Caracterização molecular da mutação pso8-1/rad6 de Saccharomyces cerevisiae, sensível à fotoadição de psoralenos, à radiação UVC e a mutágenos químicos

Um novo mutante isolado da levedura Saccharomyces cerevisiae, sensível à fotoativação de psoralenos mono- e bi-funcionais, à UVC e ao MNNG, complementou o fenótipo de sensibilidade à fotoadição de psoralenos conferido pelas mutações pso1 a pso7 e assim foi chamado pso8-1. O duplo mutante pso8-1 rad4-4 foi altamente sensível à UVC, indicando assim uma interação sinergística dos dois mutantes alelos. A clonagem molecular pela complementação do fenótipo de sensibilidade à radiação UVC do mutante pso8-1 e estudos genéticos revelaram que pso8-1 é alelo ao gene RAD6. O produto do gene RAD6/UBC2 é uma enzima conjugada à ubiquitina envolvida em reparação de DNA, esporulação, recombinação, indução de mutagênese, degradação de proteínas, genes silenciosos, transposição Ty1. Enquanto o mutante pso8-1 apresenta um fenótipo mutador espontâneo e possui baixa mutabilidade induzida a mutágenos, a esporulação de diplóides homoalélicas mostrou eficiência próxima à da linhagem selvagem. A análise da seqüência do mutante alelo mostrou que pso8-1 contém uma nova, e até agora desconhecida, transição T→C no nucleotídeo 191, levando à substituição de uma prolina altamente conservada por uma leucina na posição 64 (Rad6-[P64L]) que pode ter severas conseqüências na estrutura terciária da proteína mutada, e conseqüente ligação a pRad18.

Efeito da administração aguda de arginina sobre aspectos bioquímicos e comportamentais em ratos adultos

Os erros inatos do metabolismo (EIM) constituem um grupo de doenças genéticas causadas pela deficiência ou ausência de uma proteína, geralmente uma enzima. A hiperargininemia é um erro inato do ciclo da uréia causado pela deficiência de arginase, enzima que converte a arginina em ornitina e uréia. O bloqueio desta reação resulta no acúmulo tecidual e plasmático de arginina e seus metabólitos, os compostos guanidínicos. As manifestações clínicas desta doença diferem substancialmente das demais doenças metabólicas do ciclo da uréia. Seus principais sintomas, que manifestam-se progressivamente, são caracterizados por espasticidade, epilepsia e retardo mental. A correlação entre o metabolismo da arginina e do óxido nítrico ocorre no chamado ciclo arginina-citrulina. A arginina é o substrato para a síntese de óxido nítrico pela ação da enzima óxido nítrico sintetase (ONS). Como os pacientes hiperargininêmicos apresentam altos níveis de arginina no plasma e tecidos, é provável que, devido ao excesso deste substrato, ocorra um aumento na síntese de óxido nítrico. O óxido nítrico em concentrações elevadas está associado à produção de radicais livres, neurotoxicidade e inibição da enzima Na+,K+-ATPase. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental ao funcionamento normal do sistema nervoso central (SNC), pois regula a transmissão do impulso nervoso, o volume celular e o transporte de moléculas ligadas ao cotransporte de Na+, tais como aminoácidos, glicose e neurotransmissores. A inibição da atividade da Na+,K+-ATPase nos sítios pré-sinápticos resulta na inibição da recaptação de glutamato, bem como na estimulação de sua liberação. A inibição desta enzima também tem sido associada a diversas neuropatologias. A Na+,K+-ATPase também está envolvida na LTP (long term potentiation – potenciação de longa duração), que é um tipo de neuroplasticidade celular que provoca alterações nas cascatas bioquímicas no SNC, que são, muitas vezes, idênticas àquelas que ocorrem durante o processo de formação da memória. Assim, acredita-se que a LTP seja um dos diversos mecanismos bioquímicos importantes para a formação da memória. Neste estudo investigamos o efeito in vivo da administração aguda de arginina, L-NAME (um potente inibidor da ONS) e a co-administração de Arg + L-NAME sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica de hipocampo de ratos adultos e sobre testes 6 comportamentais utilizados para avaliar o aprendizado e memória: campo aberto e esquiva inibitória. Os resultados obtidos demonstraram que a arginina inibiu significativamente a atividade da enzima Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica de hipocampo de ratos. A administração de L-NAME não alterou a atividade da enzima, mas preveniu a diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase causada pela arginina. Nos experimentos de comportamento foram avaliados o aprendizado, a consolidação e a evocação da memória de longa duração pela administração das soluções em três momentos diferentes. A arginina diminuiu o desempenho do teste de esquiva inibitória nos três momentos, o L-NAME isoladamente não alterou o comportamento dos animais, mas quando co-administrado com a arginina aumentou a capacidade de memorização desta tarefa. Estes resultados indicam que a administração de arginina in vivo reduz tanto a atividade da Na+,K+-ATPase como a modulação da memória em ratos, e que isso ocorreu, provavelmente, pelo aumento da síntese de óxido nítrico. Assumindo a possibilidade de que isso possa ocorrer em pacientes com hiperargininemia, os resultados obtidos podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a disfunção neurológica associada a essa doença.

A gestão ambiental em indústrias do vale do Taquari :

A preservação do meio ambiente está deixando de ser uma prática só dos países desenvolvidos. Preservar e despoluir o meio ambiente está se tornando uma das diretrizes de todos os países, independente da sua condição econômica ou social. Para tanto é oportuno avaliar as práticas de gestão ambiental das indústrias do Vale do Taquari. O Vale do Taquari é composto por 40 municípios, abrangendo uma área de 5.762 Km2. Sua população é de cerca de 315 mil habitantes e sua formação étnico-cultural compõe-se de imigrantes portugueses, alemães e italianos. Possui uma economia bem diversificada, com forte concentração na atividade agroindustrial, com ênfase na produção de proteína animal. O objetivo deste trabalho é analisar o processo de implantação das técnicas de produção mais limpa nas indústrias do Vale do Taquari. Para tanto, foram investigadas 54 indústrias, de forma a destacar as variáveis externas que estão pressionando por melhorias ambientais, identificando motivações para adoção destas práticas e dificuldades encontradas. Também foram avaliados o uso de técnicas de produção mais limpa e os seus possíveis ganhos econômicos. A pesquisa mostrou que as indústrias do Vale do Taquari se comportam de forma variada, quanto ao assunto gestão ambiental. Verificou-se que 30% das indústrias desconhecem o assunto, porém acham que se faz necessário uma rigorosa fiscalização por parte dos órgãos competentes. Como forma de preservação ambiental, as indústrias procuram diminuir o consumo dos recursos naturais, optando por fontes alternativas, principalmente os insumos energéticos. Estas atitudes, na maioria das indústrias da região, são tomadas por iniciativa própria. O destino dos resíduos industriais, as dificuldades na reciclagem e os custos não absorvidos pelos consumidores, caracterizam algumas das dificuldades encontradas pelas indústrias para reduzir o impacto das suas atividades sobre ambiente. Com relação às práticas de preservação ambiental, alguns setores, estão bem adiantados, obtendo inclusive ganhos econômicos. Nestes casos, percebe-se as vantagens do uso das técnicas da produção mais limpa, quando então a indústria passa a consumir menos energia, menos matérias-primas e reduz substancialmente os resíduos danosos à natureza.

Estádios críticos para suplementação nitrogenada em cevada

A época de aplicação de N na cultura da cevada pode influenciar o rendimento de grãos pelo estímulo específico dado a seus componentes. Neste sentido, foi realizado o presente trabalho para determinar o período e os estádios fenológicos da cultura da cevada afetados pela aplicação de N. Foram conduzidos três experimentos a campo em Eldorado do Sul, Encruzilhada do Sul e e outro em Victor Graeff, no ano de 2000, e dois experimentos a campo, um em Eldorado do Sul e Victor Graeff, no ano de 2001. Os estádios de aplicação de N foram na emergência das plântulas; emissão da 2a ou 3ª folha; 4a ou 5ª folha; 6a ou 7ª folha; 8a ou 9ª folha e emborrachamento, e as doses de N foram 30 ou 40 e 60 ou 80 kg.ha-1. Foram analisados o rendimento de grãos e seus componentes (espigas área-1, grãos espiga-1 e massa de grão), a característica cervejeira dos grãos, o desenvolvimento de afilhos, a produção de massa seca e o acúmulo de N na parte aérea. As maiores respostas em rendimento de grãos foram observadas entre a emissão da 3a folha à emissão da 7a folha do colmo principal. A aplicação de N antecedendo o início do afilhamento beneficiou a formação de colmos área-1 e grãos espiga-1 e a aplicação no final do afilhamento consolidou o número de espigas área-1 e grãos espiga-1. A aplicação de N no final do afilhamento resultou na maior disponibilidade de N para dar aporte ao processo de acúmulo de massa seca e N, que é intensificado no período de alongamento dos entrenós O aporte de N a estes processos diminuiu a competição entre os colmos e as estruturas reprodutivas, reduzindo a mortalidade de colmos. Até o final do afilhamento, não houve incremento no teor de proteína dos grãos devido à maior produção de massa seca e ao aumento do número de grãos área-1, diluindo o N acumulado na parte aérea neste componente.

Trombose da veia porta em crianças e adolescentes : deficiência das proteínas C, S e Antitrombina e pesquisa das mutações fator V Leiden, G20210A da Protrombina e C677T da Metileno-tetraidrofolato redutase

Objetivo: A trombose da veia porta é uma causa importante de hiper-tensão porta em crianças e adolescentes, porém, em uma proporção importante dos casos, não apresenta fator etiológico definido. O objetivo desse estudo é determinar a freqüência de deficiência das proteínas inibidoras da coagulação – proteínas C, S e antitrombina − e das mutações fator V Leiden, G20210A no gene da protrombina e C677T da metileno-tetraidrofolato redutase em crianças e adolescentes com trom-bose da veia porta, definir o padrão hereditário de uma eventual deficiência das pro-teínas inibidoras da coagulação nesses pacientes e avaliar a freqüência da deficiên-cia dessas proteínas em crianças e adolescentes com cirrose. Casuística e Métodos: Foi realizado um estudo prospectivo com 14 crianças e adolescentes com trombose da veia porta, seus pais (n = 25) e dois gru-pos controles pareados por idade, constituídos por um grupo controle sem hepato-patia (n = 28) e um com cirrose (n = 24). A trombose da veia porta foi diagnosticada por ultra-sonografia abdominal com Doppler e/ou fase venosa do angiograma celíaco seletivo. A dosagem da atividade das proteínas C, S e antitrombina foi determinada em todos os indivíduos e a pesquisa das mutações fator V Leiden, G20210A da pro-trombina e C677T da metileno-tetraidrofolato redutase, nas crianças e adolescentes com trombose da veia porta, nos pais, quando identificada a mutação na criança, e nos controles sem hepatopatia. Resultados: Foram avaliados 14 pacientes caucasóides, com uma média e desvio padrão de idade de 8 anos e 8 meses ± 4 anos e 5 meses e do diagnóstico de 3 anos e 8 meses ± 3 anos e seis meses. Metade dos pacientes pertenciam ao gênero masculino. O motivo da investigação da trombose da veia porta foi hemorra-gia digestiva alta em 9/14 (64,3%) e achado de esplenomegalia ao exame físico em 5/14 (35,7%). Anomalias congênitas extra-hepáticas foram identificadas em 3/14 (21,4%) e fatores de risco adquiridos em 5/14 (35,7%) dos pacientes. Nenhum pa-ciente tinha história familiar de consangüinidade ou trombose venosa. A deficiência das proteínas C, S e antitrombina foi constatada em 6/14 (42,9%) (p < 0,05 vs con-troles sem hepatopatia), 3/14 (21,4%) (p > 0,05) e 1/14 (7,1%) (p > 0,05) pacientes com trombose da veia porta, respectivamente. A deficiência dessas proteínas não foi identificada em nenhum dos pais ou controles sem hepatopatia. A mutação G20210A no gene da protrombina foi identificada em um paciente com trombose da veia porta e em um controle sem hepatopatia (p = 0,999), mas em nenhum desses foi identificado a mutação fator V Leiden. A mutação C677T da metileno-tetraidrofo-lato redutase foi observada na forma homozigota, em 3/14 (21,4%) dos pacientes com trombose da veia porta e em 5/28 (17,9%) controles sem hepatopatia (p = 0,356). A freqüência da deficiência das proteínas C, S e antitrombina nos pacientes com cir-rose foi de 14/24 (58,3%), 7/24 (29,2%) e 11/24 (45,8%), respectivamente (p < 0,05 vs controles sem hepatopatia), sendo mais freqüente nos pacientes do subgrupo Child-Pugh B ou C, que foi de 11/12 (91,7%), 5/12 (41,7%) e 9/12 (75%), respectivamente (p < 0,05 vs controles sem hepatopatia). Conclusões: A deficiência de proteína C foi freqüente nas crianças e adolescentes com trombose da veia porta e não parece ser de origem genética. A deficiência de proteína S, antitrombina e as presenças das mutações G20210A da protrombina e C677T da metileno-tetraidrofolato redutase foram observadas mas não apresentaram diferença estatística significativa em relação ao grupo controle sem hepatopatia. O fator V Leiden não foi identificado. Os resultados deste estudo sugerem que a deficiência da proteína C pode ocorre como conseqüência da hiper-tensão porta. Os distúrbios pró-trombóticos hereditários não parecem apresentar um papel importante em relação à trombose nas crianças e adolescentes estudadas.

Fator de Von Willebrand no adenocarcinoma colorretal

O adenocarcinoma colorretal é um dos tumores sólidos mais prevalentes no mundo, ocupando a terceira posição em ambos os sexos, precedido pelo carcinoma de pulmão e estômago em homens, e pelo carcinoma de mama e cérvix em mulheres. No Brasil, o adenocarcinoma colorretal está entre as cinco neoplasias mais freqüentes, ocupando a quinta posição em mortalidade. A sobrevida global dos pacientes está em torno de 40% em 5 anos, tendo havido pequena elevação deste índice nas últimas quatro décadas. O estadiamento clínico-patológico permanece como o mais importante indicador prognóstico para o adenocarcinoma colorretal, sendo a sobrevida em 5 anos dos pacientes portadores de metástases à distância menor que 5%. Estas lesões são encontradas em 75% dos indivíduos que morrem da doença e representam, na maioria das vezes, um evento terminal. O processo de metastatização segue uma série de etapas interligadas que devem ser completadas pela célula tumoral para que se produza uma lesão clinicamente evidente. O primeiro passo desta seqüência se dá através de um fenômeno conhecido como angiogênese. Este consiste na proliferação endotelial acelerada com formação de novos vasos, que irão permitir que o tumor cresça e envie células neoplásicas à circulação. Esta neovascularização leva à maior produção de uma glicoproteína plasmática essencial para o processo de hemostasia primária, o fator de von Willebrand. Esta proteína é liberada pelas células endoteliais e pelas plaquetas e seus níveis estão elevados em situações clínicas em que há proliferação ou dano endotelial. Nos pacientes com câncer, o fator de von Willebrand, além de servir como potencial marcador da angiogênese, contribui diretamente para a formação das metástases, promovendo a ligação das células tumorais às plaquetas. Esta interação faz com que se formem agregados celulares heterotípicos que não são reconhecidos pelo sistema imunológico e têm maior capacidade de adesão aos leitos capilares dos órgãos alcançados. A associação entre aumento nos níveis plasmáticos do fator de von Willebrand e a progressão neoplásica foi demonstrada em pacientes com tumores de cabeça e pescoço e colo uterino, não havendo dados na literatura sobre a correlação deste fator com o câncer colorretal. No presente estudo foram comparados as concentrações desta proteína em 75 pacientes com adenocarcinoma colorretal e em 88 controles saudáveis, sendo estes valores correlacionados com os principais indicadores prognósticos da doença. Este é o primeiro estudo a ser publicado que documenta o comportamento do fator de von Willebrand em pacientes com adenocarcinoma colorretal. Os resultados deste estudo demonstraram que os pacientes com câncer colorretal apresentaram níveis de fator de von Willebrand significativamente superiores aos controles (P < 0.0001). Houve associação significativa entre as concentrações do fator de von Willebrand e o estadiamento tumoral (P < 0.0001), a invasão de estruturas anatômicas adjacentes (P < 0.009) e a presença de metástases à distância (P < 0.02). Os dados aqui apresentados sugerem que os níveis plasmáticos do fator de von Willebrand nos pacientes com adenocarcinoma colorretal possam ser indicadores do comportamento biológico deste tumor. Portanto, a definição do papel desta proteína no processo de disseminação neoplásica merece estudos complementares.

Avaliação de IGF-1 (Insulin-like growth factor-1), IGFBP-1 e IGFBP-3 (Insulin-like to growth binding protein-1 e 3) no fluído folicular de pacientes infertéis com endometriose

Resumo não disponível.

Estudo sobre o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral em um modelo in vivo e em culturas organotípicas de hipocampo de ratos

A HSP27 é um membro da família das proteínas de choque térmico que protege as células contra diversos tipo de estresse, sendo expressa principalmente em astrócitos depois da isquemia. Neste trabalho, nós estudamos o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral, usando um modelo in vivo e culturas organotípicas. Foram estudados diferentes tempos de reperfusão in vivo (1, 4, 7, 14, 21, 30 dias) usando 2 min, 10 min ou 2+10 min de isquemia global transitória pela oclusão dos 4 vasos (4VO). Foi observado um aumento no imunoconteúdo no DG depois de todos os tratamentos, com uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Em CA1, região vulnerável, observou-se um aumento no imunoconteúdo depois de 10 ou 2+10 min de isquemia; em 10 min o aumento de fosforilação foi paralelo ao imunoconteúdo, enquanto com 2+10min de isquemia, quando a região CA1 se tornou resistente, houve uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Os resultados sugerem que a HSP27 pode estar atuando como chaperona, protegendo outras proteínas da desnaturação nos astrócitos, os quais podem auxiliar os neurônios a sobreviverem por manter a homeostase do tecido. Em culturas organotípicas, foram usados 5 ou 10 min de privação de glicose e oxigênio (OGD) ou 1µM de NMDA para induzir tolerância ao tempo letal, 40 min, de privação de glicose e oxigênio (OGD). Nesse caso, foi observado um aumento no imunoconteúdo de HSP27 depois de todos os tratamentos, mas a porcentagem de HSP27 fosforilada se manteve constante ou aumentou quando o pré-condicionamento ocorreu. A HSP27 pode estar modulando os filamentos de actina ou bloqueando o processo apoptótico, facilitando a sobrevivência das células. Em conjunto, os resultados sugerem que o mecanismo que leva à morte de células pode ser diferente nos dois modelos, exigindo atuações distintas da proteína.

Clonagem e caracterização parcial de cDNA de glândula salivar de Boophilus microplus (Acari:Ixodidae) similar a glutationa s-transferase

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago de bovino que causa sérias perdas econômicas. Estudos para o desenvolvimento de formas alternativas de controle do carrapato tem sido realizados para diminuir ou substituir a aplicação de agentes químicos, que contaminam o ambiente, os derivados da carne, além dos problemas de resistência das gerações de carrapatos aos acaricidas. As vacinas são uma forma alternativa de controle do carrapato. As enzimas glutationa S-transferase (GSTs) são alvo potencial para intervenção imunológica contra alguns parasitas. Este trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar parcialmente um cDNA de B. microplus similar a GST da classe Mu. O clone SG2 foi isolado dentre aproximadamente 8 x 103 pfu de fagos recombinantes de uma biblioteca de cDNA de glândula salivar de partenógina, sondada com anti-soro de coelho contra glândula salivar. O clone SG2 contendo um inserto de 864 pb teve sua seqüência determinada e a fase de leitura aberta corresponde a 220 amino ácidos. A análise desta seqüência indicou que o gene clonado codifica uma GST de B. microplus (BmGST) com um motivo altamente conservado entre os resíduos 60 e 68 que compreende o sítio de ligação a glutationa (GSH) e outro motivo SLAILRYL, centrado no resíduo 78 da seqüência. No alinhamento múltiplo da AgSG2 com outras GSTs foi observada uma similaridade de até 41% com GSTs da classe Mu de outros organismos e inclusive com outra GST da classe Mu isolada de larva de B. microplus (HE et al., 1999). A proteína recombinante AgSG2 purificada apresentou atividade enzimática contra o substrato cromogênico CDNB. Ensaios de atividade enzimática com extratos de tecidos, secreções e excreções foram realizados para verificar a presença de GST. Ensaios de RT-PCR com tecidos de B. microplus indicaram que os sítios de síntese de BmGST são glândulas salivares e intestino de partenógina e teleógina.

Resposta de cultivares de arroz irrigado à densidade de semeadura e à adubação nitrogenada em área com rizipiscicultura

A rizipiscicultura caracteriza-se pelo cultivo de arroz irrigado e peixes em consórcio, sendo uma prática milenar realizada em diversos países asiáticos. No Brasil, esta atividade ainda não está muito difundida e os seus benefícios ainda são pouco conhecidos. Com o objetivo de avaliar o efeito de três densidades de semeadura (70, 150 e 230 kg/ha) e de três níveis de nitrogênio (40, 80 e 160 kg/ha) sobre o rendimento de grãos e outras características agronômicas de duas cultivares de arroz irrigado. Foi conduzido um experimento a campo em Santo Antônio da Patrulha, RS, no ano agrícola 2000/2001. Foram avaliados atributos físicos e químicos do solo, acamamento de plantas, crescimento e distribuição radicular, rendimento de grãos, componentes do rendimento, esterilidade, qualidade de grãos, rendimento de massa seca, índice de colheita e nitrogênio acumulado na parte aérea da planta. A fertilidade e a concentração de raízes na camada mais superficial do solo (0 – 5 cm) são maiores em relação à camada de 5,1 – 15 cm. A elevação da densidade de semeadura na cultivar IRGA 417 resulta em aumento no rendimento de grãos e no acamamento de plantas. Na cultivar IRGA 419 não há efeito do aumento da densidade de semeadura sobre estes parâmetros. Independente da cultivar e da densidade de semeadura, o rendimento de grãos de arroz irrigado e o acamamento de plantas não foram afetados pela adubação nitrogenada. O rendimento de massa seca da parte aérea aumenta com o aumento da densidade de semeadura somente até à DPF. O teor de proteína bruta dos grãos de arroz irrigado é maior na cultivar IRGA 417 do que na cultivar IRGA 419.

Desempenho e comportamento de ovinos em gestação e lactação nos diferentes estágios fenológicos de azevém anual sob pastejo

O experimento foi conduzido na Estação Experimental Agronômica, UFRGS, Eldorado do Sul (30º05’22” S; 51º39’08” W), com o objetivo de avaliar o desempenho e comportamento ingestivo de ovinos em fim de gestação e início de lactação nos diferentes estágios fenológicos do azevém anual (Lolium multiflorum Lam.): vegetativo, pré-florescimento e florescimento. As maiores taxas de acúmulo diário de matéria seca (MS) foram registradas nos estágios vegetativo (70kg/ha/dia) e pré-florescimento de azevém anual (44kg/ha/dia) e as menores taxas no estágio de florescimento (30kg/ha/dia). As porcentagens de digestibilidade in vitro da matéria orgânica (80,5, 71,4 e 60,7%) e da proteína bruta (23,7, 21,2 e 19,4%) apresentaram a mesma tendência. Estes efeitos foram acompanhados por redução de folhas e aumento de colmos proporcionais de 66 e 42 para 35% e 18 e 29 para 41% nos estágios vegetativo, pré-florescimento e florescimento, respectivamente. Em resposta a estes parâmetros, observou-se variações no comportamento ingestivo dos ovinos tais como nos tempos de pastejo diário (9,65, 10,97 e 10,68h), nas taxas de bocados (52,65, 51,93 e 40,63 bocados/min) e nos tamanhos de bocados (0,064, 0,055 e 0,048g/bocado) que determinaram diferentes consumos de forragem estimado por simulação de pastejo (4,48%, 3,91% e 2,72% P.V.). Estes resultados evidenciam o alto potencial do azevém anual em termos de ganho de peso vivo nos estágios vegetativo (225kg/ha) e pré-florescimento (145kg/ha). Estes registros também evidenciam o efeito negativo da redução na qualidade da forragem no estágio de florescimento sobre o consumo voluntário e o rendimento animal (1,2kg/ha).

Avaliação do potencial tóxico e genotóxico do sulfato de cobre em planária : utilidade deste organismo para biomonitoramento ambiental

A poluição do meio ambiente por metais pesados apresenta um problema grave devido a sua alta toxicidade e a capacidade de bioacumulação. Tendo em vista o vasto uso do sulfato de cobre em algumas indústrias e nas lavouras do Rio Grande do Sul, e a importância de se avaliar possíveis danos causados nos seres vivos, o objetivo deste trabalho foi determinar o potencial tóxico do sulfato de cobre em Planária e verificar a utilidade deste organismo para biomonitoramento ambiental. O sulfato de cobre induziu dano dose-dependente no DNA após exposição aguda e crônica, sendo que o efeito observado é a primeira evidência da genotoxicidade do cobre detectada com o Teste Cometa. A interferência dos íons de cobre com o processo de reparo do dano no DNA induzido pelo MMS sugere que o cobre poderia modular os efeitos genotóxicos associados com a exposição às misturas complexas no meio ambiente. Monitoramento da cinética do reparo no DNA em planárias mostrou reparo mais lento in vivo em comparação aos dados obtidos em cultura de células, acentuando a importância dos testes in vivo na avaliação do risco associado com a exposição adversa. O conteúdo da proteína hsp60 em planária Dugesia schubarti não foi alterado em resultado da exposição ao cobre, mostrando que não é um parâmetro adequado para avaliação da contaminação química. Animais não tratados apresentaram quantidades detectáveis de proteína hsp60, revelando um alto nível basal de expressão desta proteína que poderia mascarar possível indução em resultado da exposição química. Contudo, indução da hsp60 foi observada após choque térmico. A atividade da catalase em planária foi significativamente induzida após exposição às baixas concentrações de sulfato de cobre, mostrando-se um indicador sensível para exposição aguda ao cobre e sugerindo possível uso deste ensaio em estudos com outros agentes oxidantes. A atividade relativamente alta da catalase, detectada nas planárias não tratadas, provavelmente está relacionada com o alto nível de oxigênio dissolvido no seu habitat. A exposição das planárias ao mutagênico conhecido MMS, in vivo, induziu quebras no DNA, de maneira dose-dependente, em concentrações similares com as da referência em células de mamíferos, comprovando a sensibilidade do sistema utilizado. A planária se mostrou também um organismo bastante apropriado para a detecção de danos no DNA utilizando-se o Teste Cometa, sugerindo que poderia ser útil para o monitoromento de efeitos genotóxicos induzidos por agentes químicos no ambiente aquático. Os resultados apresentados neste estudo revelam o potencial tóxico e genotóxico do sulfato de cobre em planárias e também sugerem que este organismo-teste pode ser considerado um sistema valioso para avaliação da contaminação química em estudos ambientais.

Estudo da fosforilação e estrutura de filamentos intermediários em astrócitos permeabilizados com digitonina

O dinâmico processo de polimerização e despolimerização dos filamentos intermediários de astrócitos é modulado principalmente por fosforilação da proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Os sítios de fosforilação da GFAP estão localizados na porção N-terminal, onde atuam proteínas quinases dependentes de AMPc e Ca2+. Este processo vem sendo investigado em fatias cerebrais, culturas de astrócitos, frações citoesqueléticas ou sistemas purificados. Neste trabalho estamos descrevendo uma nova técnica para o estudo do sistema fosforilante da GFAP que consiste na permeabilização de astrócitos em cultura com digitonina, Este modelo permite o acesso aos sítios intracelulares mantendo preservada, ainda que parcialmente, a compartimentalização celular. As condições de permeabilização foram estebelecidas com base na exclusão ao azul de Tripan. A incubação das células com AMPc e Ca2+ promoveram o aumento da fosforilação da GFAP, enquanto imunocitoquímica com anti-GFAP mostrou que em condições basais astrócitos permeabilizados mantém sua morfologia protoplasmática típica e apresenta a estrutura dos filamentos intermediários preservada. Ao incubar os astrócitos permeabilizados com AMPc estes filamentos aparentemente condensaram formando longos processos. Estes resultados sugerem que esta técnica tem potencial considerável para o estudo de alterações estruturais nos filamentos gliais em paralelo com a fosforilação de proteínas por permitir o uso de moduladores específicos de proteínas quinases e fosfatases.

Avaliação da atividade neuroprotetora do extrato de kava (Piper methysticum) em modelos in vitro de lesão celular

As doenças cerebrovasculares, popularmente conhecidas como derrames, são uma das principais causas de morbidade e mortalidade entre adultos e idosos. Contudo, muitos pacientes que sofrem derrame sobrevivem e experimentam as conseqüências do insulto por muitos anos, muitas vezes a nível emocional, motor ou intelectual. Dentre estas lesões, destaca-se a isquemia cerebral. Existem modelos experimentais de isquemia cerebral in vivo e in vitro. Os modelos in vitro são realizados em culturas ou fatias de tecido cerebral submetidas à Privação de Oxigênio e Glicose (POG), que mimetizam condições traumáticas similares, mas não idênticas às produzidas in vivo. A investigação da atividade de substâncias potencialmente neuroprotetoras a partir da comparação da morte celular entre culturas ou fatias de tecido cerebral controle e tratadas é facilitada neste tipo de modelo experimental. Após a injúria, as culturas são expostas a métodos de avaliação da viabilidade ou dano celular como, por exemplo, o corante fluorescente iodeto de propídeo, que marca seletivamente células mortas ou em curso de morte, ou MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) que mede a viabilidade mitocondrial possibilitando uma posterior quantificação. As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos. Um exemplo é a planta kava-kava ou somente kava (Piper Methysticum) a qual chamou a atenção dos pesquisadores devido à sua utilização nas ilhas do Pacífico sul. Foi demonstrada a possibilidade da kava possuir uma variedade de atividades farmacológicas importantes, entre elas a atividade de neuroproteção Esse trabalho tem como objetivo avaliar a atividade neuroprotetora do extrato de kava-kava (Piper methysticum) em modelos in vitro de morte neuronal em fatias de hipocampo de ratos, investigar o envolvimento da proteína de choque térmico HSP27 (Heat Shock Protein) no processo de morte e neuroproteção induzida pela kava, bem como investigar o efeito da lesão induzida por POG sobre o imunoconteúdo da proteína Oxido Nítrico Sintase induzível (iNOS). Os resultados dos experimentos por nós realizados nas culturas organotípicas submetidas à POG por 40 minutos e tratadas com extrato de kava (7µg/ml) demonstraram uma significativa redução, na ordem de 58% na intensidade da morte neuronal na região CA1 do hipocampo em resposta à injúria. Em fatias hipocampais submetidas à POG por 60 minutos a adição do extrato de kava 7µg/ml aumentou em 15% a viabilidade celular, confirmando a atividade neuroprotetora sugerida para esta planta. As culturas expostas à POG e tratadas com kava apresentaram um aumento significativo no imunoconteúdo da proteína HSP27, esse aumento é acompanhado de um aumento da fosforilação, uma vez que a percentagem de proteína fosforilada se mantém igual. As fatias lesionadas tratadas com kava apresentaram uma diminuição significativa no imunoconteúdo da iNOS na ordem de 35 % em relação as fatias lesionadas tratadas com DMSO (Dimetilsulfoxido). Estes dados podem sugerir que um dos mecanismos da neuroproteção observada para o extrato de kava, possa envolver essas proteínas.

Produção, caracterização, purificação e aplicação de uma protease produzida pelo microrganismo Microbacterium sp. kr10

O uso de enzimas como agentes de modificação das propriedades funcionais de proteínas tem se tornado bastante difundido na indústria de alimentos. As proteases, apresentam inúmeras vantagens, principalmente, devido a sua atividade em baixas concentrações e a sua ausência de toxicidade, que faz com que se elimine a necessidade da sua remoção do produto final. O objetivo deste trabalho foi determinar as condições ótimas de produção da protease de Microbacterium sp. kr10, caracterizar e purificar parcialmente a enzima, assim como verificar a sua utilização como agente de modificação das propriedades funcionais da proteína de soja. Através da metodologia de superfície de resposta foram determinadas as condições ótimas de produção da protease, pH de 7,0, temperatura de 25°C e 12,5 g L-1 de farinha de pena (p/v). O padrão proteolítico da enzima tanto no extrato cru quanto na parcialmente purificada indicam que esta é uma metaloprotease, com pH e temperaturas ótimos nas faixas de 6,5 a 7,5, e 45 a 55°C, respectivamente. A atividade enzimática foi totalmente inibida por EDTA, fenantrolina, HgCl2 e CuCl2 e parcialmente inibida por ZnCl2, MnCl2 e SnCl2. A enzima foi parcialmente purificada através de cromatografia de gel filtração e troca iônica resultando num fator de purificação de 250. Um aumento gradativo do grau de hidrólise da proteína de soja foi observado à medida que se aumentou a razão enzima/substrato utilizada, assim como a redução da formação de espuma e o aumento da capacidade emulsificante de uma solução composta pelo hidrolisado de soja e óleo de soja, mesmo sob condições de alta temperatura e alta concentração de sal. Desta forma, esta protease apresenta potencial para aplicação como agente de modificação protéica de proteína de soja isolada.