Riparazione del danno ischemico ostruttivo del miocardio mediante cellule staminali mesenchimali sottoposte a stimolazione elettromeccanica in bioreattore

Nell’ambito dell’ingegneria dei tessuti, la possibilità di rigenerazione del miocardio post-infartuale è un argomento “caldo”, che suscita grandi speranze ma solleva altrettanto grandi interrogativi - sostenuti dal sussistere di dubbi di base sulle scelte operative praticabili. Esiste tuttavia concordanza nel considerare fondamentale l’utilizzo di un “supporto” che possa mantenere nella sede peri-infartuale le cellule competenti. Infatti, la semplice iniezione di cellule staminali per via endovenosa o direttamente nell’area infartuata non si è dimostrata particolarmente efficace, soprattutto a causa della cospicua perdita cellulare che si verifica rapidamente dopo il trapianto. Ci si orienta quindi verso la strategia di seminare cellule in grado di transdifferenziare in senso muscolare cardiaco su un materiale biocompatibile in vitro e di impiantare successivamente il costrutto ottenuto in vivo dove ci si attende il riassorbimento del biomateriale e l’integrazione delle cellule. Tuttavia, mentre in altri settori della medicina - quali ortopedia e dermatologia - l’impiego di pseudotessuti ingegnerizzati ha già permesso di conseguire ottimi risultati nella rigenerazione di tessuti danneggiati, allo stato attuale, i progressi ottenuti nell’ambito della rigenerazione del miocardio infartuato appaiono ancora aneddotici e distanti dall’ottenere protocolli condivisi per l’impiego in clinica. Il lavoro presentato in questa ricerca, condotto grazie alla sinergia di competenze interdisciplinari negli ambiti chimico, biologico e dell’ingegneria biomedica meccanica ed elettronica, è uno studio di fattibilità di una metodica standardizzata in grado di indirizzare cellule staminali mesenchimali (MSCs) indifferenziate verso l’acquisizione in vitro di caratteri fenotipici confrontabili con quelli delle cellule muscolari cardiache attraverso il paradigma della coltura dinamica in bioreattore. Il prototipo di bioreattore impiegato, in quanto sviluppato originalmente nel corso di questa attività di ricerca, presenta rispetto ad altri strumenti descritti l’innovazione e il vantaggio di non richiedere l’utilizzo di un incubatore, in quanto esso stesso permette di coltivare cellule al suo interno in condizioni controllate di temperatura, pH e concentrazione di CO2. La sua flessibilità operativa consente di impostare e controllare da personal computer leggi di moto di qualsiasi forma anche con cicliche molto veloci. Infine, la presenza di estensimetri in grado di misurare finemente la variazione di tensione esercitata sulla matrice polimerica utilizzata, posta in trazione tra due afferraggi, permette di applicare nel tempo una forza di stiramento costante, ottenendo deformazioni controllate e risultati riproducibili in termini di modificazioni cellulari. Il superamento delle problematiche sorte durante la fase di messa a punto del sistema, che deve essere ritenuto parte integrante del lavoro di sviluppo condotto, ha permesso di studiare l’adattamento di MSCs allo stiramento ciclico, mostrando che questo effettivamente determina alcune differenze fenotipiche rispetto al controllo statico. Inoltre le cellule hanno acquistato una disposizione orientata lungo l’asse longitudinale delle fibre, dato questo particolarmente importante se si considera la disposizione ordinata delle cellule del miocardio, le quali costituiscono un vero e proprio sincizio, indispensabile per una diffusione sincrona dell’impulso elettrico di contrazione. La creazione di uno pseudotessuto cardiaco ottimale richiederà ovviamente ulteriore lavoro, ma la metodica qui presentata si propone al tempo stesso come uno strumento di studio e come una strategia operativa per un approccio innovativo e standardizzabile alla medicina rigenerativa del miocardio.

Intrinsic uncoupling in the ATP synthase of Escherichia coli. Studies on WT and ε-truncated mutants

The H+/ATP ratio in the catalysis of ATP synthase has generally been considered a fixed parameter. However, Melandri and coworkers have recently shown that, in the ATP synthase of the photosynthetic bacterium Rb.capsulatus, this ratio can significantly decrease during ATP hydrolysis when the concentration of either ADP or Pi is maintained at a low level (Turina et al., 2004). The present work has dealt with the ATP synthase of E.coli, looking for evidence of this phenomenon of intrinsic uncoupling in this organism as well. First of all, we have shown that the DCCD-sensitive ATP hydrolysis activity of E.coli internal membranes was strongly inhibited by ADP and Pi, with a half-maximal effect in the submicromolar range for ADP and at 140 µM for Pi. In contrast to this monotonic inhibition, however, the proton pumping activity of the enzyme, as estimated under the same conditions by the fluorescence quenching of the ΔpH-sensitive probe ACMA, showed a clearly biphasic progression, both for Pi, increasing from 0 up to approximately 200 µM, and for ADP, increasing from 0 up to a few µM. We have interpreted these results as indicating that the occupancy of ADP and Pi binding sites shifts the enzyme from a partially uncoupled state to a fully coupled state, and we expect that the ADP- and Pi-modulated intrinsic uncoupling is likely to be a general feature of prokaryotic ATP synthases. Moreover, the biphasicity of the proton pumping data suggested that two Pi binding sites are involved. In order to verify whether the same behaviour could be observed in the isolated enzyme, we have purified the ATP synthase of E.coli and reconstituted it into liposomes. Similarly as observed in the internal membrane preparation, in the isolated and reconstituted enzyme it was possible to observe inhibition of the hydrolytic activity by ADP and Pi (with half-maximal effects at few µM for ADP and at 400 µM for Pi) with a concomitant stimulation of proton pumping. Both the inhibition of ATP hydrolysis and the stimulation of proton pumping as a function of Pi were lost upon ADP removal by an ADP trap. These data have made it possible to conclude that the results obtained in E.coli internal membranes are not due to the artefactual interference of enzymatic activities other than the ones of the ATP synthase. In addition, data obtained with liposomes have allowed a calibration of the ACMA signal by ΔpH transitions of known extent, leading to a quantitative evaluation of the proton pumping data. Finally, we have focused our efforts on searching for a possible structural candidate involved in the phenomenon of intrinsic uncoupling. The ε-subunit of the ATP-synthase is known as an endogenous inhibitor of the hydrolysis activity of the complex and appears to undergo drastic conformational changes between a non-inhibitory form (down-state) and an inhibitory form (up-state)(Rodgers & Wilce, 2000; Gibbons et al., 2000). In addition, the results of Cipriano & Dunn (2006) indicated that the C-terminal domain of this subunit played an important role in the coupling mechanism of the pump, and those of Capaldi et al. (2001), Suzuki et al. (2003) were consistent with the down-state showing a higher hydrolysis-to-synthesis ratio than the up-state. Therefore, we decided to search for modulation of pumping efficiency in a C-terminally truncated ε mutant. A low copy number expression vector has been built, carrying an extra copy of uncC, with the aim of generating an ε-overexpressing E.coli strain in which normal levels of assembly of the mutated ATP-synthase complex would be promoted. We have then compared the ATP hydrolysis and the proton pumping activity in membranes prepared from these ε-overexpressing E.coli strains, which carried either the WT ε subunit or the ε88-stop truncated form. Both strains yielded well energized membranes. Noticeably, they showed a marked difference in the inhibition of hydrolysis by Pi, this effect being largely lost in the truncated mutant. However, pre-incubation of the mutated enzyme with ADP at low nanomolar concentrations (apparent Kd = 0.7nM) restored the hydrolysis inhibition, together with the modulation of intrinsic uncoupling by Pi, indicating that, contrary to wild-type, during membrane preparation the truncated mutant had lost the ADP bound at this high-affinity site, evidently due to a lower affinity (and/or higher release) for ADP of the mutant relative to wild type. Therefore, one of the effects of the C-terminal domain of ε appears to be to modulate the affinity of at least one of the binding sites for ADP. The lack of this domain does not appear so much to influence the modulability of coupling efficiency, but instead the extent of this modulation. At higher preincubated ADP concentrations (apparent Kd = 117nM), the only observed effects were inhibition of both hydrolysis and synthesis, providing a direct proof that two ADP-binding sites on the enzyme are involved in the inhibition of hydrolysis, of which only the one at higher affinity also modulates the coupling efficiency.

On Designing Compliant Actuators Based On Dielectric Elastomers

Dielectric Elastomers (DE) are incompressible dielectrics which can experience deviatoric (isochoric) finite deformations in response to applied large electric fields. Thanks to the strong electro-mechanical coupling, DE intrinsically offer great potentialities for conceiving novel solid-state mechatronic devices, in particular linear actuators, which are more integrated, lightweight, economic, silent, resilient and disposable than equivalent devices based on traditional technologies. Such systems may have a huge impact in applications where the traditional technology does not allow coping with the limits of weight or encumbrance, and with problems involving interaction with humans or unknown environments. Fields such as medicine, domotic, entertainment, aerospace and transportation may profit. For actuation usage, DE are typically shaped in thin films coated with compliant electrodes on both sides and piled one on the other to form a multilayered DE. DE-based Linear Actuators (DELA) are entirely constituted by polymeric materials and their overall performance is highly influenced by several interacting factors; firstly by the electromechanical properties of the film, secondly by the mechanical properties and geometry of the polymeric frame designed to support the film, and finally by the driving circuits and activation strategies. In the last decade, much effort has been focused in the devolvement of analytical and numerical models that could explain and predict the hyperelastic behavior of different types of DE materials. Nevertheless, at present, the use of DELA is limited. The main reasons are 1) the lack of quantitative and qualitative models of the actuator as a whole system 2) the lack of a simple and reliable design methodology. In this thesis, a new point of view in the study of DELA is presented which takes into account the interaction between the DE film and the film supporting frame. Hyperelastic models of the DE film are reported which are capable of modeling the DE and the compliant electrodes. The supporting frames are analyzed and designed as compliant mechanisms using pseudo-rigid body models and subsequent finite element analysis. A new design methodology is reported which optimize the actuator performances allowing to specifically choose its inherent stiffness. As a particular case, the methodology focuses on the design of constant force actuators. This class of actuators are an example of how the force control could be highly simplified. Three new DE actuator concepts are proposed which highlight the goodness of the proposed method.

Prestazioni energetiche degli edifici. Un caso di studio

Nella tesi sono state valutate le prestazioni energetiche di un edificio esistente ed i possibili interventi migliorativi da porre in opera per migliorare dette prestazioni in riferimento all'involucro edilizio, agli impianti e alla produzione di energia da fonti rinnovabili.

Un'applicazione VoIP per Symbian: un'interfaccia utente

Nel campo della tecnologia, l’ultimo decennio è stato caratterizzato da significativi sviluppi nel mondo dei dispositivi mobili. Si è passati dal tradizionale telefono cellulare, ai più recenti palmari e Smartphone che integrano al tradizionale stereotipo di telefono cellulare, funzionalità avanzate su hardware molto sofisticato. Con un moderno dispositivo mobile infatti, è possibile collegarsi ad Internet, leggere mail, guardare video, scaricare applicazioni e installarle per poterne così fruire. L’International Telecommunications Union (ITU-T) ha stimato che alla fine del 2010 il numero di utenti Internet a livello mondiale ha raggiunto i 2 mi- liardi e che gli accessi alla rete cellulare hanno raggiunto circa 5,3 miliardi di sottoscrizioni. Se si considera inoltre che le reti 2G verranno sostituite da quelle 3G (che consente una connessione alla rete a banda larga tramite dispositivi cellulari), è inevitabile che nel prossimo futuro, gli utilizzatori di Internet tramite rete mobile potranno arrivare ad essere anche qualche miliardo. Le applicazioni disponibili in rete sono spesso scritte in linguaggio Java che su dispositivi embedded, dove è cruciale il consumo di energia, mettono in crisi la durata della batteria del dispositivo. Altre applicazioni scritte in linguaggi meno dispendiosi in termini di consumi energetici, hanno un’interfaccia scarna, a volte addirittura ridotta a semplice terminale testuale, che non è indicata per utenti poco esperti. Infine altre applicazioni sono state eseguite solo su simulatori o emulatori, perciò non forniscono riscontri su dispositivi reali. In questa tesi verrà mostrato come su un dispositivo mobile sia possibile utilizzare, tramite un’interfaccia “user-friendly”, una tecnologia già esistente e diffusa come il VoIP in maniera tale che qualunque tipologia di utente possa utilizzarla senza conoscerne i dettagli tecnici. Tale applicazione, dovendo utilizzare una connessione dati, sfrutterà o una connessione a una rete WLAN o una connessione a una rete cellulare (GPRS, UMTS e HSDPA ad esempio) a seconda della dotazione hardware dell’apparecchio mobile e della locazione dello stesso in una rete accessibile dall’utente.

DTCU: Alberi Decisionali per la Classificazione di Dati Incerti

Oggi piu' che mai e' fondamentale essere in grado di estrarre informazioni rilevanti e conoscenza dal grande numero di dati che ci possono arrivare da svariati contesti, come database collegati a satelliti e sensori automatici, repository generati dagli utenti e data warehouse di grandi compagnie. Una delle sfide attuali riguarda lo sviluppo di tecniche di data mining per la gestione dell’incertezza. L’obiettivo di questa tesi e' di estendere le attuali tecniche di gestione dell’incertezza, in particolare riguardanti la classificazione tramite alberi decisionali, in maniera tale da poter gestire incertezza anche sull’attributo di classe.

Learning for scheduling a portfolio of constraint solvers

Nel lavoro di tesi qui presentato si indaga l'applicazione di tecniche di apprendimento mirate ad una più efficiente esecuzione di un portfolio di risolutore di vincoli (constraint solver). Un constraint solver è un programma che dato in input un problema di vincoli, elabora una soluzione mediante l'utilizzo di svariate tecniche. I problemi di vincoli sono altamente presenti nella vita reale. Esempi come l'organizzazione dei viaggi dei treni oppure la programmazione degli equipaggi di una compagnia aerea, sono tutti problemi di vincoli. Un problema di vincoli è formalizzato da un problema di soddisfacimento di vincoli(CSP). Un CSP è descritto da un insieme di variabili che possono assumere valori appartenenti ad uno specico dominio ed un insieme di vincoli che mettono in relazione variabili e valori assumibili da esse. Una tecnica per ottimizzare la risoluzione di tali problemi è quella suggerita da un approccio a portfolio. Tale tecnica, usata anche in am- biti come quelli economici, prevede la combinazione di più solver i quali assieme possono generare risultati migliori di un approccio a singolo solver. In questo lavoro ci preoccupiamo di creare una nuova tecnica che combina un portfolio di constraint solver con tecniche di machine learning. Il machine learning è un campo di intelligenza articiale che si pone l'obiettivo di immettere nelle macchine una sorta di `intelligenza'. Un esempio applicativo potrebbe essere quello di valutare i casi passati di un problema ed usarli in futuro per fare scelte. Tale processo è riscontrato anche a livello cognitivo umano. Nello specico, vogliamo ragionare in termini di classicazione. Una classicazione corrisponde ad assegnare ad un insieme di caratteristiche in input, un valore discreto in output, come vero o falso se una mail è classicata come spam o meno. La fase di apprendimento sarà svolta utilizzando una parte di CPHydra, un portfolio di constraint solver sviluppato presso la University College of Cork (UCC). Di tale algoritmo a portfolio verranno utilizzate solamente le caratteristiche usate per descrivere determinati aspetti di un CSP rispetto ad un altro; queste caratteristiche vengono altresì dette features. Creeremo quindi una serie di classicatori basati sullo specifico comportamento dei solver. La combinazione di tali classicatori con l'approccio a portfolio sara nalizzata allo scopo di valutare che le feature di CPHydra siano buone e che i classicatori basati su tali feature siano affidabili. Per giusticare il primo risultato, eettueremo un confronto con uno dei migliori portfolio allo stato dell'arte, SATzilla. Una volta stabilita la bontà delle features utilizzate per le classicazioni, andremo a risolvere i problemi simulando uno scheduler. Tali simulazioni testeranno diverse regole costruite con classicatori precedentemente introdotti. Prima agiremo su uno scenario ad un processore e successivamente ci espanderemo ad uno scenario multi processore. In questi esperimenti andremo a vericare che, le prestazioni ottenute tramite l'applicazione delle regole create appositamente sui classicatori, abbiano risultati migliori rispetto ad un'esecuzione limitata all'utilizzo del migliore solver del portfolio. I lavoro di tesi è stato svolto in collaborazione con il centro di ricerca 4C presso University College Cork. Su questo lavoro è stato elaborato e sottomesso un articolo scientico alla International Joint Conference of Articial Intelligence (IJCAI) 2011. Al momento della consegna della tesi non siamo ancora stati informati dell'accettazione di tale articolo. Comunque, le risposte dei revisori hanno indicato che tale metodo presentato risulta interessante.