Involvement of microRNAs in the cytotoxic effects exerted by proinflammatory cytokines on pancreatic beta-cells.

OBJECTIVE: Pancreatic beta-cells exposed to proinflammatory cytokines display alterations in gene expression resulting in defective insulin secretion and apoptosis. MicroRNAs are small noncoding RNAs emerging as key regulators of gene expression. Here, we evaluated the contribution of microRNAs to cytokine-mediated beta-cell cytotoxicity. RESEARCH DESIGN AND METHODS: We used global microarray profiling and real-time PCR analysis to detect changes in microRNA expression in beta-cells exposed to cytokines and in islets of pre-diabetic NOD mice. We assessed the involvement of the microRNAs affected in cytokine-mediated beta-cell failure by modifying their expression in insulin-secreting MIN6 cells. RESULTS: We found that IL-1beta and TNF-alpha induce the expression of miR-21, miR-34a, and miR-146a both in MIN6 cells and human pancreatic islets. We further show an increase of these microRNAs in islets of NOD mice during development of pre-diabetic insulitis. Blocking miR-21, miR-34a, or miR-146a function using antisense molecules did not restore insulin-promoter activity but prevented the reduction in glucose-induced insulin secretion observed upon IL-1beta exposure. Moreover, anti-miR-34a and anti-miR-146a treatment protected MIN6 cells from cytokine-triggered cell death. CONCLUSIONS: Our data identify miR-21, miR-34a, and miR-146a as novel players in beta-cell failure elicited in vitro and in vivo by proinflammatory cytokines, notably during the development of peri-insulitis that precedes overt diabetes in NOD mice.

Seleção indireta para teor de 2-tridecanona em tomateiros segregantes e sua relação com a resistência à traça-do-tomateiro

Este trabalho teve como objetivo verificar a relação entre o teor de 2-tridecanona (2-TD) em materiais selecionados e o nível de resistência à traça-do-tomateiro (Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae)) em gerações avançadas de Lycopersicon spp. derivado de cruzamentos interespecíficos. Foi usada uma população de tomateiros segregantes (geração F4RC2) para 2-TD, uma metilcetona que confere resistência à traça-do-tomateiro. Genótipos foram selecionados e avaliados quanto à resistência do tipo não-preferência: três materiais com alto teor do aleloquímico 2-TD (HI1, HI2, HI3) e dois materiais com baixo teor (LO1, LO2), além das testemunhas. Após infestação controlada, foram avaliados: contagem do número de ovos postos, evolução da lesão nos folíolos, porcentagem de folíolos atacados, e índice geral de lesão causada pela traça. Plantas com alto teor de 2-TD (HI1 e HI3) tiveram uma baixa progressão das lesões ocasionadas pelo ataque de T. absoluta. A planta LO1 foi muito atacada pela praga, o mesmo não ocorrendo com a planta LO2, que foi infestada acidentalmente por ácaros do gênero Tetranychus, acarretando, provavelmente, uma disputa de nicho ecológico entre os dois artrópodes. Concluiu-se que altos teores de 2-TD estão ligados a mecanismos de resistência à traça-do-tomateiro do tipo não-preferência por oviposição e alimentação.

Crescimento radicular de plântulas de milho afetado pela resistência do solo à penetração

A resistência do solo à penetração é relacionada com a textura, compactação e umidade do solo. No presente trabalho se estudou o efeito da interação desses fatores sobre o crescimento de raízes de milho. Materiais de solo com 22, 30, 34, 41 e 48% de argila foram acondicionados em tubos de PVC de 10 cm com 4,3 cm de diâmetro interno, nas densidades globais de 1,07, 1,18, 1,36 e 1,53 g cm-3, em três tensões de água: -0,034, -0,106 e -0,640 MPa. Plântulas de milho foram cultivadas nos tubos por 48 horas. Quando a densidade do solo é baixa, a textura tem papel preponderante no crescimento radicular. Esse efeito é menor à medida que aumenta a densidade global. O aumento da resistência do solo à penetração causa diminuição no comprimento e número de raízes seminais adventícias; a raiz seminal primária mostra menor capacidade de penetração do que as raízes seminais adventícias. Resistências do solo à penetração da ordem de 1,3 MPa reduzem à metade o crescimento das raízes seminais adventícias do milho.

MMPBSA decomposition of the binding energy throughout a molecular dynamics simulation of Amyloid-Beta (Aß10-35) aggregation

Recent experiments with amyloid-beta (Aß) peptides indicate that the formation of toxic oligomers may be an important contribution to the onset of Alzheimer's disease. The toxicity of Aß oligomers depend on their structure, which is governed by assembly dynamics. However, a detailed knowledge of the structure of at the atomic level has not been achieved yet due to limitations of current experimental techniques. In this study, replica exchange molecular dynamics simulations are used to identify the expected diversity of dimer conformations of Aß10-35 monomers. The most representative dimer conformation has been used to track the dimer formation process between both monomers. The process has been characterized by means of the evolution of the decomposition of the binding free energy, which provides an energetic profile of the interaction. Dimers undergo a process of reorganization driven basically by inter-chain hydrophobic and hydrophilic interactions and also solvation/desolvation processes.

Crescimento e resistência à seca de leucena em solo de cerrado

Plantas envasadas de Leucaena leucocephala Lam. (De Witt) foram cultivadas em casa de vegetação sob 30% de sombreamento artificial, em solo de cerrado, com adição de 0, 750, 1.500 e 3.000 kg ha-1 de NPK (4-14-8). Aos 180 dias após a emergência (DAE), as plantas crescidas em solo sem adubo químico apresentaram os menores valores de taxa de crescimento relativo (TCR = 0,028 g g-1 dia-1), biomassa total (5,2 g), taxa assimilatória líquida (TAL= 4,2.10-4 g cm-2 dia-1), e não produziram nem flores nem vagens. Entre as plantas cultivadas em solo fertilizado, as que receberam maiores quantidades de adubo químico apresentaram maiores valores de biomassa total e área foliar, a partir de 90 DAE. Porém, os maiores valores de TCR (43,92.10-4 g g-1 dia-1) e TAL (15,01 g cm-2 dia-1) foram obtidos nas plantas crescidas em solo com 750 kg ha-1 de NPK. A presença de flores e vagens nas plantas que receberam 1.500 e 3.000 kg ha-1 de NPK ocorreu a partir dos 120 DAE, e aos 150 DAE se iniciou o processo de abscisão foliar nos vegetais crescidos em todos os tratamentos, com conseqüente redução da área foliar, TAL e TCR. Na presença de estresse hídrico simulado, as plantas com 90 DAE mostraram-se mais resistentes que as de 30 dias. Porém, nos dois casos, as plantas mais tolerantes à dessecação foram as crescidas em solo com maiores teores de NPK, e um ajuste osmótico auxiliou as plantas a sobreviverem durante o período da seca.

EFEITO DE TRICOMAS, ALELOQUÍMICOS E NUTRIENTES NA RESISTÊNCIA DE LYCOPERSICON HIRSUTUM À TRAÇA-DO-TOMATEIRO

Estudos foram conduzidos com o objetivo de verificar o efeito de tricomas, aleloquímicos e nutrientes nas folhas de partes do dossel das plantas na resistência de Lycopersicon hirsutum à traça- do-tomateiro, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Foram quantificados os teores de 2-tridecanona (2-TD), 2-undecanona (2-UD), N, P, K, Ca e Mg, densidade e tipos de tricomas e tamanho das folhas nos terços apical, mediano e basal do dossel de plantas de L. hirsutum e de L. esculentum e estudaram- se os efeitos destes fatores sobre características biológicas de T. absoluta. Observou-se elevação no teor de 2-TD da base para o ápice do dossel. Não se detectou diferença significativa quanto ao número de ovos de T. absoluta ao longo do dossel de L. hirsutum, constatando-se em L. esculentum maior oviposição nos terços apical e mediano do que no basal. As folhas do terço apical de L. hirsutum apresentaram maior efeito deletério sobre as larvas de traça.

Avaliação de linhagens, híbridos F1 e cultivares de pimentão quanto à resistência a Meloidogyne spp.

Com o objetivo de avaliar híbridos F1 de pimentão, juntamente com suas linhagens progenitoras e cultivares, quanto à resistência a Meloidogyne incognita (raças 1, 2, 3 e 4) e a M. javanica, foi instalado um experimento em casa de vegetação nas dependências da Pioneer Sementes Ltda, em Ijaci, MG. Foi utilizado o delineamento de blocos casualizados, em esquema de parcela subdividida, com cinco parcelas (compostas pelas quatro raças de M. incognita e mais a espécie M. javanica) e 48 subparcelas (compostas por 47 genótipos de pimentão e mais uma cultivar de tomate (Ângela Gigante I-5100), usada como testemunha padrão). Foram usadas cinco repetições e oito plantas em cada subparcela. A inoculação foi feita na concentração de 60 ovos/mL de substrato à base de vermiculita e casca de Pinus sp. (50%) e casca de arroz carbonizada (50%). Sessenta dias após a inoculação, procedeu-se às avaliações. Todas as cultivares e linhagens-padrão (Linha 004 e Linha 006) mostraram-se suscetíveis às raças 1, 2, 3 e 4 de M. incognita. Todos os genótipos de pimentão foram resistentes a M. javanica. Todas as linhagens experimentais mostraram-se resistentes às quatro raças de M. incognita; o mesmo ocorreu com a maioria dos híbridos F1 experimentais, apesar de o grau de resistência dos híbridos F1, em geral, ter sido inferior ao das respectivas linhagens. Os resultados indicaram que é viável a utilização de híbridos F1 entre linhagens resistentes vs. linhagens suscetíveis para fins de controle dos nematóides M. incognita e M. javanica, via resistência varietal.

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor beta/delta in the Brain: Facts and Hypothesis.

peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are nuclear receptors acting as lipid sensors. Besides its metabolic activity in peripheral organs, the PPAR beta/delta isotype is highly expressed in the brain and its deletion in mice induces a brain developmental defect. Nevertheless, exploration of PPARbeta action in the central nervous system remains sketchy. The lipid content alteration observed in PPARbeta null brains and the positive action of PPARbeta agonists on oligodendrocyte differentiation, a process characterized by lipid accumulation, suggest that PPARbeta acts on the fatty acids and/or cholesterol metabolisms in the brain. PPARbeta could also regulate central inflammation and antioxidant mechanisms in the damaged brain. Even if not fully understood, the neuroprotective effect of PPARbeta agonists highlights their potential benefit to treat various acute or chronic neurological disorders. In this perspective, we need to better understand the basic function of PPARbeta in the brain. This review proposes different leads for future researches.

Catechol-binding serines of beta(2)-adrenergic receptors control the equilibrium between active and inactive receptor states.

The binding free energy for the interaction between serines 204 and 207 of the fifth transmembrane helix of the beta(2)-adrenergic receptor (beta(2)-AR) and catecholic hydroxyl (OH) groups of adrenergic agonists was analyzed using double mutant cycles. Binding affinities for catecholic and noncatecholic agonists were measured in wild-type and mutant receptors, carrying alanine replacement of the two serines (S204A, S207A beta(2)-AR), a constitutive activating mutation, or both. The free energy coupling between the losses of binding energy attributable to OH deletion from the ligand and from the receptor indicates a strong interaction (nonadditivity) as expected for a direct binding between the two sets of groups. However, we also measured a significant interaction between the deletion of OH groups from the receptor and the constitutive activating mutation. This suggests that a fraction of the decrease in agonist affinity caused by serine mutagenesis may involve a shift in the conformational equilibrium of the receptor toward the inactive state. Direct measurements using a transient transfection assay confirm this prediction. The constitutive activity of the (S204A, S207A) beta(2)-AR mutant is 50 to 60% lower than that of the wild-type beta(2)-AR. We conclude that S204 and S207 do not only provide a docking site for the agonist, but also control the equilibrium of the receptor between active (R*) and inactive (R) forms.

Insulin-secreting beta-cell dysfunction induced by human lipoproteins.

Diabetes is associated with significant changes in plasma concentrations of lipoproteins. We tested the hypothesis that lipoproteins modulate the function and survival of insulin-secreting cells. We first detected the presence of several receptors that participate in the binding and processing of plasma lipoproteins and confirmed the internalization of fluorescent low density lipoprotein (LDL) and high density lipoprotein (HDL) particles in insulin-secreting beta-cells. Purified human very low density lipoprotein (VLDL) and LDL particles reduced insulin mRNA levels and beta-cell proliferation and induced a dose-dependent increase in the rate of apoptosis. In mice lacking the LDL receptor, islets showed a dramatic decrease in LDL uptake and were partially resistant to apoptosis caused by LDL. VLDL-induced apoptosis of beta-cells involved caspase-3 cleavage and reduction in the levels of the c-Jun N-terminal kinase-interacting protein-1. In contrast, the proapoptotic signaling of lipoproteins was antagonized by HDL particles or by a small peptide inhibitor of c-Jun N-terminal kinase. The protective effects of HDL were mediated, in part, by inhibition of caspase-3 cleavage and activation of Akt/protein kinase B. In conclusion, human lipoproteins are critical regulators of beta-cell survival and may therefore contribute to the beta-cell dysfunction observed during the development of type 2 diabetes.

Resistência de genótipos de caupi ao caruncho

A utilização de resistência genética ao ataque de Callosobruchus maculatus (Fabr.) tem sido alvo de investigação científica, especialmente no que diz respeito à identificação de fontes de resistência. O presente trabalho objetivou incorporar, ao grupo de caracteres desejáveis para o cultivo de caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp.), resistência genética ao caruncho (C. maculatus). Foram realizadas hibridações dos genótipos IT81D-1045 e IT81D-1064 (portadores de resistência ao inseto) com CNCx 252-1E/FB, CNCx 187-22D-1 e BR 1-Poty (capazes de transferir resistência a viroses, tolerância à seca, formação de grãos com padrão comercial, elevado potencial de produção e adaptabilidade a diferentes condições ambientais). Populações segregantes obtidas destes cruzamentos foram conduzidas pelo método SPD (descendência de uma única vagem), e na geração F5 foram realizadas seleções individuais. As linhagens obtidas foram avaliadas em conjunto com materiais de origens diferentes, utilizando-se parâmetros associados à infestação da praga. Foi constatado que os genótipos avaliados apresentaram variabilidade quanto à preferência à postura, número de insetos emergidos e número de sementes danificadas; as linhas EVx 37-15E e EVx 37-2E foram as que sofreram menor dano causado pelo caruncho; as variáveis número de ovos, número de insetos emergidos e número de sementes danificadas mostraram-se positiva e significativamente correlacionadas entre si; o grupo das linhagens que descendem de genitores resistentes apresenta valores significativamente inferiores aos obtidos pelas demais, o que indica que a resistência ao inseto se transmite geneticamente.

Activity of beta-glucosidase and levels of isoflavone glucosides in soybean cultivars affected by the environment

The enzyme beta-glucosidase hydrolyses the isoflavone glucosides developing aglycones, which are compounds with anticancer effects, that are also related with the astringency observed in soybean flavor. Due to the importance of this enzyme, a study was carried out to determine beta-glucosidase activity in soybean (Glycine max (L.) Merrill) cultivars with different contents of isoflavone glucosides (enzyme substrate). The enzyme activity was determined in 51 soybean cultivars sowed in Londrina (latitude 23ºS), in Paraná State, Brazil, and in the cultivar IAS 5 from soybean production regions of different Brazilian states. Among the cultivars, a range of variability of 176.1 to 96.3 units of enzyme activity (cultivars IAC-2 and Embrapa 2, respectively) was observed. A significant variability among cultivars could suggest genetic differences. In the states of Rio Grande do Sul, Paraná and Mato Grosso do Sul, the cultivar IAS 5 presented similar average of beta-glucosidase activity: 132.1, 131.9 and 132.5 units, respectively. Among locations in the states, the cultivar IAS 5 presented a variability for enzyme activity from 138.8 to 124.8 units, which were statistically different. In spite of statistics, the numerical values were not too different to assume that environmental conditions affected enzyme activity. A non-significative correlation for isoflavone glucoside concentrations and enzyme activity was observed among cultivars.

Estabilidade da resistência a Zabrotes subfasciatus conferida pela proteína arcelina, em feijoeiro

A arcelina é uma proteína encontrada em feijões silvestres e confere resistência ao caruncho-do-feijão, Zabrotes subfasciatus (Boh., 1833) (Coleoptera: Bruchidae). Comparativamente às cultivares suscetíveis Porrillo 70 e Goiano Precoce, estudou-se a estabilidade da resistência, conferida por dois alelos da proteína arcelina, nas linhagens do feijoeiro Arc1 e Arc4, após a criação do inseto por quatro gerações sucessivas no mesmo genótipo. O experimento foi conduzido no Laboratório da Embrapa-Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão (CNPAF), no município de Santo Antônio de Goiás, GO, em condições não-controladas, utilizando-se delineamento experimental inteiramente ao acaso. Observaram-se, nas linhagens portadoras de arcelina, redução do número de ovos e de adultos emergidos, redução do peso dos insetos, e prolongamento do período ovo-adulto. Na linhagem Arc1, a resistência ao Z. subfasciatus foi mais expressiva. Nessa linhagem, os parâmetros número de ovos, número de adultos emergidos, período ovo-adulto, razão sexual e peso de machos não foram alterados, porém observou-se aumento progressivo de peso das fêmeas nas gerações. Na linhagem Arc4, houve redução do período ovo-adulto, embora o número de ovos e de adultos emergidos, razão sexual e peso de machos e fêmeas não tenham sido alterados.

Peroxisome proliferator activated receptor BETA/DELTA as a central player in the skin response to ultra-violets radiation

Previous studies in the lab of Dr. Liliane Michalik, have shown thai the nuclear hormone receptor Peroxisome Proliferator Activated Receptor beta/delta (PPARß/ö) is an important regulator of skin homeostasis, being involved in the regulation of keratinocyte differentiation, inflammation, apoptosis, arid mouse skin wound healing. Studies of PPARß/ö knock out mice have suggested a possible role for this receptor in cancer. However, contradictory observations of the role for PPARß/ö on tumor growth have been published, depending on cellular contexts and biological models. Given the controversial role of PPARß/ö in skin carcinoma development, the main aim of this PhD work has been to further explore the implication of PPARß/ö in skin response to UV and skin tumor growth. This PhD dissertation is divided in four chapters. The first chapter describes the core part of the project, where I explored the changes in miRNA expression in the skin upon chronic UV irradiation of PPARß/ö wild type and knock-out mice. This analysis shed light on a miRNA- PPARß/ö signature and also predicted thai miR-21-3p (previously named miR-21*) is a key regulator of the PPARß/ö-dependent UV response in the pre-lesiona! skin. Using mice acutely UV-irradiated, ! further demonstrated that miR-21-3p is indirectly regulated by PPARß/ö through activation of Transforming Growth Factor (TGFß)-1 under UV exposure. I also show that miR-21-3p is deregulated in human cutaneous squamous celi carcinoma. In cultured keratinocytes, application of a miR-21 -3p mimic oligonucleotide sequence leads to the regulation of lipid metabolism-related pathway. In the second chapter, I demonstrate that the usage of an mRNA/miRNA combined bioinformatics analysis leads to the discovery of important pathways involved in the PPARß/ö-miRNA response of the skin to chronic UV irradiation, indeed, I validated angiogenesis and lipid metabolism as important functions regulated by PPARß/ö in this context. In the third chapter, we demonstrate that PPARß/5 knockout mice have decreased cutaneous squamous cell carcinomas incidence compared to wild type mice and that PPARß/5 directly activates the cSrc kinase gene. In the last chapter, we review novel insights into PPAR functions in keratinocytes and liver, with emphasis on PPARß/ö but also on PPARa. In summary, this PhD study shows that i) PPARß/5 is able to regulate biological function through regulation of miRNAs, and specifically through miR-21-3p, the passenger miRNA of the oncomiR miR-21, and that ii) the PPARß/5-dependent skin response to UV involves the regulation of angiogenesis and lipid metabolism. Furthermore, the bioinformatics study highlights the relevance of performing integrated mRNA and miRNA genome-wide studies in order to better screen mRNAs and/or miRNAs of interest in the biological context of diseases. - Des études préalables dans le laboratoire du Dr. Liliane Michalik ont démontré que le récepteur nucléaire PPARß/5 est un régulateur important de l'homéostasie de la peau, étant impliqué dans la régulation de la différenciation des keratinocytes, dans l'inflammation, dans l'apoptose et dans la cicatrisation de la peau chez !a souris. L'étude de souris knock-out pour le gène PPARß/5, ont suggérées un rôle possible de ce récepteur dans le cancer. Cependant, des observations opposées ont été publiées suggérant un rôle pro- ou anti- cancer selon le tissue impliqué et le type- cellulaire. En considérant cette controverse autour du rôle de PPARß/5 dans le développement des cancers de la peau, le but principal de mon projet de recherche aura été d'approfondir l'exploration du rôle de PPARß/5 dans la réponse de la peau aux UVs et dans le développement du cancer. Cette dissertation de thèse est divisée en quatre parties. Une première partie, représentant le coeur de mon travail de recherche, décrit la découverte de l'implication des microRNAs (rniRNAs) dans la réponse aux UVs de PPARß/ö et plus spécifiquement l'implication du miRNA miR- 21 -3p (précédemment nommé miR-21*). En étudiant un modèle de souris irradiées de manière aigüe aux UVs, nous montrons que ia régulation de miR-21-3p est PPARß/ö-däpenaante et que cette régulation à lieu par l'intermédiaire du facteur de transcription TGFß-1. Dans des cultures de keratinocytes Humains, la transfecticn d'une séquence oligonucléotidique similaire à celle de miR-21-3p (mimic), montre l'implication de rniR-21-3p dans des fonctions importantes pour le développement des cancers telles que le métabolisme des lipides. Dans un second chapitre, nous montrons que l'usage d'une méthode bioinformatique combinant l'expression des ARN messagers et des miRNAs permet de mettre en évidence des fonctions biologiques importantes lors de ia réponse de PPARß/ö à l'irradiation chronique. L'angiogenèse, le stress oxydatif et le métabolisme des lipides font partie de ces fonctions régulées par PPARß/5 dans la peau irradiée aux UVs. Nous mettons également en évidence la régulation du gène LpcatS par PPARß/5 dans la peau irradiée aux UV ainsi que dans des keratinocytes humains suggérant un rôle pour PPARß/5 dans le remodelage des lipides membranaires. Dans une troisième partie, nous établissons un lien entre la régulation de l'oncogène Src et l'activation de PPARß/5 dans les carcinomes spinocellulaires de la peau. Finalement dans un quatrième chapitre, nous faisons une revue des dernières recherches portées sur le rôle de PPARß/5 et de PPARa dans le foie et ia peau. En résumé ce projet de thèse représente un avancement pour la recherche sur rimplication de PPARß/5 dans la réponse aux UVs de la peau. Pour la première fois, un lien est établi entre ce facteur de transcription et la régulation de microRNAs dans le cadre du carcinome spinocellulare. Jusqu'alors resté dans l'ombre de rniR-21-5p, miR-21-3p est en fait fortement augmenté à la fois dans un modèle de souris d'irradiation aux UVs ainsi que dans ie carcinome spinocellulare chez i'humain. De nouvelles fonctions biologiques pour PPARß/5 ont été également mises en évidence dans ce travail, comme la régulation de l'angiogenèse ou du métabolisme des lipides dans Sa peau. De plus cette dissertation valorise l'intérêt d'une association entre le travail de laboratoire et celui de la bioinformatique.