Busca de parceiros físicos das proteínas ADAM23 e MX1, utilizando o sistema de duplo híbrido em Saccharomyces cerevisae

A metilação de ilhas CpG em regiões regulatórias de vários genes tem sido descrita como um processo importante no silenciamento de genes supressores de tumor e diretamente envolvida no processo de carcinogênese de uma série de tumores. O estudo desses genes afetados pela metilação em tumores visa identificar possíveis marcadores moleculares para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de tumores, além de possibilitar a descoberta de fatores importantes no processo biológico do câncer. Os genes MX1 e ADAM23 foram identificados como diferencialmente metilados em linhagens celulares provenientes de carcinoma de cabeça e pescoço. Neste sentido, ao estudar o perfil diferencial de metilação de genes em carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, o gene MX1 foi identificado como diferencialmente expresso. Dessa forma, para elucidar a função destes genes no controle da carcinogênese, o presente estudo buscou identificar ligantes celulares das proteínas MX1 e ADAM23 por meio de rastreamentos de duplo-híbrido, usando bibliotecas de cDNA de cérebro fetal humano. Os rastreamentos com a proteína ADAM23 não geraram resultados positivos por isso não são aqui discutidos. Foi realizado rastreamento com a proteína MX1, que resultou em aproximadamente 1,0x106 transformantes, dos quais 74 foram confirmados pelo ensaio de duplo-híbrido e codificam para 9 ligantes já conhecidos e 21novos ligantes prováveis de MX1. Entre esses novos ligantes prováveis estão proteínas que já haviam sido descritas como ligantes de MX1, incluindo a própria proteína MX1, o que valida os resultados obtidos com este rastreamento. Além disso, grande parte dos ligantes identificados são fatores envolvidos no processo de SUMOilação de proteínas, na formação de corpúsculos nucleares denominados PML-NB e uma série de proteínas relacionadas ao controle da transcrição e apoptose... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Ação de nanopartículas estruturadas de manganês sobre viabilidade de células prostáticas humanas tumorais

O estágio supervisionado no Laboratório de Engenharia Celular/Divisão Hemocentro - FMB teve por objetivo oportunizar ao aluno o exercício dos conhecimentos adquiridos em cultura de células, por meio de atuação prática em laboratório, bem como proporcionar o desenvolvimento de habilidades e competências pessoais e profissionais. A presente monografia descreve o tratamento de nanopartículas estruturadas de manganês em culturas de células humanas tumorais prostáticas após 24 e 48 horas, buscando identificar, de uma forma bem simples, possíveis propriedades antitumorais destas nanopartículas, através de análises de viabilidade celular por coloração de Azul de Tripan

Tumor venéreo transmissível canino com enfoque nos diversos tratamentos

The canine Transmissible Venereal Tumor (TVT) is a neoplasm of round cells that primarily affects the external genitalia of both male and female dogs with high casuistry. Its transmission occurs by the tumor cells’ implementation in the mucous membranes during the coitus or in other body parts through licking, scratching or direct contact with the tumor. The clinical manifestations vary according to the location. Despite being a malignant neoplasm, TVT’s metastatic potential is low. The diagnosis is based on macroscopic characteristics, clinical signs, cytology and/or histopathology exam, among which cytology is considered the best method. There are several treatment protocols for the TVT, among which, surgical excision, radiotherapy, immunotherapy and chemotherapy. Chemotherapy with vincristine sulfate is the elected treatment. However, more and more new alternatives have been developed, as the usage of natural products, homeopathy and ivermectina. They can be used as a unique treatment to neoplasm or combined to the chemotherapy in order to decrease the dose and the application number of the chemotherapic and its side effects

Indução de morte celular por apoptose decorrente da irradiação com Raios-X: um ensaio com células mamárias humanas tumorais

Apoptosis is a form of programmed cell death selectively removes abnormal cells, and thus contributes to maintaining the balance of the dynamics of cell reproduction. Therefore the verification of the occurrence of apoptotic cell death after a pathological stimulus is crucial for the analysis of the maintenance of normal cell cycle of a given tissue or organ. In this experiment were used cells lines human mammary tumor MDAMB231, T47, MCF7, which were irradiated with X-rays at a dose of 5 Gy in a time interval of 15 seconds, and filtration of 1mm aluminum. Samples containing the cells were grown in a specific culture medium, containing fetal bovine serum and growth factor, and two samples were prepared with each of the cell lines, one to be irradiated, and another that has not been irradiated, which denoted by negative control of the irradiation. The primary goal of the experiment was to verify and compare the rates of apoptosis in each cell lines, in which were irradiated and that were not irradiated, using flow cytometry as a method for detecting apoptotic cell death in together with specific markers annexin V and propidium iodide. Data from the readings made by flow cytometry were analyzed and interpreted using the software WinMDI statistical graph. By comparing the indices relating to the readings of positive and negative for specific markers of apoptosis, based on differences in the statistical data presented lectures regarding the cellular irradiated and not irradiated, collude cells in question once... (Complete abstract click electronic access below)

Papel reparador e imunomodulador das células-tronco mesenquimais (CTMs) deficientes de receptor para interferon-gamma (IFNy) em modelos renais agudos

A insuficiência renal aguda (IRA) é uma patologia que apresenta alta incidência na população e elevada morbimortalidade. Apesar de todos os avanços terapêuticos já obtidos, essas taxas ainda continuam elevadas. Uma possível alternativa, atualmente sugerida, seria o transplante de células-tronco. O processo regenerativo das células-tronco mesenquimais (CTMs) já foi demonstrado em diversos modelos experimentais e em alguns ensaios clínicos. O mecanismo de ação mais sugerido é a ação parácrina das CTMs na área lesada. Ainda, sabe-se que nesse ambiente, citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IFNγ, ativam as CTMs para seu papel reparador. O presente estudo busca analisar o papel do IFNγ na ativação das CTMs em modelos renais. As CTMs de animais nocautes para receptor de IFNγ (IFNγR KO) e de animais selvagens (controle/ C57/Bl6) foram isoladas do tecido adiposo. Essas células foram caracterizadas por imunofenotipagem e diferenciação em adipócitos e osteócitos. A lesão renal aguda foi obtida através do clampeamento dos pedículos renais de camundongos machos C57/Bl6, por 45 min. Após 4hs da lesão isquêmica, as CTMs IFNγR KO e CTMs controles foram administradas intraperitonealmente, e 24hs após a cirurgia os animais foram sacrificados. O tratamento com CTMs selvagens apresentou significativa redução dos níveis de uréia e creatinina sérica. No entanto, a redução desses níveis séricos com CTMs IFNγR KO foi menos intensa. Com relação à análise da resposta inflamatória do rim, os dados demonstram que a expressão de RNAm de IL-6 é maior nos animais tratados com CTMs IFNγR KO quando comparada ao tratamento com CTMs selvagens; porém, os dois tratamentos apresentam expressão reduzida em comparação aos animais não tratados. Já a expressão de RNAm de IL-10 é maior em animais tratados com CTMs em comparação aos não tratados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Atividade imunomoduladora de parasporina de Bacillus thuringiensis sobre linfócitos e monócitos humanos

Bacillus thuringiensis is an environmental bacteria that produces a group of crystallizable proteins (Cry) that are toxic for several insects and worms species. Recently, it was described a novel class of Cry proteins called parasporins (PS) that showed cytotoxic effects on animal and human tumor cells. Six types of PS have been described so far, PS1 to PS6, and their cytotoxic activity has been studied. However, the direct effect on tumor cells has been the current research focus, while the immunomodulatory role of the PS has not been studied yet. Therefore, this study aimed to verify whether PS of TC 2.3.1R6 B. thuringiensis strain has immunostimulatory activity on human lymphocytes and monocytes. We have evaluated the protein toxicity against human cells, the lymphoproliferative activity and the effects on peripheral blood monocytes. The PS-PK showed no toxic or stimulating activity on lymphocyte proliferation. However, it inhibited the spontaneous production of IL-10 as well as ConA-induced and the production of IFN-γ. PS-PK decreased the release of hydrogen peroxide and increased the production of TNF- α by monocytes. PS-PK performed inhibitory production of hydrogen peroxide and TNF-α by monocytes, whereas PS-Tp showed stimulation of the production of hydrogen and TNF-α

Efeito da silibinina sobre o fator de transcrição nuclear-kB e produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia

Pre-eclampsia (PE) is a complication of human pregnancy characterized by hypertension and proteinuria after 20 weeks of gestation. Its incidence varies from 5% to 7% of pregnancies and is a major cause of morbidity and maternal and fetal mortality. This is a multisystemic disease, with focus on vascular dysfunction and is closely related to the exacerbated activation of the immune system. In addition to increased activation of monocytes and granulocytes, there is an elevated production of proinflammatory cytokines in pregnant women with PE. The nuclear transcription factor-kB (NF-kB) is present in the cells of the immune system and is responsible for transcription of genes related to inflammation. Whereas the PE is associated with intense inflammatory response, the use of substances modulating the activity of NF-kB factor could be useful in alleviating the inflammation present in these patients. Silibinin is the main component of silymarin, a polyphenolic extract obtained from fruits and seeds of Sylibum marianum with potent hepatoprotective, anti-inflammatory and anti-fibrotic activities. The silibinin mechanism of action includes the ability to inhibit NF-kB activation and, consequently, its migration to the nucleus. The objective of this study was to assess whether silibinin modulates the activity of NF-kB and the production of inflammatory cytokines in mononuclear cells of patients with PE. We evaluated 34 pregnant women with PE, 20 normotensive pregnant women (GN) and 15 non-pregnant women (NG). Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained from those groups of women and cultured in the presence or absence of silibinin (5 uM or 50 uM) and stimulated or not with lipopolysaccharide (LPS) for 18 h to obtain supernatant for determination of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-1 (IL-1β) by enzyme immunoassay (ELISA). The cells were...(Complete abstract click electronic access below)

Expressão do gene Glipican 3 (Gpc3) no urotélio da bexiga de ratos expostos ao diuron (3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) por 7 dias e 20 semanas

Diuron (3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) is a substituted urea herbicide widely used in crops of sugar cane, cotton and soybeans. In 1997, this agent has been classified by the United States Environmental Protection Agency as known/likely human carcinogen because it induced tumors in the urinary bladder and renal pelvis of rats, and breast and skin of mice exposed to 2500 ppm for feed for two years. A previous study from our group demonstrated dose-response relationship in the gene expression profile associated with severe necrosis on bladder urothelium and increased incidence of simple hyperplasia in male Wistar rats treated with different concentrations of diuron for 20 weeks. To check how early the molecular changes occurs, rats were fed for 7 days with diets containing diuron at 0, 125, 500 or 2500 ppm. The main observations recorded were urothelium ultrastructural alterations and disruptions of molecular pathways associated with cell-cell interaction and the tissue organization maintenance. Particularly, the gene Glypican 3 (Gpc3), a surface proteoglycan related to cellular adhesion and apoptosis induction, was down regulated on urothelium exposed to 2500ppm diuron for 7 days and 20 weeks. The aim of this study was validate by quantitative RT-PCR real time, the reduced Gpc3 gene expression in epithelial cells of the urinary bladder of male Wistar rats treated with different concentrations of diuron for 7 days and 20 weeks. The endogenous control of the quantitative PCR real time technique was the β-actin gene and the target was the gene Gpc3. The relative quantification (RQ) was obtained by the method of relative quantification 2-ΔΔCt . Animals exposed to diuron for 7 days or for 20 weeks presented reduction of Gpc3 gene expression compared to the control group. This reduction was statistically significant only for the 7 days study. Moreover, by comparing animals exposed for 7 days with the exposed for 20 weeks, it was ...

Neoplasia mamária em cadelas: aspectos clínico-cirúrgicos

Oncology is presenting an important role in clinical practice as a speciality in recent years in Veterinary Medicine. Mammary gland tumors are detected mainly in old and middleaged bitches that are sexually intact or spayed and the caudal abdominal and inguinal mammary glands are the most affected and they present a percentage up to 75% of malignancy. The majority of dogs with mammary neoplasms are clinically healthy at the time of diagnosis and the tumors can be identified by the owner or a professional during a routine physical examination. Cytological examination of fine needle aspirates can be performed. This procedure is easy and low cost and some criteria that may indicate malignancy are evaluated, however to obtain a definitive diagnosis is performed histopathology of the excised tissue or from biopsy. Regional lymph nodes are the first lymph node to receive lymphatic drainage from the neoplasm. They are at the highest risk of regional metastasis, while the lung is the most common site for distant metastasis. Determining the clinical stage enables the definition of the extension of the tumor. As a consequence, this allows a prognosis to be established and treatment to be planned. The type of therapy to be chosen incites controversy since there are numerous treatment options described, but the surgery is the chosen treatment. However, surgery is not always effective for malignant tumors, and recurrences may occur and in these cases, auxiliary chemotherapy treatments are used. The prognosis for animals that have mammary tumors depends on several factors, such as: size, stage, type of tumor cells and clinical behavior of the tumor, age and medical condition of the animal, and presence of metastasis. Because of this, more detailed studies are needed based on epidemiological surveys in order to provide more informations about risk factors, prevalence and follow-up after treatment of mammary... (Complete abstract click electronic access below)

Efeito da concentração citostática de 5-fluorouracil sobre a imunogenicidade de células de câncer colorretal murino MC-38

A quimioterapia é o tratamento padrão para pacientes com os mais variados tipos de câncer, (sendo o 5 Fluorouracil -5Fu- a droga de escolha no caso do câncer colorretal) mas ela está associada a efeitos colaterais que podem ser muito severos. A exposição de células tumorais a agentes antineoplásicos, em dose baixa e não citotóxica, pode torná-las mais imunogênicas, enquanto que a exposição de células dendríticas (DC) a esses agentes antineoplásicos pode aumentar sua capacidade de induzir resposta antitumoral in vitro. O objetivo deste estudo é verificar se o tratamento in vitro de células tumorais MC38 com 5-Fu (dose não citotóxica) pode induzir a expressão de moléculas que aumentem suas características imunogênicas, fazendo com que elas sejam mais facilmente identificadas pelo sistema imune. Para isso, camundongos da linhagem C57/Bl-6 foram inoculados subcutaneamente com células MC38 e sete dias depois foram vacinados com DC sensibilizadas com antígenos tumorais obtidos a partir da lise de células MC38 mantidas em cultura e previamente tratadas com 5-Fu, em dose não citotóxica (DC-5Fu), para que a performance das DC sensibilizadas pudesse ser comparada à performance das DC selvagens

Análise da expressão de antígenos câncer/testítulo (CTs) em pacientes com mieloma múltiplo

O mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia maligna secundária à expansão clonal de células plasmáticas caracterizada pela presença de imunoglobulina monoclonal no sangue e/ou na urina, lesões líticas ósseas e infiltração de plasmócitos monoclonais na medula óssea. A caracterização dos mecanismos responsáveis pela expansão das células tumorais do MM é difícil e envolve uma série de alterações genéticas e mudanças no microambiente da medula óssea, favorecendo o crescimento do tumor e a falha do sistema imune em reconhecê-lo. O MM é uma doença incurável, sendo a sobrevida mediana dos pacientes em torno de 3-5 anos. Terapias atuais como quimioterapia e transplante autólogo de células-tronco podem induzir remissão da doença, mas a recaída e a morte são inevitáveis. Os antígenos específicos câncer/testículo (CTs) foram originalmente descritos em pacientes com melanoma e são assim denominados, pois suas proteínas foram identificadas em espermatogônias, células conhecidas por não expressarem antígenos de histocompatibilidade (HLA), o que as impossibilita de desencadear uma resposta imune específica. Esses antígenos foram identificados posteriormente em vários tipos de tumores humanos, como melanoma, carcinoma pulmonar, câncer renal, entre outros. Até o momento, existem poucas informações a respeito de sua importância como fatores de prognóstico clínico ou relacionado à proliferação aberrante das células plasmáticas. Assim, o objetivo deste estudo é avaliar o nível de expressão gênica dos antígenos câncer/testículo MAGEC1(CT7), MAGEA3/6, LAGE-1, NY-ESO-1 e GAGE em amostras de aspirado de medula óssea total de pacientes com mieloma múltiplo. A análise de expressão por RT-PCR dos 5 CTs de interesse, realizada em 21 amostras de medula total de pacientes com MM, demonstrou as seguintes freqüências: CT7 (42,9%), LAGE-1 (23,8%)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Genotipagem de HLA de classe I e II para seleção de células precursoras dendríticas para estudo da imunobiologia do vírus associado ao Sarcoma de Kaposi (KSHV)

The Kaposi-associated Herpesvirus (KSHV) also known as Human Herpesvirus 8 (HHV-8) is associated with the development of Kaposi’s sarcoma (KS) and others limphoprolipheratives diseases such as Primary Effusion Lymphoma (PEL) and Multicentric Castleman Disease (MCD). Even though the virus is considered lymphotropic, it is able to infect others cell types such as macrophages, dendritic cells, endothelial cells, monocytes and fibroblasts. After infection, KSHV be latent expressing essential viral genes to its maintenance in a infected cell. However, in some circumstances may occur the reactivation of lytic cycle producing new viral particles. K1 protein of KSHV interferes in the cellular signaling inducing proliferation and supporting cellular transformation. K1 is encoded by viral ORF-K1, which shows high variability between different genotypes of KSHV. So far, it is not clear whether different isoforms of K1 have specific immunobiological features. The KSHV latency is maintained under strict control by the immune system supported by an adequate antigen presentation involving Human Leucocyte Antigen (HLA) class I and II. Polymorphisms of HLA class I and II genes confer an enormous variability in molecules that recognize a large amount of antigens, but also can increase the susceptibility to autoimmune diseases. Therefore, the present study aims to genotype HLA class I (A and B) and class II (DR and DQ) from volunteers to identify haplotypes that can provide better response to K1 epitopes of different KSHV genotypes. First of all, 20 volunteers were selected to genotype HLA genes. In our results we observed prevalence of certain HLA class I haplotypes as HLAA1, HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26, HLA-B8, HLA-B18 e HLA-B44. After the in silico analysis using BIMAS and SYFPEITHI databases, we observed high scores for epitopes from the B genotype of KSHV, indicating...(Complete abstract click electronic access below)

Direcionamento de peptídeos tolerogênicos da proteína de choque térmico 60 para células dendríticas utilizando anticorpos anti-DEC-205

A indução de tolerância imunológica em situações altamente desejadas como no transplante e em doenças autoimunes permanece um grande desafio para pesquisa científica de tradução. Nesse contexto, o estudo das proteínas do choque térmico (HSPs) e seus peptídeos vêm trazendo informações relevantes sobre o controle da reposta imune. Dados da literatura mostram que alguns de seus peptídeos apresentam propriedades imunorreguladoras, como os peptídeos N3 e N7 da HSP60. Além disso, tem se mostrado que a apresentação de antígenos em contextos específicos por células dendríticas (DCs) pode favorecer o estabelecimento da tolerância imunológica. Dessa forma, o direcionamento dos peptídeos tolerogênicos da HSP60, N3 e N7, in vivo, para DCs, com o intuito de essas células apresentarem esses peptídeos em um contexto imunorregulador, pode induzir um estado de tolerância. Assim, nesse trabalho, tivemos como objetivo a produção de anticorpos (Acs) contra o receptor DEC-205 de DCs conjugados com os peptídeos N3 e N7 da HSP60. Esses Acs, ao se ligarem ao DEC-205 nas DCs, podem ser fagocitados, processados e por fim apresentados a células T em um contexto imunorregulador. Para tal, foram realizadas transfecções de células HEK-293T e CHO com plasmídeos codificando as cadeias leve e pesada dos respectivos Acs a fim de se obter essas proteínas recombinantes. Podemos observar que as células HEK apresentaram uma produção mais eficiente dos Acs quando comparadas com as células CHO (120 vs 30 ng/ml, respectivamente), apesar disso a produção dos Acs ficou abaixo do esperado impossibilitando a realização ensaios in vivo. Além disso, realizamos um ensaio de ligação do Ac anti-DEC-N7 a superfície de DCs e observamos que os Acs produzidos apresentam capacidade de se ligarem a superfície dessas células. Concluímos que os anticorpos recombinantes anti-DEC-205 são capazes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Marcadores de superfície de Células-tronco: estudo de reação cruzada inter-espécies

Mesenchymal stem cells (MSCs) are adult multipotent cells with fibroblastoid morphology and adherent to plastic. Furthermore, they can be obtained from different sources. Besides bone marrow, these cells are taken from umbilical cord blood, umbilical vein, saphenous vein, peripheral blood, arteries, liver and fetal pancreas, placenta, dental pulp and adipose tissue. MSCs derived from adipose tissue are important because of the abundant number of cells that can be obtained from this tissue, easy access and little discomfort to the patient. This study compared two techniques for obtaining MSCs from adipose tissue: mechanical dissociation (MD) and enzymatic digestion (ED). We also analyzed the inter-species cross-reactions using commercial monoclonal antibodies directed against surface antigens of stem cells from different species: mouse, horse, rabbit, monkey and human. We found that MD technique is favorable in relation to ED within 15 days of culture, and ED is more efficient in the first days of culture. The data also showed that MD causes less damage to cellular DNA. About inter-species cross-reactions, the monoclonal antibody A69 directed against stem cells from rabbits, which can be used in veterinary medicine, particularly in research involving horses

Análise da expressão de genes oncogênicos selecionados do KSHV em células endoteliais TIVE-LTC co-cultivadas com células linfóides Jurkat com e sem expressão constitutiva da proteína tat do HIV-1

O Herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV), ou Herpesvírus Humano tipo 8 (HHV-8), é o agente etiológico do sarcoma de Kaposi (SK), uma neoplasia maligna vascular. O ciclo biológico do KSHV apresenta duas fases, denominadas ciclo latente e ciclo lítico (ou produtivo). O ciclo latente é marcado pela expressão de um número reduzido de genes virais, com destaque para LANA e vFLIP. No ciclo lítico ocorre a replicação do genoma viral e a produção de novas partículas virais infecciosas; dentre seus principais produtos destacam-se as proteínas Rta, vGPCR e K1. LANA, vFLIP, vGPCR e K1 apresentam propriedades oncogênicas relatadas na literatura, enquanto Rta têm papel importante na regulação da transição entre os ciclos lítico e latente do KSHV. O KSHV é requerido para o desenvolvimento do SK. No entanto, a infecção pelo vírus não é suficiente para o desenvolvimento da doença. Por outro lado, sabe-se que o HIV é um co-fator importante, que favorece o desenvolvimento dessa neoplasia. Sugere-se que a proteína tat do HIV-1 amplifica a infectividade do KSHV, hiper-regulando a expressão de diferentes genes herpesvirais e colaborando para o crescimento e sobrevivência de células endoteliais que compõem as lesões do SK. A fim de contribuir para um melhor entendimento dos efeitos da proteína tat do HIV-1 em células infectadas pelo KSHV, o presente trabalho descreveu eventuais alterações na expressão dos genes codificadores de vFLIP, LANA, vGPCR, Rta e K1 em células endoteliais de veia umbilical humana imortalizada pela telomerase e infectada pelo KSHV a longo prazo (TIVE-LTCs) expostas à proteína tat do HIV-1 produzida por células linfóides T (CLTs) em co-cultivo. Células Jurkat contendo ou não vetor da proteína tat do HIV-1 foram utilizadas como CLTs e co-cultivadas com TIVE-LTCs por 48, 72 e 96 horas. Após extração do RNA total das...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)