Monoclonal antibodies in fish and shellfish health management in India

The paper describes the superiority of monoclonal antibodies (MAb) over conventional polyclonal antisera. Studies undertaken indicate that Aeromonas hydrophila isolates are highly heterogenous and variation exists even between isolates from a farm, requiring a large number of MAbs for classification and use of information in vaccine development. However, some of the MAbs could be used for detection of homologous isolates in fish kidney by immunodot assay and evaluation and standardization of biofilm of A. hydrophila for oral vaccination in carps.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA): tipificação do cassete cromossômico SCCmec e resistência a antimicrobianos em pacientes com fibrose cística assistidos em dois centros no Rio de Janeiro

A infecção pulmonar de etiologia bacteriana é um dos principais problemas que levam a morbi-mortalidade na fibrose cística (FC). Staphylococcus aureus se destaca como um dos micro-organismos mais frequentes e com um agravante para a terapêutica quando se apresentam resistentes à oxacilina (MRSA). Amostras MRSA podem ser classificadas tanto genotipicamente quanto fenotipicamente em MRSA adquiridas na comunidade (CA-MRSA) ou adquiridas no hospital (HA-MRSA). Fenotipicamente, essa classificação é muito controversa, podendo se basear em critérios epidemiológicos ou ainda pelo perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Por outro lado, a classificação genotípica consiste na determinação dos cassetes cromossômicos (SCCmec), local de inserção do gene mecA (que confere resistência a meticilina). Atualmente são reconhecidos 11 tipos de SCCmec, sendo os de tipo I ao III e VIII relacionados ao genótipo HA-MRSA e IV ao XI ao genótipo CA-MRSA. Classicamente CA-MRSA é capaz de produzir a toxina Panton-Valentine leukocidin (PVL), codificada pelos genes luk-S e luk-F que está associada à pneumonia necrotizante e infecções de tecidos moles em pacientes com FC com quadros de exacerbação pulmonar. No Brasil, raros são os trabalhos envolvendo caracterização de SCCmec em amostras de pacientes com FC. Diante disso, este estudo teve como objetivo principal a caracterização dos tipos de SCCmec e ainda a determinação do perfil de susceptibilidade a antimicrobianos em uma população de MRSA recuperada de pacientes com FC assistidos em dois centros de tratamento no Rio de Janeiro, Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) e Instituto Fernandes Figueira (IFF). Foram estudadas 108 amostras de MRSA isoladas do período de 2008 a 2010, sendo 94 oriundas de 28 pacientes adultos atendidos no IFF e 14 de 2 pacientes adultos atendidos no HUPE. Foram encontradas altas taxas de resistência para os antimicrobianos oxacilina, cefoxitina e eritromicina. Todas as amostras foram sensíveis à vancomicina e a linezolida quando determinada as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM). Através da técnica de PCR foi possível a tipificação dos SCCmec em 82,4% das amostras, sendo 64% destas compatíveis ao genótipo CA-MRSA. Não houve diferença estatística nas taxas de susceptibilidade aos antimicrobianos entre as amostras CA-MRSA e HA-MRSA. Foram encontrados os SCCmec dos tipos I, III, IV e V, sendo os tipos I e IV os mais frequentes. O gene que codifica a toxina PVL foi encontrado em 34,2% das amostras e foi observado em amostras CA-MRSA e HA-MRSA. Nosso estudo se destaca por apresentar um alto percentual de amostras CA-MRSA e ainda por ser o primeiro do país a detectar a presença do gene que codifica a toxina PVL em pacientes com FC. Além disso, de forma inédita na literatura, encontramos o gene luk-S, em amostras classificadas como HA-MRSA em pacientes com FC. Os poucos estudos nacionais, bem como as diferenças encontradas entre trabalhos, refletem a necessidade de conhecimento mais aprimorado do MRSA envolvido nas infecções pulmonares dos pacientes com FC.

Caracterização e diversidade molecular do transposon Tn1546, carreador do gene vanA, responsável pela expressão de resistência à vancomicina, em amostras clínicas de diferentes espécies de Enterococcus

Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são reconhecidos como importantes patógenos causadores de infecções nosocomiais, configurando um grave problema de saúde pública, principalmente pela escassez de opção terapêutica eficaz. O fenótipo de resistência VanA é o mais frequente, sendo definido pela resistência a altos níveis de vancomicina e teicoplanina. VanA é caracterizado por um conjunto gênico (vanRSHAXYZ) localizado no elemento genético móvel denominado transposon Tn1546. A diversidade de Tn1546 resulta de alterações estruturais promovidas por deleções ou integração de sequências de inserção (IS) que, exercem papel chave na evolução do elemento VanA, modificando os aspectos relacionados à sua transferência e expressão do fenótipo. O objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar o polimorfismo de elementos Tn1546 presentes em amostras de diferentes espécies de Enterococcus isoladas em instituições hospitalares do Estado do Rio de Janeiro no período de 2000 a 2012. Foram incluídas neste estudo 70 amostras VRE que foram caracterizadas quanto ao gênero, espécies e genótipo de resistência aos glicopeptídeos por métodos convencionais e PCR multiplex. A susceptibilidade a 17 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em ágar, e concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina e teicoplanina foi determinada por microdiluição em caldo. O tranposon foi obtido após lise das células bacterianas e amplificação por PCR longo, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para a região repetida e invertida que flanqueia este elemento genético. A diversidade dos elementos Tn1546 foi avaliada por um conjunto de métodos moleculares que incluiu a análise do polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), utilizando-se a endonuclease ClaI, amplificação de segmentos internos por PCR de sobreposição de oligonucleotídeos (overlapping PCR) e detecção de sequências de inserção (ISs). A caracterização em espécies considerada para as demais análises foi obtida pela metodologia de PCR de acordo com a seguinte distribuição: E. avium (N=6), E. faecalis (N=12), E. faecium (N=46), E. gallinarum (N=4) e E. raffinosus (N=2). Todas as amostras apresentaram o genótipo vanA. Nos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foi observado que todas as amostras foram multirresistentes, sendo resistente de 6 a 13 dentre os 17 antimicrobianos testados. A presença de elementos semelhantes ao arquétipo de Tn1546 foi observada em 61,5% das amostras; entretanto, 27 amostras apresentaram perfis variantes de Tn1546. Foram identificados nove perfis de RFLP, dentre 66 avaliadas, sendo o perfil I, prevalente e semelhante ao arquétipo de Tn1546. Não foi possível analisar quatro amostras por RFLP. Os produtos de amplificação de Tn1546 alterados, obtidos pela overlapping PCR e pelo rastreamento de IS, levaram à classificação de 15 tipos polimórficos, nomeados de A a O. A maioria dos Tn1546 polimórficos teve suas regiões de ORF1 e/ou ORF2 deletadas; e IS1542 juntamente com IS1216V foram as inserções mais frequentes, que em muitas situações compartilhavam a mesma região de inserção. IS19 foi detectada apenas na região vanS-vanH. Os dados apresentados neste estudo indicam que o polimorfismo de Tn1546 pode ser explorado no rastreamento de rotas de transmissão, acompanhamento da dispersão de elementos VanA e investigação da evolução de amostras VRE.

Estudo de atributos de virulência e resistência a antimicrobianos em amostras de P. aeruginosa

P. aeruginosa é um importante agente de infecções relacionadas à assistência em saúde. Habitualmente, o estabelecimento de infecções agudas é precedido pela colonização das mucosas dos pacientes. Não se sabe, porém, se os processos infecciosos são causados pelas próprias cepas bacterianas colonizadoras ou por outras com que os pacientes entrem em contato, dotadas ou não de maior potencial de virulência ou de resistência a antimicrobianos que as tornem mais eficientes como agentes infecciosos. Assim, este estudo teve como objetivos i) investigar a existência de potenciais diferenças entre amostras de P. aeruginosa que causaram apenas colonização e aquelas responsáveis por infecção, isoladas de um mesmo paciente, quanto a seus fenótipos de virulência e de não susceptibilidade a antimicrobiamos; ii) pesquisar a existência de associação entre características dos paciente, incluindo o tipo de evolução clínica, com as demais variáveis estudadas. No estudo foram incluídos 21 pacientes que desenvolveram infecção por P. aeruginosa durante sua internação no Centro de Terapia Intensiva do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, entre abril de 2007 e abril de 2008. De cada paciente foram selecionadas duas amostras bacterianas: a primeira isolada durante o episódio de infecção e a amostra colonizadora obtida imediatamente antes da ocorrência da infecção. As amostras selecionadas foram estudadas quanto a i) expressão de três mecanismos de virulência (citotoxicidade, aderência a células epiteliais respiratórias humanas e capacidade de formação de biofilme); ii) presença de genes codificadores das proteínas efetoras do sistema de secreção do tipo 3 (SST3 - exoS, exoT, exoU e exoY); iii) perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, iv) perfil de fragmentação do DNA cromossômico por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). As amostras bacterianas obtidas de infecções agudas foram significativamente mais citotóxicas que aquelas obtidas de colonização. Embora sem diferença estatística, a citotoxicidade das amostras que causaram infecção em pacientes que evoluíram para óbito foi superior à citotoxicidade das amostras de pacientes que sobreviveram. O gene que codifica a toxina ExoU foi detectado em 16 amostras (38%), sendo nove de colonização e sete de infecção. Não houve diferença significativa entre as amostras de colonização e infecção quanto à aderência, produção de biofilme, expressão dos genes do SST3 e não-susceptibilidade às diferentes classes de antimicrobianos. Também não foi encontrada associação entre a não-susceptibilidade à quinolona, ou a outras classes de antimicrobianos, e a presença do gene exoU. As 42 amostras de P. aeruginosa estudadas foram incluídas em 20 genótipos. Em 10 deles foi detectado o gene exoU. Amostras de um mesmo genótipo foram uniformes quanto à expressão dos genes do SST3 e a não-susceptibilidade aos antimicrobianos, mas não quanto às outras variáveis estudadas. Em apenas sete pacientes (33,3%), as amostras de colonização e de infecção pertenciam ao mesmo genótipo. Assim, nesse estudo, o estabelecimento do processo infeccioso resultou não da perda do equilíbrio estabelecido entre os mecanismos de agressão das amostras colonizadoras e os de defesa do hospedeiro e sim da introdução de nova cepa bacteriana no organismo hospedeiro, cepa esta dotada de maior potencial citotóxico.

Tuberculosis in seals caused by a novel member of the Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii sp. nov.

A comparison of Mycobacterium tuberculosis complex isolates from seals (pinnipeds) in Australia, Argentina, Uruguay, Great Britain and New Zealand was undertaken to determine their relationships to each other and their taxonomic position within the complex. Isolates from 30 cases of tuberculosis in six species of pinniped and seven related isolates were compared to representative and standard strains of the M. tuberculosis complex. The seal isolates could be distinguished from other members of the M. tuberculosis complex, including the recently defined ‘Mycobacterium canettii’ and ‘Mycobacterium caprae’, on the basis of host preference and phenotypic and genetic tests. Pinnipeds appear to be the natural host for this ‘seal bacillus’, although the organism is also pathogenic in guinea pigs, rabbits, humans, Brazilian tapir (Tapirus terrestris) and, possibly, cattle. Infection caused by the seal bacillus is predominantly associated with granulomatous lesions in the peripheral lymph nodes, lungs, pleura, spleen and peritoneum. Cases of disseminated disease have been found. As with other members of the M. tuberculosis complex, aerosols are the most likely route of transmission. The name Mycobacterium pinnipedii sp. nov. is proposed for this novel member of the M. tuberculosis ...

Caracterização de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs), genes de resistência aos antimicrobianos e conteúdo plasmidial em cepas de Escherichia coli e Salmonella spp. não tifóides isoladas do ambiente hospitalar e da comunidade

Enterobactérias produtoras de ESBLs são descritas tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade em todo o mundo. No Brasil, esses microrganismos também têm emergido como uma causa importante de infecções, sendo as enzimas CTX-M as prevalentes. O objetivo deste estudo foi analisar diferentes aspectos genotípicos relacionados à expressão da resistência aos antimicrobianos em cepas Escherichia coli e de Salmonella spp, tais como: a diversidade de ESBLs, os genes de resistência aos antimicrobianos e o conteúdo plasmidial. Os aspectos epidemiológicos das cepas produtoras de ESBLs também foram investigados. Foram estudadas 88 cepas de enterobactérias, sendo 43 E. coli e 45 cepas de Salmonella spp., de origem hospitalar e da comunidade (principalmente alimentos), isoladas na cidade do Rio de Janeiro. A expressão de ESBL foi observada em sete cepas de E. coli (7/43, 16,3%) e em uma cepa de Salmonella Typhimurium (1/45, 2,3%) e as enzimas foram identificadas como variantes de CTX-M e SHV-5, respectivamente. Entre as cepas de E. coli, a enzima CTX-M-2 foi a mais frequente (n = 4), sendo detectada em cepas isoladas de swab retal de pacientes hospitalizados, enquanto as enzimas CTX-M-59 (uma variante de CTX-M) (n = 1) e CTX-M-9 (n = 2) foram identificadas em cepas isoladas a partir de espécimes clínicos. Salmonella Typhimurium produtora de SHV-5 foi isolada do ambiente hospitalar (fórmula infantil). As cepas de E. coli produtoras das enzimas CTX-M pertenceram a grupos filogenéticos (A, B1, D) e STs (ST34, ST69, ST101) diferentes, sendo os genes blaCTX-M identificados em plasmídeos com tipo de replicon IncA/C de cerca de 150 kb (blaCTX-M-2, blaCTX-M-9, blaCTX-M-59) ou 80 kb (blaCTX-M-2). A cepa de S. Typhimurium produtora de SHV-5 pertenceu a um único clone (A-ST19) e o gene blaSHV-5 foi identificado em plasmídeo com o replicon IncL/M com aproximadamente 55Kb. Foi identificado pela primeira vez no Brasil o ST313 em um clone de S. Typhimurium (D-ST313), comumente associado com doenças invasivas severas, particulamente no continente africano. Genes que codificam para a resistência aos antimicrobianos não-beta-lactâmicos e integrons classe 1 foram identificados entre as cepas de E. coli e de Salmonella spp. multirresistentes produtoras ou não de ESBLs. Em conclusão: i) nossos resultados referentes à E. coli confirmaram a disseminação de enzimas CTX-M (principalmente variantes do grupo CTX-M-2) desde, pelo menos, o ano de 2000, em hospitais no Rio de Janeiro; demonstraram a implicação dos plasmídeos IncA/C na disseminação de genes blaCTX-M; indicaram a possível evolução intra-plasmídeo de blaCTX-M-59 a partir de blaCTX-M-2; a observação da diversidade e multiplicidade de plasmídeos poderiam fornecer plataformas genéticas para a dispersão de diferentes genes e/ou elementos de resistência aos antimicrobianos; ii) em relação à Salmonella spp. este estudo descreveu, pela primeira vez, o isolamento, a partir de fórmula infantil, de uma cepa de S. Typhimurium produtora de ESBL; foi demonstrada a associação do gene blaSHV-5 com plasmídeo do tipo IncL/M, que é considerado epidêmico; foi identificado o clone D-ST313 de S. Typhimurium, que está associado a doenças invasivas severas no continente africano, que reuniu cepas isoladas exclusivamente do ambiente hospitalar.

Caracterização fenotípica e molecular de amostras de Enterococcus isoladas em um hospital universitário da cidade do Rio de Janeiro

Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente. Nos seres humanos, compõem a microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinário. Nas últimas décadas, esses microrganismos se tornaram importantes agentes etiológicos de infecções hospitalares. Uma característica marcante desses microrganismos é a resistência intrínseca a vários antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções, além de alguns fatores que tem sido relacionado à virulência de enterococos. Este estudo investigou a presença de enterococos em amostras de infecção e colonização de pacientes hospitalizados, profissionais de saúde, dietas hospitalares e manipuladores de alimentos. Foram analisadas 276 amostras de colonização, de quadros de infecção, dietas orais e manipuladores de alimento. Não foram recuperadas amostras dos profissionais de saúde. Todas as amostras foram submetidas a testes convencionais de caracterização do gênero e espécies. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram empregados pelo método de disco difusão, além da CIM para vancomicina e teicoplanina. A produção de biofilme e a expressão da gelatinase também foram avaliadas. Os genes de resistência a gentamicina, estreptomicina e vancomicina e os genes de virulência cylA, esp e fsr foram pesquisados pela técnica de PCR. O polimorfismo genético foi determinado por PFGE. A espécie E. faecalis foi a prevalente nas amostras isoladas de colonização e infecção (42,2% e 81,9%, respectivamente). E. casseliflavus (58,9%) foi a mais freqüente dentre as amostras das dietas hospitalares e E. faecium (46,7%) de manipuladores. Dentre as amostras de colonização as maiores taxas de resistência foram observadas para eritromicina (76,3%) e ciprofloxacina (53,9%). Dentre as amostras de infecção, >70% foram resistentes a eritromicina, ciprofloxacina e tetraciclina. Resistência a níveis elevados de gentamcina (HLR-GE) e estreptomicina (HLR-ST) foi detectada em 24,6% e 20,4% das amostras, respectivamente, e todas foram portadoras dos respectivos genes. A maioria das amostras de colonização (52,6%) e infecção (55,7%) foram multirresistentes. A taxa para resistência a níveis elevados de vancomicina foi de 5,2% e todas eram portadoras do gene vanA. Em relação a formação de biofilme, 70,2% foram produtoras, com uma maior freqüência dentre as de infecção. A expressão de gelatinase foi detectada em 28,9% e 44,3% das amostras de colonização e infecção, respectivamente. Nenhuma das amostras isoladas das dietas hospitalares e de manipuladores expressou gelatinase. Nas amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium (n=109) 16,5%, 51,4% e 48,6% apresentaram produtos de amplificação referentes aos genes cylA, esp e fsr, respectivamente. A análise do polimorfismo genético revelou uma extensa diversidade dentre as amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium, não acarretando um perfil eletroforético prevalente. Entretanto, foi observado um perfil único dentre as amostras de E. gallinarum resistentes a vancomicina (vanA). Este estudo mostrou que amostras de enterococos isoladas de diferentes fontes, não só de quadros infecciosos, podem representar um risco para a população, apontando para uma maior reflexão quanto ao papel desses microrganismos nas infecções humanas, particularmente no ambiente hospitalar.

Determinação do perfil fenotípico e genotípico de amostras de Staphylococus aureus resistentes à meticilina (MRSA) e sensíveis a antibióticos não ß-lactâmicos em cinco hospitais no município do Rio de Janeiro

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um dos principais microrganismos envolvidos nas Infecções relacionadas à Assistência à Saúde (IrAS). Porém, um clone de MRSA, o CA-MRSA, emergiu na comunidade e atualmente vem sendo agente de IrAS. O objetivo desta dissertação é avaliar fenotípica e genotipicamente 111 amostras de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina e sensíveis a antibióticos não ß-lactâmicos de pacientes atendidos em cinco hospitais no município do Rio de Janeiro. Utilizando os critérios padronizados pelo CLSI 2012, foram determinadas as susceptibilidades a 11 antimicrobianos pelo método de disco difusão em ágar e concentração inibitória mínima para vancomicina e oxacilina pelo método da microdiluição em caldo. A multirresistência (resistência a 3 ou mais antimicrobianos não ß-lactâmicos) foi observada em 31,5% das amostras, sendo que 53,2% apresentaram resistência ao antimicrobiano clindamicina, uma das opções para o tratamento empírico das infecções de pele/tecidos moles. 86,4% apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina ≥ 1,0 g/mL ou seja, elevado percentual de amostras associadas ao fenômeno MIC creep, o qual está associado ao insucesso na terapia antimicrobiana anti-MRSA. Não foi observado até o momento nenhuma amostra com CIM ≥ 4cg/mL para vancomicina, entretanto, já há resistência à linezolida em quatro hospitais do estudo. A tipificação do SCCmec nos permitiu classificar 4,5% das amostras em HA-MRSA e 86,5% em CA-MRSA, nas quais a resistência heterogênea típica à oxacilina foi observada em 57,2%. A toxina de Panton-Valentine (PVL) foi identificada pela metodologia de PCR em 28% das amostras com genótipo CA-MRSA. Os fatores de riscos clássicos, da literatura, relacionados à infecção por HA-MRSA foram também observados nos pacientes com infecção por CA-MRSA portadoras de SCCmec IV e V. No intuito de verificar a existência de similaridades genéticas ou a presença de clone predominante entre as amostras dos cinco hospitais, foi realizada a técnica de eletroforese em gel sob campo pulsado (PFGE) e observou-se diversidade genética assim como a presença de amostras com padrões similares aos clones OSPC (18,5%) e USA400. Não foram encontradas amostras com padrões de eletroforese similares aos clones USA300, USA800 e CEB. É essencial a vigilância da resistência aos antimicrobianos não ß-lactâmicos no CA-MRSA, em especial à vancomicina. A mudança na epidemiologia deste microrganismo vem impactando os padrões característicos dos genótipos limitando os critérios de diferenciação entre eles. Neste contexto, as técnicas moleculares atuam como excelentes ferramentas de caracterização. O conhecimento do patógeno auxilia na elaboração e implementação de medidas preventivas, contribuindo para o controle da doença tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade.

Epidemiologia molecular de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) isolados de pacientes com Fibrose Cística

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um importante patógeno pulmonar em pacientes com fibrose cística (FC). Caracteriza-se pela resistência a todos os β-lactâmicos, devido a presença do elemento genético móvel SCCmec o qual abriga o gene mecA. Além disso, é reconhecido por vários fatores de virulência o qual destacamos a toxina Panton-Valentine Leukocidin (PVL), uma citolisina formadora de poros na célula hospedeira, e por apresentar diversos clones epidêmicos envolvidos em surtos hospitalares. O objetivo desse estudo foi caracterizar a epidemiologia de MRSA, isolados de pacientes com FC referente a dois centros de referência no Rio de Janeiro a partir da aplicação de técnicas fenotípicas e genotípicas. Um total de 57 amostras de MRSA foi submetido ao teste de difusão em ágar para 11 antimicrobianos a fim de avaliar perfil de resistência, com aplicação da técnica da PCR foi tipificado o SCCmec e investigado a presença do gene LukS-PV responsável pela codificação da toxina PVL com intuito de estabelecer uma melhor caracterização epidemiológica dos clones identificados pela técnica do MLST (Multilocus Sequence Typing). Os antimicrobianos não β-lactâmicos apresentaram um percentual de resistência abaixo de 50%, em que destacamos a eritromicina com o maior percentual 45,6% e quanto ao perfil de resistência 24,6% foram multirresistentes. Com exceção do SCCmec II, os outros tipos foram encontrados (I, III, IV e V) com os respectivos percentuais de 22,8% (n=13), 7,1% (n=4), 61,4% (n=35) e 3,5% (n=2) e apenas 5,3% (n=3) das amostras não foram caracterizadas, não há dados da prevalência do SCCmec IV. Vinte (35,1%) amostras apresentaram produtos de amplificação compatível com a presença do gene lukS, aproximadamente metade dessas amostras (55%) estava correlacionada ao SCCmec IV. Com a análise do MLST, obtivemos os STs 1 (n=1, 1,7%), 5 (n=28, 49,1%), 30 (n=11, 19,3%), 72 (n=1, 1,7%), 398 (n=1, 1,7%), 1635 (n=7, 12,3%), 1661 (n=2, 3,5%), 239 (n=5, 8,8%), e ainda identificamos um novo ST (2732) presente em 1 amostra. A partir de uma análise associativa entre o MLST e o SCCmec foi possível observar a presença de linhagens características de clones epidêmicos, como o UK-EMRSA-3 (ST5, SCCmec I), USA 800/pediátrico (ST5, SCCmec IV), Oceania Southwest Pacific Clone - OSPC (ST30, SCCmec IV) e Brazilian Epidemic Clone - BEC (ST239, SCCmec III). Em conclusão este estudo é o primeiro a caracterizar linhagens epidêmicas de MRSA nos centros de atendimento a pacientes com FC no Rio de Janeiro, sendo necessário um monitoramento constante a fim de evitar a disseminação desses clones.

Complexo Burkholderia cepacia em pacientes com fibrose cística: caracterização das espécies, avaliação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos e da diversidade genética

O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) é um grupo de 17 espécies intimamente relacionadas que estão associadas à deterioração pulmonar e aumento da mortalidade em pacientes com Fibrose Cística (FC). Essas espécies variam entre si em relação à prevalência, quadros clínicos e virulência. Pouco é conhecido em relação ao perfil de resistência aos antimicrobianos. Uma vez estabelecida a infecção, a abordagem terapêutica e as medidas de controle atualmente adotadas são baseadas no CBc, sem considerar cada espécie em particular. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência das espécies do CBc em pacientes atendidos em dois centros de referência no Rio de Janeiro, bem como estabelecer perfis de resistência a antimicrobianos e avaliar a diversidade molecular entre as espécies. Cem amostras do CBc isoladas de 38 pacientes com FC no período de janeiro de 2010 a fevereiro de 2012 foram identificadas por métodos fenotípicos e pelo sequenciamento do gene recA. As CIMs para amicacina, aztreonam, ceftazidima, trimetoprim/sulfametoxazol e tobramicina foram determinadas por microdiluição e a genotipagem das espécies foi realizada por PFGE com a enzima SpeI. B. vietnamiensis (44%) foi a espécie mais prevalente, seguida de B. cenocepacia IIIA (36%), B. multivorans (10%), B. cenocepacia IIIB (1%) e B. stabilis (1%). Cinco por cento das amostras não foram identificadas. B. vietnamiensis foi identificada em mais da metade dos pacientes (58,3%). Foram observadas diferenças no perfil de susceptibilidade entre as espécies do CBc. B. cenocepacia IIIA foi a espécie que apresentou as maiores taxas de resistência aos antimicrobianos, sobretudo para trimetoprim/ sulfametoxazol (80,5%), principal antimicrobiano utilizado no tratamento de infecções causadas pelo CBc. Amostras com perfis MDR ocorreram em todas as espécies, destacando-se o perfil A, resistente simultaneamente aos cinco antimicrobianos, observado em 58,8% das amostras de B.cenocepacia IIIA. A análise do polimorfismo genético mostrou que, apesar de B. vietnamiensis ter sido a espécie mais prevalente, a ocorrência de nove grupos clonais sugere que a aquisição dessas cepas tenha se dado a partir de uma fonte ambiental comum. Para B. cenocepacia IIIA, 52,9% das amostras foram atribuídas a um mesmo grupo clonal (BcA), compartilhado entre nove pacientes atendidos em um mesmo centro de referência. Oitenta por cento dessas amostras apresentaram ainda resistência a todos os antimicrobianos testados. Os dados mostram que, mesmo com o emprego de técnicas moleculares, é difícil a identificação do CBc em nível de espécie; que B. cenocepacia IIIA é caracterizada por índices de resistência superiores às outras espécies e que a transmissão cruzada entre os indivíduos aponta para a necessidade do estabelecimento de medidas de vigilância do CBc nos centros de referência.

Caracterização molecular de bastonetes Gram positivos irregulares e actinomicetos aeróbios obtidos de espécimes clínicos, de ensaios de esterilidade e de áreas limpas

Os bastonetes Gram positivos irregulares (BGPIs) compõem um grupo de espécies bacterianas com ampla diversidade fenotípica e que podem estar presente no meio ambiente, na microbiota humana e de animais. A identificação acurada de BGPIs em nível de gênero e espécie empregando métodos bioquímicos convencionais é bastante limitada, sendo recomendado, portanto, o uso de técnicas moleculares. No presente estudo, foram identificadas amostras de BGPIs oriundas de espécimes clínicos de humanos, de produtos farmacêuticos e de áreas limpas através da análise de sequencias do gene 16S rRNA e de outros genes conservados (housekeeping genes). Os resultados obtidos pelo sequenciamento dos genes 16S rRNA e rpoB demonstraram C. striatum multi-resistente (MDR) como responsável por surto epidêmico em ambiente hospitalar da cidade do Rio de Janeiro. Quinze cepas de C. striatum foram isoladas em cultura pura a partir de secreção traqueal de pacientes adultos submetidos a procedimentos de entubação endotraqueal. A análise por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) indicou a presença de quatro perfis moleculares, incluindo dois clones relacionados com cepas MDR (PFGE I e II). Os dados demonstram a predominância de PFGE I entre cepas MDR isoladas de unidades de terapia intensiva e enfermarias cirúrgicas. Uma potencial ligação causal entre a morte e a infecção por C. striatum MDR (PFGE tipos I e II) foi observada em cinco casos. Adicionalmente, acreditamos que este seja o primeiro estudo de identificação de espécies de Nocardia relacionadas com infecções humanas pela análise da sequencia multilocus (MLSA) no Brasil. Diferente dos dados observados na literatura (1970 a 2013) e obtidos pelos testes fenotípicos convencionais, a caracterização molecular de quatro lócus (gyrB-16S-secA1-hsp65) permitiu a identificação das espécies N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica e N. exalbida/gamkensis relacionadas com quadros de nocardiose em humanos. Cepas de N. nova isoladas de diferentes materiais clínicos de um único paciente apresentaram padrões de susceptibilidade antimicrobianos idênticos e dois perfis PFGE, indicando a possibilidade de quadros de co-infecção por N. nova em humanos. Em outra etapa da investigação, amostras de BGPIs obtidos de ambientes de salas limpas que não puderam ser identificadas por critérios convencionais foram submetidas a análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterizadas 95,83% em nível de gênero e 35,42% em espécies. Para gêneros mais encontrados no estudo, foram analisados os genes rpoB e recA de dezessete cepas de Microbacterium e utilizado o MLSA para a identificação de sete cepas identificadas como Streptomyces. Os ensaios permitiram a identificação de três cepas de Microbacterium e de uma única amostra de Streptomyces ao nível de espécie. A análise da sequencia do gene rpoB também se mostrou eficaz na identificação de espécies de cepas de Corynebacterium. Finalmente, para as cepas ambientais pertencentes à classe Actinobacteria os dados morfológicos, bioquímicos e genotípicos permitiram documentar a cepa 3117BRRJ como representante de uma nova espécie do gênero Nocardioides, para o qual o nome Nocardioides brasiliensis sp. nov. e as cepas 3712BRRJ e 3371BRRJ como representante de um novo gênero e espécie para o qual o nome Guaraldella brasiliensis nov. foi proposto.

Aderência, invasão e indução de apoptose por estreptococos do grupo B em células epiteliais respiratórias A549

Estreptococos do grupo B (EGB), principalmente sorotipo III são a principal causa de pneumonia neonatal, sepse e meningite. O potencial de virulência das amostras de EGB pode determinar a colonização ou a infecção do hospedeiro. Como o pulmão constitui uns dos primeiros órgãos durante o processo de invasão sistêmica por EGB, nós decidimos investigar os mecanismos de adesão e invasão de amostras do sorotipo III (90356-líquor e 80340-vagina) com linhagem de células epiteliais do pulmão humano (A549). Desta forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de aderência e invasão de duas amostras de EGB sorotipo III com células de epiteliais pulmonares A549, a persistência bacteriana intracelular, a fusão com compartimentos acídicos, potencial citotóxico e indução de apoptose. As amostras mostraram capacidade de aderir e invadir o epitélio pulmonar A549, onde a amostra 90356-líquor isolada de paciente a que apresentou maior propriedade adesiva e invasiva que a amostra 80340-vagina (p<0,05). Ambas as cepas mostraram persistência intracelular sem replicação no interior do epitélio respiratório até 24h de incubação. Além disso, verificamos que os EGB são capazes de promover vacuolização celular permanecendo viáveis dentro de vacúolos acídicos, sugerindo a ocorrência de fusão lisossomo-fagossomo. A amostra 90356-líquor também mostrou maior citotoxidade quando comparada com a amostra 80340-vagina. A análise por citometria de fluxo demonstrou, pela primeira vez, que o EGB induz apoptose em epitélio respiratório, podendo representar um mecanismo importante para o desenvolvimento da lesão celular aguda e a patogênese bacteriana.

Caracterização de Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores não usuais em bacteremias pelas técnicas de Matrix-Assisted Laser Desorption IonizationTime of Flight Mass Spectrometry, sequenciamento de DNA e método fenotípico convencional

Alguns Bastonetes Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicação em infecções é subestimada. Devido à similaridade fenotípica, mudanças taxonômicas, baixa reatividade bioquímica e limitações nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificação de BGNNF é frequentemente equivocada, culminando com a denominação de diferentes micro-organismos apenas como BGNNF, por falta de melhor diferenciação. O objetivo desse estudo foi avaliar, por métodos fenotípico convencional, proteômico e molecular, a identificação de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitário no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratório clinico como BGNNF para a identificação por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotípicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espécies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espécies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotípicos incluíram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordância com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nível de espécie foi de 64% (n=30) e apenas em gênero a concordância foi de 17% (n=8). A análise comparativa geral da identificação por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nível de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordância em nível de espécie para 60%. As discordâncias parecem ser devido às diferenças nos perfis proteicos das amostras em relação às amostras-referência do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualização de perfis no sistema. A análise do polimorfismo genético de B. contaminans mostrou a ausência de um clone disseminado causando surto, além da provável origem ambiental das infecções. Os setores de nefrologia e hemodiálise contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as culturas, respectivamente. As discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificação das espécies do CBc. Os BGNNF incomuns são de difícil caracterização independente da metodologia usada e nenhum método por si só foi capaz de identificar todas as amostras.

Infecções por corinebactérias não diftéricas em cateter venoso central de pacientes oncológicos pediátricos

Estudo descritivo retrospectivo realizado no Instituto Nacional do Câncer José Alencar Gomes da Silva, INCA/HCI-Rio de Janeiro, Brasil, (INCA- HCI-RJ), avaliou infecções por Corynebacterium sp. com ênfase nos pacientes pediátricos em tratamento nos setores onco-hematológico pediátrico e seus acessos venosos. Os resultados permitiram a elaboração de dois artigos. No Artigo 1 - Foram analisadas as bacteremias causadas por espécies de corinebactérias não produtoras de toxina diftérica, observadas em dois períodos, com intervalo de sete anos (2003/2004 e 2012/2013), totalizando 62 pacientes. No Artigo 2 - Foi realizada investigação clínica e epidemiológica de 24 casos de infecção por Corynebacterium sp. em amostras de sangue de cateter e/ou periférica, em menores de 18 anos em tratamento onco-hematopediátrico, em dois períodos, com intervalo de oito anos (2003/2004 e 2013/2014). Nos dois artigos foram avaliados aspectos clínico-epidemiológicos, tratamentos realizados, conduta em cada paciente e avaliação da susceptibilidade aos antimicrobianos das cepas isoladas. Os tumores sólidos tiveram maior prevalência em ambas análises. No primeiro artigo, as infecções por corinebactérias tiveram relação com os pacientes usuários de cateter venoso central. Após estes primeiros resultados, foi desenhado um segundo estudo retrospectivo com abordagem em pacientes pediátricos em tratamento. Cerca de 83,3% destes pacientes eram portadores de cateter venoso central de longa permanência (CVCLP). A análise microbiológica permitiu a observação da incidência de novas espécies de corinebactérias, algumas multirresistentes, além da evolução dos padrões de susceptibilidade aos antimicrobianos, com aumento da resistência a alguns dos agentes utilizados na rotina de tratamento para infecções por este grupo. Em ambos estudos C. amycolatum foi a espécie predominante. Apesar de terem sido identificadas cepas multirresistentes, todas as cepas isoladas apresentaram susceptibilidade a vancomicina (artigos 1 e 2). O uso de vancomicina permitiu preservação dos dispositivos venosos com estabilização do quadro clínico, na maioria dos casos. Na avaliação retrospectiva do segundo estudo proposto 40% dos CVCLP foram preservados, a análise comparativa dos períodos estudados revelou uma evolução na preservação de dispositivos venosos mediante o tratamento antimicrobiano orientado nos casos de infecção por Corynebacterium. A integração da equipe multidisciplinar, desde a identificação dos casos clínicos, manuseio das amostras, identificação laboratorial e os resultados, bem como na proposta de tratamento promoveu uma melhoria significativa na assistência aos pacientes e contribuiu para o sucesso terapêutico observado neste trabalho. O reconhecimento das corinebactérias como importantes agentes associados a infecções em pacientes oncológicos pediátricos pelos profissionais de saúde contribuiu para a elaboração de estratégias específicas e, conseqüentemente, para melhorias nas condutas e protocolos, bem como na terapêutica aplicada às infecções por estes agentes.

Bases moleculares da multiresistência a drogas em Mycobacterium tuberculosis

A tuberculose (Tb) é a principal causa de morte no mundo, por um agente infeccioso. O tratamento padrão é a quimioterapia: rifampicina (RMP), isoniazida (INH) e pirazinamida (PZA). O maior problema global da Tb é o aumento de cepas multirresistentes (resistência pelo menos à INH e à RMP) do Mycobacterium tuberculosis (MTb). A resistência à INH e RMP ocorre geralmente por mutação genética nos genes KatG e rpoB, respectivamente. Os objetivos deste trabalho foram: 1. Analisar os tipos e freqüências de mutações em duas regiões iniciais do gene katG do MTb. 2. Determinar os tipos e freqüências das mutações no gene rpoB. Duas regiões do gene katG e uma do gene rpoB foram amplificadas por PCR e seqüenciadas para o diagnóstico das mutações. Para a análise do gene katG foram utilizadas 101 cepas. Dentre estas, 4 eram sensíveis e não apresentaram mutação (controle). Das 97 cepas restantes, na primeira região seqüenciada do KatG, não ocorreram mutações em 67. Nas outras 30 cepas houve 33 deleções de nucleotídeos, sendo que 24 ocorreram no último nucleotídeo do códon 4 (24,7%), o que caracterizou um novo alelo. Na região 2, dentre as 97 cepas não houve mutação em 16 - sete estavam associadas a ausência de mutação na região 1. Ocorreram 83 mutações pontuais, sendo 75,3% no códon 315. Sete cepas resistentes a INH não apresentaram mutações em nenhuma das duas regiões analisadas. As mutações na região 2 permitiram o diagnóstico de resistência à INH em 79 cepas ou 81,4%. Nove cepas que não mostraram mutações na região 2 tiveram mutações na região 1. Logo, esta região permitiu o acréscimo do diagnóstico de resistência à INH para 88 cepas, aumentando a positividade em 9,3%. Em sete casos resistentes não houve mutação em ambas as regiões. Na análise do gene rpoB usamos 120 cepas de MTb. Nenhuma mutação foi encontrada em 13 isolados resistentes à RMP. O códon que apresentou maior freqüência de mutação foi o 531 (45.6%), seguido pelo 526 (26%) e 516 (12.5%). Em outros onze códons, foi encontrado um total de 18 mutações (15.2%), principalmente nos códons 511 (3.4%) e 513 (3.4%). Nenhum dos isolados sensíveis à RMP apresentou mutações. No Estado do Rio de Janeiro, as mutações mais freqüentes foram: 516 (5%), 526 (2.5 %) e 531 (21.2%). Dentre os outros estados, as mutações mais freqüentes foram: 516 (2.5 %), 526 (11%) e 531 (19.4%). A freqüência de mutações dos isolados do Rio de Janeiro foi comparada com a encontrada nos outros estados, mas quando o removemos da análise, a freqüência de mutações nos códons 531 e 526 para os outros 15 estados é semelhante. A análise estatística mostra que este dado é significativo (p=0.002). No entanto, quando todos os estados são analisados simultaneamente, o códon 531 é novamente o mais freqüentemente mutado. A análise do gene rpoB diagnosticou a resistência à rifampicina em 89,17% das cepas. Nossos resultados confirmam que, no Brasil, mutações na região RRDR do gene rpoB podem predizer resistência a RMP.