小麦春化相关基因的克隆及其功能分析

一． 小麦相关基因ver203F cDNA全序列克隆与功能分析 　　根据本实验室通过差异筛选技术克隆到的与春化相关的基因cDNA verc203的序列，设计PCR 5’端PCR引物，利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）克隆策略，得到春化相关基因ver203基因的同源基因ver203F cDNA的3’端序列，长度为1,197bp。Northern分析表明ver203F全长约为1.5 kb，且其表达具有春化处理的特异性。根据3’RACE克隆的ver203F 3 ’端核苷酸序列设计了3’端PCR引物，利用5’RACE克隆到该基因的5’端片段，经DNASIS核酸分析软件分析将5’45RACE和3’RACE DNA序列拼接合并，得到ver203F全长cDNA，从TdT加尾5’末端到poly A全长为1,561 bp，5’端起始密码子ATG上游非编码区－1～－192共了192bp，终止密码子TGA到poly A的非编码区有253bp，cDNA编码区全长1,119 bp，推测编码373氨基酸残基。国际基因序列数据库检索表明该基因序列（GenBank/EMBL/DDBJ：AB012013）与大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性。因上推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径，ver203F作用的发挥可能需要其它蛋白的参与，或ver203F本身就是一个受体蛋白。 　　为了研究ver203F基因的功能，将通过3’RACE克隆到的ver203F 3’端序到分别构建正义和反义植物表达载体，通过花粉管通道法、农杆菌介导的叶圆片法以及农杆菌介导的真空转化法分别转化小麦、烟草和拟南芥菜。获得转基因植株后，PCR、DNA Dob Blot、Southern Blot分析以及GUS活性检测证明外源基因已整合到转基因植株中，并得到表达。在获得的小麦、烟草和拟南芥菜转基因植株中，它们开花时间都相应地推迟，表明正常植物体内该基因在控制营养生长向生殖生长的转变中起作用。ver203F可以影响小麦和拟南茶菜花序的发育，首先无论正义还是反义都使得花序的发育受到抑制，在小麦中表现为顶部小穗退化，在拟南芥菜中表现为顶花。其次在转化正义基因的转基因拟南芥菜中，观察到产生的顶花为对称的两朵或以对称的两朵顶花基部为生长点长出丛生花，这种对称花的麦型小麦小穗中小花的表型相类似，说明ver203F基因可能在小麦小花的发育过程中也起着重要作用。 二． 春化相关基因ver17在开花过程中功能的分析 以春化处理冬小麦（京冬1号）幼苗cDNA为材料，通过减法杂交与差异筛选得到春化相关cDNA克隆verc17。为了研究该基因的功能，以包含CaMV 35S启动子的pBI221为载体，将ver17cDNA片段分别从两个方向插入pBI221的BamH I－Sma I, Xba I－BamH I间，构建正义和反义表达质粒：p17S和p17X，通过花粉管通道法转化小麦。对T0和T1两代转基因小麦的观察发现，在转化反义基因p17X的转基因小麦首先表现为抽穗推迟，其次穗的顶部和基部小穗严重退化，另外还发现转化反义基因的小麦败育现象严重（主要是花粉败育），因此推测ver17基困能可具有以下几方面的特点：a．春化诱导型表达;b．促进植物开花;c．促进穗顶端和基部花的发育，减少其退化;d．影响雄蕊的发育。

利用反义RNA技术进行木质素生物合成调控的研究

木质素是一类酚类次生代谢产物，在植物体内行使重要的生理功能，但它却是形成造纸污染的主要来源。利用基因工程手段，在分子水平调节木质素的生物合成，降低木质素的含量或改变组分以培育适合造纸的植物原料树种具有较大的应用价值和环保效益。本研究利用反义RNA技术，主要围绕木质素合成三种相关酶咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)、4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）的基因对植物木质素生物合成途径调节的研究，取得如下进展： 1.农杆菌介导法将COMT和CCoAOMT基因的单价和双价的反义表达载体导入烟草，比较了两个甲基化酶的功能。PCR-Southern和Northern点杂交结果表明反义基因已整合到烟草基因组DNA上，并在转录水平表达。两种反义基因对木质素生物合成调节的效果显示，CCoAOMT能更有效地调节木质素生物总量的合成，COMT仅特异调节S木质素的合成。表达反义CCoAOMT基因的转基因毛白杨，内源CCoAOMT基因的表达在转录和蛋白水平均受到抑制，最终引起转基因植株木质素含量普遍降低，最多降低达26.20%，筛选出木质素含量下降10%以上的转基因毛白杨株系8个，为源头治理造纸废水污染奠定了基础。 2． 对克隆的4CL基因进行了表达特性分析， RT-PCR分析表明，分离的毛白杨4CL基因主要在木质部丰富表达，叶中表达量较少，树皮中不表达。在毛白杨的一个生长季，该基因表达显示明显的双锋特征，该表达模式与木材早材和晚材的发育时期相吻合，表明分离的毛白杨4CL基因与木质素的生物合成密切相关。农杆菌介导法将反义4CL基因导入烟草和毛白杨，利用分子生物学检测手段对转化植株进行筛选，获得批量转基因植株。Klason木质素含量测定分析表明，抑制内源4CL基因表达，能有效降低转基因植物中的木质素含量，且不影响植株正常生长和发育以及碳水化合物的合成。转基因毛白杨的茎杆上一些区域呈红棕色，颜色的深度与转基因毛白杨木质素含量的下降幅度呈一定的正相关性，颜色变化可作为转基因植株筛选的一个辅助指标。现已获得木质素含量下降10%以上的转基因株系3个，最多下降达41.73%，可供中试与制浆实验，为培育低木质素环保型毛白杨提供理论与实践依据。 3.为了优化现有的表达框架，使目的基因更有效地调节木质素的生物合成，应用PCR技术从毛白杨基因组中分离得到C4H(肉桂酸4—羟基化酶)基因启动子片段（GenBank注册号：AY351673）。GUS荧光活性分析和组织化学染色显示，该启动子在一些木质化的组织和器官中特异表达，随着组织成熟度和木质化程度的增加，表达活性逐渐增强，并且该启动子受伤诱导。反义CCoAOMT基因在C4H启动子的调控下，会引起转基因烟草木质素均有不同程度的减少，但不影响碳向碳水化合物的转换合成，对植物的生长发育也无明显负效应。这些结果证明了从毛白杨中分离的C4H 启动子可以应用于造纸原料树种材性改良的遗传工程操作。 4．首次从水稻中华10号（Oryza sativa L. ssp. japonica）分离了CCoAOMT基因家族的三个成员，对其基因结构及表达特性的分析表明，该基因家族的三个成员与水稻的木质化进程关系密切，研究结果有助于了解单子叶植物中的甲基化途径发生机制，为高产水稻抗倒伏和茎杆饲料作物的遗传改良奠定了基础。

白皮松花粉管发育过程中RNA、蛋白质和多糖类物质的合成及其动态变化

花粉管是有花植物受精过程中雄性生殖单位的载体，它同根毛、真菌菌丝一样，具有典型的极性顶端生长模式。裸子植物花粉与被子植物相比，具有萌发时间较长，生长缓慢等特点。但是目前人们对于裸子植物花粉萌发和花粉管生长的机理还不清楚。本文以裸子植物白皮松（Pinus bungeana）的花粉为材料，采用细胞学和生理生化方法，包括应用普通光学显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、显微红外光谱（FTIR）和透射电镜（TEM）等技术，对其花粉萌发和花粉管生长过程进行了较为系统的研究，旨在进一步揭示裸子植物花粉管发育的调控机制。 本论文首先研究了外源Ca2+ 和3种调钙药物（A23187、EGTA、TMB8）对白皮松花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明，在离体培养条件下，高浓度的Ca2+（1%）能完全抑制白皮松花粉的萌发，低浓度的Ca2+ 则影响不大，而花粉萌发和花粉管生长的最适Ca2+ 浓度为0.01%。用Ca2+ 载体A23187、Ca2+ 螯合剂EGTA和钙通道阻滞剂TMB8分别处理花粉后，花粉萌发和花粉管生长均受到抑制。另外，用 Ca2+ 荧光探针 Fluo-3AM标记，对Ca2+ 的分布变化进行了观察，发现在花粉萌发的初期，Ca2+ 向萌发孔聚集。在正常生长的花粉管中Ca2+ 呈梯度分布，顶端荧光最强。与对照相比，A23187处理后花粉粒中荧光增强，而EGTA和TMB8处理的花粉粒中荧光强度均减弱。并且这3种调钙药物还破坏了花粉管顶端的Ca2+ 浓度梯度，最终导致花粉管的生长受阻。 花粉萌发和花粉管的生长依赖于RNA和蛋白质的不断合成。在放线菌素D的存在下，花粉萌发基本不受影响，但花粉管的生长速度下降，花粉管中RNA含量也减少。而经过放线菌酮处理后，花粉萌发和花粉管生长均受到抑制，花粉管中蛋白质含量降低，同时花粉管顶端显著膨大。通过SDS-PAGE的结果表明，花粉粒萌发前后蛋白质图谱有明显差异。FTIR光谱分析表明，两种抑制剂处理均导致花粉管壁的化学组成发生了变化，例如蛋白质和饱和酯含量减少，而羧酸的含量增加。此外，由放线菌酮和放线菌素D处理后，花粉管的超微结构也发生了明显变化，其中特别是花粉管顶端的分泌系统遭到严重破坏。 纤维素的正常合成对于白皮松花粉管的生长是必需的。在正常培养基中添加纤维素生物合成抑制剂2，6-二氯苯腈（DCB）后，花粉萌发几乎不受影响，但是花粉管的形态发生异常，生长速率降低。DCB处理还导致花粉管壁中纤维素含量下降，而胼胝质在花粉管顶端积累。用识别酯化果胶的JIM7和识别酸性果胶的JIM5对离体培养的白皮松花粉管进行标记后，发现果胶成分呈异常分布图式。FTIR光谱分析结果表明花粉管细胞壁中蛋白质、羧酸以及饱和酯含量增加。同时，在电镜下观察发现，花粉管细胞壁顶端呈现不均匀加厚，其中主要的细胞器，如高尔基体和线粒体等膜结构均遭到破坏。 上述结果说明，白皮松成熟花粉粒中已含有花粉萌发和花粉管早期生长所必需的Ca2+ 和RNA，但是在花粉管的后续伸长过程中仍需要外源Ca2+ 的参与以及新RNA、蛋白质的不断合成。与被子植物不同，裸子植物花粉萌发的启动也需要新蛋白的合成。尽管在花粉管中纤维素的含量很低，但是对于细胞壁的构建、花粉管的正常形态的维持起着关键作用。