Mécanismes de résistance aux inhibiteurs de CCR5

Le travail décrit dans ce manuscrit vise à caractériser les voies de résistance aux inhibiteurs de CCR5. Lors d’une première étape, nous avons développé un test phénotypique clonal nous permettant d’une part d’identifier le tropisme viral et d’autre part de mesurer la résistance aux inhibiteurs des CCR5. Des virus à tropisme R5 ou X4 représentant aussi peu que 0,4% d’un mélange de populations virales sont détectables par ce test, démontrant ainsi sa sensibilité. De plus, grâce à son approche clonale, cette technique permet de différencier les virus à tropisme double de populations virales mixtes. Par la suite, nous avons étudié l’impact des mutations dans les régions variables de la protéine gp120 de l’enveloppe du virus VIH-1 sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5. Pour ce faire, nous avons généré des virus résistants par passage des isolats CC1/85 et BAL, en présence de concentrations sous-inhibitrices de maraviroc (MVC) et vicriviroc (VCV). Après quelques passages du virus CC1/85 en présence de MVC, certaines sont apparues dans differentes régions de la gp120. Par la suite, nous avons sélectionné trois mutations dans les domaines variables de la gp 120, V169M en V2, L317W en V3 et I408T en V4 pour construire des virus contenant des mutations simples, doubles et triples afin d’évaluer la contribution des mutations individuelles ou combinées au phénotype de résistance. Nous avons déterminé la sensibilité de chaque mutant à MVC et VCV, le pourcentage d’infectivité et le tropisme viral par rapport au phénotype sauvage. Tous les mutants ont conservé le tropisme R5 et ont montré une diminution d’infectivité par rapport au contrôle. Nos résultats ont montré que les mutants qui portent des mutations en V4 (I408T) ont eu le plus d'impact sur la susceptibilité au MVC. Finalement, nous avons voulu évaluer l’activité antivirale d’un nouvel inhibiteur de CCR5, VCH-286 avec d’autres inhibiteurs de CCR5 tels que MVC et VVC ainsi que ses interactions avec des médicaments représentatifs de différentes classes d’antirétroviraux ARV employés en clinique pour traiter le HIV/SIDA., afin d’évaluer si ces médicaments pourraient être utilisés dans un même régime thérapeutique. Nous avons tout d’abord évalué indépendamment l’activité antivirale des trois inhibiteurs de CCR5 : VCH-286, MVC et VVC. Par la suite nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec MVC et VVC. Finalement nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec d’autres médicaments antirétroviraux. Ces études ont montré que VCH-286 est un inhibiteur puissant de CCR5 avec une activité antivirale in vitro de l’ordre du nanomolaire et des interactions médicamenteuses favorables avec la majorité des ARV tels que les inhibiteurs de transcriptase inverse, de protéase, d’intégrase, et de fusion employés en clinique pour traiter le VIH/SIDA et des interactions allant de synergie à l'antagonisme avec les inhibiteurs de CCR5. Nos résultats montrent que la plasticité de l’enveloppe virale du VIH-1 a des répercussions sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5, le tropisme et la possible utilisation de ces molécules en combinaison avec d’autres molécules appartenant à la même classe.

Studies on IL-18 in HIV infection : effects of the cytokine on intestinal integrity, and platelets as a new source of the cytokine

L'interleukine IL-18 (IL-18), un membre de la famille de l’IL-1, est une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle. Elle est produite par les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules épithéliales, les kératinocytes et le cortex surrénal dans le corps humain. Cette cytokine est d'abord produite comme une protéine précurseure inactive, qui est par la suite clivée en une forme mature par la caspase-1 activée. La caspase, en elle-même, existe comme précurseur inactif dans les cellules humaines et requiert l'assemblage d'inflammasomes pour son activation. L'IL-18 pour joue un rôle clé dans la médiation des conditions inflammatoires. Notre laboratoire et d'autres ont montré que l'infection par le VIH est accompagnée d'une augmentation des taux circulants d'IL-18 avec une diminution des niveaux de son antagoniste, l'interleukine-18 binding protein (IL-18BP). Dans cette thèse, nous démontrons pour que l'IL-18 est également produite et sécrétée par les plaquettes humaines lors de leur activation. Les plaquettes contiennent des composants de l'inflammasome. Ils assemblent et activent la caspase-1, qui ensuite traite le précurseur de l'IL-18 dans sa forme mature au cours du processus d'activation des plaquettes. La cytokine est synthétisée de novo lors de l'activation des plaquettes. Contrairement à l'IL-18, les plaquettes expriment constitutivement l’IL-18BP, et la libèrent de manière constitutive, ainsi que lors de l'activation. L'IL-18 et l'IL-18BP sont colocalisés avec CD63, un marqueur pour les granules α des plaquettes. L'IL-18 libéré des plaquettes constitue la source principale de cette cytokine dans la circulation humaine chez les individus sains. Nous avons identifié des concentrations faibles de cette cytokine dans les lysats de plaquettes chez les individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. D'autre part, les concentrations ont été augmentées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes chez les individus infectés. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'IL-18BP dans les lysats de plaquettes d'individus sains et infectés par le VIH. Cependant, des quantités plus faibles de cet antagoniste ont été trouvées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes d'individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. Nos résultats ont des implications importantes pour les maladies inflammatoires chroniques dans laquelle une activité accrue de l'IL-18 joue un rôle pathogène. Le VIH est également accompagné par une inflammation intestinale et une diminution de l'intégrité intestinale, mesurée par la réparation de la muqueuse, la régénération et la perméabilité. Cependant, on en sait peu sur la relation entre le niveau élevé de l'IL-18 associé à l'infection au VIH et la perméabilité intestinale: ceci n'a jamais été étudié. Dans cette thèse, nous démontrons le rôle du virus et sa protéine Tat à augmenter la production d'IL-18 chez deux lignées de cellules épithéliales intestinales (HT29 et Caco2) ainsi qu'une diminution de l'IL-18BP. L'IL-18 induit une hyperperméabilité de la barrière épithéliale en perturbant à la fois les jonctions serrées et adhérentes, et ce, en modulant l'expression et la distribution de l'occludine, de claudine-2 et de la bêta-caténine. Une désorganisation de l'actine F a également été observée dans les cellules lors de l'incubation avec l'IL-18. Les mêmes observations ont été faites avec la protéine Tat du VIH-1. Après une incubation prolongée, l'IL-18 a causé la mort des cellules intestinales et induit l'apoptose par l'activation de la caspase-1 et la caspase-3. Fait intéressant, les taux plasmatiques de lipopolysaccharides chez trois catégories différentes de patients au VIH (ART-naïf, ART-traitée et contrôleurs élite) sont en corrélation avec les niveaux plasmatiques de l'IL-18. Enfin, nous avons étudié la voie de signalisation à travers laquelle l'IL-18 induit une perméabilité intestinale accrue. En bref, nos études identifient les plaquettes comme une source importante d'IL-18, et leur activation lors d'une infection à VIH contribue à des concentrations accrues de cette cytokine. Le virus entraine également l'augmentation de la production de cytokines par les cellules épithéliales intestinales. L'activité biologique accrue de ces cytokines contribue à la pathogenèse du sida en augmentant la perméabilité intestinale et en causant la mort des cellules intestinales. L'IL-18 pourrait servir de cible moléculaire pour retarder la progression du sida et réduire l'inflammation chronique dans un stade précoce d'une infection à VIH.

Overexpression of catalase prevents gentamicin – induced apoptosis of renal proximal tubular cells in transgenic mice.

Introduction : La néphrotoxicité est une complication majeure de la gentamicine, qui est largement utilisée dans le traitement des infections bactériennes, en particulier celles provoquées par des bactéries à Gram-négatif. La gentamicine induit l'apoptose tubulaire, mais les mécanismes moléculaires impliqués demeurent mal compris. Dans l’étude présente, nous avons examiné le rôle des espèces réactives de l'oxygène (ROS) , des proteins Bax, Bmf et Caspase-12 (Csp-12) dans le mécanisme d’action de la gentamicine sur l'apoptose des tubules proximaux rénaux (RPT) et les dommages rénaux induits par ce médicament chez la souris. Méthode: Des souris adultes (âgées 18-19 semaines) mâles non-Tg et des souris transgéniques (CAT-Tg) qui surexpriment la catalase spécifiquement dans leurs cellules des RPT ont été traitées par injections intra-péritonéales de gentamicine (20 mg/kg/jour) pour 5 jours consécutifs, puis euthanasiés. Les reins ont été examinés et analysés par histologie, immunohistochimie pour presansance de la stress oxidative, expression des proteins Bax, Bmf et Csp-12 et essai TUNEL pour étudier de l’apoptose . Nous avons aussi examiné l'effet de la gentamicine sur génération des ROS et l’apoptose dans les cellules RPTC immortalisées de rat (IRPTC) in vitro. Résultats: In vivo, chez les souris non-Tg, la gentamicine induit une tubulopathie et l'apoptose des RPT , stimule la production de ROS et induit une augmentation de Bax et Bmf détectée par immunohistochimie et augmont activité du caspase-12. Ces changements sont atténués chez les souris Cat-Tg. In vitro, la gentamicine induit l’apoptos des cellulles. Le co-traitement avec la catalase normalise ces effets dans les IRPTC. Conclusion : Ces données démontrent que l'apoptose des RPTC induite par la gentamicine s’effectue, au moins en partie, par l'intermédiaire de la génération des ROS.

Une étude multicas des pratiques de soutien des enseignants du primaire auprès d’élèves immigrants

Cette recherche a pour but d’étudier les pratiques enseignantes de soutien auprès des élèves immigrants récemment arrivés au Québec, ne maîtrisant pas le français et intégrés dans des classes ordinaires au primaire. Pour ce faire, nous avons mené une recherche de type qualitatif avec deux enseignantes et leurs trois élèves immigrantes. Afin de documenter les pratiques de soutien en contexte réel de la classe, comprendre les raisons des enseignantes à l’égard du soutien et le point de vue des élèves, nous avons procédé à des observations de classe et à des entrevues individuelles générales et spécifiques avec les participantes, en plus de consulter certaines productions écrites des élèves immigrantes participantes. La présentation des données prend la forme d’une étude multicas décrivant les pratiques de soutien mises en place par chacune des deux enseignantes à partir de 22 séquences de soutien qui ont été décrites en tenant compte du contexte de chaque classe, puis analysées à la lumière de deux cadres théoriques complémentaires, le cadre d’analyse du travail enseignant et l’approche sociohistorico-culturelle. Les résultats de cette recherche mettent en exergue le sens de la pratique enseignante de soutien qui se coconstruit dans les interactions entre l’enseignante et l’élève, selon leurs apports mutuels, et selon les facteurs de la classe. L’analyse des raisons des enseignantes à l’égard du soutien montre que devant les difficultés des élèves immigrantes anticipées, constatées ou signalées, les enseignantes prennent des décisions pour prendre ces difficultés en considération, les traiter et mettre en place des pratiques de soutien. Les décisions des enseignantes découlent d’un processus de négociation interne entre la prise en compte des difficultés, notamment imprévues, et le maintien de leurs tâches prescrites, tout en considérant les facteurs contextuels de la classe. Le processus de négociation se poursuit et se déplace ensuite entre l’enseignante et l’élève, lesquelles construisent le sens de soutien à travers leurs interactions. Les concepts empruntés de l’approche sociohistorico-culturelle nous permettent de comprendre la relation dialectique entre l’élève et l’enseignante lors des interactions. Les deux s’ajustent l’une par rapport à l’autre dans le but d’arriver à un consensus sur le sens de la difficulté. De ce fait, la pratique enseignante de soutien est construite suite aux négociations entre l’élève et l’enseignante, mais aussi suite à la négociation interne de l’enseignante, et ce, dépendamment des facteurs du contexte. Notre recherche a contribué à apporter cette clarification sur la manière d’appréhender les pratiques enseignantes de soutien en contexte de classe ordinaire.

Les relations entre les caractéristiques socioprofessionnelles, les connaissances, les représentations et les contenus d’enseignement traités en classe par les enseignants responsables d’éducation relative au VIH/SIDA en Afrique du Sud

Il est généralement admis que l’éducation constitue une des stratégies les plus efficaces pour lutter contre le VIH/SIDA et diminuer sa transmission (Gallant et Matika-Tyndale, 2004). À cet effet, plusieurs pays d’Afrique subsaharienne ont inclus des programmes d’éducation au VIH/SIDA dans leur curriculum scolaire afin de contrer l’épidémie (ADEA, 2007). Cependant, l’efficacité de ces programmes éducatifs demeure incertaine. Par exemple, les objectifs des programmes éducatifs, tels que la transmission de connaissances relatives au VIH/SIDA, ou la diminution des comportements sexuels risqués, ne sont pas toujours atteints (Matika-Tyndale, 2009; Oshi, D., Nakalema, S. et Oshi, L, 2005). Le succès d’un programme de lutte et de prévention en milieu scolaire peut être lié aux contenus d’enseignement traités en classe par les enseignants (Ahmed et al., 2009). Les contenus traités dépendent en partie des représentations et des connaissances des enseignants par rapport au(x) sujet(s) qu'ils enseignent et pour des sujets aussi délicats que le VIH/SIDA et la sexualité, cette relation est particulièrement importante. Par exemple, en Afrique du Sud, malgré l’existence d’une politique nationale sur le VIH et l’inclusion des sujets relatifs au VIH/SIDA dans le curriculum scolaire, la mise en oeuvre du programme de lutte et de prévention peut être compromise par la résistance des enseignants à parler de certains sujets controversés (Ahmed et al. 2009; Mathews et al., 2006). Notre étude, menée dans la région de Cape Town en Afrique du Sud, visait à mieux comprendre les relations entre les caractéristiques socioprofessionnelles des enseignants, leurs connaissances, leurs représentations à l’égard de l’éducation relative au VIH/SIDA et les contenus d’enseignement abordés dans le cours life-orientation dédié à l’éducation relative au VIH/SIDA. Au total, 71 enseignants du cours life-orientation provenant de 18 écoles secondaires ont participé à cette étude. Les enseignants ont rempli un questionnaire portant sur leurs caractéristiques socioprofessionnelles (âge, genre, expérience d’enseignement, niveau enseigné et expérience personnelle avec le VIH/SIDA), leurs connaissances, différentes composantes de leurs représentations (attitudes, norme sociale perçue et contrôle comportemental perçu) et les contenus d’enseignement qu’ils abordent en classe. iv Les résultats des analyses des données ainsi recueillies montrent que la norme sociale perçue est la seule composante des représentations reliée aux contenus d’enseignement abordés en classe par l’enseignant. Les attitudes des enseignants envers l’éducation relative au VIH/SIDA sont plutôt favorables, mais plusieurs d’entre eux manifestent des lacunes par rapport à leurs connaissances sur les modes de transmission et de prévention du VIH/SIDA. Par ailleurs, plusieurs croient que le manque de formation et le manque de matériel sont des obstacles à leur enseignement. Les expériences personnelles avec le VIH/SIDA sont associées à des attitudes plus positives chez les enseignants et l’expérience d’enseignement du cours life-orientation est reliée aux connaissances relatives au VIH/SIDA et au contrôle comportemental perçu de l’enseignant. Nos résultats suggèrent également que certains contenus d’enseignement spécifiques de l’éducation relative au VIH/SIDA, tel que l’utilisation des condoms, semblent être particulièrement controversés et source de malaise pour les enseignants. Nos résultats donnent également des pistes de recherches futures s’intéressant à l’amélioration de l’enseignement relatif au VIH/SIDA, notamment au sujet du besoin de formation et de matériel pédagogique supplémentaire, ainsi qu’au sujet de l’influence des membres de la société sur l’enseignement effectué en classe. Notre recherche montre également l’importance de distinguer, en recherche, les différents contenus d’enseignement, plutôt que de considérer de façon globale l’éducation relative au VIH/SIDA.

Homéostasie des histones en réponse au dommage à l’ADN et étude d’inhibiteurs de désacétylases d’importance clinique

La chromatine possède une plasticité complexe et essentielle pour répondre à différents mécanismes cellulaires fondamentaux tels la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nucléosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire d’où l’intérêt de cette thèse d’y porter une attention particulière. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associé à l’émergence du cancer. Le chapitre II de cette thèse focalise sur la répression transcriptionnelle des gènes d’histones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en réponse au dommage à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage à l’ADN en début de phase S, les kinases du point de contrôle Mec1, Tel1 et Rad53 s’assurent de bloquer les origines tardives de réplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagéniques ou cytotoxiques entre les ADN polymérases et les lésions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthèse totale d’ADN est soudainement ralentie par le point de contrôle, l’accumulation d'un excès d'histones nouvellement synthétisées est néfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manière non-spécifique aux acides nucléiques. L'un des mécanismes mis en place afin de minimiser la quantité d’histones libres consiste à réprimer la transcription des gènes d'histones lors d'une chute rapide de la synthèse d'ADN, mais les bases moléculaires de ce mécanisme étaient très mal connues. Notre étude sur la répression des gènes d’histones en réponse aux agents génotoxiques nous a permis d’identifier que les kinases du point de contrôle jouent un rôle dans la répression des gènes d’histones. Avant le début de mon projet, il était déjà connu que le complexe HIR est requis pour la répression des gènes d’histones en phase G1, G2/M et lors de dommage à l’ADN en phase S. Par contre, la régulation du complexe HIR en réponse au dommage à l'ADN n'était pas connue. Nous avons démontré par des essais de spectrométrie de masse (SM) que Rad53 régule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-unités, Hpc2, à de multiples résidus in vivo et in vitro. La phosphorylation d’Hpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gènes d’histones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la présence sur les promoteurs des gènes d'histones corrèle avec leur répression. De plus, nous avons mis à jour un nouveau mécanisme de régulation du complexe HIR durant la progression normale à travers le cycle cellulaire ainsi qu'en réponse aux agents génotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protéine Hpc2 est très instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gènes d’histones et la production d'un pool d'histones néo-synthétisées juste avant l'initiation de la réplication de l’ADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brève période de temps durant la phase S. Ces résultats suggèrent qu'Hpc2 est une protéine clef pour la régulation de l'activité du complexe HIR et la répression des gènes d’histones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en réponse au dommage à l’ADN. Dans le but de poursuivre notre étude sur la régulation des histones, le chapitre III de ma thèse concerne l’analyse globale de l’acétylation des histones induite par les inhibiteurs d’histone désacétylases (HDACi) dans les cellules normales et cancéreuses. Les histones désacétylases (HDACs) sont les enzymes qui enlèvent l’acétylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent à l’oncogenèse par leur fusion aberrante avec des complexes protéiques oncogéniques. Les perturbations causées mènent souvent à un état silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrés par ces protéines de fusion. Notre étude de l’effet sur l’acétylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et l’entinostat (MS-275), a permis de démontrer une augmentation élevée de l’acétylation globale des histones H3 et H4, contrairement à H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancéreuses. Notre quantification en SM de l'acétylation des histones a révélé de façon inattendue que la stœchiométrie d'acétylation sur la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manière surprenante, cette stœchiométrie n'augmente pas dans des cellules traitées avec différents HDACi. Plusieurs études de H3K56Ac chez l’humain présentes dans la littérature ont rapporté des résultats irréconciliables. Qui plus est, H3K56Ac était considéré comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. C’est pourquoi nous avons porté notre attention sur la spécificité des anticorps utilisés et avons déterminé qu’une grande majorité d’anticorps utilisés dans la littérature reconnaissent d’autres sites d'acétylation de l’histone H3, notamment H3K9Ac dont la stœchiométrie d'acétylation in vivo est beaucoup plus élevée que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite à notre étude sur l’acétylation des histones et consiste en un rapport spécial de recherche décrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et l’homme et comporte également une évaluation d’un anticorps supposément spécifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez l’humain.

Cartes conceptuelles du Glossaire

Ce guide pédagogique fait suite au Glossaire du DESS en administration de l'éducation. Il explique comment les mots du vocabulaire relié au travail des directions d'établissement scolaire et à leur formation peuvent être regroupés dans des cartes conceptuelles pour mieux en saisir la portée. Il explicite aussi la conception et la construction de cartes conceptuelles et présente des exemples issus de la concertation entre les formateurs.

Role of Nuclear Angiotensin-II Receptor Mediated Signalling in Cardiovascular Remodelling

Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle. Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.

Caractérisation biochimique du complexe Smc5-6

Les membres de la famille SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), présents dans tous les domaines de la vie, sont impliqués dans des processus allant de la cohésion des chromatides-sœurs jusqu’à la réparation de l’ADN. Chacun des membres de cette famille, composée de 6 membres (Smc1 à Smc6), s’associe avec un autre membre ainsi qu’à des sous-unités non-SMC pour former 3 complexes : cohésine, condensine et Smc5-6. L’implication du complexe Smc5-6 dans plusieurs aspects du maintien de l’intégrité génomique est bien démontrée. Néanmoins, une question fondamentale concernant ce complexe demeure encore sans réponse: comment peut-il être impliqué dans autant d’aspects de la vie d’une cellule? Encore à ce jour, il est difficile de répondre à cette question en raison du manque d’information disponible au sujet des activités biochimiques de ce complexe. C’est pourquoi l’objectif de ce travail consiste en la caractérisation biochimique du complexe Smc5-6. La biochimie de cohésine et condensine suggère diverses possibilités en ce qui a trait aux activités biochimiques du complexe Smc5-6. La première étape de mon projet fut donc d’élaborer une procédure pour la purification de Smc5 et Smc6 après surexpression en levure. Après plusieurs expériences, il apparut clair que les deux protéines possèdent une activité de liaison à l’ADN simple brin (ADNsb) ainsi qu’à l’ADN double brins (ADNdb) et que, même si les protéines peuvent se lier aux deux types d’ADN, elles possèdent une plus grande affinité pour l’ADNsb. De plus, ces expériences permirent de démontrer que l’interaction entre Smc5 ou Smc6 et l’ADNsb est très stable, alors que l’interaction avec l’ADNdb ne l’est pas. Suite à l’obtention de ces résultats, la seconde étape fut la détermination de la ou des partie(s) de Smc5 et Smc6 permettant la liaison à l’ADN. Pour répondre à cette question, une dissection moléculaire fut réalisée, suivi d’une caractérisation des différents domaines constituants Smc5 et Smc6. De cette façon, il fut possible de démontrer qu’il existe deux sites de liaison à l’ADN sur Smc5 et Smc6 ; le premier site se trouvant dans le domaine «hinge» ainsi que dans la région adjacente du domaine «coiled-coil» et le second au niveau de la tête ATPase des deux protéines. Bien que les deux domaines puissent lier l’ADNsb, il fut démontré qu’une différence majeure existe au niveau de leur affinité pour ce type d’ADN. En effet, le domaine «hinge» possède une affinité plus forte pour l’ADNsb que la tête ATPase. De plus, cette dernière est incapable de lier l’ADNdb alors que le domaine «hinge» le peut. L’identification des sites de liaison à l’ADN sur Smc5 et Smc6 permettra de créer de nouveaux mutants possédant un défaut dans la liaison à l’ADN. Ainsi, l’étude du complexe Smc5-6 durant la réparation de l’ADN in vivo sera facilité.

Impact d'un traumatisme crânio-cérébral léger sur l’architecture du sommeil et le transcriptome dans un modèle murin

Le traumatisme crânien léger (TCL) est l'un des troubles neurologiques les plus courants affectant la santé publique. Aussi, les troubles du sommeil sont fréquents chez les patients atteints de TCL. Les études chez les rongeurs montrent que certains marqueurs de plasticité synaptique diminuent après le TCL, ce qui pourrait nuire à la plasticité du cerveau. Nous suggérons que la perte de sommeil intensifie l'effet négatif de TCL, qui peut refléter les changements des marqueurs de plasticité synaptique ou des changements des voies physiologiques qui régulent le sommeil. En utilisant un modèle de traumatisme crânien sur crâne fermé (closed head injury), nous avons étudié la relation bidirectionnelle entre le TCL et le sommeil en évaluant les effets de TCL sur l’activité électrique du cerveau par électroencéphalographie (EEG), et ceux de la privation de sommeil (PS) sur l'expression génique post-TCL. Premièrement, l'activité EEG a été enregistrée pour voir si l'architecture du sommeil est altérée suite au TCL. Nous avons ensuite voulu tester si la PS suite TCL induit des changements dans l'expression des gènes : Arc, Homer1a, Hif1a, Bdnf, Fos et éphrines, qui ont été liés à la plasticité synaptique et à la régulation du sommeil. Nous avons également étudié l'effet de la PS post-TCL sur le génome complet dans les régions cibles (cortex et l'hippocampe). Les principaux résultats obtenus dans cette étude confirment que TCL modifie de manière significative l'activité spectrale pendant l'éveil, le sommeil Rapid Eye Movement (REM) et le sommeil non-REM dans le deuxième 24 heures post-TCL. Fait intéressant, la capacité de maintenir de longues périodes d'éveil a été altérée immédiatement après TCL (première 24h post-TCL). La dynamique de l'activité delta pendant l'éveil a été modifié par le TCL. Parallèlement à ces modifications, des changements dans l'expression des gènes ont été observés dans le cortex et l'hippocampe. Seulement Arc et EfnA3 ont montré une interaction TCL / PS et ce dans l’hippocampe, tandis que l'expression de tous les autres gènes semblait être affectée par la PS ou TCL indépendamment. Nos résultats montrent pour la première fois que le TCL induit l'expression de deux chimiokines (Ccl3 et Cxcl5) à la fois dans le cortex cérébral et l'hippocampe 2,5 jours post-TCL. Également, nous avons observé que le TCL induit une diminution de l'expression de Lgals3 et S100A8 dans le cortex, et une augmentation d’Olig2 dans l'hippocampe. Les résultats concernant les effets de la PS sur le génome complet du cortex et de l'hippocampe montrent des changements significatifs dans les gènes impliqués dans diverses fonctions physiologiques, telles que les rythmes circadiens, la réponse inflammatoire, ainsi que de l'activation des cellules gliales. En général, nos résultats précisent les changements dans la qualité de l’éveil ainsi que dans l'expression de divers gènes après TCL.

Enseignement de la géométrie en première secondaire et conceptions d'élèves : une oscillation entre la perception, la mesure et la théorie

Cette recherche, réalisée en milieu scolaire québécois, concerne l’enseignement et l’apprentissage de la géométrie à l’entrée au secondaire. Ce contexte est caractérisé par une géométrie non clairement définie d’un point de vue épistémologique, tant dans le programme d’études du premier cycle que dans les manuels scolaires. Ainsi, nous avons cherché à voir d’une part, l’activité géométrique souhaitée et actualisée par des enseignants incluant les problèmes proposés et, d’autre part, les conceptions d’élèves développées par ces problèmes. À partir de données recueillies auprès de quatre classes, nous avons déterminé cette activité géométrique et répertorié six types de problèmes dont quatre sont dominants ainsi que des conceptions d’élèves. L’activité géométrique en classe a donné lieu à des moments d’hésitation épistémologique, lesquels ne sont pas sans effet dans le développement des conceptions des élèves.

Qui fait quoi? Analyse des libellés de contribution dans les articles savants

Qui fait quoi au sein d’une équipe de recherche scientifique? Ce mémoire propose de définir les rôles de chacun des auteurs à l’aide d’une méthodologie originale. L’ordre des auteurs est un indicateur utile de l’importance relative de chacun des co-auteurs, mais il ne révèle pas la nature précise de leur rôle au sein de l’équipe. Ainsi, notre recherche démontre que l’utilisation des libellés de contributions aux articles scientifiques à des fins bibliométriques est possible et ce, même à grande échelle. Nos résultats montrent qu’il existe des différences dans les contributions apportées aux articles scientifiques et que ces différences s’appliquent aussi à la répartition du travail au sein des équipes de recherche selon le sexe des auteurs.

La petite GTPase Rab11 et ses interacteurs orchestrent la migration cellulaire collective et la cytocinèse chez la Drosophile

Le trafic vésiculaire permet un échange coordonné de molécules entre les différents organites de la cellule et dépend largement des petites GTPases de la famille des Rabs dont le nombre varie entre 27 chez la Drosophile et 70 chez l’Homme. Un des prochains défis consiste donc à élucider les mécanismes cellulaires qui coordonnent l’activité de ces Rabs, laquelle garantit un transport vésiculaire ordonné au sein de la cellule. Les Rabs agissent comme des interrupteurs moléculaires grâce à leur capacité à cycler entre un état actif et inactif. L’activité des Rabs est contrôlée par des protéines régulatrices puis des effecteurs en aval coordonnent leurs différentes fonctions. La petite GTPase Rab11 est essentielle au développement de plusieurs organismes incluant la Drosophile, C. elegans et la souris puisqu’elle se retrouve au cœur de différentes voies de transport. D’ailleurs, le trafic de molécules dépendant de Rab11 est perturbé dans plusieurs pathologies. Malgré son rôle central dans le trafic vésiculaire, la régulation de Rab11 reste peu comprise in vivo. Cette thèse se penche sur les mécanismes moléculaires contrôlant les fonctions de Rab11 et de ses effecteurs lors de la migration cellulaire collective et lors de la cytocinèse. Nous avons identifié Evi5 comme un nouvel acteur clé de la migration cellulaire collective, et nous montrons qu’elle possède une activité Rab11-GAP essentielle pour maintenir les récepteurs de guidance actifs de façon polarisée au front de migration. Nous avons ensuite déterminé que Rab11 régule la communication cellulaire lors de la migration collective par l’entremise de son interaction avec la Moésine. Une question reste toutefois en suspens : sachant que Rab11 compte plus de 13 effecteurs, quels sont les mécanismes assurant la spécificité de l’interaction entre cette GTPase et un effecteur particulier? Une partie de la réponse provient peut-être de nos observations que les membres des Rab11-FIPs de classe I, une famille d’effecteurs de Rab11, interagissent avec les protéines d’échafaudage 14-3-3. Chez la Drosophile, Rip11 est le seul représentant des Rab11-FIPs de classe I et nous montrons que Rip11 aurait des fonctions inattendues durant la cytocinèse qui seraient coordonnées par 14-3-3. Nos recherches permettent de dresser un portrait plus authentique des mécanismes moléculaires régulant les différentes fonctions de Rab11 et de ses effecteurs in vivo.

Les azasulfurylpeptides : synthèse, analyse conformationnelle et applications biologiques

Les azasulfurylpeptides sont des mimes peptidiques auxquels le carbone en position alpha et le carbonyle d’un acide aminé sont respectivement remplacés par un atome d’azote et un groupement sulfonyle (SO2). Le but premier de ce projet a été de développer une nouvelle méthode de synthèse de ces motifs, également appelés N-aminosulfamides. À cette fin, l’utilisation de sulfamidates de 4-nitrophénol s’est avérée importante dans la synthèse des azasulfuryltripeptides, permettant le couplage d’hydrazides avec l’aide d’irradiation aux micro-ondes (Chapitre 2). Par la suite, en quantité stoechiométrique d’une base et d’un halogénure d’alkyle, les azasulfurylglycines (AsG) formés peuvent être chimiosélectivement alkylés afin d’y insérer diverses chaînes latérales. Les propriétés conformationnelles des N-aminosulfamides à l’état solide ont été élucidées grâce à des études cristallographiques par rayons X : elles possèdent une structure tétraédrique autour de l’atome de soufre, des traits caractéristiques des azapeptides et des sulfonamides, ainsi que du potentiel à favoriser la formation de tours gamma (Chapitre 3). Après le développement d’une méthode de synthèse des N-aminosulfamides en solution, une approche combinatoire sur support solide a également été élaborée sur la résine amide de Rink afin de faciliter la génération d’une librairie d’azasulfurylpeptides. Cette étude a été réalisée en employant le growth hormone releasing peptide 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2). Ce dernier est un hexapeptide possédant une affinité pour deux récepteurs, le growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS-R1a) et le récepteur cluster of differenciation 36 (CD36). Une affinité sélective envers le récepteur CD36 confère des propriétés thérapeutiques dans le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Six analogues d’azasulfurylpeptides de GHRP-6 utilisés comme ligands du CD36 ont été synthétisés sur support solide, mettant en évidence le remplacement du tryptophane à la position 4 de GHRP-6 (Chapitre 4). Les analogues de GHRP-6 ont été ensuite analysés pour leur capacité à moduler les effets de la fonction et de la cascade de signalisation des ligands spécifiques au Toll-like receptor 2 (TLR2), en collaboration avec le Professeur Huy Ong du département de Pharmacologie à la Faculté de Pharmacie de l’Université de Montréal. Le complexe TLR2-TLR6 est reconnu pour être co-exprimé et modulé par CD36. En se liant au CD36, certains ligands de GHRP-6 ont eu un effet sur la signalisation du TLR2. Par exemple, les azasulfurylpeptides [AsF(4-F)4]- et [AsF(4-MeO)4]-GHRP-6 ont démontré une capacité à empêcher la surproduction du monoxyde d’azote (NO), un sous-produit réactif formé suite à l’induction d’un signal dans les macrophages par des ligands spécifiques liés au TLR2, tel le fibroblast-stimulating lipopeptide 1 (R-FSL-1) et l’acide lipotéichoïque (LTA). En addition, la sécrétion du tumor necrosis factor alpha (TNFa) et du monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), ainsi que l’activation du nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kB), ont été réduites. Ces résultats démontrent le potentiel de ces azasulfurylpeptides à pouvoir réguler le rôle du TLR2 qui déclenche des réponses inflammatoires et immunitaires innées (Perspectives). Finalement, le potentiel des azasulfurylpeptides d’inhiber des métallo-bêta-lactamases, tels le New-Delhi Metallo-bêta-lactamase 1 (NDM-1), IMP-1 et le Verona Integron-encoded Metallo-bêta-lactamase 2 (VIM-2), a été étudié en collaboration avec le Professeur James Spencer de l’Université de Bristol (Royaumes-Unis). Certains analogues ont été des inhibiteurs micromolaires du IMP-1 (Perspectives). Ces nouvelles voies de synthèse des azasulfurylpeptides en solution et sur support solide devraient donc permettre leur utilisation dans des études de relations structure-activité avec différents peptides biologiquement actifs. En plus d'expandre l'application des azasulfurylpeptides comme inhibiteurs d'enzymes, cette thèse a révélé le potentiel de ces N-aminosulfamides à mimer les structures secondaires peptidiques, tels que les tours gamma. À cet égard, l’application des azasulfurylpeptides a été démontrée par la synthèse de ligands du CD36 présentant des effets modulateurs sur le TLR2. Compte tenu de leur synthèse efficace et de leur potentiel en tant qu’inhibiteurs, les azasulfurylpeptides devraient trouver une large utilisation dans les sciences de peptides pour des applications dans la médecine et de la chimie biologique.

Soutenir le développement des compétences reliées au préceptorat auprès d'infirmières préceptrices.

Rapport de stage présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.) en sciences infirmières option formation