白杄花粉管胞吞/胞吐动态及其与细胞壁构建的关系

在有花植物受精过程中，具有顶端极性生长特性的花粉管是雄性生殖单位的载体，同时也是研究细胞生长分子调控机理的理想体系。与被子植物相比，裸子植物花粉具有萌发时间长、花粉管生长缓慢等特点。对于裸子植物花粉萌发和花粉管生长的机理，目前人们尚不十分清楚。本文将以裸子植物白杄（Picea meyeri）花粉为材料，应用不同浓度的分泌系统干扰剂Brefeldin A处理，并通过细胞学和生理生化方法，其中包括普通光学显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、显微红外光谱（FTIR）和透射电镜（TEM）等技术，对其花粉萌发和花粉管生长过程中胞吞胞吐的调控，以及与细胞壁建成的关系等进行较为系统的研究，旨在为进一步揭示裸子植物花粉管发育的调控机理提供参考。 首先比较观察了各种细胞器在白杄与被子植物花粉管中的分布差异。经FM4-64探针标记结果表明，在正常生长的白杄花粉管顶端存在分泌小泡积累的透明区，但与被子植物比较起来，此透明区在花粉管中所占比例较小，且不呈倒“V”字型。在透射电镜下观察发现，其花粉管顶端透明区内分泌小泡的分布密度远低于被子植物。另外，在白杄花粉管中，线粒体的分布一般靠近细胞壁的地方，高尔基体分布较为分散，而内质网的分布则不具方向性。 其次，研究了BFA对白杄花粉萌发和花粉管生长的影响，特别是对其花粉管生长过程中的胞吐/胞吞作用。通常在正常生长的白杄花粉管中，用FM4-64标记后发现，在其顶端形成与透明区对应的荧光亮区;超微结构显示，在花粉管顶端进行旺盛的胞吐作用，许多分泌小泡正与质膜融合，以及分布有大量显示高分泌活性的壁旁体（PB）等。而经过BFA处理后，花粉的萌发和花粉管的生长均受到严重抑制，花粉管出现了弯曲（波状生长）或顶端膨大等异常形态，同时还干扰了FM4-64在花粉管顶端的标记模式。另外，花粉管顶端分泌小泡数量减少，透明区内充满线粒体、高尔基体和空泡等一些大的细胞器，壁旁体也随之消失，其中高尔基体呈现解体或弯曲的异常形态，在其周围的分泌小泡数量大大减少，内质网出现膨胀和核糖体脱落等;同时胞吐活性标志性酶——酸性磷酸酶的活性也随之降低。通过对FM4-64的染料吸收实验表明，BFA对胞吞有明显的促进作用。由上可见，BFA对白杄花粉管生长过程中的胞吐和胞吞作用起了相反的影响， BFA正是通过扰乱花粉管生长过程中的分泌途径来抑制其花粉管的生长。 最后，检测了白杄花粉管分泌途径紊乱后，管壁物质合成的变化情况。通过FTIR光谱分析表明，BFA处理后花粉管壁化学组分发生了变化，例如蛋白质和多糖含量明显减少，而且与蛋白比较起来，多糖的含量下降更为明显，尤其是在顶端。蛋白和多糖含量的下降导致花粉管壁的组成结构不够致密。由SDS-PAGE的结果显示， BFA抑制后，花粉管壁中糖蛋白的含量下降了60%，同时很多壁蛋白条带在BFA处理后不表达或含量减少。通过对花粉管壁多糖成分的研究表明，BFA处理还导致纤维素含量下降，而胼胝质在花粉管顶端积累。用识别AGPs的LM6和识别酸性果胶的JIM5对花粉管进行标记，发现BFA处理后AGPs的环状分布消失，酸性果胶质在顶端的含量也明显减少，但在胞质内却形成一些小的分隔亮点（compartments）。 综上所述，导致裸子植物白杄花粉管生长缓慢的原因，可能与其顶端透明区较小、分泌小泡数量少等有关。另外，从白杄花粉管的细胞质状态和细胞器分布上看，虽然与被子植物相比差异较大，但在其正常生长中仍能进行旺盛地胞吐和胞吞过程。经BFA处理后引起花粉管内分泌系统的紊乱，致使管壁物质不能正常合成，从而导致花粉管的停滞生长。

酵母拮抗菌的抑病效力、规模化培养及相关机理研究

我们实验室从果实表面分离获得的酵母拮抗菌已经证明能有效防治各种果实采后主要病害，为了加快生物拮抗菌的商业化应用，本文在完善拮抗菌抑病机理的基础上，重点研究了拮抗菌规模化培养条件，生物菌剂制品的稳定性，以及拮抗菌对环境胁迫的生理反应。主要研究内容包括：（1）分析酵母菌拮抗菌、病原菌与果实之间的互作效应及其影响因子;（2）筛选酵母拮抗菌规模化培养的最佳营养配方及培养条件;（3）优化酵母拮抗菌干粉与液体剂型的制备方式;（4）研究酵母拮抗菌在不同剂型中生活力下降的可能机理;（5）探讨酵母拮抗菌次生代谢产物的抑菌效果。研究结果如下： 1、单独接种Monilinia fructicola或同时接种M. fructicola和Cryptococcus laurentii均能诱导甜樱桃果实SOD、CAT和POD等抗氧化酶活性升高并加速脂质过氧化，同时伴有PPO同工酶新酶带出现。病原菌M. fructicola和Penicillum expansum在接种初期均显著促进拮抗菌C. laurentii在桃果实伤口处的生长。C. laurentii在接种24h内显著抑制桃果实LOX活性、O2•-产生与H2O2积累。单独接种病原菌能显著诱导桃果实LOX活性升高，促进O2•-产生，但抑制H2O2积累。病菌侵染后果实中 O2•-增加，以及H2O2的降低可能是桃果实对病原菌侵染的一种生理应答方式。 2、抗坏血酸钠能显著提高C. laurentii对甜樱桃果实褐腐病的防治效果，较低浓度的拮抗菌（ 1×107 cells mL-1）与200mM抗坏血酸配合使用可以达到较高浓度拮抗菌（1×108 cells mL-1）单独使用对M. fructicola的防治效果。抗坏血酸钠的协同抑病机理可能是在抑制病原菌生长的同时，也抑制了果实的抗氧化酶活性，从而加速了脂质过氧化过程。 3、酵母菌产业化培养条件的筛选结果表明，不同拮抗菌对培养基中营养物质的需求不一样，培养所需的温度有差异。在120L发酵罐的中试实验表明两种拮抗菌采用筛选出的最佳培养条件均得到浓度大于1× 109 CFU mL-1的菌悬液。 4、保护剂种类是影响Rhodotorula glutinis 和 C. laurentii两种酵母拮抗菌冷冻干燥效果的最主要因素，但保护剂效果的发挥依赖于其浓度与酵母菌生长阶段。无菌水和PBS（100mM, pH5.8）可以作为拮抗菌C. laurentii液体剂型的有效保护剂，而柠檬酸钠（100mM, pH5.8）则诱导拮抗菌C. laurentii的生活力快速丧失。 5、酵母菌拮抗菌冻干制品的研究表明，在胁迫环境下酵母菌生活力快速丧失与大量产生活性氧有关，这暗示活性氧的产生可能是导致酵母菌细胞死亡的主要因素。柠檬酸钠（100mM, pH5.8）对C. laurntii死亡的诱导效应受柠檬酸根浓度和介质酸度的双重影响。活性氧在柠檬酸钠诱导酵母菌生活力快速丧失中大量产生并发挥重要作用。 6、酵母拮抗菌能够产生某些对果实采后病原真菌具有抑制效果的挥发性和不挥发性物质。同一种酵母菌产生的物质对不同病原菌有不同的拮抗效果，而不同酵母菌对同一种病原菌的拮抗效果也不完全相同。但是，不同类型的培养基对拮抗菌产生的抑菌物质有明显的影响。

大蒜重金属抗性基因的克隆及其功能分析

金属硫蛋白（metallothionein，MT）和植物络合素（phytochelatin，PC）是植物中能够与金属离子结合的两大类多肽。二者均富含Cys，但前者是mRNA的编码产物，后者是酶促反应的产物，植物络合素合酶（PCS）则是合成PC的关键酶之一。目前已发现许多植物同时存在金属硫蛋白基因和植物络合素合酶基因。研究重金属胁迫下这两类基因的表达对了解植物的重金属抗性的分子机制具有重要意义，同时还可以为培育能用于植物修复的品种提供新思路。 本论文从大蒜中克隆了一个type 2 MT基因，命名为AsMT2a，将其在大蒜中的表达模式与大蒜的植物络合素合酶基因（AsPCS1）进行了比较，并对二者的过表达转基因拟南芥的重金属抗性进行研究。其主要结果如下： 1． AsMT2a基因全长525 bp，编码79个氨基酸，其中有14个Cys 残基。 推测的氨基酸序列分析表明其Cys的位置和数目与来自其它植物的type 2 MT蛋白的完全一致。 2． RT-PCR的结果显示，大蒜根部AsPCS1的表达在Cd处理的短期（1 hr）内迅速增强，同时PCs含量也大幅度增加。但AsMT2a的表达在Cd处理10 hr后才有明显的增加。说明AsPCS1可能在植物对重金属的急性解毒方面起主要作用，而AsMT2a则在植物对重金属长久耐性中的离子平衡方面起更大作用。暗示在大蒜暴露于Cd胁迫的不同时期AsPCS1和AsMT2a基因可以互相协调而对重金属胁迫作出反应。此外，在不同胁迫条件下，AsPCS1和AsMT2a的表达模式不同，其中Cd、As和热激可以促进根中AsPCS1的表达和PCs的积累。 3．将AsPCS1和AsMT2a转入对砷和镉敏感的酵母菌株 FD236-6A中，RT-PCR的结果显示这两个基因均可在酵母中稳定表达，对转化子的重金属抗性实验表明这两个基因均可提高转化子对砷和镉的抗性。 4．将AsPCS1和AsMT2a 置于 CaMV 35S启动子下转入拟南芥中，RT-PCR结果表明，这两个基因均可在拟南芥中表达。有趣的是，AsPCS1在拟南芥中存在两个转录本，且二者均具有完整的ORF，其推测的氨基酸序列相差38个氨基酸。说明部分AsPCS1在拟南芥中经过了精确的剪切和拼接过程，但其机制尚不清楚。 5．在Cd 胁迫下，AsPCS1的超表达拟南芥的生长好于野生型植株，主要表现在转基因拟南芥的根较长，根数目较多;但在As胁迫下AsPCS1转基因植株与野生型植株没有明显的差别。与此不同的是将AsMT2a转入拟南芥后，转基因植株的As抗性明显增强，同样表现在根长度和根数目上。进一步将AsPCS1和AsMT2a同时转入拟南芥进行超表达，在Cd胁迫下，转基因植株的生长好于野生型植株，且种子萌发率也较高。 6．Cd和As胁迫下，AsPCS1过表达植株的PCs含量增加，同时Cd和As的积累量也明显增加，其中Cd胁迫下Cd含量增加最多，平均比野生型对照增加4倍;而As胁迫下As含量比野生型对照增加1.2倍。在Cd和As胁迫下，AsMT2a过表达植株的Cd和As积累量与野生型相比分别增加1.4倍和0.8 倍。双价基因AsMT2a +AsPCS1过表达植株的 Cd 积累量是野生型的5.8倍，是AsMT2a过表达植株的2.4 倍，是AsPCS1过表达植株的1.2倍。 在克隆AsMT2a的同时，我们还从大蒜中克隆到了一个金属硫蛋白基因家族的新成员，命名为AsMT2b，并对其功能进行了初步探讨。主要结果如下： 1．AsMT2b 全长520 bp，其开读框架为243 bp，编码80个氨基酸，其中含有15个Cys 残基。对推测的氨基酸序列分析表明AsMT2b的N端和C端domain内，Cys的数目和排列方式与其它type 2 MT蛋白明显不同。 其N 端domain内的结构为CXXC——CXC——CXC——CXCC，C端domain 内的结构为CXXC——CXC——CXC。暗示AsMT2b 可能具有与其它MT不同的生物学功能。 2．在较低浓度Cd（200 µM）胁迫下，AsMT2b的表达量随着处理时间（24 hr内）的延长而降低，但随着处理浓度的升高（500 µM）和处理时间延长（48 hr），其表达量又逐步增强，说明AsMT2b可能在胁迫强度增大到一定值时方起作用。 3． 将AsMT2b转入对Cd和As敏感的酵母菌株FD236-6A中，发现AsMT2b对酵母As抗性的提高贡献不大，但可明显提高酵母对Cd的抗性。 4．对AsMT2b的超表达拟南芥的重金属抗性分析表明，与野生型植株比较，转基因植株具有较强的Cd抗性，表现在Cd胁迫下，种子的萌发率较高，根较长，侧根数较多。但在As胁迫下，转基因植株的生长和野生型没有明显差异。可以看出，转AsMT2b的拟南芥对重金属的抗性不同于转AsMT2a的植株，前者的抗Cd性较强，而后者的抗As性较强。 5． Cd胁迫下，AsMT2b过表达拟南芥的Cd含量明显增加，平均比野生型对照植株增加70％，但各个株系的增加幅度不一致。 另外，我们还对CdCl2胁迫下，大蒜幼苗中镉的积累及氧化胁迫和抗氧化能力的变化进行了研究。结果表明在CdCl2 胁迫下，大多数Cd在根部积累，而只有少量的Cd积累于叶片中。5 mM 和10 mM CdCl2 抑制SOD和CAT的活性，但随着处理时间的延长，二者的活性回复到对照水平或高于对照。在CdCl2胁迫下，POD的活性明显增强，同时脂质过氧化产物积累。这些结果说明镉胁迫下，植物细胞中氧化胁迫加剧，而抗氧化酶活性的增强是植物对次生氧化胁迫的一种适应策略。 综上所述，在重金属胁迫下， AsPCS1和AsMT2a之间及AsMT2a和AsMT2b之间均表现出明显的协调反应。这种协调反应可能是植物维持细胞内离子稳态的机制之一。而重金属胁迫下，过表达AsPCS1，AsMT2a或AsPCS1+AsMT2a的拟南芥体内的重金属含量明显增加，表明这些基因可望用于重金属污染土壤的植物修复中。

含铬或锰的新型固氮酶的纯化, 特性和结晶—棕色固氮菌突变种UW3中CrFe蛋白和MnFe蛋白的研究

以含MnSO4或Na2CrO4的无钼无氨的修改Burk’s培养基， 培养不能合成含钼固氮酶体系的棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii Lipmann) 突变种UW3， 发现在一定浓度范围内， MnSO4或Na2CrO4的加入有助于促进其生长。 菌体生长和C2H2还原活性曲线测定结果表明， 这种促进作用很可能是通过Mn或Cr取代Mo， 参与组装固氮酶中心原子簇， 从而影响固氮活性而实现的。 利用阴离子交换 (DEAE-52和Q-Sepharose FF) 和凝胶过滤 (Sephacryl S-200) 柱层析从两种菌体中纯化得到固氮酶组分Ⅰ蛋白 (分别命名为MnFe蛋白和CrFe蛋白)， 并对其进行了特性研究。 厌氧天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 和SDS-PAGE结果显示， 两种蛋白均为两种亚基组成的四聚体。 亚基可以与OP MoFe蛋白抗体发生免疫反应， 分子量分别略小于野生种OP MoFe蛋白的α和β亚基。 CrFe蛋白的C2H2还原活性， Ar下放氢活性和固氮活性分别相当于OP MoFe蛋白的36%， 38%和43%， 而MnFe蛋白活性相当于OP MoFe蛋白的50%左右， 并且两种蛋白与OP MoFe蛋白具有相似的固氮电子利用率。 对两种蛋白金属含量的测定证实其中分别含有Mn和Cr， 但仍存在少量Mo污染。 与OP MoFe蛋白相比，这两种蛋白圆二色谱的摩尔椭圆率 ([θ]) 除在450nm较接近外，在可见光区的其它波长处均显著降低。 与DT还原OP MoFe蛋白相似， CrFe蛋白和MnFe蛋白具有g≈4。3、3。7和2。0的特征EPR信号， 但各处信号强度比例不同。 在对污染Mo可能引起的信号进行校正后，CrFe蛋白的三个信号强度分别相当于DT还原OP MoFe蛋白的20%， 0%和10%， 而MnFe蛋白则分别相当于112%， 49%和65%。 上述结果表明， CrFe蛋白和MnFe蛋白与OP MoFe蛋白金属原子簇的主要差异很可能在于FeMco (M=Cr， Mn或Mo)的M种类， 而P-cluster结构和组成均未见大的差异。 利用气相扩散悬滴法对MnFe蛋白和CrFe蛋白结晶条件进行了筛选和初步优化， 确定了以Tris/Hepes， NaCl， MgCl2和PEG 8000为主要变量的沉淀剂体系， 寻找各组分对于晶体生长的最适浓度。 以此为基础探讨了应用气相扩散坐滴法和液-液扩散法对两种蛋白结晶条件的优化。 在一定条件下， 两种蛋白分别通过液-液扩散法获得了优质大单晶。 对从CrFe蛋白和MnFe蛋白制备物中培养出的蛋白质晶体的SDS-PAGE鉴定显示， 晶体由与OP MoFe蛋白相似的两种亚基组成。 通过 “神舟三号” 飞船搭载实验探讨了空间微重力对于厌氧蛋白质结晶的影响， 结果表明， 微重力有助于避免孪晶形成， 并具有长期培养后获得适于进行X-射线衍射分析的优质大单晶的潜在前景。 结合空间科学使固氮酶结构与功能研究得以发展， 这项工作是有意义并且可行的。

缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究—纯化、结晶及金属簇的组成与分布

从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE－52、Sephacryl S－200及Q－Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase，PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin，Bfr）。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度;而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1，但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等，2004）。 通过Sephacryl S－200柱洗脱峰收集精度的调整及Q－Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting），以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似，从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46-50%;而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外，与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-tagged ΔnifZ Av1（Hu等，2004）的信号明显不同。这就表明，ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-tagged ΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等（1998）对nifZ产物（NifZ）和nifW产物（NifW）可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响;nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZ Av1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25%PEG 6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体;在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显;PEG 6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZ Av1制备物的纯度达到90%以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。

Nifedipine调节白皮松(Pinus bungeana)花粉管蛋白质表达及其对细胞壁构建的影响

花粉管是种子植物受精过程中的雄性生殖单位的载体，由于其生长依赖于胞内Ca2+梯度，并具有典型的顶端极性生长的特点，因而成为近年来研究植物细胞相互识别、胞内和胞外信号传导理想的模式系统。裸子植物花粉与被子植物相比具有萌发时间长、生长缓慢等特点。Ca2+在裸子植物花粉萌发和花粉管生长中的作用机制目前尚不明确。本研究以裸子植物白皮松(Pinus bungeana)的花粉为材料，运用不同浓度钙通道抑制剂Nifedipine（Nif）处理，对其花粉萌发和花粉管生长进行了细胞学研究和蛋白质组学分析，以探讨Ca2+对白皮松花粉生长的调控机制，为进一步揭示裸子植物花粉萌发和花粉管生长机理提供参考。 本论文首先研究了钙通道抑制剂Nif和Ca2+螯合剂EGTA对白皮松花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明，用Nif处理花粉后，花粉萌发和花粉管生长均受到明显抑制。经Ca2+荧光探针Fluo-3AM标记，对Nif处理后Ca2+在花粉管中的分布模式进行了观察，发现Ca2+在正常生长的花粉管中呈梯度分布，并在其顶端的荧光最强。与对照相比，处理后的花粉管荧光强度明显减弱，且顶端Ca2+梯度消失。通过EGTA漂洗后的花粉粒，在正常培养基上萌发率较高，但其生长速率受到抑制。由此说明了细胞壁钙库对花粉管生长的抑制效应显著高于对花粉萌发的影响，是花粉管生长的限速因子。同时外加钙调素还可逆转EGTA对其花粉萌发和花粉管生长的抑制。上述结果表明，白皮松花粉萌发及花粉管生长需要外源Ca2+的内流，以及胞内形成的Ca2+浓度梯度。 用FM4-64探针标记结果发现，正常花粉管中的胞吞作用主要发生在顶端和亚顶端区域，胞吞的小泡也集中分布在这两个区域。经Nif处理后，既不影响花粉管的胞吞过程，同时胞吞发生的位置也与对照相似，只是胞吞的小泡分散于整个花粉管中。电子显微镜观察表明，各种细胞器在白皮松正常生长的花粉管中分布与被子植物存在较大差异，例如前者无明显地分区现象，不具胼胝质塞。白皮松花粉管顶端和亚顶端的壁旁体与质膜融合现象频繁发生。花粉管经Nif处理后，线粒体出现不同程度的解体和液泡化，内质网液泡化和核糖体脱落，液泡大量聚集在花粉管顶端，壁旁体与膜融合现象减少，以及花粉管壁明显变薄等。此外，通过微丝特异性探针鬼笔环肽标记结果表明，正常生长花粉管的微丝呈长轴向排列， Nif处理后微丝断裂，其断裂程度与处理浓度有关。由此可见，外源Ca2+对花粉管的胞吞无明显抑制或促进作用，但对胞吞小泡重回收可能有影响。当胞内Ca2+梯度消失后，则明显抑制了微丝骨架的聚合，进而使胞吐作用减缓，高尔基体分泌小泡聚集，多种细胞器液泡化，引起花粉管顶端膨大，细胞壁变薄，继而抑制花粉管的正常生长。 运用免疫荧光标记技术显示，正常生长的花粉管壁含有纤维素、胼胝质、果胶质和阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs），其中纤维素和胼胝质在细胞壁上呈均匀分布，而酸性果胶质只存在花粉管两侧壁上，酯化果胶分布于花粉管顶端。经过Nif处理后，胼胝质和酸性果胶质均在花粉管顶端累积，而AGPs和纤维素的分布却无明显变化。另外，傅里叶红外光谱分析结果也同样支持上述结论。通过花粉管壁蛋白的SDS-PAGE分析表明，Nif对细胞壁蛋白的合成也有较大的影响。 在花粉管的钙通道受到抑制后，应用蛋白质组学技术分析其蛋白质的表达图谱，通过双向电泳已分离出约1000个蛋白质斑点，经软件分析发现，除其中50个蛋白斑点外，大部分蛋白质的表达量均未发生变化。上述50个发生变化的蛋白斑点酶切后，再经过ESI－MS/MS鉴定和质谱数据库的搜索，共鉴定出28个蛋白，其中12个为上调蛋白，16个下调蛋白，根据其主要功能分为与代谢、细胞扩展、翻译后修饰以及信号相关的蛋白。经过Nif处理后，花粉管中碳水化合物代谢能力下降，ATP的产生受到抑制，参与细胞壁多糖合成及小泡运输的蛋白，如valosin containing protein（VCP）、reversibly glycolsylated polypeptide(RGP)、UDP-glucose dehydrogenase (UDPGDH)和α-tubulin表达下调。另外，通过上述方法还鉴定出与丝氨酸/苏氨酸激酶保守结构域同源的受体蛋白激酶等。 综上所述，白皮松花粉管钙通道受到抑制后，通过影响花粉管蛋白的表达，抑制微丝微管骨架的组装，致使胞吐速度变慢，花粉管壁酸性果胶质、胼胝质等多糖分布的变化及总多糖含量的减少，最终抑制了花粉管的正常生长。

拮抗菌和化学物质的抑病机理及果实抗病相关基因的克隆

真菌病害是造成采后新鲜水果损失的一个主要原因。生物拮抗菌能有效地防治果实采后腐烂，降低杀菌剂的用量，从而增加了食品安全性和降低了潜在的环境危害。然而，与化学杀菌剂相比，单独使用生物拮抗菌对果实采后病害的控制效果有时不如化学杀菌剂明显。因此，为了提高拮抗菌的生防效力，有效控制果实的采后病害，本文主要研究了拮抗菌与化学物质使用的防病机理，并从冬枣果实中克隆β-1，3-葡聚糖酶基因并对其特性进行了初步分析。研究结果表明： 1. 酵母菌Cryptococcus laurentii和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis能够有效的防治冬枣果实采后青霉病和黑霉病的发生，而且C. laurentii对病害的防治效果比B. subtilis好。拮抗菌的抑病效果与使用浓度成正比。在接种C. laurentii的伤口上再接种病原菌可以显著刺激酵母菌的生长。然而，在接种B. subtilis的伤口上接种病原菌则不增加拮抗细菌的群体数量。 2. 不同酵母拮抗菌对四种杀菌剂（Deccozil，Sportak，Iprodine和Stroby）的敏感程度不同。其中，R. glutinis对Deccozil，Iprodione和Stroby最敏感。将低剂量的杀菌剂与酵母菌配合能显著增强酵母菌对采后病菌的抑制作用。C. laurentii与100 µl/L的Stroby配合能完全抑制青霉和黑霉病菌的孢子萌发。2%（w/v）的碳酸氢钠（SBC）与C. laurentii或T. pullulans配合使用显著抑制采后病菌(Penicillium expansum或Alternaria alternata)的孢子萌发和芽管伸长。SBC显著增强拮抗菌对梨果实采后青霉病和黑霉病的防治能力。C. laurentii对采后病害的防治效果好于T. pullulans的防治效果。 3. C. laurentii和B. subtilis对冬枣果实抗病性的诱导与接种距离和接种时间密切相关。距接种拮抗菌近的部位，抗性诱导就越强。酵母菌诱导果实的这种抗病性与诱导果实几丁质酶，β-1，3-葡聚糖酶， PAL，POD和PPO活性有关。 4. 采前喷施2 mM的水杨酸（SA）和0.2 mM的茉莉酸甲酯（MeJA）显著降低甜樱桃果实采后褐腐病的病斑直径， 并能诱导甜樱桃果实β-1，3-葡聚糖酶， PAL， POD和PPO活性以及乙烯含量的增加。采前处理对果实抗病性的诱导效果要好于采后处理。采前和采后SA或MeJA处理，贮藏于25C的甜樱桃果实β-1，3-葡聚糖酶和PAL活性显著高于贮藏于0C的甜樱桃果实的酶活性。2 mM的SA显著抑制了Monilinia fructicola的孢子萌发和菌丝扩展;而0.2 mM的MeJA则对M. fructicola几乎没有抑制作用。在贮藏早期，MeJA对果实β-1，3-葡聚糖酶和PAL活性的诱导作用要强于SA的诱导作用。 5. 1 × 108CFU/ml的C. laurentii，以及5 × 107CFU/ml的C. laurentii与0.2 mM的MeJA 配合使用均可诱导桃果实的抗性，并显著降低果实青霉病和褐腐病的病斑直径。0.2 mM的MeJA能促进C. laurentii生长，抑制P. expansum的菌丝扩展， 但对M. fructicola基本没有抑制作用。在25和0C，MeJA和C. laurentii单独或配合使用都诱导了桃果实几丁质酶，β-1，3-葡聚糖酶，PAL和POD活性的升高。这些抗病相关酶活性的升高可能与病斑扩展的程度是直接相关的。 6. 通过设计简并引物，采用降落PCR，扩增出β-1，3-葡聚糖酶基因的同源片段，分别克隆到两个彼此间同源性很低的β-1，3-葡聚糖酶的cDNA全长（Glu-1和Glu-2）。RT-PCR结果表明，Glu-1基因的表达受酵母拮抗菌C. laurentii处理所诱导，这一结果与酵母拮抗菌诱导果实β-1，3-葡聚糖酶活性的增加相呼应;而Glu-2基因的表达则不受C. laurentii处理所诱导。

MADS-box基因在单子叶植物花发育中的功能研究

第一部分 水稻E类MADS-box 基因在花发育中的功能分析 MADS-box 基因是一个大的转录因子家族，在花发育过程中起重要作用。根据对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛遗传突变体的研究，提出了花发育的ABCDE模型。该模型认为：A、B、C、D、E代表了5类功能不同的花器官特征基因，单独或联合控制花器官的发育。A类基因控制萼片的发育;A、B和E类基因控制花瓣的发育;B、C和E类基因控制雄蕊的发育;C和E类基因控制心皮的发育;D类基因控制胚珠的发育;A和C类基因相互抑制。在这5类基因中，E类基因的功能较为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且具有花分生组织决定性（Floral meristem determinency）。在单子叶植物中，E类基因的功能发生了很大的分化。水稻是单子叶植物的模式植物，水稻中至少有5个E类基因，分别是OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，在这5个E类基因中，除了对OsMADS1基因有较深入的研究外，对其它几个E类基因的功能了解甚少。我们在现有的研究基础上，根据对双子叶植物中E类基因的研究结果，以OsMADS8基因为出发点，利用组织原位杂交，RNAi技术对水稻中的E类基因进行了深入的研究。结果表明：OsMADS8/7基因早在花序枝梗分生组织原基就有转录，随着小穗的生长发育，逐渐集中在小穗分生组织原基，小花分生组织原基，浆片、雄蕊和心皮中表达;在胚珠形成时，内外珠被有很强的杂交信号，而且在幼胚和胚乳中也有表达。OsMADS5在幼花时期，四轮花器官均有表达，在小穗发育后期及受精后的表达方式与OsMADS8/7基因相同。OsMADS8基因被抑制后，转基因植株没有任何表型变化，说明很可能有其它E类基因弥补了OsMADS8基因的功能缺失;当同时抑制其它E类基因的表达时，转基因植株抽穗期明显延长，四轮花器官的发育均受到影响：稃片类似叶片状;浆片转变为稃片类的结构;雄蕊没有花粉;心皮具有了稃片的特点;没有胚珠结构的形成，同时失去了花分生组织决定性，在心皮的部位产生了新的花器官或花分生组织逆转为花序分生组织。说明水稻四轮花器官及胚珠的正常发育需要E类基因的参与，但其功能与双子叶植物如拟南芥，西红柿、矮牵牛等直系同源基因相比已经发生变化;水稻中的E类基因在维持花分生组织特征性方面起重要作用;另外对抽穗期有影响。 第二部分 玉米MADS-box基因ZAG2转录调控区的研究 基因的时空表达受基因中的顺式作用元件及其反式作用因子调控。顺式作用元件由位于基因编码区上游的启动子区域和位置不确定的增强子区域组成。顺式作用元件对基因表达的开启至关重要。MADS-box 基因编码一类控制花器官发育的转录因子，在花的发育过程中顺序表达。MADS-box 基因突变，花器官发生同源异型转换。研究MADS-box 基因的调控序列可以进一步揭示影响基因时空表达的内外因素。ZAG2是玉米MADS-box 基因中的D类基因，控制胚珠的发育，在胚珠和心皮的内表面特异表达。ZAG2基因有7个外显子和6个内含子。我们从玉米基因组分离到了ZAG2基因翻译起始点上游3040bp的序列，并利用5’-RACE方法鉴定出了转录起始点的位置。序列比较发现，在 5’-UTR内有一个1299bp的内含子，这个内含子可能对基因的表达有调控作用，因此构建了两个与GUS基因融合的表达载体：一个是pZAG2-1::GUS，包括翻译起始点以上所有的调控序列;另一个是pZAG2-2::GUS，去掉了5’-UTR中的内含子序列，转化水稻。结果这两个构建都没有使GUS基因在正确的位置表达。pZAG2-1::GUS构建在心皮基部类似花托的部位及稃片顶端着色，pZAG2-2::GUS构建在内外稃片沿稃脉的部位有很强的着色，说明翻译起始点上游的调控序列不足以使基因正常表达。两个构建着色方式不同，可能pZAG2-1::GUS构建在5’-UTR部分含有抑制ZAG2基因在稃片表达的顺式元件，或者启用了在5’-UTR中的转录起始点，因为在5’-UTR的内含子中也有一个很典型的TATA-box。我们推测，在ZAG2基因编码区的第一内含子可能存在另外一些使基因正常表达的增强元件，需要进一步的序列缺失实验加以验证。

果实对酵母拮抗菌和外源水杨酸诱导的抗病性应答机理

用生物和非生物因子来进行采后病害的防治，是一个非常有效的方法。诱导抗性作为控制果蔬采后病害的生物技术，已成为该领域的一个研究热点。然而诱导抗性的机制非常复杂，涉及到寄主、病原菌、激发子之间的相互作用关系。本研究主要利用酵母拮抗菌Pichia membranefaciens和SA处理果实，观察其抗性诱导表达和对采后青霉病菌（Penicillium expansum）的抑制作用，并从蛋白质组学水平上对诱导抗性的机理进行了分析。研究结果表明： 1、酵母拮抗菌P. membranefaciens (5 × 107 cells·ml-1)和SA(0.5 mM)处理采后甜樱桃果实，能够明显地降低病害的发病率和病斑直径。酵母菌和SA处理影响到了果实抗氧化酶的活性，同时还改变了POD同工酶谱和甜樱桃果实的总蛋白含量，并诱导了新的蛋白质条带产生。用光学显微镜和扫描电子显微镜技术观察发现，在in vitro条件下P. membranefaciens能够紧密地结合与病原菌的菌丝，而在in vivo条件下这种结合较为松散。 2、借鉴其它模式植物的方法，我们建立了一整套适用于多汁类植物材料的蛋白质组学研究方法。对于芒果，桃，甜樱桃、苹果以及冬枣等果实，都取得了重复性非常好的2-D图谱。我们应用该技术进一步研究了P. membranefaciens (1 × 108 cells·ml-1)以及SA (0.5 mM)处理对桃果实蛋白质组的诱导影响。结果显示，两种激发子处理都能够诱导桃果实产生抗性，从而减轻青霉病引起的腐烂。在诱导处理1 d以后，酵母拮抗菌和SA分别诱导22和16个蛋白的差异表达。质谱鉴定的蛋白属于6大类：代谢，防御反应，转录，能量途径以及细胞结构。有6个蛋白受到两种激发子的共同调控。其中，4种蛋白(包括glutathione peroxidase, polyphenol oxidase precursor, catalase和methionine sulfoxide reductase) 属于抗氧化蛋白，涉及到活性氧代谢。另2个蛋白（Major allergen Pru av 1和peroxidase）是病程相关蛋白，直接参与植物的防御反应。同时一些磷酸化酶和转录因子也受到两种激发子的调节从而参与果实的抗病反应。酶学测定和Northern杂交的结果表明，拮抗菌与SA处理均能影响过氧化氢酶活性及其基因的表达。 3、采前用较高浓度SA (2 mM) 短时间（10s）处理不同成熟期的甜樱桃果实，能够明显降低果实青霉病的病斑直径，并能减轻较低成熟度果实的发病率。在没有接菌的情况下，SA诱导了33个差异表达的蛋白，其中用质谱鉴定出了26个。而在接种病原菌的情况下，SA诱导了19个差异表达的蛋白，并鉴定出了其中的12个。这些蛋白分别涉及到代谢、防御反应、转录、能量途径、信号转导等过程。在没有接种病原菌的情况下，SA处理诱导了Putative DnaJ heat shock protein, PR1-like protein, Peroxidase, Major allergen Pru av 1 (Pru a 1)和Catalase等与抗病有关的蛋白。而在接种病原菌的情况下，诱导了PR1-like protein, Peroxidase和Catalase蛋白的差异表达。通过酶活性测定以及对细胞学定位的研究，我们发现在没有接种病原菌的情况下，POD的活性受到SA的诱导。但是在接种病原菌以后，诱导效果不明显。

向日葵 (Helianthus annuus L.) 种质资源相关的基础研究

向日葵原产自北美,通过人工培育,形成了具有不同遗传多态性的品种,是一种集观赏、药用、食用、油用于一体，经济价值很高的资源植物。前人已经利用传统育种、辐射育种以及现代生物技术手段对向日葵种质资源的开发和保护进行了深入研究，这也加速了向日葵新品种的选育。随着离子注入等新型辐射方式的出现，离子注入对向日葵的诱变育种研究逐渐成为向日葵新品种选育的一个新增长点。另外，作为世界四大油料作物之一，向日葵种子老化问题一直存在于向日葵种质资源保存过程。向日葵种子作为向日葵的主要物质储存库，除了含有丰富的油、脂肪酸外，还含有丰富的维生素E资源。提高向日葵种子维生素E含量可以延长向日葵种子保存时间，也可以提高向日葵的经济价值。本文以向日葵种子为实验材料，分别用蛋白质组学的方法和生理方法对N+注入后向日葵种子、人工衰老向日葵种子以及向日葵种子成熟过程中维生素E代谢进行了初步分析。 对N+注入后向日葵种子蛋白质组变异研究发现，对照种子蛋白中的No.29特异蛋白与MADS盒转录因子HAM59有23.48%的匹配率;处理种子中的No.279特异蛋白与亮氨酸拉链蛋白的同源蛋白HAHB-4有23.20%的匹配率。说明离子注入能引起向日葵种胚蛋白质组水平上的变异，以期对离子注入的诱变机制进行初步探讨，为进一步探讨离子注入对于DNA及蛋白质的是否存在诱变热点提供一些初步的证据。 种子在高温和高含水量情况下曝露数天诱发的加速衰老比一般衰老引起更多的生化分解;另一方面，在长期贮存条件下的低温贮存环境和种子低含水量可能使种子处于玻璃态。种子胞质的极高粘度和低分子运动能够阻止或抑制很多有害过程。尽管种子衰老的生理机制已有大量研究，但衰老过程中的主要过程和相互作用仍未完全清楚。本文报道向日葵种子在较宽范围的含水量和温度条件下的脂过氧化、非酶蛋白糖基化对种子衰老的影响;同时，对种子玻璃态在长期贮存中对生化分解的阻滞作用并由此延长种子存活力也进行了探讨;与此同时我们借用蛋白质组学手段对加速老化的向日葵种子进行蛋白质组变异分析，结果发现随着老化程度的加深，出现部分蛋白含量随之增加，同时老化速率随之下降。通过质谱鉴定发现其中两个蛋白分别与resistance gene analog NBS4和 NBS5具有一定的同源性。因此我们推测，在加速老化过程中，亦可出现一些延缓老化的蛋白质，同时这些蛋白的出现是否标志着加速老化过程中也存在“玻璃态”有待于进一步的证实。 另外，我们以20份向日葵种质资源为实验材料，通过对维生素E含量、含油率、皮壳率以及百粒重的测定及统计分析，试图了解向日葵种质资源中维生素E含量变异及相关数据。结果表明，在20份向日葵种质资源中，油葵的维生素E含量和含油率明显高于食葵;含油率与维生素E含量在0.01水平呈极显著正相关，含油率与百粒重在0.05水平呈显著负相关;百粒重与皮壳率在0.01水平呈极显著负相关。通过初步评价，发现3份富含天然维生素E的向日葵种质。为了提高向日葵种子中维生素E含量，我们对向日葵胚胎发育过程中维生素E的积累以及短时高温对维生素E代谢的影响做了分析。我们发现，生育酚含量在开花后12到33天期间呈线性增长，并于33天后基本达到最大值，直至种子成熟。在上述生育酚增长期，我们将以每7天作为一个时间单位，对向日葵种胚发育过程进行高温处理。我们发现，高温对维生素E积累具有明显的刺激作用（以干重为基础）。但是由于在开花后12到19天之内高温处理会极大的影响干重的增加，因此当温度超过35℃时，生育酚总量还是大大下降的。然而，35℃的高温在向日葵开花后12到19天内并没有影响种胚的干重，而大大提高了单粒种子中的生育酚含量。因此，这些结果说明，我们可以调整播种时间提高向日葵中生育酚的含量，从而提高向日葵油的品质和向日葵种质的价值。

OsRMC基因调控水稻根生长发育的机理研究

实验室前期工作证明OsRAA1在玉米泛素启动子驱动下组成型表达，可以抑制水稻初生根的生长，促进不定根的形成，形成不同程度螺旋状的初生根，根的向地性反应减缓，这些表型和野生型水稻用生长素处理的表型类似，而且OsRAA1基因的转录受生长素诱导，这些结果表明OsRAA1可能参与了生长素的信号转导途径。但这些表型产生的机理还不是很清楚。在水稻中，茉莉酸在根发育过程中的作用多为生理实验的报道;拟南芥中的研究表明生长素信号转导和茉莉酸信号转导可能都受26S蛋白酶体的调控。由此我们推测茉莉酸在根的发育过程中可能也起着同样的促进作用。本论文在超表达OsRAA1水稻基础上旨在克隆新基因，并对新基因功能进行研究，以探讨茉莉酸在水稻根发育过程中的分子机理，并对生长素和茉莉酸信号转导的关系进行探讨。 　　首先运用双向电泳技术结合质谱分析技术，在超表达OsRAA1水稻背景下发现了受体激酶家族DUF26的一个成员明显下调，我们命名为OsRMC（Oryza sativa Root Meander and Curling，AAL87185），Western杂交进一步证明了这个结果。 　　OsRMC位于4号染色体，信息学分析表明只有一个拷贝，没有内含子，ORF阅读框为777bp，编码的蛋白分子量为27.9 kDa，等电点（pI）为5.01。对该蛋白进行同源性比较发现，其含有2个C-X8-C-X2-C基序（Cys-rich repeat, CRR）即半胱氨酸富集区，其中第四个半胱氨酸残基不保守，该基序会形成二硫键，编码两个未知功能的DUF26（Domain Unknown Function 26）结构域。OsRMC由一个信号肽和两个CRR区组成，但没有跨膜区和激酶区。RT-PCR显示OsRMC可能是组成型表达的基因;亚细胞实验表明OsRMC是膜定位的蛋白。Western blot显示OsRMC受茉莉酸诱导表达，受生长素的抑制。 　　RNAiOsRMC转基因水稻在暗处培养时，抑制了初生根的生长，使侧根数目减少，但促进了不定根的生长和数目的增加;第二叶鞘变短，这些表型和前人报道的外源茉莉酸处理野生型的表型一致。转基因对生长素信号转导和合成没有影响，但初生根和第二叶鞘对外源茉莉酸更加敏感，说明RNAiOsRMC转基因水稻可能增强了茉莉酸信号转导途径。分析转基因水稻的茉莉酸信号转导途径部分相关基因的表达变化，根中受茉莉酸信号转导特异诱导的病原相关基因RSOsPR10的表达明显增多，而JAmyb和OsNDPK1的表达没有变化，证实转基因增强了茉莉酸信号转导其中的一个路径;进一步分析茉莉酸合成途径12-OXO-PDA（12-氧代-顺，顺-10，15-植物二烯酸）还原酶基因OsOPR的表达发现与野生型没有明显差别，说明转基因可能没有影响体内的茉莉酸合成途径。RNAiOsRMC转基因水稻的初生根比野生型的更容易发生弯曲，实验表明培养过程中茉莉酸和背触反应（negative thigmotropism）共同作用使转基因的初生根更容易发生卷曲，而光信号会增强卷曲程度。但RNAiOsRMC转基因水稻并没有影响根的向地性，暗示RNAiOsRMC转基因可能增强了根的回旋运动或（和）背触反应，从而促进了根的弯曲和卷曲。这些结果证明OsRMC参与的茉莉酸信号转导过程在水稻根的发育、弯曲和卷曲过程中起着重要的促进作用。通过对超表达OsRAA1和RNAiOsRMC转基因水稻的分析，说明水稻中存在着生长素信号转导促进茉莉酸信号转导的途径。 　　综合以上实验结果认为，OsRAA1调控了受体激酶家族DUF26的一个成员OsRMC，使其表达量降低，该过程增强了茉莉酸信号转导途径;确认了受体激酶家族DUF26的基因具有重要的生物学功能，证实了OsRMC调控的茉莉酸信号转导在水稻根系发育、根弯曲和卷曲过程中具有重要的促进作用;证明水稻中存在着生长素信号转导促进茉莉酸信号转导的途径，为完善各种植物激素调控水稻根系发育的网络提供了新的实验证据。 　　 　　

海藻糖提高酵母拮抗菌生活力和生防效力的作用机制

近年来，利用酵母拮抗菌进行果实采后病害的生物防治已经成为果实采后领域的研究热点。但是，在实际应用中生物拮抗菌制剂的防病效果远不如化学药剂稳定。由于生物拮抗菌是活体，生活力和生防效力易受诸多因素影响。在商品化制剂的剂型加工、销售、以及使用过程中的环境条件往往影响酵母拮抗菌的生活力和抑病能力，成为酵母拮抗菌产业化生产和商品化应用过程中的一个主要障碍。将酵母拮抗菌和其它化学物质配合使用可以提高拮抗菌的生防效力。另外，增加酵母拮抗菌对逆境条件的耐受力也是增加或稳定其防治效果的有效途径。本文研究了海藻糖与酵母拮抗菌生活力和生防效力的关系，通过生理手段提高了酵母拮抗菌内源海藻糖的含量，同时探讨了在多种逆境条件下内源海藻糖含量对酵母拮抗菌生活力和生防效力的影响及其作用机制。主要研究结果如下： 1. 以1 %海藻糖作为碳源培养酵母拮抗菌Cryptococcus laurentii可以提高其内源海藻糖含量。在in vitro试验中，提高内源海藻糖含量可以提高C. laurentii在低温（1 ºC）、气调（1 ºC，5 % O2，5 % CO2）条件下的生活力;在in vivo试验中，提高C. laurentii内源海藻糖含量可以提高其在苹果果实伤口上的种群密度和对苹果青霉病的防治效果。内源海藻糖的积累还能提高C. laurentii冷冻干燥后的生活力，海藻糖对酵母细胞质膜的保护作用可能是一个主要原因。 2. 以1 %海藻糖作为碳源能提高酵母拮抗菌Rhodotorula glutinis的内源海藻糖含量。内源海藻糖含量的增加可以提高C. laurentii和R. glutinis在慢速冷冻处理中的生活力。同时，海藻糖作为外源保护剂可以明显提高两种酵母拮抗菌在冷冻干燥处理后的生活力。在快速冷冻、慢速冷冻和冷冻干燥处理中，提高酵母拮抗菌的内源海藻糖含量并使用海藻糖作为外源保护剂可以获得更高的生活力。同时，这种内、外源保护因子的综合作用也可以提高两种拮抗菌在苹果果实伤口上的种群密度和对苹果青霉病的防治效果。 3. 脱脂牛奶和糖（葡萄糖，半乳糖，蔗糖，海藻糖）作为保护剂可以提高C. laurentii冷冻干燥后在常温（25 ºC）和低温（4 ºC）保存过程中的生活力。脱脂牛奶和糖保护剂的复合使用对C. laurentii的保护效果高于其单独使用的效果。通过对几种常用的碳源进行筛选，发现柠檬酸作为碳源对C. laurentii内源海藻糖的积累有明显的诱导作用。当使用相同的保护剂或保护剂组合时，高内源海藻糖含量的酵母拮抗菌生活力更强。当冷冻干燥前使用半乳糖 + 脱脂牛奶作为保护剂时，高内源海藻糖含量的C. laurentii在4 ºC保存90 天后对苹果青霉病的防治效果和与新鲜培养的酵母拮抗菌相当。 4. 酵母拮抗菌C. laurentii冷冻干燥后在常温(25 ºC)保存期间，细胞生活力下降，细胞膜的完整性降低，胞内活性氧水平增加，同时与抗氧化相关的超氧化物歧化酶（SOD）活性也增加，而过氧化氢酶（CAT）活性则下降。提高内源海藻糖含量和/或使用外源保护剂（5 %脱脂牛奶 + 10 %葡萄糖）可以减缓上述指标下降或上升的速度。内、外源因子的共同作用有利于提高对拮抗菌细胞的保护作用。 5. 利用褐藻酸钠制成的含酵母拮抗菌的胶球在干燥后能有效的保持C. laurentii的生活力。在3种不同粘度的褐藻酸钠中，0.5 % 3500 cp的褐藻酸钠表现出较好的保护效果。内源海藻糖的积累可以提高干胶球中C. laurentii的生活力，作为外源保护剂的4种糖（葡萄糖、半乳糖、蔗糖、海藻糖）中只有海藻糖在低温条件下可以提高C. laurentii的生活力，其它3种糖反而降低了C. laurentii的生活力。

小麦SKP1同源基因TSK1的克隆和功能分析

SKP1 (S-phase kinase-associated-protein 1) 家族蛋白是普遍存在于真核生物中的一类小分子量蛋白质，其主要的生物学功能在于参与SCF复合体的形成，从而调控生物体内泛素介导的蛋白质降解，并参与多方面的生物发育过程。SKP1蛋白能够同时和Cullin蛋白以及F-box蛋白结合，形成SCF复合体的核心部分。因此，SKP1正常功能的维持对于SCF复合体功能的实现至关重要。研究显示，植物中尤其是以拟南芥为代表模式植物中已经发现了21个SKP1基因成员，并发现其中的ASK1参与了多个SCF复合体的形成并调控着包括植物雄性减数分裂、生长素、赤霉素、茉莉酸和乙烯等生理和发育进程。但是来自高等植物尤其是小麦和水稻中的SKP1基因还鲜有报道，其功能还不为所知;此外，SKP1基因与ABA的关系还没有任何报道。 　　本文利用筛选小麦减数分裂期小花的cDNA文库结合RT-PCR的方法从小麦中分离到了一个SKP1同源基因，并命名为TSK1 (Triticum aestivum SKP1-Like 1)。序列比较结果显示TSK1与多个植物来源的SKP1基因有较高的同源性，对其推测的编码蛋白序列的分析发现TSK1与包括拟南芥来源的ASK1/ASK2等蛋白的羧基端存在非常高的保守性。 　　在对TSK1表达模式的研究中，本文发现TSK1主要是集中在小麦花序和幼根中表达。利用多种激素对小麦幼苗处理之后，发现TSK1的表达受ABA的抑制，但是当小麦中ABA合成受抑的情况下，TSK1的表达会有所增加，说明TSK1的表达受ABA的调控。RNA原位杂交显示TSK1基因在花顶端分生组织、花药以及幼根等分生较旺盛的组织中有较强的表达，暗示该基因可能参与了与细胞分裂相关的过程。 　　为了研究TSK1可能具有的功能，本文首先在ask1-1突变体背景上超表达TSK1，发现能够部分恢复ask1-1突变体雄性不育的表型，说明TSK1和ASK1在植物减数分裂过程中存在某种保守性。 　　在野生型拟南芥中超表达TSK1造成了拟南芥多个方面的变化，包括萌发和开花推迟，气孔开度减小等。进一步的观察发现，转基因植株的萌发和营养生长都呈现出对ABA的超敏感，后续证据证实这种ABA的超敏感性并不是由于转基因拟南芥中ABA合成途径的改变所造成的，而极有可能是影响了ABA的信号传导过程。RT-PCR的结果显示，转基因植株中多个ABA相关的已知基因表达量的发生了变化。 　　为了提供植物中SKP1家族成员参与调节植物ABA信号传导途径证据，本文对拟南芥ASK1/ask1 ASK12/ask2的杂合双突变体自交后代进行了研究。结果显示，ask1/ask1纯合突变体和ask1/ask1 ASK2/ask2植株表现出对ABA的弱敏感性。该结果从另一个侧面印证了TSK1超表达植株对ABA超敏感表型。 　　此外，TSK1超表达拟南芥也表现出生长素相关表型，也印证了该基因可能与ASK1类似，参与到生长素介导的根发育过程。 　　综上所述，本文认为TSK1参与了植物激素介导的植物发育过程，而且极有可能是形成了目前未知的某种SCF复合体。最重要的是，本文的结果为SCF复合体参与调节植物ABA信号传导途径提供了生理及遗传层面的证据。 　　 　　

查尔酮异构酶基因过表达对新疆雪莲类黄酮生物合成的调控

新疆雪莲（Saussurea involucrata Kar. et Kir.）是我国名贵中药材，其主要药用活性成分为黄酮类化合物。目前人们对新疆雪莲及它的黄酮类化合物的需求日益增多，但雪莲的人工栽培技术尚未成熟，在野生状态下，新疆雪莲只能生长在海拔4,000到5,000米的雪山上，现在由于过度采挖已濒临灭绝。为解决雪莲资源匮乏，提高雪莲中黄酮类成分的含量，本研究通过基因工程手段利用发根农杆菌将黄酮代谢途径中的关键酶－查尔酮异构酶（CHI）基因导入新疆雪莲，产生转基因新疆雪莲毛状根及再生苗，以期提高新疆雪莲的黄酮类物质含量，进行新疆雪莲黄酮类物质的生产。主要结果如下： 　　1．对克隆到的水母雪莲查尔酮异构酶基因（Smchi）进行功能分析。转Smchi正义、反义烟草的CHI酶活性实验结果表明，转Smchi正义的烟草CHI酶活性比对照提高3-6倍，而转反义Smchi基因的烟草CHI酶活性比对照则显著降低。分析不同株系的转基因烟草和对照烟草的黄酮含量和花色素含量表明，转Smchi正义的烟草积累比对照显著增高水平的总黄酮，其中株系CS-5黄酮含量是对照的6倍，转Smchi反义的烟草则积累较低水平的总黄酮，而且转基因烟草的总黄酮含量与Smchi基因的表达水平和CHI酶活性成正相关。但不论转Smchi基因正义或反义方向的烟草，其花色素含量和对照相比均没有发生显著变化。进一步对转基因烟草的黄酮成分进行分析，发现烟草中的主要黄酮成分芦丁在转Smchi正义烟草中有很高的积累。 　　2．发根农杆菌介导法将Smchi基因导入新疆雪莲，得到转Smchi基因的新疆雪莲毛状根。实验发现，35S-chi转基因对毛状根的生长没有显著影响，但35S-chi转基因毛状根能够合成显著提高水平的芹菜素和总黄酮，其中根系C46经过35 d培养，能产生32.1 mg/L的芹菜素和647.8 mg/L的总黄酮，分别是对照根系的12倍和4倍;不同根系的Smchi基因表达水平、CHI酶活性和芹菜素含量成正相关。本研究为通过基因工程手段提高新疆雪莲毛状根芹菜素和总黄酮含量提供了一个有效方法。 　　3．在1/2MS附加GA1.5 mg/L的培养基上，新疆雪莲毛状根的不定芽再生频率高且不定芽生长健壮。再生苗在MS+BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L的培养基上继代培养生长量较大，经过20 d的培养，35S-chi转基因新疆雪莲再生苗株系（C17、C27、C46）、对照再生苗（Control-1）和正常试管苗（Control-2）之间生长量差异不显著，增殖倍数都在7倍左右;实验还发现，毛状根再生苗比各自来源的毛状根的芹菜素和总黄酮含量下降了20-30%，但转基因再生苗的芹菜素和总黄酮含量比Control-1和Control-2都有显著提高，其中C46芹菜素和总黄酮含量分别为1.86 mg/g 干重和37.3 mg/g干重，分别是Control-1的12倍和 2.4 倍，Control-2的4 倍和1.6倍。这些结果表明由毛状根诱导出的再生苗可作为增强目标次生代谢产物生产的另外一个有效来源。 　　

拟南芥有性生殖模式和叶片特性对大气CO2浓度变化的响应

预计到本世纪末，大气CO2浓度将会增加到540～970ppm，大气CO2浓度升高所引起的全球气候变化已经受到广泛的关注。植物生长依赖CO2，并且对大气CO2浓度升高在结构和生理上产生响应。目前已有大量报道，从生态系统、群落、种群、个体、器官、组织、生理以及生化等水平上研究高浓度CO2所对植物产生的影响。但是有关高浓度CO2对植物有性生殖影响的报道却很少，同时多数实验均建立在短期的生殖响应，忽视了植物在长期高CO2浓度下具有的反馈作用和CO2浓度变化对植物的驯化作用。植物有性生殖与其生态适应性和农作物籽粒产量的关系极为密切;同时，植物有性生殖特性的变化，也可作为预测植物对全球气候变化响应的重要指标之一。为此，利用高浓度CO2对植物进行长期选择实验将很有必要。研究结果将为预测未来大气CO2浓度增加的条件下陆地生态系统的演变趋势、全球变化对植物有性生殖响应的方式和机制提供新的思路和有效方法。 　　在本研究中，我们以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为实验材料，利用370和700ppm CO2对其进行连续8个世代处理，首先研究高浓度CO2对每一个世代的拟南芥有性生殖特性的影响，然后比较各个世代中各种生殖特性指标变化的规律，从细胞、组织和个体尺度上揭示拟南芥有性生殖对全球变化的响应模式。此外，在700ppm CO2处理下，我们对拟南芥叶片生理、生化以及结构的变化进行了相关研究。两部分研究结果及主要结论如下： 　　首先，在每一个世代中，与370ppm CO2相比较，700ppm CO2处理显著促进了拟南芥开花，缩短生长周期，增加花、角果及种子等生殖的产量，降低种子N含量，提高种子C/N比、种子千粒重以及生殖生物量所占总生物量的比例等，而对种子萌发率、角果所含种子数目以及角果长度则无显著影响。但是， 通过对相同CO2浓度处理条件下，不同世代之间的研究结果比较发现，不同世代之间相关的生殖生物学指标并无显著差异。 　　其次，高浓度CO2显著降低叶片气孔密度、气孔指数、气孔导度以及蒸腾速率。在高浓度CO2处理下，叶肉细胞中叶绿体数目、叶绿体宽度和表观面积、淀粉粒大小和数量、叶片和细胞壁厚度等都显著增加，但是基粒内囊体膜的数量却显著下降。叶片中碳水化合物如可溶性总糖、淀粉以及纤维素含量在高浓度CO2下分别显著增加71.9%、78.7% 和 22.3%。此外，在高浓度CO2处理下，叶片中多数激素如如吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、赤霉素(gibberellin, GA)、玉米素核苷(zeatin riboside, ZR)、二氢玉米素核苷(dihydrozeatin riboside, DHZR)和异戊烯基腺苷(isopentenyl adenosine, iPA)均都显著地增加，而脱落酸(abscisic acid, ABA)含量却有所下降。最后，叶片中各种矿物质元素含量如N、P、K、Ca和Mg等含量在高浓度CO2处理下也都显著下降，而C/N比增加24.8％。 　　以上结果表明： 　　(1) 在每一个世代中，700ppm CO2处理对拟南芥各种有性生殖特性具有显著的影响，但是高浓度CO2处理对植物所引起的效应在多个世代以内并不能够传递给后代，所以在多个有性生殖世代内，高浓度CO2处理对植物生长、生殖没有驯化作用。 　　(2) 在高浓度CO2处理下，拟南芥叶片中叶绿体超微结构的变化，可能主要是由于叶绿体中淀粉粒数量和体积大小显著增加而引起。 　　(3) 在高浓度CO2处理下，由于拟南芥叶片内与促进细胞分裂与伸长的激素含量显著增加，从而对拟南芥植株生长发育速率的提高起了重要的作用。 　　(4) 拟南芥生长在高浓度CO2条件下，其叶片中各种矿质元素含量（如N、P、K、Ca和Mg）均显著降低，究其原因可能是，第一由于叶片中碳水化合物含量的显著增加而对矿物质元素具有稀释作用;第二由于蒸腾速率下降，引起矿质元素从根部随着蒸腾流运输到地上部分的含量相应减少。