Cdk Activity Couples Epigenetic Centromere Inheritance to Cell Cycle Progression

Centromeres form the site of chromosome attachment to microtubules during mitosis. Identity of these loci is maintained epigenetically by nucleosomes containing the histone H3 variant CENP-A. Propagation of CENP-A chromatin is uncoupled from DNA replication initiating only during mitotic exit. We now demonstrate that inhibition of Cdk1 and Cdk2 activities is sufficient to trigger CENP-A assembly throughout the cell cycle in a manner dependent on the canonical CENP-A assembly machinery. We further show that the key CENP-A assembly factor Mis18BP1(HsKNL2) is phosphorylated in a cell cycle-dependent manner that controls its centromere localization during mitotic exit. These results strongly support a model in which the CENP-A assembly machinery is poised for activation throughout the cell cycle but kept in an inactive noncentromeric state by Cdk activity during S, G2, and M phases. Alleviation of this inhibition in G1 phase ensures tight coupling between DNA replication, cell division, and subsequent centromere maturation.

Rikskansleren Axel Oxenstiernas skrifter och brefvexling.

Editor of Förra afd. Bd. 1-2, Sen. afd. Bd. 4-5: C. G. Styffe; Förra afd. Bd. 3: Sam Clason; Förra afd. Bd. 4-10: Herman Brulin; Förra afd. Bd. 11.1: Emil Schieche; Förra afd. Bd. 13-15: Tor Berg; Sen. afd. Bd. 1, 3, 6-10: Per Sondén; Sen. afd. Bd. 2: J. F. Nyström; Sen. afd. Bd. 11: Nils Edén; Sen afd. Bd. 12: Nils ahnlund.

Greenpeaces modelläsare : En multimodal textanalys av Greenpeace i Sveriges externa mejl

I denna uppsats undersöker jag vilka modelläsare som skapas i två olika sorters mejl från Greenpeace i Sverige till personer som engagerar sig i organisationens arbete. Jag gör en multimodal textanalys med utgångspunkt i dialogism och sociosemiotisk teori, och jag använder analysmetoder från den systemisk-funktionella grammatiken. Resultatet visar att de två mejltyperna i det stora hela är mycket lika varandra, men att det finns vissa skillnader och att de olika mejltyperna därigenom konstruerar delvis olika modelläsare som verkliga läsare måste förhålla sig till. Modelläsarna skapas genom realiseringar av olika språkliga och visuella betydelseskapande resurser som t.ex. presuppositioner, processer, distans och språk- och bildhandlingar. Det gemensamma för modelläsarna är att de sympatiserar med Greenpeace, har en aktiv aktörsroll och har en nära och jämlik relation till organisationen. 

Co-branding på sociala medier : En studie av hur betydelser skapas och förstärks i ett svenskt modevarumärkes visuella marknadsföring

Syftet med denna studie är att undersöka hur företag använder co-branding och sociala medier för att skapa betydelse för sitt varumärke. Detta kommer jag att undersöka utifrån följande huvudfrågeställning:  Vilka betydelser skapas, alternativt förstärks, genom StyleIn AB’s co-brandingsamarbeten på sociala medier? För att göra det tydligare har jag även två mindre frågeställningar att utgå ifrån:  Hur använder StyleIn AB sociala medier som främsta forum för co-branding samarbeten?  Hur skapas och förstärks betydelse i StyleIns inlägg på sociala medier genom cobranding? Den pågående expansionen av sociala medier och den visuella kulturens framväxt är grunden till varför jag valt att skriva denna uppsats. Betydelser, budskap och värderingar kommer till uttryck i visuellt material och sprids enkelt och snabbt via olika sociala medier. Då kanalerna är billiga att använda sig utav är det vanligt för företag att bedriva sin marknadsföring i dessa forum. I denna uppsats har jag valt att titta närmare på hur ett företag använder sociala medier för att sprida både sitt eget och andra varumärkens budskap genom vad man kallar för “co-branding” i sociala medier. Min studie är avgränsad till det svenska modeföretaget StyleIn AB’s sociala kanaler där de ihop med andra företag exponeras i visuella former. Anledningen till att jag valde företaget StyleIn har att göra med att co-branding är en stor och återkommande del av deras marknadsföring på sociala medier. Med anledning till forumet för denna marknadsföring kommer mitt bakgrundskapitel beröra just sociala medier. Eftersom co-branding är en varumärkesbyggande process kommer mitt teoretiska ramverk, inklusive mitt kapitel om tidigare forskning, att beröra olika teorier kring varumärken samt forskning i fenomenet co-branding. Teorier kring sociala mediers nytta för varumärken kommer också presenteras för att kunna besvara hela min frågeställning. Vidare använder jag mig av semiotisk analys som metod för att jag så djupt som möjligt skall kunna förklara de olika betydelserna i de tre inlägg jag använder mig utav. I mitt resultat kommer jag fram till att StyleIn’s co-branding samarbeten på sociala medier är en värdeskapande process som bygger upp StyleIn som varumärke genom att använda sig av betydelser lånade av andra varumärken. Jag kommer fram till att det handlar om värderingar som rör en viss typ av livsstil och utifrån dessa kan man urskilja betydelser och meningar uppkomna ur användandet av andra varumärken ihop med sitt eget på sociala medier.

Syns det inte, finns det inte : En studie om produktplaceringar i tv-serier och film

Tidigare har den vanligaste typen av reklam varit den i form av avbrott i tv­sändningar men i takt med våra ändrade tv­vanor söker reklamföretagen nya sätt att marknadsföra sig själva på. Så kallade produktplaceringar, är ett sådant marknadsföringssätt. Ett av de tydligaste exempel på detta är år 1982 då filmen E.T: The Extra Terrestrial hade premiär och huvudkaraktären åt godiset Reeses Pieces, en produktplacering som medförde en försäljningsökning på hela 65%. Produktplaceringar är sedan dess en blomstrande bransch och drar årligen in mångmiljardbelopp men attityderna gentemot denna typ av reklam har sviktat. Vi ställde oss därför frågan hur attityderna gentemot reklamfenomenet ser ut idag samt ifall ålder är en avgörande faktor för hur individer resonerar om produktplaceringar. Detta har lett till denna studiens syfte som är att undersöka två generationers attityder gentemot produktplaceringar i film och tv­serier samt hur de uppmärksammar det. Eftersom syftet med studien är att erhålla information om individers personliga uppfattningar, ansåg vi att den kvalitativa intervjun var bäst lämpad. Fyra intervjuer med personer mellan 20­30 år samt fyra intervjuer med personer mellan 50­60 år genomfördes. Materialet bestod i slutändan av åtta transkriberade intervjuer som analyserades med hjälp av studiens teoretiska ramverk. Teorierna berör generella antaganden om produktplaceringar, olika typer av produktplaceringar, dess påverkan på publiken, övertalningsförsök samt attityd och perception. Studien resulterade i att vi fann skillnader i hur generationerna uppmärksammar produktplaceringar. Den yngre generationen är i högre grad mottaglig för subtila placeringar medan den äldre generationen ansåg att placeringarna behövde vara tydliga och inzoomade för att uppmärksammas. Gällande attitydsaspekten fann vi att den yngre generationen har en något mer negativ inställning mot produktplaceringar, vilket kan bero på att denna typ av reklam påverkar det undermedvetna, något som framförallt den yngre generationen anser vara läskigt. Den äldre generationen har en något mer positiv syn på produktplaceringar, men en viss skepcism består. Detta beror troligen på att reklamtypen faktiskt påverkar och bringar ett köpintresse, något som denna generation hade skilda åsikter kring.

Marabou Black, med avsikt att lura sin publik : En kvalitativ analys av debatten efter vilseledande PR-utövande

Den 18 mars 2013 meddelar den folkkära artisten Tommy Nilsson att han byter namn till Black och  väljer en mörkare och hårdare image. Reaktionerna låter inte vänta på sig och under dagen går nyheten varm i svensk media. Senare ska det visa sig att det hela bara handlar om en PR-kampanj med syfte att marknadsföra chokladjätten Marabous nya chokladkaka med smak av saltlakrits. Tidigare forskning har visat på hur den här typen av PR-utövande, som ämnar vilseleda sin publik, riskerar att skada förtroendet för såväl företag, som journalister och PR-utövare. Genom en kritisk diskursanalys undersöker den här studien debatten som uppkommer som en reaktion på den här typen av PR-utövande, med hjälp av den specifika kampanjen Black. Genom tio argumenterande/debatterande texter på såväl nyhetsplattformar som bloggar undersöks argument, uppfattningar och förslag på konsekvenser. För att bättre förstå den profession som debatten berör tas centrala teorier om den relativt outforskade PR-branschen upp. En central del i studien inom såväl tidigare forskning som teori är hur det nya medieklimatet-/samhället har en betydande roll när den här typen av marknadsföring får allt större plats i nyhetsflödet. Resultatet visar att majoriteten av deltagarna i debatten ställer sig kritiska till det här sättet att marknadsföra produkter/tjänster på. Det argumenteras genomgående för hur den här metoden kan anses bra i den mån den bidrar till mycket uppmärksamhet och stor spridning på kort sikt. Men att problematiken ligger i att PR bör handla om att hjälpa företag och organisationer att förbättra deras anseende/varumärke. Genom att vilseleda journalister och mediepubliken riskerar man istället att skada förtroendet på lång sikt. I undersökningen har det framkommit att åsikter och uppfattningar inte skiljer sig beroende på vilken bakgrund/anknytning som skribenten har. Såväl journalister som yrkesverksamma inom reklam-/marknadsföringsbranschen erkänner ett ogillande gentemot metoden. Det visar sig även att det finns avvikande åsikter som skiljer från den negativa uppfattningen, dessa röster beskriver kampanjmetoden som harmlös, nytänkande och rolig. 

Systematic proteomic strategies to map the human signaling landscape

Thesis (Ph.D.)--University of Washington, 2016-05

Antitumor activity of 3-ingenyl angelate: Plasma membrane and mitochondrial disruption and necrotic cell death

Options for skin cancer treatment currently include surgery, radiotherapy, topical chemotherapy, cryosurgery, curettage, and electrodes-sication. Although effective, surgery is costly and unsuitable for certain patients. Radiotherapy can leave a poor cosmetic effect, and current chemotherapy is limited by low cure rates and extended treatment schedules. Here, we describe the preclinical activity of a novel topical chemotherapeutic agent for the treatment of skin cancer, 3-ingenyl angelate (PEP005), a hydrophobic diterpene ester isolated from the plant Euphorbia peplus. Three daily topical applications of 42 nmol (18 mug) of PEP005 cured a series of s.c. mouse tumors (B16 melanoma, LK2 UV-induced squamous cell carcinoma, and Lewis lung carcinoma; it = >14 tumors/group) and human tumors (DO4 melanoma, HeLa cervical carcinoma, and PC3 and DU145 prostate carcinoma; it = >4 tumors/group) previously established (5-10 mm(3)) on C57BL/6 or Fox1(nu) mice. The treatment produced a mild, short-term erythema and eschar formation but, ultimately, resulted in excellent skin cosmesis. The LD90 for PEP005 for a panel of tumor cell lines was 180-220 muM. Electron microscopy showed that treatment with PEP005 both ill vitro (230 tot) and ill vivo (42 nmol) rapidly caused swelling of mitochondria and cell death by primary necrosis. Cr-51 release, uptake of propidium iodide, and staining with the mitochondria dye JC1, revealed that PEP005 (230 muM) treatment of tumor cells ill vitro resulted in a rapid plasma membrane perturbation and loss of mitochondrial membrane potential. PEP005 thus emerges as a new topical anti-skin cancer agent that has a novel mode of action involving plasma membrane and mitochondrial disruption and primary necrosis, ultimately resulting in an excellent cosmetic outcome.

Identification of the nuclear localization signals within the Epstein-Barr virus EBNA-6 protein

Epstein-Barr virus nuclear antigen (EBNA)-6 is essential for EBV-induced immortalization of primary human B-lymphocytes in vitro. Previous studies have shown that EBNA-6 acts as a transcriptional regulator of viral and cellular genes; however at present, few functional domains of the 140 kDa EBNA-6 protein have been completely characterized. There are five computer-predicted nuclear localization signals (NLS), four monopartite and one bipartite, present in the EBNA-6 amino acid sequence. To identify which of these NLS are functional, fusion proteins between green fluorescent protein and deletion constructs of EBNA-6 were expressed in HeLa cells, Each of the constructs containing at least one of the NLS was targeted to the nucleus of cells whereas a construct lacking all of the NLS was cytoplasmic. Site-directed mutation of these NLS demonstrated that only three of the NLS were functional, one at the N-terminal end (aa 72-80), one in the middle (aa 412-418) and one at the C-terminal end (aa 939-945) of the EBNA-6 protein.

IGF-1 phosphorylates AMPK-alpha subunit in ATM-dependent and LKB1-independent manner

Serine/threonine protein kinase AMP-activated protein kinase (AMPK) is a key metabolic stress-responsive factor that promotes the adaptation of cells to their microenvironment. Elevated concentrations of intracellular AMP, caused by metabolic stress, are known to activate AMPK by phosphorylation of the catalytic subunit. Recently, the tumor suppressor serine/threonine protein kinase LKB1 was identified as an upstream kinases, AMPKKs. In the current study, we found that stimulation with growth factors also caused AMPK-alpha subunit phosphorylation. Interestingly, even an LKB1-nonexpressing cancer cell line, HeLa, exhibited growth factor-stimulated AMPK-alpha subunit phosphorylation, suggesting the presence of an LKB1-independent pathway for AMPK-alpha subunit phosphorylation. In the human pancreatic cancer cell line PANC-1, AMPK-alpha subunit phosphorylation promoted by IGF-I was suppressed by antisense ataxia telangiectasia mutated (ATM) expression. We found that IGF-1 also induced AMPK-alpha subunit phosphorylation in the human normal fibroblast TIG103 cell line, but failed to do so in a human fibroblast AT2-KY cell line lacking ATM. Immunoprecipitates of ATM collected from IGF-1-stimulated cells also caused the phosphorylation of the AMPK-alpha subunit in vitro. IGF-1-stimulated ATM phosphorylation at both threonine and tyrosine residues, and our results demonstrated that the phosphorylation of tyrosine in the ATM molecule is important for AMPK-alpha subunit phosphorylation during IGF-1 signaling. These results suggest that IGF-1 induces AMPK-alpha subunit phosphorylation via an ATM-dependent and LKB1-independent pathway. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

HLS5, a novel RBCC (ring finger, B box, coiled-coil) family member isolated from a hemopoietic lineage switch, is a candidate tumor suppressor

Hemopoietic cells, apparently committed to one lineage, can be reprogrammed to display the phenotype of another lineage. The J2E erythroleukemic cell line has on rare occasions developed the features of monocytic cells. Subtractive hybridization was used in an attempt to identify genes that were up-regulated during this erythroid to myeloid transition. We report here on the isolation of hemopoietic lineage switch 5 (Hls5), a gene expressed by the monocytoid variant cells, but not the parental J2E cells. Hls5 is a novel member of the RBCC (Ring finger, B box, coiled-coil) family of genes, which includes Pml, Herf1, Tif-1alpha, and Rfp. Hls5 was expressed in a wide range of adult tissues; however, at different stages during embryogenesis, Hls5 was detected in the branchial arches, spinal cord, dorsal root ganglia, limb buds, and brain. The protein was present in cytoplasmic granules and punctate nuclear bodies. Isolation of the human cDNA and genomic DNA revealed that the gene was located on chromosome 8p21, a region implicated in numerous leukemias and solid tumors. Enforced expression of Hls5 in HeLa cells inhibited cell growth, clonogenicity, and tumorigenicity. It is conceivable that HLS5 is one of the tumor suppressor genes thought to reside at the 8p21 locus.

Transient production of recombinant proteins by chinese hamster ovary cells using polyethyleneimine/DNA complexes in combination with microtubule disrupting anti-mitotic agents

We have developed a simple and robust transient expression system utilizing the 25 kDa branched cationic polymer polyethylenimine (PEI) as a vehicle to deliver plasmid DNA into suspension-adapted Chinese hamster ovary cells synchronized in G2/M phase of the cell cycle by anti-mitotic microtubule disrupting agents. The PEI-mediated transfection process was optimized with respect to PEI nitrogen to DNA phosphate molar ratio and the plasmid DNA mass to cell ratio using a reporter construct encoding firefly luciferase. Optimal production of luciferase was observed at a PEI N to DNA P ratio of 10:1 and 5 mug DNA 10(6) cells(-1). To manipulate transgene expression at mitosis, we arrested cells in G2/M phase of the cell cycle using the microtubule depolymerizing agent nocodazole. Using secreted human alkaline phosphatase (SEAP) and enhanced green fluorescent protein (eGFP) as reporters we showed that continued inclusion of nocodazole in cell culture medium significantly increased both transfection efficiency and reporter protein production. In the presence of nocodazole, greater than 90% of cells were eGFP positive 24 h post-transfection and qSEAP was increased almost fivefold, doubling total SEAP production. Under optimal conditions for PEI-mediated transfection, transient production of a recombinant chimeric IgG(4) encoded on a single vector was enhanced twofold by nocodazole, a final yield of approximately 5 mug mL(-1) achieved at an initial viable cell density of 1 x 10(6) cells mL(-1). The glycosylation of the recombinant antibody at Asn(297) was not significantly affected by nocodazole during transient production by this method. (C) 2004 Wiley Periodicals, Inc.

RNA interference against human papillomavirus oncogenes in cervical cancer cells results in increased sensitivity to cisplatin

Targeted inhibition of oncogenes in tumor cells is a rational approach toward the development of cancer therapies based on RNA interference (RNAi). Tumors caused by human papillomavirus (HPV) infection are an ideal model system for RNAi-based cancer therapies because the oncogenes that cause cervical cancer, E6 and E7, are expressed only in cancerous cells. We investigated whether targeting HPV E6 and E7 oncogenes yields cancer cells more sensitive to chemotherapy by cisplatin, the chemotherapeutic agent currently used for the treatment of advanced cervical cancer. We have designed siRNAs directed against the HPV E6 oncogene that simultaneously targets both E6 and E7, which results in an 80% reduction in E7 protein and reactivation of the p53 pathway. The loss of E6 and E7 resulted in a reduction in cellular viability concurrent with the induction of cellular senescence. Interference was specific in that no effect on HPV-negative cells was observed. We demonstrate that RNAi against E6 and E7 oncogenes enhances the chemotherapeutic effect of cisplatin in HeLa cells. The IC50 for HeLa cells treated with cisplatin was 9.4 mu M, but after the addition of a lentivirus-delivered shRNA against E6, the IC50 was reduced almost 4-fold to 2.4 mu M. We also observed a decrease in E7 expression with a concurrent increase in p53 protein levels upon cotreatment with shRNA and cisplatin over that seen with individual treatment alone. Our results provide strong evidence that loss of E6 and E7 results in increased sensitivity to cisplatin, probably because of increased p53 levels.

A Novel Mammalian Retromer Component, Vps26B

The mammalian retromer protein complex, which consists of three proteins - Vps26, Vps29, and Vps35 - in association with members of the sorting nexin family of proteins, has been implicated in the trafficking of receptors and their ligands within the endosomal/lysosomal system of mammalian cells. A bioinformatic analysis of the mouse genome identified an additional transcribed paralog of the Vps26 retromer protein, which we termed Vps26B. No paralogs were identified for Vps29 and Vps35. Phylogenetic studies indicate that the two paralogs of Vps26 become evident after the evolution of the chordates. We propose that the chordate Vps26-like gene published previously be renamed Vps26A to differentiate it from Vps26B. As for Vps26A, biochemical characterization of Vps26B established that this novel 336 amino acid residue protein is a peripheral membrane protein. Vps26B co-precipitated with Vps35 from transfected cells and the direct interaction between these two proteins was confirmed by yeast 2-hybrid analysis, thereby establishing Vps26B as a subunit of the retromer complex. Within HeLa cells, Vps26B was found in the cytoplasm with low levels at the plasma membrane, while Vps26A was predominantly associated with endosomal membranes. Within A549 cells, both Vps26A and Vps26B co-localized with actin-rich lamellipodia at the cell surface. These structures also co-localized with Vps35. Total internal reflection fluorescence microscopy confirmed the association of Vps26B with the plasma membrane in a stable HEK293 cell line expressing cyan fluorescent protein (CFP)-Vps26B. Based on these observations, we propose that the mammalian retromer complex is located at both endosomes and the plasma membrane in some cell types.

Silencing of integrated human papillomavirus type 18 oncogene transcription in cells expressing SerpinB2

The serine protease inhibitor SerpinB2 (PAI-2), a major product of differentiating squamous epithelial cells, has recently been shown to bind and protect the retinoblastoma protein (Rb) from degradation. In human papillomavirus type 18 (HPV-18) -transformed epithelial cells the expression of the E6 and E7 oncoproteins is controlled by the HPV-18 upstream regulatory region (URR). Here we illustrate that PAI-2 expression in the HPV-18-transformed cervical carcinoma line HeLa resulted in the restoration of Rb expression, which led to the functional silencing of transcription from the HPV-18 URR. This caused loss of E7 protein expression and restoration of multiple E6- and E7-targeted host proteins, including p53, c-Myc, and c-Jun. Rb expression emerged as sufficient for the transcriptional repression of the URR, with repression mediated via the C/EB beta-YY1 binding site (URR 7709 to 7719). In contrast to HeLa cells, where the C/EBP beta-YY1 dimer binds this site, in PAI-2- and/or Rb-expressing cells the site was occupied by the dominant-negative C/EBP beta isoform liver-enriched transcriptional inhibitory protein (LIP). PAI-2 expression thus has a potent suppressive effect on HPV-18 oncogene transcription mediated by Rb and LIP, a finding with potential implications for prognosis and treatment of HPV-transformed lesions.