Quantitation of alternatively spliced NMDA receptor NR1 isoform mRNA transcripts in human brain by competitive RT-PCR

The N-methyl-D-aspartate (NMDA)-selective subtype of ionotropic glutamate receptor is of importance in neuronal differentiation and synapse consolidation, activity-dependent forms of synaptic plasticity, and excitatory amino acid-mediated neuronal toxicity [Neurosci. Res. Program, Bull. 19 (1981) 1; Lab. Invest. 68 (1993) 372]. NMDA receptors exist in vivo as tetrameric or pentameric complexes comprising proteins from two families of homologous subunits, designated NR1 and NR2(A-D) [Biochem. Biophys. Res. Commun. 185 (1992) 826]. The gene coding for the human NR1 subunit (hNR1) is composed of 21 exons, three of which (4, 20 and 21) can be differentially spliced to generate a total of eight distinct subunit variants. We detail here a competitive RT-PCR (cRT-PCR) protocol to quantify endogenous levels of hNR1 splice variants in autopsied human brain. Quantitation of each hNR1 splice variant is performed using standard curve methodology in which a known amount of synthetic ribonucleic acid competitor (internal standard) is co-amplified against total RNA. This method can be used for the quantitation of hNR1 mRNA levels in response to acute or chronic disease states, in particular in the glutamatergic-associated neuronal loss observed in Alzheimer's disease [J. Neurochem. 78 (2001) 175]. Furthermore, alterations in hNR1 mRNA expression may be reflected at the translational level, resulting in functional changes in the NMDA receptor. (C) 2003 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

Quantitation of human brain GABAA receptor isoforms by competitive RT-PCR

We have developed a competitive RT-PCR assay, adapted from Lewohl et al. [Brain Res. Brain Res. Protoc. 1 (1997) 347]. for the quantitation of GABA, receptor beta isoforms in human brain using an internal standard that shares high sequence homology to the targets. The internal standard is identical to the beta(1) sequence except for a 61 bp deletion and the incorporation of a Hind III restriction enzyme site. Unlike traditional competitive RT-PCR, which requires a range of internal standard concentrations to be titrated against a constant amount of unknown, this method relies on a standard curve for quantitation of each sample and thus permits increased sample throughput. This method is suitable for the quantitation of beta(1), beta(2) and beta(3) isoforms of the GABA(A) receptor in human alcoholic and control brain. (C) 2003 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

Preliminary comparison of three lightcycler pcr assays for the detection of herpes simplex virus in swab specimens

Three Herpes Simplex Virus LightCycler polymerase chain reaction assays were compared for the detection of herpes simplex virus in 48 swab specimens. The assays comprised of one in-house assay and two commercial kits: the Artus HSV LC RealArt PCR kit and the Roche LightCycler HSV 1/2 Detection kit. On the whole, the three assays had comparable sensitivities. However, differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by melting curve analysis was problematic in all assays. Overall, the results highlight the limitations of typing herpes simplex virus by melting curve analysis.

An SNP-based PCR assay to differentiate between Listeria monocytogenes lineages derived from phylogenetic analysis of the sigB gene

The alternative sigma factor sigB gene is involved in the stress response regulation of Listeria monocytogenes, and contributes towards growth and survival in adverse conditions. This gene was examined to determine if it could be a useful indicator of lineage differentiation, similar to the established method based on ribotyping. The sigB sequence was resolved in four local L. monocytogenes strains and the phylogenetic relationship among these, and a further 21 sigB gene sequences from strains of different serotype and lineage including two Listeria innocua strains, obtained from the GenBank database were determined. The sigB nucleotide sequences of these 25 Listeria strains were then examined for single nucleotide polymorphic (SNP) sites that could differentiate between the three lineages. Based on nucleotide sequences L. monocytogenes lineage F serotype 1/2b and 4b clustered together, lineage II/serotype 1/2a and 1/2c strains clustered together, lineage III/serotypes 4a and 4c strains clustered together and L. innocua strains clustered together as an outgroup. SNPs differentiating the three lineages were identified. Individual allele-specific PCR reactions based on these polymorphisms were successful in grouping known and a further 37 local L. monocytogenes isolates into the three lineages. (C) 2003 Elsevier B.V. All fights reserved.

Gene flow in great bustard populations across the Strait of Gibraltar as elucidated from excremental PCR and mtDNA sequencing

Recent advances in molecular biology have made it possible to use the trace amounts of DNA in faeces to non-invasively sample endangered species for genetic studies. Here we use faeces as a source of DNA and mtDNA sequence data to elucidate the relationship among Spanish and Moroccan populations of great bustards. 834 bp of combined control region and cytochrome-b mtDNA fragments revealed four variable sites that defined seven closely related haplotypes in 54 individuals. Morocco was fixed for a single mtDNA haplotype that occurs at moderate frequency (28%) in Spain. We could not differentiate among the sampled Spanish populations of Caceres and Andalucia but these combined populations were differentiated from the Moroccan population. Estimates of gene flow (Nm = 0.82) are consistent with extensive observations on the southern Iberian peninsular indicating that few individuals fly across the Strait of Gibraltar. We demonstrate that both this sea barrier and mountain barriers in Spain limit dispersal among adjacent great bustard populations to a similar extent. The Moroccan population is of high ornithological significance as it holds the only population of great bustards in Africa. This population is critically small and genetic and observational data indicate that it is unlikely to be recolonised via immigration from Spain should it be extirpated. In light of the evidence presented here it deserves the maximum level of protection.

Efeito da privação de sono paradoxal e do bloqueio da síntese da corticosterona sobre os limiares da reação de defesa induzida pela estimulação elétrica da matéria cinzenta periaquedutal e colículo superior

O Transtorno do pânico (TP) é um transtorno mental comum que afeta até 5% da população em algum momento da vida, sendo caracterizada pela presença de ataques de pânico (AP) recorrentes. Constitui uma psicopatologia que pode ser afetada pela privação do sono (PS), relação que ainda é pouco compreendida. Neste contexto, modelos experimentais de AP e de PS são ferramentas úteis na investigação dessa possível correlação, especialmente motivado pela crescente condição de privação de sono, que tem se tornado cada vez mais frequente na sociedade moderna. Assim, este estudo avaliou os efeitos da privação de sono paradoxal (PSP) sobre os limiares dos comportamentos defensivos induzidos por estimulação intracraniana (EI) da MCPD e CS de ratos num modelo experimental de AP, assim como verificou a influência da corticosterona sobre esses limiares. Foram utilizados 160 ratos Wistar machos (300g), organizados em 4 grupos com 40 animais cada, como se segue: Grupo Controle (CTR) submetido à EI, porém sem PSP; Grupo Privação (PRV), submetido à EI e privado por 96 horas; Grupo Privação + Bloqueio da corticosterona (PRB), submetido ao tratamento com metirapona, EI, e privado por 96 horas, e Grupo Controle + Bloqueio da corticosterona (CTB), submetido ao tratamento com metirapona e EI, porém sem privação de sono. Após 10 dias do implante cirúrgico intracraniano de eletrodo na MCPD e CS, os animais passaram por 5 sessões de estimulação, como se segue: 1ª (TRI) considerada triagem - imediatamente antes da privação, 2ª (P48) após 48h de privação, 3ª (P96) após 96h de privação, 4ª (R48) após 48h de retirada da privação e 5ª (R96) após 96h de retirada da privação. As curvas de limiares das respostas individuais de defesa obtidas nas várias sessões de estimulação da MCPD e CS (TRI, P48, P96, R48 e R96) dos ratos foram comparadas entre si, bem como as curvas de limiares de uma dada resposta nos diferentes grupos (CTR, PRV, CTB e PRB). Além disso, os níveis de corticosterona (CORT) foram dosados nas diferentes sessões de EI, e comparadas num mesmo grupo, bem como nos diferentes grupos. No grupo CTR, todos os comportamentos foram iguais em todas as sessões quando comparados à TRI, entretanto, nos animais privados (PRV), o limiar do galope (GLP) reduziu significativamente em R48 e R96, não ocorrendo xix alterações nos demais comportamentos. Em contraste, no grupo PRB, o Trote (TRT) aumentou a partir de P48, enquanto o GLP não foi alterado em nenhuma sessão de EI. Na comparação entre os grupos, em Salto (SLT), Micção (MIC), Exoftalmia (EXO), Imobilidade (IMO), Defecação (DEF), TRT e GLP, não sofreram alterações decorrentes da CORT produzida decorrente da PSP, sugerindo que a corticosterona não altera os comportamentos defensivos característicos do Ataque de Pânico. Em adição, tais resultados sugerem que os efeitos tardios da PSP sobre os limiares de GLP possivelmente se devam a mecanismos neuroquímicos tempo-dependente.

Prevalência elevada do Alloiococcus otitidis na otite média com efusão através da PCR simultânea

A etiologia da otite média com efusão (OME) não é completamente conhecida, mas agentes infecciosos podem contribuir para sua patogênese. O conhecimento sobre a epidemiologia bacteriana da OME em áreas geográficas distintas é essencial para a implementação de tratamentos racionais, quando indicados. OBJETIVO: Determinar a prevalência do Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis e Alloiococcus otitidis nas efusões da orelha média de crianças com otite média recorrente (OMR) e otite média com efusão crônica (OMEC) que foram submetidas à miringotomia e comparar os resultados obtidos por cultura e PCR. FORMA DE ESTUDO: Estudo clínico com coorte transversal. MATERIAL E MÉTODO: 128 efusões obtidas por timpanocentese de 75 crianças entre 11 meses e 10 anos de idade foram analisadas por cultura e PCR simultânea. RESULTADOS: Cultivaram-se bactérias em 25,1% das amostras e os patógenos principais foram encontrados em 19,6%. O A.otitidis não foi isolado em cultura. A PCR identificou bactérias em 85,9%, com os seguintes resultados individuais: A.otitidis, 52,3%; H.influenzae, 39,1%; S.pneumoniae, 12,5% e M.catarrhalis, 10,2%. A PCR foi significativamente mais sensível que a cultura (P<0,01). O S.pneumoniae foi mais encontrado em OMR do que em OMEC (P=0,038). CONCLUSÕES: A prevalência das bactérias na OME em um grupo de crianças brasileiras é semelhante àquelas relatadas em outros países, sendo o H.influenzae o mais encontrado dentre os patógenos principais da orelha média. O S.pneumoniae foi mais freqüente em OMR do que em OMEC. A PCR é mais sensível na detecção de bactérias na efusão da orelha média, comparada com cultura, e é essencial para a identificação do A.otitidis. O elevado percentual de detecção do A.otitidis sugere mais investigações sobre sua atuação no início e no prolongamento de doenças da orelha média.

Efeito da mitomicina C em polipose nasossinusal eosinofílica, in vivo: dosagem de IL5 e GM-CSF, RT-PCR

A polipose nasossinusal eosinofílica (PNS) é manifestação de uma doença inflamatória crônica na mucosa do nariz e nos seios paranasais caracterizada por infiltração de granulócitos eosinófilos. O fator responsável pela eosinofilia e manutenção dessas células com a perpetuação do processo inflamatório e formação polipóide é objeto constante de estudos. As citocinas como IL5 (interleucina 5) e GM-CSF (fator estimulador de colônia granulócito macrófago) aumentam a sobrevida dos eosinófilos e prolongam a sua presença no tecido polipóide, diminuindo o índice de apoptose eosinofílica. OBJETIVO: Avaliar o efeito da mitomicina C - MMC - por meio de aplicação tópica em pacientes portadores de PNS eosinofílica quanto à presença de IL5 e GM-CSF. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Quinze pacientes portadores de PNS eosinofílica foram submetidos à aplicação tópica de MMC na concentração de 0,5mg/ml, 1ml, durante cinco minutos, na cavidade nasal direita, e submetidos à biópsia para RT-PCR 24hs após. O grupo-controle foi a cavidade nasal esquerda. O perfil de citocinas foi analisado para IL5 e GM-CSF. RESULTADOS: A comparação dos resultados de GM-CSF pré e pós-uso de MMC quando usamos o teste t pareado apresenta p=0,041. A comparação para IL5 resulta em p < 0,001. CONCLUSÃO: O uso de MMC em pacientes com PNS mostra redução com significância estatística par GM-CSF e importante significância para IL5.

Correlação da cadeia ossicular no transoperatório com achados histológicos de colesteatomas

A Otite Média Crônica é definida pela presença de alterações teciduais inflamatórias irreversíveis na fenda auditiva. As lesões ossiculares são as mais prevalentes. OBJETIVO: Correlacionar o grau de comprometimento da cadeia ossicular, visualizada no transoperatório, com o grau histológico de inflamação e com a espessura da perimatriz de colesteatomas. TIPO DE ESTUDO: Estudo transversal. MÉTODOS: Descrições cirúrgicas de 71 pacientes foram revisadas. Colesteatomas coletados e fixados em formol 10% e preparadas uma lâmina em Hematoxilina-Eosina e outra em Picrossírios. A leitura foi "cega", através de imagens digitais, no ImageProPlus. A análise estatística foi realizada através do coeficiente de Spearman, sendo considerados como estatisticamente significativos os valores de P<0,05. RESULTADOS: Havia algum envolvimento da cadeia ossicular em 65 casos. O ossículo mais freqüentemente afetado era a bigorna, seguida pelo estribo e pelo martelo. Ao aplicarmos o coeficiente de Spearman entre o grau de comprometimento da cadeia ossicular com a idade do paciente à cirurgia, a espessura da perimatriz e o grau histológico de inflamação não foram detectadas correlações. CONCLUSÃO: Os nossos achados indicam que é praticamente universal o acometimento da cadeia ossicular na presença de colesteatoma. Não foi encontrada correção entre a erosão ossicular e os achados histológicos.

Tensão térmica e taxa de reação em um reator para gaseificação de biomassa do tipo concorrente

A conversão da energia química da biomassa em outras formas de energia pode ser processada de diversas maneiras. Dentre essas, encontra-se a gaseificação, que utiliza reatores para conversão da biomassa em gás combustível. Para o dimensionamento de um gaseificador e seus constituintes, vários fatores devem ser levados em consideração, desde as características do combustível até as reais necessidades de energia térmica liberada. Especificamente no dimensionamento da grelha, alguns índices servem de referência, como a tensão térmica e a taxa de reação. Este trabalho teve como objetivos determinar a taxa de reação e a tensão térmica de uma grelha plana utilizada em um gaseificador bem como comparar os valores obtidos com aqueles recomendados para o dimensionamento de grelhas em fornalhas. Foi utilizado um gaseificador de biomassa de fluxo concorrente de pequena escala, ao qual foi acoplada uma câmara para combustão do gás produzido. O combustível utilizado foi toretes de eucalipto, em pedaços com diâmetro de 4 a 8 cm e comprimento de 10 a 20 cm. Conclui-se que os índices de taxa de reação e tensão térmica encontrados podem ser utilizados como parâmetros para o dimensionamento de grelhas de gaseificadores de leito fixo.

Caracterização de genótipos de soja na região dos Cerrados quanto à reação à podridão vermelha da raiz, causada pelos fungos Fusarium tucumaniae e Fusarium brasiliense

A podridão vermelha da raiz de soja vem crescendo em importância, a cada ano, no Brasil, com aumento substancial de participação nas perdas de produtividade. Na região dos Cerrados, são escassos os dados de campo sobre a reação de cultivares à doença. Assim, este trabalho teve como objetivo a caracterização, em campo, de uma série de genótipos de soja, quanto à resistência à podridão vermelha da raiz, em solos naturalmente infestados. Foram testados 71 genótipos de soja, sendo 16 do ciclo de maturação precoce, 28 do ciclo de maturação médio e 27 do ciclo de maturação tardio, em quatro localidades, no entorno do Distrito Federal. O delineamento experimental foi o de blocos ao acaso, com quatro repetições. A caracterização foi realizada por meio dos níveis de incidência e severidade dos sintomas foliares. Genótipos com altos níveis de resistência à doença foram observados nos três grupos de maturação, em cultivares e linhagens em fase final de melhoramento.

Projeto da cadeia de suprimento: uma visão dinamica da decisão fazer versus comprar

Nos últimos anos, temos observado movimentos cíclicos na arquitetura da cadeia de suprimento de alguns setores produtivos. Ora temos o setor integrado verticalmente, composto por grandes empresas dominantes, ora temos o mesmo setor desintegrado horizontalmente, constituído por uma multidão de empresas atuando em nichos de mercado. Nesse ambiente altamente competitivo, o domínio de competências essenciais, com maior valor agregado, é decisivo para a sobrevivência de qualquer organização. Este artigo propõe facilitar a compreensão do assunto, analisando a evolução dos modelos tradicionais de decisão fazer versus comprar e avaliando sua adequação em setores da economia com elevada velocidade evolutiva.