCYP1 and ARP genes are important in the developmental process to plants. In silico analysis, were used several databases with the exclusion criterion E-value <1.0x10-15. As a result, conservation was observed for proteins analyzed by means of multiple alignments and the presence of functional domains. Then, overexpression cassettes were constructed for the ARP cDNA in sense and antisense orientations. For this step, it was used the CaMV35S promoter. The cDNA orientation (sense or antisense) in relation to the promoter was determined by restriction enzymes and sequencing. Then, this cassette was transferred to binary vector pZP211 and these cassettes were transferred into Agrobacterium tumefaciens LBA4404. S. lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) and MT-Rg1 plants were transformed. In addition, seedlings were subjected to hormone treatments using a synthetic auxin (- naphthalene acetic acid) and cyclosporin A (cyclophilin inhibitor) treatments and it was found that the hormone treatment there were changes in development of lateral roots pattern, probably related to decreases in auxin signaling caused by reduction of LeCYP1 in MT-dgt plants while cyclosporin A treatments, there was a slight delay in flowering in cv. MT plants. Furthermore, assay with real-time PCR (RT-qPCR) were done for expression level analysis from LeCYP1 and ARP in order to functionally characterize these sequences in tomato plants.

Análise do transcriptoma das glândulas venenosas do escorpião Tityus stigmurus

In Brazil, accidents with scorpions are considered of medical importance, not only by the high incidence, but also for the potentiality of the venom from some species in determining severe clinical conditions. Tityus stigmurus is a widely distributed scorpion species in Northeastern Brazil and known to cause severe human envenomations, inducing pain, hyposthesia, edema, erythema, paresthesia, headaches and vomiting. The present study uses a transcriptomic approach to characterize the molecular repertoire from the non-stimulated venom gland of Tityus stigmurus scorpion. A cDNA library was constructed and 540 clones were sequenced and grouped into 37 clusters, with more than one EST (expressed sequence tag) and 116 singlets. Forty-one percent of ESTs belong to recognized toxin-coding sequences, with antimicrobial toxins (AMP-like) the most abundant transcripts, followed by alfa KTx- like, beta KTx-like, beta NaTx-like and alfa NaTx-like. Our analysis indicated that 34% include other possible venom molecules , whose transcripts correspond to anionic peptides, hypothetical secreted peptides, metalloproteinases, cystein-rich peptides and lectins. Fifteen percent of ESTs are similar to cellular transcripts. Sequences without good matches corresponded to 11%. This investigation provides the first global view of cDNAs from Tityus stigmurus. This approach enables characterization of a large number of venom gland component molecules, which belong either to known or atypical types of venom peptides and proteins from the Buthidae family

Análise filogenética e funcional de dois genes de reparo homólogos a AP endonuclease em cana-de-açúcar: ScARP1 e ScARP3

The genome of all organisms constantly suffers the influence of mutagenic factors from endogenous and/or exogenous origin, which may result in damage for the genome. In order to keep the genome integrity there are different DNA repair pathway to detect and correct these lesions. In relation to the plants as being sessile organisms, they are exposed to this damage frequently. The Base Excision DNA Repair (BER) is responsible to detect and repair oxidative lesions. Previous work in sugarcane identified two sequences that were homologous to Arabidopsis thaliana: ScARP1 ScARP3. These two sequences were homologous to AP endonuclease from BER pathway. Then, the aim of this work was to characterize these two sequence using different approaches: phylogenetic analysis, in silico protein organelle localization and by Nicotiana tabacum transgenic plants with overexpression cassette. The in silico data obtained showed a duplication of this sequence in sugarcane and Poaceae probably by a WGD event. Furthermore, in silico analysis showed a new localization in nuclei for ScARP1 protein. The data obtained with transgenic plants showed a change in development and morphology. Transgenic plants had slow development when compared to plants not transformed. Then, these results allowed us to understand better the potential role of this sequence in sugarcane and in plants in general. More work is important to be done in order to confirm the protein localization and protein characterization for ScARP1 and ScARP3

Identificação de genes em Chromobacterium violaceum relacionados à resposta ao estresse

The sequencing of the genome of Chromobacterium violaceum identified one single circular chromosome of 4.8 Mb, in which approximately 40% of the founded ORFs are classified as hypothetical conserved or hypothetical. Some genic regions of biotechnological and biological interest had been characterized, e. g., environmental detoxification and DNA repair genes, respectively. Given this fact, the aim of this work was to identify genes of C. violaceum related to stress response, as the ones involved with mechanisms of DNA repair and/or genomic integrity maintenance. For this, a genomic library of C. violaceum was built in Escherichia coli strain DH10B (RecA-), in which clones were tested to UVC resistance, resulting in five candidates clones. In the PLH6A clone were identified four ORFs (CV_3721 to 3724). Two ORFs, CV_3722 and CV_3724, were subcloned and a synergic complementation activity was observed. The occurrence of an operon was confirmed using cDNA from C. violaceum in a RT-PCR assay. Further, it was observed the induction of the operon after the treatment with UVC. Thus, this operon was related to the stress response in C. violaceum. The mutagenesis assay with rifampicin after the treatment with UVC light showed high frequency of mutagenicity for the ORF CV_3722 (Pol III δ subunit). In this way, we propose that the C. violaceum δ subunit can act in DH10B in the translesion synthesis using Pol IV in a RecA independent-manner pathway. In growth curve assays other four clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B and PLE12H) were able to complement the function at the dose 5 J/m2 and in mutagenicity assays PLE7B, PLE10B and PLE12H showed frequencies of mutation with significant differences upon the control (DH10B), demonstrating that in some way they are involved with the stress response in C. violaceum. These clones appear to be interrelated, probably regulated by a messenger molecule (eg., nucleotide c-di-GMP) and/or global regulatory molecule (eg., σS subunit of RNA polymerase).The results obtained contribute for a better genetic knowledge of this specie and its response mechanisms to environmental stress.

Análise do efeito de polimorfismos não-sinônimos em genes de reparo de DNA da via BER na resposta inflamatória da meningite

In vitro and in animal models, APE1, OGG1, and PARP-1 have been proposed as being involved with inflammatory response. In this work, we have investigated if the SNPs APE1 Asn148Glu, OGG1 Ser326Cys, and PARP-1 Val762Ala are associated to meningitis and also developed a system to enable the functional analysis of polymorphic proteins. Patients with bacterial meningitis (BM), aseptic meningitis (AM) and controls (non-infected) genotypes were investigated by PIRA-PCR or PCR-RFLP. DNA damages were detected in genomic DNA by Fpg treatment. IgG and IgA were measured from plasma and the cytokines and chemokines were measured from cerebrospinal fluid samples using Bio-Plex assays. The levels of NF-κB and c-Jun were measured in CSF by dot blot assays. A significant (P<0.05) increase in the frequency of APE1 148Glu allele in BM and AM patients was observed. A significant increase in the genotypes Asn/Asn in control group and Asn/Glu in BM group was also found. For the SNP OGG1 Ser326Cys, the genotype Cys/Cys was more frequent (P<0.05) in BM group. The frequency of PARP-1 Val/Val genotype was higher in control group (P<0.05). The occurrence of combined SNPs increased significantly in BM patients, indicating that these SNPs may be associated to the disease. Increasing in sensitive sites to Fpg was observed in carriers of APE1 148Glu allele or OGG1 326Cys allele, suggesting that SNPs affect DNA repair activity. Alterations in IgG production were observed in the presence of SNPs APE1Asn148Glu, OGG1Ser326Cys or PARP-1Val762Ala. Reductions in the levels ofIL-6, IL-1Ra, MCP-1/CCL2and IL-8/CXCL8 were observed in the presence of APE1148Glu allele in BM patients, however no differences were observed in the levels of NF-κB and c-Jun considering genotypes and analyzed groups. Using APE1 as model, a system to enable the analysis of cellular effects and functional characterization of polymorphic proteins was developed using strategies of cloning APE1 cDNA in pIRES2-EGFP vector, cellular transfection of the construction obtained, siRNA for endogenous APE1 and cellular cultures genotyping. In conclusion, we obtained evidences of an effect of SNPs in DNA repair genes on the regulation of immune response. This is a pioneering work in the field that shows association of BER variant enzymes with an infectious disease in human patients, suggesting that the SNPs analyzed may affect immune response and damage by oxidative stress level during brain infection. Considering these data, new approaches of functional characterization must be developed to better analysis and interactions of polymorphic proteins in response to this context

Caracterização funcional de dois cDNAs de cana-de- açúcar : PKCI e SHAGGY

Flowering is controlled by several environmental and endogenous factors, usually associated with a complex network of metabolic mechanisms. The gene characterization in Arabidopsis model has provided much information about the genetic and molecular mechanisms that control flowering process. Some of these genes had been found in rice and maize. However, in sugarcane this processe is not well known. It is known that early flowering may reduce its production up to 60% at northeast conditions. Considering the impact of early flowering in sugarcane production, the aim of this work was to make the gene characterization of two cDNAs previously identified in subtractive cDNA libraries: scPKCI and scSHAGGY. The in silico analysis showed that these two cDNAs presented both their sequence and functional catalytic domains conserved. The results of transgenic plants containing the overexpression of the gene cassette scPKCI in sense orientation showed that this construction had a negative influence on the plant development as it was observed a decrease in plant height and leaf size. For the scPKCI overexpression in antisense orientation it was observed change in the number of branches from T1 transgenic plants, whereas transgenic T2 plants showed slow development during germination and initial stages of development. The other cDNA analyzed had homology to SHAGGY protein. The overexpression construct in sense orientation did not shown any effect on development. The only difference observed it was an increase in stigma structure. These results allowed us to propose a model how these two genes may be interact and affect floweringdevelopment.

Purification, characterization, crystallization and theoretical molecular modeling of gyroxin fraction from Crotalus durissus terrificus venom (Laurenti, 1768)

The venom of Crotalus durissus terrificus snakes presents various substances, including a serine protease with thrombin-like activity, called gyroxin, that clots plasmatic fibrinogen and promote the fibrin formation. The aim of this study was to purify and structurally characterize the gyroxin enzyme from Crotalus durissus terrificus venom. For isolation and purification, the following methods were employed: gel filtration on Sephadex G75 column and affinity chromatography on benzamidine Sepharose 6B; 12% SDS-PAGE under reducing conditions; N-terminal sequence analysis; cDNA cloning and expression through RT-PCR and crystallization tests. Theoretical molecular modeling was performed using bioinformatics tools based on comparative analysis of other serine proteases deposited in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database. Protein N-terminal sequencing produced a single chain with a molecular mass of similar to 30 kDa while its full-length cDNA had 714 bp which encoded a mature protein containing 238 amino acids. Crystals were obtained from the solutions 2 and 5 of the Crystal Screen Kit (R), two and one respectively, that reveal the protein constitution of the sample. For multiple sequence alignments of gyroxin-like B2.1 with six other serine proteases obtained from snake venoms (SVSPs), the preservation of cysteine residues and their main structural elements (alpha-helices, beta-barrel and loops) was indicated. The localization of the catalytic triad in His57, Asp102 and Ser198 as well as S1 and S2 specific activity sites in Thr193 and Gli215 amino acids was pointed. The area of recognition and cleavage of fibrinogen in SVSPs for modeling gyroxin B2.1 sequence was located at Arg60, Arg72, Gln75, Arg81, Arg82, Lis85, Glu86 and Lis87 residues. Theoretical modeling of gyroxin fraction generated a classical structure consisting of two alpha-helices, two beta-barrel structures, five disulfide bridges and loops in positions 37, 60, 70, 99, 148, 174 and 218. These results provided information about the functional structure of gyroxin allowing its application in the design of new drugs.

Expression of the sigma35 and cry2AB genes involved in Bacillus thuringiensis virulence

Muitos genes estão envolvidos nos mecanismos de esporulação da bactéria Bacillus thuringiensis. A regulação e expressão desses genes resultam em uma produção massiva da proteína Cry, responsável pela morte das larvas de muitos insetos. Neste trabalho monitorou-se a expressão de genes de Bacillus thuringiensis, ao longo de três fases de seu desenvolvimento. Foram construídos macroarrays de DNA dos genes selecionados, cujas seqüências estão disponibilizadas no GenBank. Estes genes foram hibridizados com cDNAs obtidos de B. thuringiensis kurstaki HD-1. As sondas de cDNA foram sintetizadas a partir da transcrição reversa do RNA da bactéria, extraído durante as fases de crescimento logarítmico, estacionária e esporulativa, marcadas com 33PadCTP. A expressão diferencial encontrada foi significativa para dois genes de B.thuringiensis, um relacionado aos fatores sigma (sigma35) e outro ao gene cry (cry2Ab). Detectaram-se diferenças entre as médias de expressão do fator sigma e do gene cry2Ab. Os valores máximos de expressão diferencial foram obtidos para o gene codificador do fator sigma35 na fase log e na fase esporulativa. Na análise de médias observou-se expressão do gene cry2Ab apenas na fase log; no entanto, de forma bem mais baixa quando comparado com a expressão de sigma35, nas três fases.