Regulation of sorting and post-Golgi trafficking of rhodopsin by its C-terminal sequence QVS(A)PA

Several mutations that cause severe forms of the human disease autosomal dominant retinitis pigmentosa cluster in the C-terminal region of rhodopsin. Recent studies have implicated the C-terminal domain of rhodopsin in its trafficking on specialized post-Golgi membranes to the rod outer segment of the photoreceptor cell. Here we used synthetic peptides as competitive inhibitors of rhodopsin trafficking in the frog retinal cell-free system to delineate the potential regulatory sequence within the C terminus of rhodopsin and model the effects of severe retinitis pigmentosa alleles on rhodopsin sorting. The rhodopsin C-terminal sequence QVS(A)PA is highly conserved among different species. Peptides that correspond to the C terminus of bovine (amino acids 324–348) and frog (amino acids 330–354) rhodopsin inhibited post-Golgi trafficking by 50% and 60%, respectively, and arrested newly synthesized rhodopsin in the trans-Golgi network. Peptides corresponding to the cytoplasmic loops of rhodopsin and other control peptides had no effect. When three naturally occurring mutations: Q344ter (lacking the last five amino acids QVAPA), V345M, and P347S were introduced into the frog C-terminal peptide, the inhibitory activity of the peptides was no longer detectable. These observations suggest that the amino acids QVS(A)PA comprise a signal that is recognized by specific factors in the trans-Golgi network. A lack of recognition of this sequence, because of mutations in the last five amino acids causing autosomal dominant retinitis pigmentosa, most likely results in abnormal post-Golgi membrane formation and in an aberrant subcellular localization of rhodopsin.

Kinetics of formation of hypoxanthine containing base pairs by HIV-RT: RNA template effects on the base substitution frequencies

Hypoxanthine (H), the deamination product of adenine, has been implicated in the high frequency of A to G transitions observed in retroviral and other RNA genomes. Although H·C base pairs are thermodynamically more stable than other H·N pairs, polymerase selection may be determined in part by kinetic factors. Therefore, the hypoxanthine induced substitution pattern resulting from replication by viral polymerases may be more complex than that predicted from thermodynamics. We have examined the steady-state kinetics of formation of base pairs opposite template H in RNA by HIV-RT, and for the incorporation of dITP during first- and second-strand synthesis. Hypoxanthine in an RNA template enhances the k2app for pairing with standard dNTPs by factors of 10–1000 relative to adenine at the same sequence position. The order of base pairing preferences for H in RNA was observed to be H·C >> H·T > H·A > H·G. Steady-state kinetics of insertion for all possible mispairs formed with dITP were examined on RNA and DNA templates of identical sequence. Insertion of dITP opposite all bases occurs 2–20 times more frequently on RNA templates. This bias for higher insertion frequencies on RNA relative to DNA templates is also observed for formation of mispairs at template A. This kinetic advantage afforded by RNA templates for mismatches and pairing involving H suggests a higher induction of mutations at adenines during first-strand synthesis by HIV-RT.

Selective pressure of a quinoxaline nonnucleoside inhibitor of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcriptase (RT) on HIV-1 replication results in the emergence of nucleoside RT-inhibitor-specific (RT Leu-74-->Val or Ile and Val-75-->Leu or Ile) HIV-1 mutants.

The quinoxaline nonnucleoside RT inhibitor (NNRTI) (S)-4-isopropoxycarbonyl-6-methoxy-3-(methylthiomethyl)-3,4- dihydroquinoxaline-2(1H)-thione (HBY 097) was used to select for drug-resistant HIV-1 variants in vitro. The viruses first developed mutations affecting the NNRTI-binding pocket, and five of six strains displayed the RT G190-->E substitution, which is characteristic for HIV-1 resistance against quinoxalines. In one variant, a new mutant (G190-->Q) most likely evolved from preexisting G190-->E mutants. The negative charge introduced by the G190-->E substitution was maintained at that site of the pocket by simultaneous selection for V179-->D together with G190-->Q. After continued exposure to the drug, mutations at positions so far known to be specific for resistance against nucleoside RT inhibitors (NRTIs) (L74-->V/I and V75-->L/I) were consistently detected in all cultures. The inhibitory activities of the cellular conversion product of 2',3'-dideoxyinosine (ddI, didanosine), 2',3'-dideoxyadenosine (ddA) and of 2',3'-didehydro-3'-deoxythymidine (d4T, stavudine) against these late-passage viruses were shown to be enhanced with the L74-->V/I RT mutant virus as compared with the wild-type (wt) HIV-1MN isolate. Clonal analysis proved linkage of the codon 74 and codon 75 mutations to the NNRTI-specific mutations in all RT gene fragments. The nonnucleoside- and nucleoside-resistance mutation sites are separated by approximately 35 A. We propose that the two sites "communicate" through the template-primer which is situated in the DNA-binding cleft between these two sites. Quinoxalines cause high selective pressure on HIV-1 replication in vitro; however, the implication of these findings for the treatment of HIV-1 infection has yet to be determined.

Des-re-territorialização e áreas protegidas na Amazônia: reflexões a partir do caso da Estação Ecológica da Terra do Meio-Pa-Brasil

A criação de espaços territoriais especialmente protegidos é uma estratégia utilizada pelo homem desde a antiguidade, objetivando a reserva de áreas com características naturais necessárias à manutenção ou à reprodução cultural de populações humanas específicas, regulando e limitando o acesso e a apropriação de certos recursos e/ou reservando-os para usos ou futuros. Os processos de criação dessas “áreas especialmente protegidas” foram contudo intensificados, no final do século XX, com a percepção da finitude dos recursos naturais, e acelerados pelo florescimento e a consolidação do capitalismo, agora “globalizado”. Quando tais processos, são orientados por interesses diversos de grupos sociais hegemônicos, são comuns não só a desestruturação do modo de vida dos usuários dos recursos naturais tradicionalmente relacionados aos “territórios especiais”, como também a expulsão de grupos não-hegemônicos neles já instalados, sempre que suas práticas culturais sejam consideradas como incompatíveis com os fins e os objetivos da área que se pretende proteger. Entre os tipos de área especialmente protegida estabelecidos pela legislação brasileira, encontram-se as Unidades de Conservação da Natureza (UC). Criadas por Lei com o objetivo de conservar a biodiversidade brasileira, as UC vem sendo palco de diversos conflitos ambientais envolvendo populações tradicionais em todos os biomas brasileiros, mas pode ser mais facilmente evidenciada na Amazônia, aonde a megabiodiversidade a proteger se sobrepõe a territórios ocupados por diversas etnias indígenas e outros povos tradicionais. Os conflitos são intensificados quando a categoria de manejo da UC criada restringe o acesso e altera os modos de apropriação e/ou dos usos tradicionais dos recursos naturais da área por parte dos residentes, inclusive impedindo a continuidade da permanência das populações no interior da UC, no caso o grupo das UC de Proteção Integral. À luz dos debates que vem sendo travados no campo da ecologia política, tais processos conflituosos estariam associados à desterritorialização dos grupos afetados pela criação da UC, nos quais o Estado brasileiro seria o responsável direto. Independentemente das diversas abordagens acadêmicas para o conceito de “território”, entende-se atualmente que a territorialização e a desterritorialização (com consequente reterritorialização) são processos interrelacionados e circularmente conectados, não podendo ser compreendidos separadamente. Assim, o objetivo do presente trabalho é contribuir para a compreensão desses processos de des-re-terrritorialização, avaliando como alguns mecanismos previstos na Lei do Sistema Nacional das Unidades de Conservação para o reassentamento das populações anteriormente residentes vem sendo aplicados, no sentido de promover processos de reterritorialização. As reflexões apresentadas se dão a partir do caso dos ribeirinhos e colonos residentes na Estação Ecológica da Terra do Meio, Pará, Brasil. A partir da avaliação, são propostas alternativas para minimizar a situação de injustiça ambiental na qual se encontram esses atores sociais específicos.

Ārtī : manuscript, 1868

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