Compas : stratégies de prise en charge clinique : médecine interne générale ambulatoire

En 36 chapitres, concis et efficaces, cet ouvrage propose des repères pour la prise en charge des patients adultes en médecine générale et en médecine interne ambulatoire. Les thèmes ont été choisis en fonction des besoins exprimés par les médecins en formation. Chaque chapitre propose une stratégie diagnostique et thérapeutique dans une perspective d'usage rationnel des ressources du système de santé, en tenant compte des données les plus récentes de la médecine basée sur les preuves. Ce livre confirme que la pratique de la médecine reste un subtil assemblage des connaissances scientifiques, de l'expertise clinique et des valeurs du patient.

Molecular insights into T cell activation : study of the TRAF, Bcl10 and Carma 1 proteins

Abstract : Activation of naïve T lymphocytes is essential for the onset of an adaptive immune response against a pathogenic threat. T lymphocytes are activated through the engagement of their highly specific cell surface antigen-receptor (TCR), together with co-stimulatory receptors, by activated antigen-presenting cells that display antigenic peptide fragments from the pathogen that they have detected. Dissection of the mechanisms that modulate TCR- and co-stimulation- induced signals is therefore crucial for the understanding of the molelcular basis of adaptive immune responses. Following antigen-receptor triggering, the Carma1, Bcl10 and Malt1 (CBM) proteins assemble into an oligomeric complex, which is essential for activation of the NF-κB and JNK signaling pathways in lymphocytes. In this work, by using human epithelial and lymphocytic cell lines, we identified the TNF-receptor-associated factor (TRAF) proteins TRAF3 and TRAF7 as new binding partners of Bcl10 and Carma1, respectively. We could show that TRAF3 is required for the proper transcriptional upregulation of IL-2 in activated T cells, and that endogenous TRAF3 is recruited to Bcl10 following TCR engagement. Although the mechanisms used by TRAF3 to modulate the transcriptional activation of the IL-2 promoter are not elucidated, the stimulus-dependent association ofTRAF3 with its direct binding partner Bcl10 suggests that TRAF3 is regulating Bcl10 function in TCR-activated lymphocytes. We also demonstrated that TRAF7 acts as a negative regulator of Carma1-induced NFκB-and AP1-dependent transcription by overexpression in 293T cells. These data suggest that TRAF7 could contribute to the negative regulation of TCR-dependent Carma1 functions. Finally, we showed that Carma1 is processed upon antigen-receptor triggering in B and T cell lines, as well as in primary human CTLs, and that this processing is dependent on the proteolytic activity of Malt1. Collectively, this work contributes to describe new proteins and regulatory mechanisms that modulate CBM-dependent functions in activated lymphocytes. Furthermore, it uncovers new tracks that could lead to a better molecular understanding of the complex interplay between the activatory and inhibitory regulators associated with the CBM complex. Résumé : L'activation des lymphocytes T naifs est une étape essentielle à la mise en place d'une réponse immunitaire adaptative pour combattre une infection. Après la détection d'un pathogène, les cellules présentatrices d'antigènes exposent à leur surface des fragments peptidiques provenant du pathogène, qui activent le récepteur à antigène (TCR) spécifique des lymphocytes T, ainsi que des molécules co-stimulatrices qui contribuent à l'activation complète des lymphocytes T. La caractérisation des mécanismes qui modulent les cascades de signaux émanant du TCR et des récepteurs de co-stimulation est essentielle à la compréhension du fonctionnement moléculaire de la réponse immunitaire adaptative. La ligation du TCR induit la formation d'un complexe oligomérique comprenant les protéines Carma1, Bcl10 et Malt1, qui est essentiel à l'activation des voies de signalisation cellulaires NF-κB et JNK induisant l'activation complète des lymphorctes T. Dans cette étude, à l'aide de lignées de cellules humaines épithéliales et lymphocytaires, nous avons identifié que deux protéines de la famille des TRAF (Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Factor), TRAF3 et TRAF7, s'associent à Bc110 et à Carma1, respectivement. Les TRAFs sont d'importants régulateurs des voies de signalisation dans les cellules du système immunitaire inné et adaptatif. Nous avons démontré que TRAF3 était important pour permettre la transcription de l'interleukine-2 (IL-2) dans les lymphocytes T activés, et que TRAF3 s'associait à Bc110 à la suite de la stimulation du TCR Les mécanismes que TRAF3 utilise pour moduler l'activation du promoteur de l'IL-2 ne sont pas connus, mais l'association de TRAF3 à Bc110 suite à la stimulation du TCR suggère que TRAF3 régule la fonction de Bc110. Nous avons également identifié TRAF7 comme un nouveau régulateur négatif des voies NF-κB et JNK induites par surexpression de la protéine Carma1. Nos données suggèrent que TRAF7 pourrait également contribuer à la régulation négative de la fonction de Carma1 dans les lymphocytes activés. Enfin, nous avons découvert que Carma1 était clivé suite à la stimulation du TCR, et que ce clivage dépendait de l'activité protéolytique de Malt1. Cette étude contribue ainsi à la description de nouvelles protéines et de nouveaux mécanismes qui modulent l'activité du complexe CBM dans les lymphocytes activés, et ouvre la voie à la caractérisation moléculaire de ces nouveaux mécanismes importants pour la régulation de la réponse immunitaire adaptative.

Urgences psychiatriques ambulatoires : quelle évolution en dix ans ?

Au sein du département de psychiatrie du CHUV à Lausanne, les soins psychiatriques ont connu il y a dix ans une réorganisation majeure avec, d'une part, la création d'unités spécialisées par psychopathologies et d'autre part, l'implantation de l'urgence psychiatrique ambulatoire unifiée à l'hôpital général. A la veille de cette réorganisation, une analyse descriptive des patients se présentant aux portes d'entrée du système de soins psychiatriques avait été effectuée par le biais d'une étude menée par les Docteurs A. Berney et Ch. Bonsack du DP-CHUV, dans le but d'améliorer l'évaluation, la prise en charge et l'orientation des patients. Aujourd'hui, toujours dans un but d'optimisation, il semble important d'explorer les possibles changements intervenus en dix ans dans le profil des patients accédant au système d'urgences psychiatriques. Notre étude, basée sur le Health of Nation Outcome Scales (HoNOS), est une étude d'observation évaluant tous les patients consécutifs, sur une période de trois semaines en 2009, se présentant au service des urgences psychiatriques ambulatoires ou qui sont admis aux urgences médicochirurgicales du CHUV et pour lesquels une évaluation psychiatrique est requise. Seuls les patients âgés de 18 à 65 ans ont été inclus. L'analyse comprend les éléments suivants: profils des patients en 2009, comparaison entre patients se présentant aux urgences psychiatriques ou médicochirurgicales, différences par sexe, comparaison entre les échantillons de 1998 et 2009, discussion des résultats et revue de la littérature. Les résultats de l'étude et la comparaison avec l'étude effectuée en 1998 valident le bien- fondé du choix fait en 1998 de réunir sur un même lieu les deux structures d'urgence, urgences médicochirurgicales et psychiatriques. Nous constatons également une baisse du taux d'hospitalisation en hôpital psychiatrique, au profit d'une prise en charge ambulatoire du patient. Parallèlement, l'investigation psychosociale et l'investigation de l'environnement du patient ont pris toujours plus d'importance.

Rôle des champignons dans la voie oxalate-carbonate

La présente thèse met en évidence trois rôles des champignons dans la voie oxalate-carbonate. (i) La dynamique fongique de production des cristaux d'oxalate de calcium montre une diminution du nombre de ces cristaux comparativement à ceux préalablement produits. Afin de confirmer ce résultat, une méthode analytique faisant usage de la chromatographie liquide mesurant l'oxalate total, a été mise en pratique. De plus, des champignons à pourriture blanche ont été cultivés sur un milieu Schlegel couramment utilisé par les bactériologistes pour montrer la dissolution bactérienne des oxalates de calcium. Certains champignons se sont révélés positifs au test. (ii) Une approche en microcosme a été employée pour comprendre le rôle respectif des champignons et des bactéries dans la voie oxalate-carbonate. Champignons et bactéries sont la composante biologique du système oxalate-carbonate et sont donc ajoutés au sol des microcosmes selon les séries : (A) champignons seuls, (B) bactéries seules et (C) champignons et bactéries ensemble. En prenant en considération la variable oxalate et en opérant une approche factorielle en accord avec la théorie de la hiérarchie, les séries additionnelles suivantes ont été étudiées : (D) champignon plus oxalate, (E) bactéries plus oxalate et (F) champignon et bactéries ensemble plus oxalate. En présence d'oxalate de calcium les résultats des quantités de champignon vivant (évaluées par dosage de l'ergostérol) au cours du temps montrent que la rapidité de colonisation des microcosmes est accélérée de trois semaines ; c'est une fertilisation du sol opérée par l'oxalate qui favorise la biomasse vivante du champignon. Les champignons à leur tour survivent sur le long terme (3 mois) seulement en présence des bactéries sinon leur biomasse vivante reste faible. Par conséquent, c'est l'interaction entre champignons et bactéries sous forme de coexistence qui permet leur survie réciproque. Les champignons interagissent en synergie avec les bactéries dans le sol du microcosme mais les bactéries, moteur de l'alcalinisation du sol, survivent plus longtemps et atteignent des populations plus élevées seulement quand le champignon et l'oxalate sont présents. En plus des résultats sur les quantités de champignons et de bactéries, le suivi du pH pour toutes les séries des microcosmes examinées laisse apparaître une propriété émergente. Pour l'unique série (F), il se produit une alcalinisation du milieu de deux unités et demie de pH. L'hypothèse de base selon laquelle l'oxalate est responsable d'une favorisation de la voie oxalate-carbonate a été vérifiée. Le rôle des champignons est de favoriser les populations bactériennes sous l'action fertilisante de l'oxalate. (iii) L'origine du calcium, une des questions à résoudre les plus importantes afin que la voie oxalate-carbonate agisse comme un puits de carbone, a été abordée théoriquement, par une littérature élargie, et expérimentalement en boîte de Pétri, en utilisant la colonisation fongique. Le rôle des champignons est de transloquer et libérer du calcium activement et passivement dans le sol.

The adaptive function of melanin-based coloration in the tawny owl (Strix aluco) ; the proximate role of the melanocortin system

Colour polymorphism is common in wild population. One of the main questioning of evolutionary biologists is to understand how different colour variants could have evolved and be maintained in fluctuating environments, a selective process that forces individuals to constantly adapt their strategies in order to survive. This issue is particularly true for traits that are genetically inherited. Natural selection erodes genotypes with lowest fitness (less adapted), reducing in turn global genetic variation within population. In this context, the study of the evolution and maintenance of melanin- based coloration is relevant since inter-individual variation in the deposition of these pigments is common in animal and plant kingdoms and is under strong genetic control. In this thesis, I focus on the specific case of the tawny owl (Strix aluco), a species displaying continuous variation in reddish pheomelanin-based coloration. Interestingly, empirical studies highlighted covariations between melanin-based coloration and important behavioural, physiological and life history traits. Recently, a genetic model pointed out the melanocortin system and their pleiotropic effects as a potential regulator of these covariations. Accordingly, this PhD thesis further investigates colour-specific behavioural, physiological, or life history strategies, while examining the proximate mechanisms underlying these reaction norms. We found that differently coloured tawny owls differently resolve fundamental trade-off between offspring number and quality (Chapter 1), light melanic individuals producing many low- quality offspring and dark, melanic ones producing few high-quality offspring. These reproductive strategies are likely to induce alternative physiological constraints. Indeed, we demonstrated that light melanic individuals produced higher levels of reactive oxygen species (ROS, Chapter 2), but also expressed higher levels of antioxidant (GSH, Chapters 2 & 3). Interestingly, we showed that light melanic breeding females could modulate their POMC prohormone levels according to the environmental conditions, while dark reddish ones produced constant levels of this prohormone {Chapter 4). Finally, we highlighted colour-specific patterns of prohormone convertase 1 (PCI) gene expression (Chapter 5), an enzyme responsible for POMC prohormone processing to ACTH and a- MSH, for instance. Altogether, these results provide strong evidence of colour-specific strategies, light and melanic tawny owls better coping with stressful and relaxed environments, respectively. Variation in melanin-based coloration is likely to be maintained by the heterogeneity of our study area and strong environmental stochasticity within and between years, these process favouring differently coloured tawny owls at different periods of time. From a proximate point of view, this PhD thesis supports the hypothesis that covariations between phenotypic traits and melanin-based coloration stems from the melanocortin system, especially the fundamental role of POMC gene expression and its processing to melanocortin peptides. - Le polymorphisme de couleur est une variation phénotypique très fréquente dans la nature. En biologie évolutive, une des problématiques clés est donc de comprendre comment différent morphes de couleur peuvent être apparus et maintenus au cours du temps dans des environnements aussi variables que les nôtres, surtout que ces fluctuations forcent ces morphes à s'adapter constamment pour assurer leur survie. Cette thématique est particulièrement réelle lorsque les variations phénotypiques sont héréditaires et donc sous forte influence génétique. La sélection naturelle a en effet le pouvoir d'éroder rapidement la variation génétique en éliminant les génotypes mal adaptés. Dans ce sens, l'étude de l'évolution, et de la maintenance de la coloration mélanique est donc tout à fait pertinente car la variation de coloration entre individus est très répandue à travers les règnes animal et végétal et sous forte influence génétique. Dans cette thèse, je me suis concentré sur le cas spécifique de la chouette hulotte (Strix aluco), une espèce présentant une variation continue dans la déposition de pigments pheomélaniques roux. De précédentes études ont déjà montré que cette variation de coloration était associée avec des variations de traits comportementaux, physiologiques ou d'histoire de vie. Récemment, une étude a souligné l'importance du système des mélanocortines et de leurs effets pléiotropes dans la régulation de ces covariations. En conséquence, cette thèse de doctoral a pour but d'étudier un peu plus les stratégies comportementales, physiologiques ou d'histoire de vie spécifiques à chaque morphe de couleur, tout en examinant un peu plus les mécanismes proximaux potentiellement à la base de ces normes de réactions. Nous constatons tout d'abord que les morphes de couleurs étaient associés à différentes stratégies dans la résolution de compromis telle que la production de beaucoup de jeunes ou des jeunes de qualité (Chapitre 1). Les morphes gris (dit peu mélaniques) ont tendance à produire beaucoup de jeunes mains de moindre qualité, alors que les morphes roux (dit fortement mélaniques) produisent moins de jeunes mais de meilleure qualité. Ces stratégies sont susceptibles alors d'induire certaines contraintes physiologiques. Par exemple, nous montrons que les morphes gris produisent plus de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS, Chapitre 2), mais aussi plus d'antioxydants (GSH, Chapitres 2 & 3). Nous montrons ensuite que les femelles grises ont une plus grande capacité à moduler leur niveau de POMC prohormone dans le sang en fonction des conditions environnementales, alors que les femelles rousses gardent un niveau constant (Chapitre 4). Finalement, nous démontrons que les patterns d'expression du gène codant pour la prohormone convertase 1 varient chez des jeunes issus de parents gris ou roux (Chapitre 5). Ceci est particulièrement intéressant car cette enzyme permet de scinder la POMC prohormone en plusieurs peptides importants tels que l'ACTH ou l'a-MSH. En conclusion, ces résultats démontrent qu'il y a bel et bien des stratégies évolutives différentes entre les morphes de couleurs, les chouettes hulottes grises et rousses étant respectivement plus adaptés à des environnements stressants ou favorables. L'hétérogénéité de notre zone d'étude et la stochasticité environnementale qui caractérise ses habitats pourraient donc agir comme une source de sélection temporelle, laquelle favoriserait les différents morphes de couleurs à diverses périodes. D'un point de vue plus proximale maintenant, cette thèse de doctorat soutient l'hypothèse que les covariations observées entre la coloration mélanique et des traits phénotypiques importants sont modulées par les effets pléiotropes du système des mélanocortines, et met en avant le rôle prépondérant que pourrait jouer l'expression du gène POMC et sa post traduction en mélanocortines.

L'angio-CT post-mortem: un nouvel outil diagnostique

L'angio-CT post-mortem est un examen peu invasif qui permet d'investiguer le système vasculaire d'une manière détaillée impossible à obtenir lors d'une autopsie conventionnelle. Le groupe de recherche lausannois sur l'angio-CT a développé un protocole standardisé pour une technique appelée «angio-CT post-mortem en phases multiples», qui permet de réaliser des angio-CT de manière simple et d'améliorer le diagnostic radiologique. De plus, de nouveaux équipements incluant une pompe à perfusion, du matériel prêt à l'emploi et un produit de contraste spécifique ont été développés. L'angio-CT permet la détection d'une source d'hémorragie, d'une malformation du système vasculaire, de lésions d'artériosclérose, d'une occlusion d'un vaisseau et la visualisation de l'anatomie vasculaire.

L'hôpital public sous l'ère de la nouvelle gouvernance : une "camisole de force" pour le personnel soignant ?

Les réformes du système de la santé, introduisant des objectifs d'efficience et de rentabilité inspirés de la doctrine de la Nouvelle gouvernance publique (NGOP), impactent l'organisation des hôpitaux et ses acteurs. Cette recherche étudie les conséquences de l'implémentation de la logique et des outils managériaux sur la profession d'infirmière en termes de contenu du travail et d'identité professionnelle. La reconfiguration des tâches au sein des structures hospitalières semble réduire l'autonomie de ces acteurs de terrain et affecter le sens que les infirmières donnent à leur travail. Par le prisme du pouvoir discrétionnaire, l'étude montre comment le personnel infirmier, principalement selon ses critères moraux, use de stratégies d'ajustement pour faire coïncider ses valeurs avec l'environnement professionnel. Toutefois, la disjonction entre les impératifs managériaux et les valeurs des infirmières engendre de la souffrance au travail. Dans une approche psychosociale, ce mémoire relie le mal-être des infirmières au concept de la « qualité empêchée » qui dévoile le mécanisme par lequel l'action des infirmières est privée en partie de son contenu.

Rationnement des soins: qu'implique l'arrêt «Myozyme»?

Cet arrêt conclut qu’un médicament hors liste des spécialités n’apportant pas un bénéfice thérapeutique élevé, et présentant un coût jugé disproportionné ne doit pas être pris en charge par l’assurance-maladie. Il est discutable à bien des égards: sur le plan de l’évaluation médico-économique utilisée comme sur les incertitudes quant à sa portée et à ses implications pour l’ensemble des acteurs du système de santé.

Disposition à payer des contribuables pour la gratuité de l'éducation

Cette contribution développe la notion de disposition à payer pour l'éducation tant sous un angle théorique que dans une perspective empirique. Sous un angle théorique, elle démontre la nécessité d'une intervention étatique pour garantir que le volume d'éducation « consommé » soit efficace et équitable. Cela débouche sur la gratuité de l'éducation avec comme corollaire un financement quasi intégral via la fiscalité. La perspective empirique de cette contribution propose et utilise une approche originale afin d'estimer les préférences des citoyens pour les prestations d'éducation par comparaison avec les autres prestations offertes par l'Etat. Une expérimentation a permis d'approximer la part du budget public que les individus souhaiteraient voir allouée à l'enseignement et à la formation. Cette part semble stable, voire se renforce légèrement entre la fin des années 1990 et les années 2000 pour atteindre près de 21% du budget. Il semble donc que les difficultés récemment médiatisées du système éducatif helvétique à répondre aux attentes élevées placées en lui n'aient pas -ou pas encore- érodé la disposition à allouer l'impôt à l'éducation.

Le régime des plans d'affectation : en particulier le plan de quartier

Le plan de quartier (Gestaltungsplan) occupe une position singulière parmi les plans d'affectation. Il oscille en effet entre deux régimes distincts : celui du plan de zones, dont il partage la nature juridique, et celui de l'autorisation de construire, que son caractère détaillé préfigure dans une large mesure. Bien qu'il soit couramment utilisé par les communes, le plan de quartier pose de nombreuses questions et mérite à ce titre de faire l'objet d'une étude approfondie. C'est ce à quoi s'emploie le présent ouvrage. Il aborde les questions pratiques et théoriques qui se posent en relation avec cet instrument : sa nature juridique, son contenu, la procédure à laquelle il est soumis et les diverses limites qui s'imposent à son auteur, de même que la forme et la licéité des arrangements qui peuvent être conclus à l'occasion de son adoption. La réflexion développée en lien avec le plan de quartier est également élargie aux autres plans d'affectation afin de proposer une vision globale, cohérente et critique du système de planification et des possibilités d'évolution qu'il recèle. Cet ouvrage a pour vocation de satisfaire le profane dans une même mesure que le spécialiste. Il présente des informations générales sur le fonctionnement de l'aménagement du territoire au sens large et les principes qui le sous-tendent, mais contient aussi des développements plus pointus destinés au lecteur désireux de pénétrer au coeur de la problématique. La systématique suivie permet d'accéder aisément aux divers sujets traités, présentés dans un ordre logique et chronologique - les chemins de traverse que dessinent les renvois proposant pour leur part un itinéraire intellectuel alternatif. Quant aux nombreuses références doctrinales et jurisprudentielles, elles permettent à chacun de prolonger la réflexion sur l'une ou l'autre des thématiques abordées.

Role of the epithelial sodium channel (ENaC) and its regulator CAP1/Prss8 in colon

Dans les cellules épithéliales sensibles à l'aldostérone, le canal sodique épithélial (ENaC) joue un rôle critique dans le contrôle de l'équilibre sodique, le volume sanguin, et la pression sanguine. Le rôle d'ENaC est bien caractérisé dans le rein et les poumons, cependant le rôle d'ENaC et son régulateur positif la protéase activatrice de canal 1 (CAP1 /Prss8) sur le transport sodique dans le côlon reste en grande partie inconnu. Nous avons étudié l'importance d'ENaC et de CAPMPrss8 dans le côlon. Les souris déficientes pour la sous- unité aENaC (souris ScnnlaKO) dans les cellules superficielles intestinales étaient viables et ne montraient pas de létalité embryonnaire ou postnatale. Sous diète normale (RS) ou pauvre en sodium (LS), la différence de potentiel rectale sensible à l'amiloride (APDamii) était drastiquement diminuée et son rythme circadien atténué. Sous diète normale (RS) ou diète riche en sodium (HS) ou fort chargement de potassium, le sodium et le potassium plasmatique et urinaire n'étaient pas significativement changé. Cependant, sous LS, les souris Senni aK0 perdaient des quantités significativement augmentées de sodium dans leurs fèces, accompagnées par de très hauts taux d'aldostérone plasmatique et une rétention urinaire en sodium augmentée. Les souris déficientes en CAPl/PmS (Prss8K0) dans les cellules superficielles intestinales étaient viables et ne montraient pas de létalité embryonnaire ou postnatale. Sous diètes RS et HS cependant, les souris Prss8KO montraient une diminution significative du APDamil dans l'après-midi, mais le rythme circadien était maintenu. Sous diète LS, la perte de sodium par les fèces était accompagnée par des niveaux d'aldostérone plasmatiques plus élevés. Par conséquent, nous avons identifié la protéase activatrice de canal CAP 1 IPrss8 comme un régulateur important d'ENaC dans le côlon in vivo. De plus, nous étudions l'importance d'ENaC et de CAPIIPrss8 dans les conditions pathologiques comme les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Le résultat préliminaire out montre qu'une déficience d'Prss8 mènait à la détérioration de la colite induite par le DSS comparé aux modèles contrôles respectifs. En résumé, l'étude a montré que sous restriction de sel, l'absence d'ENaC dans Pépithélium de surface du côlon était compensée par 1'activation du système rénine-angiotensine- aldostérone (RAAS) dans le rein. Ceci a mené à un pseudohypoaldostéronisme de type I spécifique au côlon avec résistance aux minéralocorticoïdes sans signe d'altération de rétention de potassium. - In aldosterone-responsive epithelial cells of kidney and colon, the epithelial sodium channel (ENaC) plays a critical role in the control of sodium balance, blood volume, and blood pressure. The role of ENaC is well characterized in kidney and lung, whereas role of ENaC and its positive regulator channel-activating protease 1 (CAPl/PrasS) on sodium transport in colon is largely unknown. We have investigated the importance of ENaC and CAPI/Prss8 in colon for sodium and potassium balance. Mice lacking the aENaC subunit (Scnnla mice) in intestinal superficial cells were viable and did not show any fetal or perinatal lethality. Under regular (RS) or low salt (LS) diet, the amiloride sensitive rectal potential difference (APDamii) was drastically decreased and its circadian rhythm blunted. Under regular salt (RS) or high salt (HS) diets or under potassium loading, plasma and urinary sodium and potassium were not significantly changed. However, upon LS, the ScnnlaK0 mice lost significant amounts of sodium in their feces, accompanied by very high plasma aldosterone and increased urinary sodium retention. Mice lacking the CAPl/PrasS (Prss8K0) in intestinal superficial cells were viable and did not show any fetal or perinatal lethality. Upon RS and HS diets, however, Prss8K0 exhibited a significantly reduced APDamii in the afternoon, but its circadian rhythm was maintained. Upon LS diet, sodium loss through feces was accompanied by higher plasma aldosterone levels. Thus, we have identified the channel-activating protease CAPl/Prss8 as an important in vivo regulator of ENaC in colon. Furthermore, we are investigating the importance of ENaC and CAPI/Prss8 in pathological conditions like inflammatory bowel disease (IBD). Preliminary data showed that PmS-deficiency led to worsening of DSS-induced colitis as compared to their respective controls. Overall, the present study has shown that under salt restriction, the absence of ENaC in colonic surface epithelium was compensated by the activation of renin-angiotensin- aldosterone (RAAS) system in the kidney. This led to a colon specific pseudohypoaldosteroni sm type 1 with mineralocorticoid resistance without evidence of impaired potassium retention.

Characterization of cytoplasmic antiviral signaling pathways

Summary Multicellular organisms have evolved the immune system to protect from pathogen such as viruses, bacteria, fungi or parasites. Detection of invading pathogens by the host innate immune system is crucial for mounting protective responses and depends on the recognition of microbial components by specific receptors. The results presented in this manuscript focus on the signaling pathways involved in the detection of viral infection by the sensing of viral nucleic acids. First, we describe a new regulatory mechanism controlling RNA-sensing antiviral pathways. Our results indicate that TRIF and Cardif, the crucial adaptor proteins for endosomal and cytoplasmic RNA detection signaling pathway, are processed and inactivated by caspases. The second aspect investigated here involves a signaling pathway triggered upon cytosolic DNA sensing. The interferon inducible protein DAI was recently described as a DNA sensor able to induce the activation of IRFs and NF-κΒ transcription factors leading to type I interferon production. Here we identify two RIP homotypic interaction motifs (RHIMs) in DAI and demonstrate that they mediate the recruitment of RIP1 and RIP3 and the subsequent NF-κΒ activation. Moreover, we observed that the mouse cytomegalovirus RHIM- containing protein M45 has the potential to block this signaling cascade by interfering with the formation of the DAI-RIP1/3 signaling complex. Finally, we report the generation and the initial characterization of NLRX1-deficient mice. NLRX1 is a member of the NOD-like receptor family localized to the mitochondria. The function of NLRX1 is still controversial: one study proposed that NLRX1 acts as an inhibitor of the RIG-like receptor (RLR) antiviral pathway by binding the adaptor protein Cardif, whereas another report implicated NLRX1 in the generation of reactive oxygen species (ROS) and the amplification of NF-κΒ and JNK triggered by TNF-α, poly(I:C) or Shigella infection. Collectively, our results indicate that NLRX1-deficiency does not affect RLR signaling nor TNF-α induced responses. Proteomics analysis identified UQCRC2, a subunit of the complex III of the mitochondrial respiratory chain, as a NLRX1 binding partner. This observation might reveal a possible functional link between NLRX1 and mitochondrial respiration and/or ROS generation. Résumé Au cours de l'évolution, les organismes multicellulaires ont développé le système immunitaire afin de se protéger contre les pathogènes. Une étape cruciale pour le déclenchement des réponses protectrices est la reconnaissance par les cellules du système immunitaire de molécules propres aux microbes grâce à des récepteurs spécifiques. Les résultats présentés dans cette thèse décrivent des nouveaux aspects concernant les voies de signalisation impliquées dans la détection des virus. Le premier projet décrit un mécanisme de régulation des voies activées par la détection d'ARN virale. Nos résultats montrent que TRIF et Cardif, des protéines adaptatrices des voies déclenchées par la reconnaissance de ces acides nucléiques au niveau des endosomes et du cytoplasme, sont clivés et inactivés par les caspases. Le projet suivant de notre recherche concerne une voie de signalisation activée par la détection d'ADN au niveau du cytoplasme. La protéine DAI a été récemment décrite comme un senseur pour cet ADN capable d'activer les facteurs de transcription IRF et NF-κΒ et d'induire ainsi la production des interférons de type I. Ici on démontre que DAI interagit avec RIP1 et RIP3 par le biais de domaines appelés RHIM et que ce complexe est responsable de l'activation de NF-κΒ. On a aussi identifié une protéine du cytomégalovirus de la souris, M45, qui contient ce même domaine et on a pu démontrer qu'elle a la capacité d'interférer avec la formation du complexe entre DAI et RIP1/RIP3 bloquant ainsi l'activation de NF-κΒ. Enfin on décrit ici la génération de souris déficientes pour le gène qui code pour la protéine NLRX1. Cette protéine fait partie de la famille des récepteurs NOD et est localisée dans la mitochondrie. Une étude a suggéré que NLRX1 agit comme un inhibiteur des voies antivirales activées par les récepteurs du type RIG-I (RLR) en interagissant avec la protéine adaptatrice Cardif. Une autre étude propose par contre que NLRX1 participe à la production des dérivés réactifs de l'oxygène et contribue ainsi à augmenter l'activation de NF- κΒ et JNK induite par le TNF-α ou le poly(I:C). Nos résultats montrent que l'absence de NLRX1 ne modifie ni la voie de signalisation RLR ni les réponses induites par le TNF-α. Des analyses ultérieures ont permis d'identifier comme partenaire d'interaction de NLRX1 la protéine UQCRC2, une des sous-unités qui composent le complexe III de la chaîne respiratoire mitochondriale. Cette observation pourrait indiquer un lien fonctionnel entre NLRX1 et la respiration mitochondriale ou la production des dérivés réactifs de l'oxygène au niveau de cette organelle.

Protection from lethal Gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4

Rapport de synthèse : L'immunité innée regroupe les mécanismes moléculaires et cellulaires formant la première ligne de défense contre les infections microbiennes. La détection des micro-organismes pathogènes est assurée par des cellules sentinelles (cellules dendritiques et macrophages) qui jouent un rôle fondamental dans l'initiation des mécanismes de défense de l'hôte. Au contact de produits microbiens, ces cellules produisent un large échantillonnage de molécules, dont des cytokines, impliquées dans le développement de la réponse inflammatoire. La régulation de cette réponse relève d'un équilibre délicat, son insuffisance tant que son excès pouvant compromettre le devenir des patients infectés. La sepsis sévère et le choc septique représentent les formes les plus sévères d'infection, et leur mortalité demeure élevée (25 à 30% pour la sepsis sévère et 50 à 60% pour le choc septique). De plus, l'incidence de la sepsis tend à augmenter, atteignant en 2000 plus de 240 cas pour 100'000 personnes en Grande-Bretagne. La sepsis est caractérisée dans sa phase aiguë par une réponse inflammatoire exubérante. La plupart des thérapies visant à la bloquer ont toutefois montré des bénéfices incertains lors de leur application clinique. Il est donc impératif d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les "Toll-like receptors" (TLRs) sont une famille de récepteurs qui jouent un rôle fondamental dans la détection des micro-organismes par les cellules du système immunitaire inné. Parmi eux, TLR4 est indispensable à la reconnaissance du lipopolysaccharide (LPS) des bactéries Gram-négatives. L'interaction entre TLR4 et le LPS représentant un élément précoce de la réponse de l'hôte à l'infection, nous avons émit l'hypothèse que TLR4 pourrait représenter une cible de choix en vue du développement de nouvelles thérapies contre la sepsis. Dans l'objectif de valider ce concept, nous avons, dans un premier temps, démontré que des souris génétiquement déficientes en TLR4 étaient totalement résistantes au choc septique induit par Escherichia coli (E. coli), une bactérie Gram-négative fréquemment responsable de sepsis. Forts de cette observation, nous avons développé une molécule recombinante composée du domaine extracellulaire de TLR4 fusionné à la partie IgGi-Fc. Cette molécule soluble, qui inhibait la réponse des macrophages au LPS in vitro, a été utilisée pour générer des anticorps anti-TLR4 chez le lapin. La spécificité et l'efficacité de ces anticorps ont été prouvées en démontrant que les anti-TLR4 bloquaient les signaux d'activation intracellulaire et la production de TNF et d'IL-6 en réponse au LPS et aux bactéries Gram-négatives in vitro et in vivo. Enfin, l'efficacité des ces anticorps a été testée dans des modèles de sepsis chez la souris. Ainsi, l'injection prophylactique (-lh) ou thérapeutique (+3h) d'anticorps anti-TLR4 réduisait la production de TNF et protégeait les animaux de la mort. De manière spectaculaire, ces anticorps réduisaient également la production de TNF et protégeaient de la sepsis à E. coli lorsqu'ils étaient administrés de manière prophylactique (-4h) et thérapeutique, jusqu'à 13 heures après l'initiation de l'infection. Ces résultats indiquent donc qu'il est possible de bloquer le développement de la réponse inflammatoire et de protéger du choc septique à bactéries Gram-négatives en utilisant des thérapies ciblant TLR4. Par ailleurs, ils suggèrent qu'une fenêtre d'opportunité de plusieurs heures pourrait être mise à profit pour initier un traitement chez les patients septiques. Ces résultats devraient encourager la poursuite des essais cliniques en cours qui visent à tester l'efficacité de thérapies dirigées contre TLR4 comme traitement complémentaire de la sepsis.

Clinical proteomics : a focus on transformed human T and B lymphocytes

Résumé large public La protéomique clinique est une discipline qui vise l'étude des protéines dans un but diagnostique ou thérapeutique. Nous avons utilisé cette approche pour étudier les lymphocytes T «tueurs » ou cytotoxiques qui font partie des globules blancs du système sanguin et agissent dans la lutte contre les infections et les tumeurs. Ces cellules sont impliquées dans l'immunothérapie cellulaire qui se fonde sur la capacité naturelle des ces lymphocytes à repérer les cellules tumorales et à les détruire. L'introduction du gène de la télomérase dans les lymphocytes T résulte en une prolongation de leur longévité, ce qui en ferait des candidats intéressants pour l'immunothérapie cellulaire. Il subsiste cependant des doutes quant aux conséquences de l'utilisation de ces lymphocytes «immortalisés ». Pour répondre à cette question, nous avons comparé le profile protéique de lymphocytes T cytotoxiques «jeunes » et vieux » avec celui des lymphocytes «immortalisés ». Nous avons trouvé que ces derniers présentent une double face et partagent à la fois les caractéristiques de la jeunesse et de la vieillesse. Dans une seconde étude de protéomique clinique, nous nous sommes penchés sur les lymphocytes B «immortalisés » cette fois-ci non pas avec la télomérase, mais avec le virus d'Epstein-Barr. Ces derniers sont utilisés comme modèle dans l'étude de la leucodystrophie, une maladie génétique rare qui affecte le cerveau. Notre but est d'identifier des marqueurs biologiques potentiels qui pourraient aider le diagnostic et le traitement de cette maladie neurodégénérative. Nous avons pour ce faire comparé les profiles protéiques des lymphocytes B «immortalisés » provenant d'individus sains et malades. Malheureusement, notre analyse n'a pas révélé de différences notoires entre ces deux classes de lymphocytes. Ceci nous permet toutefois de conclure que la maladie n'affecte pas la synthèse des protéines de manière prépondérante dans ces cellules sanguines. En résumé, le travail présenté dans cette thèse montre à la fois le potentiel et les limites de l'analyse des protéines lymphocytaires, dans différentes situations biologiques. Résumé La protéomique clinique ouvre la porte vers de multiples horizons relatifs au traitement de diverses maladies. Ce domaine particulier alliant la protéomique à la médecine, implique l'intervention de la biologie moléculaire et cellulaire. Dans notre étude, nous nous sommes d'abord intéressés aux lymphocytes T CD8+ cytotoxiques dans le contexte de l'immunothérapie adoptive. Le fondement de cette thérapie repose sur la capacité naturelle de ces lymphocytes à reconnaître les cellules tumorales et à les détruire chez les patients atteints de cancer. L'introduction du gène de la transcriptase réverse de la télomérase (hTERT) dans les lymphocytes T humains permet de rallonger leur durée de vie, sans toutefois induire d'altérations liées à la transformation. Cependant, des incertitudes subsistent quant à la ressemblance physiologique et biochimique entre ces cellules surexprirnant la télomérase et les cellules normales. Afin de répondre à cette question, nous avons comparé l'expression des protéines de lymphocytes humains T CD8+ «jeunes » et «vieux »avec celle de lymphocytes transduits avec hTERT. Nous avons trouvé que les lymphocytes T surexprimant la télomérase ont un profile protéique intermédiaire, avec certaines expressions protéiques similaires aux jeunes cellules T et d'autres se rapprochant des cellules vieilles. Dans la seconde partie de notre étude, nous nous sommes intéressés aux lymphocytes B transformés avec le virus d'Epstein-Barr provenant de patients atteints d'une maladie génétique rare du cerveau, la leucodystrophie. Dans cette maladie, des mutations dans le facteur de transcription eIF2B, impliqué dans la synthèse protéique, ont été trouvées. Afin d'analyser les conséquences de ces mutations et de trouver des biomarqueurs spécifiques à cette maladie, nous avons effectué une analyse protéomique des lymphoblastes provenant de malades et d'individus sains. Nous avons trouvé que les mutations dans le complexe ubiquitaire eIF2B n'affectent pas de manière significative l'expression des protéines des lymphoblastes mutés. En conclusion, notre travail illustre le potentiel et les limitations des technologies protéomiques utilisées pour disséquer l'implication des protéines dans différentes situations biologiques. Summary Clinical proteomics opens the door to multiple applications related to the treatment of diseases. This particular field is at the crossroad of proteomics and medicine and involves tools from cellular and molecular biology. We focused first our investigations on cytotoxic T cells in the context of adoptive immunotherapy, which is an interesting and evolving field. The basis of this therapy relies on the natural capacity of cytotoxic CD8+ T lymphocytes in recognizing tumor cells and destroying them in cancer patients. As their number is reduced, the idea would be to use transformed T lymphocytes with extended life span. Overexpression of telomerase into human T lymphocytes results in the extension of their replicative life span, but it still remains unclear whether these cells are physiologically indistinguishable from normal ones. To address this question, we compared the proteome of young and aged CD8+ T lymphocytes with that of T cells transduced with hTERT and found that the latter cells displayed an intermediate protein pattern, sharing similar protein expression with young, but also with aged T cells. We were then interested in studying Epstein-Barr virus transformed B lymphocytes in the context of a rare human brain genetic disorder called leukodystrophy. In this disease, mutations in the ubiquitous factor eIF2B involved in protein synthesis and its regulation have been reported. In order to analyze the functional consequences of the mutations and to find out specific biomarkers of eIF2B-related disorders, proteomic and peptidomic studies were carried out on lymphoblasts from eIF2Bmutated patients versus healthy patients. Following two-dimensional gel electrophoresis and mass fingerprints, mutations in the eIF2B complex did not appear to significantly affect the proteome of the mutated lymphoblasts extracts. To conclude, our work emphasizes the potentials and the limitations of the proteomic technologies used to analyze the role of lymphocyte proteins in different biological situations.

Comparative assessement of intimal hyperplasia development after 14 days in two different experimental settings : tissue culture versus ex vivo continuous perfusion of human saphenous vein

Résumé de l'article : L'hyperplasie intimale est un processus de remodelage vasculaire ubiquitaire après une lésion, pouvant menacer la perméabilité de tout type de reconstruction vasculaire. Les mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de l'hyperplasie intimale ne sont que partiellement élucidés. Il est par conséquent nécessaire d'effectuer des recherches complémentaires afin d'en améliorer la compréhension et ainsi permettre l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques médicamenteuses. La culture de veines en milieu statique permet le développement de l'hyperplasie intimale. Ce modèle maintient la viabilité tissulaire, comme décrit précédemment dans d'autres études, mais empêche l'analyse des paramètres hémodynamiques. La mise au point d'un modèle de perfusion in vitro permettant la perfusion de segments vasculaires représente une approche expérimentale intégrant les différents facteurs hémodynamiques. Le système de perfusion (Ex Vivo Vein Support System) que nous avons élaboré conserve l'intégrité pariétale ainsi que les propriétés vasomotrices des veines pour une durée de 14 jours. Cette étude démontre que les deux modèles permettent le développement de l'hyperplasie intimale. Toutefois, les propriétés vasomotrices ainsi que l'influence des paramètres hémodynamiques ne peuvent être analysées que par l'utilisation du système de perfusion. Ce dernier a permis de perfuser des vaisseaux humains sans contamination bactérienne tout en maintenant l'intégrité cellulaire. Ce modèle de perfusion se rapproche plus des conditions hémodynamiques rencontrées in vivo que le modèle statique. Abstract : Background. Intimal hyperplasia (IH) is a vascular remodeling process which often leads to failure of arterial bypass or hemodialysis access. Experimental and clinical work have provided insight in IH development; however, further studies under precise con-trolled conditions are required to improve therapeutic strategies to inhibit IH development. Ex vivo perfusion of human vessel segments under standardized hemodynamic conditions may provide an adequate experimental approach for this purpose. Therefore, chronically perfused venous segments were studied and compared to traditional static culture procedures with regard to functional and histomorphologic characteristics as well as gene expression. Materials and methods. Static vein culture allowing high tissue viability was performed as previously described. Ex vivo vein support system (EVVSS) was performed using a vein support system consisting of an incubator with a perfusion chamber and a pump. EVVSS allows vessel perfusion under continuous flow while maintaining controlled hemodynamic conditions. Each human saphenous vein was divided in two parts, one cultured in a Pyrex dish and the other part perfused in EVVSS for 14 days. Testing of vasomotion, histomorphometry, expression of CD 31, Factor VIII, MIB 1, α-actin, and PAI-1 were determined before and after 14 days of either experimental conditions. Results, Human venous segments cultured under traditional or perfused conditions exhibited similar IH after 14 days as shown by histomorphometry. Smooth-muscle cell ( SMC) was preserved after chronic perfusion. Although integrity of both endothelial and smooth-muscle cells appears to be maintained in both culture conditions as confirmed by CD31, factor VIII and α-actin expression, a few smooth-muscle cells in the media stained positive for factor VIII. Cell-proliferation marker MIB-1 was also detected in the two settings and PAI-1 mRNA expression and activity increased significantly after 14 days of culture and perfusion. Conclusion. This study demonstrates the feasibility to chronically perfuse human vessels under sterile conditions with preservation of cellular integrity and vascular contractility. To gain insights into the mechanisms leading to IH, it will now be possible to study vascular remodeling not only under static conditions but also in hemodynamic environment mimicking as closely as possible the flow conditions encountered in reconstructive vascular surgery.