水稻花药绒毡层特异基因及减数分裂相关基因的分离与功能分析

　利用RNA减法杂交、差异筛选和5’-RACE���方法从水稻分离到了一花药绒毡层特异表达的基因RA39。Southern 杂交表明，RA39在水稻基因组中是以单拷贝的形式存在的。RT-PCR 结果初步表明，RA39是一水稻花药特异表达的基因。RNA原位杂交进一步表明，RA39主要在水稻花药的绒毡层中表达，而且在小孢子母细胞减数分裂期和四分体时期表达量最高。RA39 cDNA全长1013bp，编码298个氨基酸残基。 RA39 cDNA与数据库中的已知序列没有明显的相似性，由其推测的多肽与核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating protein, RIP）的序列相似在19-34%之间。多重序列排列分析结果表明构成RIPs活性位点的5个关键氨基酸残基在RA39中是保守的，在蓖麻毒蛋白中分别为Tyr80、 Tyr123、 Glu177、 Arg180 and Trp211 。利用原核表达系统，通过蛋白质分离和纯化获得了在SDS电泳图谱上为单一条带的纯的RA39蛋白，用兔rRNA作底物进行的酶活性分析证明该蛋白有N-糖基化作用，是一种类型I的核糖体失活蛋白。反义转基因植株的花粉用TTC进行活性染色结果显示其活性明显减弱，成熟的T0代反义转基因植株的结实率明显降低，只有对照的20-60%。这说明，RA39蛋白可能和小孢子母细胞的发育相关。 　　酵母DMC1是减数分裂过程中同源染色体配对和重组修复所必需的减数分裂特异基因。根据酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1的保守区设计简并性引物，通过RT-PCR和RACE���方法，从水稻中分离出了酵母DMC1的同源基因OsDMC1。RT-PCR分析表明，OsDMC1在花中表达量最高，在根中表达量较低，在叶片和幼芽几乎不表达。水稻基因组中有两个拷贝的OsDMC1。OsDmc1蛋白与酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1氨基酸一致性分别为53%和81%。 　　酵母Spo11在减数分裂过程中具有催化DNA双链断裂从而起始同源重组的功能。以酵母Spo11氨基酸序列为探针和现有的数据库通过数据分析，结合RACE���术，克隆了水稻SPO11同源基因OsSPO11-1， OsSPO11-1是一个单拷贝基因，有3个外显子和2个内含子，在转录过程中通过内含子的可变剪切产生4个不同的转录本（OsSPO11-1A、OsSPO11-1B、OsSPO11-1C和OsSPO11-1），其中，OsSPO11-1A是一个未剪切的转录本，OsSPO11-1B包含内含子2，OsSPO11-1C包含内含子1，OsSPO11-1D是一个完全剪切的转录本。这些转录本编码的蛋白有一致的246氨基酸残基的C-端，包含了Spo11/TopVIA家族蛋白共有的5个功能基元，是该家族的新成员。OsSPO11-1A和 OsSPO11-1C在花中优势积累，OsSPO11-1B是花特异的，而OsSPO11-1D在营养器官中优势积累。在花中该基因主要在减数分裂的花粉母细胞和胚曩中表达，在减数分裂期的绒毡层细胞和不同花器官的微管束细胞中也表达。这些结果说明内含子涉及到了OsSPO11-1表达的器官特异性调节，该基因除了参与减数分裂的调节外，在体细胞的发育中可能起重要作用。

植物对重金属砷和镉胁迫适应的分子机理初探

随着现代工业的发展，重金属污染日趋严重。重金属污染引发的环境和健康问题在许多国家都有报道，我国的重金属污染状况也不容乐观。土壤和水体中的重金属污染可以通过食物链进入人体，对人类健康造成很大的危害，如诱发癌症 和畸胎等。 植物修复是一种利用植物对重金属或有机污染物的超富集能力清除或减低污染的环境生物技术。植物修复的生物学机制的研究为这项技术走向实用化奠定了基础。植物修复近期的进展可能来自于可更有效地富集重金属的植物品种的选择、土壤条件的改善等;但长远看来，植物修复技术的巨大进步将取决于新的可更好地抵抗重金属或降解有机毒物的基因的鉴定和克隆，并通过转基因技术创造一批新的植物品种，如可迅速大量富集重金属的高生物量的用作环境净化的植物，以及可排拒重金属吸收的粮食、蔬菜和水果等作物。 本研究针对砷污染的植物修复机制，以超富集砷的凤尾蕨属植物——蜈蚣草为试材取得了如下进展： 1． 以从砷污染地区采集的蜈蚣草（Pteris vittataL．）为植物材料，利用抑制消减杂交(SSH)分离了经砷诱导处理与其对照间表达有差异的cDNA片段，以期得到与砷富集密切相关的基因。其中筛选到的一个cDNA片段与ABC transporter (ATP-binding cassette transporter)有较高的同源性。通过RACE���法对该基因进行了克隆，并进行了初步的结构和功能分析。结果表明所获得的PvABCTl (Accession No. AY496966)为一全长cDNA，长度为2165 bp，其中开读框架为1791 bp，编码597个氨基酸。该基因所编码的蛋白中含有2个ABC transporter特性结构域，1个ATP-binding cassette和2个ATP/GTP结合位点(P-loop)，没有明显的跨膜区。 2． 对蜈蚣草在砷胁迫下PvABCT1基因的表达模式进行了研究。转录水平分析表明PvABCT1的表达受砷的诱导。进一步通过PvABCTl-GFP融合基因在洋葱细胞中的表达进行亚细胞定位，结果显示该基因可能定位于细胞质中。 3． 为了研究所克隆的PvABCT1基因的功能，本研究构建了PvABCT1的酵母表达载体，把该基因转入因ACR3基因缺失而对砷敏感的酵母突变株。酵母功能互补实验表明PvABCT1不仅不能与ACR3基因功能互补，反而使酵母对砷的敏感性增加，同时酵母细胞中的砷含量较未转化的酵母细胞增加。即在转入PvABCT1后，酵母细胞吸收了更多的砷。这暗示该基因与蜈蚣草中砷的高吸收有关。 针对食品重金属污染问题，本研究探讨了减低蔬菜对重金属吸收的方法及其 作用机理，取得了如下进展： 1．研究了钙离子和镧离子对镉离子胁迫下生菜种子萌发和植株生长的影响，结果表明在种子萌发时外施4 mM CaCI2或0.04 mg/L La(N03)3均可提高生菜对重金属镉的抗性。 2．通过检测0.5 mM CdCl2胁迫下生菜植株中的镉含量以及外施钙离子或镧离子后相应的镉含量，发现4 mM CaCl2可以增加镉胁迫下生菜植株中镉的积累;而0.04 mg/L La(N03)3可以降低镉胁迫下生菜植株中镉的积累。 3．对生菜中植物络合素合酶基因进行了克隆，通过RT-PCR分析以及植物络合素( phytochelatins，PCs)的检测，探讨了外施钙离子或镧离子对镉胁迫下生菜植株中植物络合素合酶基因在转录水平的表达量、植物络合素含量以及镉的积累三者之间的关系。结果表明：4 mM CaCl2可以提高镉胁迫下生菜植株中植物络合素合酶基因在转录水平的表达以及植物络合素的含量，增加镉的积累;而0.04 mg/L La(N03)3虽然同样可以提高植物络合素合酶基因在转录水平的表达以及植物络合素的含量，却能降低镉胁迫下生菜植株中镉的积累。这暗示外施钙离子可以促进用于重金属污染环境修复的植物对重金属的吸收，而外施镧离子可以用于降低叶菜类蔬菜中重金属镉的积累。

水稻花发育相关基因RA68和OsUBP1的分离与功能分析

　　　　　　　　　　　　　　　　　第一部分 利用减法杂交和RACEs从水稻中克隆了一个编码含有脯氨酸和苏氨酸丰富结构域多肽的cDNA,其相应的基因被命名为RA68。RA68由3个外显子和2个内含子组成，编码的蛋白由219个氨基酸残基组成。该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽，一个亲水性的N－端结构域和一个疏水性的C－端结构域组成。 N端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列。 Southern杂交和序列分析结果表明RA68在水稻基因组中以单拷贝存在，定位于第2号染色体。Northern杂交结果表明RA68在幼芽和花中表达量较高，在根和叶中不表达。原位杂交分析结果表明：在幼苗期RA68 主要在幼芽胚芽鞘的内外层细胞和幼叶原基的表层细胞中表达;转入生殖生长期后，在花序分生组织、枝梗原基顶端、花器官原基、大孢子囊和花粉粒中表达。用GFP作报告基因，用洋葱表皮细胞进行的瞬间表达测试结果显示RA68蛋白定位于细胞核中。转反义RA68水稻植株抽穗期比对照野生型延迟30天左右。这些结果表明RA68可能是水稻花分生组织特征基因，在成花转变过程中起作用。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第二部分 通过RACE���RT-PCR方法分离了水稻OsUBP1基因，其推测编码蛋白含有UBP结构域（Cys Box和His Box）和TopⅥA结构域。RT-PCR分析结果表明OsUBP1在转录过程中通过可变剪接产生多个不同的转录本，这些转录本在叶、根、颖花和幼芽中存在着时空调节表达模式，每种组织中的转录本是不一样的。这些转录本内含子剪切位点除了经典的GT-AG外，还有GC-AG、CT-AC、TT-GA、GT-GA和CT-GA。由于发生了GC-AG的可变剪切产生了OsUBP1的重要功能结构域Cys Box。水稻OsUBP1基因和OsSPO11-1基因位于11号染色体的同一基因座位上。原位杂交分析表明，在花中OsUBP1 mRNA 主要在药壁绒毡层、花粉粒、大孢子囊和颖花底部维管束中表达。转反义OsUBP1植株大多不能正常结实，这说明OsUBP1可能参与水稻的育性调节。 关键词

青蒿素生物合成调控的研究章焰生

青蒿 (Artemisia annua) 是目前唯一用来生产抗疟药剂青蒿素的一种药用植物，由于青蒿植株中青蒿素的含量过低，使得青蒿素的生产不能满足市场的需要，提高青蒿植株中青蒿素的含量显得尤为重要，本论文围绕着调控青蒿素的生物合成作出了以下一些研究： 一、紫穗槐二烯合酶基因启动子的克隆 　紫穗槐二烯合酶是参与青蒿素生物合成的一个关键酶，以法呢基焦磷酸为底物，催化形成青蒿素分子所具有的杜松烯环状结构, 此酶被认为是青蒿素分支途径中的第一个关键限速酶，因此它的表达水平高低关系着流向青蒿素生物合成的碳流量。为了了解紫穗槐二烯合酶的表达模式，用Tail-PCR的方法我们从青蒿高产株系001中克隆得到紫穗槐二烯合酶基因的两个启动子，分别命名为AMSP1与AMSP2，序列比较分析可看出两启动子有三处大的差异片段，由此推测紫穗槐二烯合酶基因在青蒿基因组中可能是一个多拷贝形式存在，Southern杂交验证了这一点，结果表明，紫穗槐二烯合酶基因在青蒿基因组中至少存在三个copy;利用PLACE数据库对克隆的启动子的顺式作用元件进行分析，发现其中有光、茉莉酸甲酯等调控元件。5'RACE���析确定了紫穗槐二烯合酶基因的转录起始位点位于翻译起始位点上游44bp处。通过PCR的方法，我们对启动子AMSP2进行5′端缺失，缺失的5个启动子片段克隆进报告基因GUS的上游，以进行下一步启动子的特性分析。 二、紫穗槐二烯合酶的表达特性分析 　　RT-PCR半定量分析表明：光正调控于紫穗槐二烯合酶的转录表达，黑暗培养条件下，青蒿植株中紫穗槐二烯合酶的转录水平较低，一旦进行光照培养，紫穗槐二烯合酶的转录水平显著上升;茉莉酸甲酯对青蒿植株中紫穗槐二烯合酶的表达调控具有光依赖性，在连续黑暗条件下，茉莉酸甲酯对紫穗槐二烯合酶的转录水平并无影响，而在正常光照与黑暗循环培养条件下，茉莉酸甲酯明显诱导了青蒿植株中紫穗槐二烯合酶的转录表达。鉴于在正常的培养条件下，茉莉酸甲酯正调控于紫穗槐二烯合酶的转录表达，我们研究了茉莉酸甲酯对青蒿植株中青蒿素生物合成的影响，结果表明，茉莉酸甲酯并未促进青蒿素的生物合成，却诱导了青蒿素生物合成的前体青蒿酸的生物合成。 三、真空介导农杆菌转化青蒿植株瞬时表达系统的建立 　　探讨了真空强度、青蒿苗龄、农杆菌的浓度、共培养方式、共培养时间以及光对青蒿植株瞬时表达的影响，结果表明真空强度70－80mbar、30天的青蒿苗龄以及侵染农杆菌浓度OD600为2.0时有利于青蒿植株的瞬时表达;液体共培养极大地抑制了外源基因在青蒿植株的瞬时表达，固体共培养与滤纸共培养适合于青蒿植株的瞬时表达系统，二者之间无明显差异;共培养时间也是影响基因瞬时表达的关键因素，结果表明，3天或4天较2天共培养有利于外源基因在青蒿植株的瞬时表达;光对青蒿植株的瞬时表达有极大地抑制作用，而黑暗条件适合于青蒿植株的瞬时表达;此系统可用于不同基因型的青蒿植株。 四、青蒿过氧化物酶基因的克隆及功能分析 　　利用RACE���法，从青蒿高产株系001中克隆了一个第三大类植物过氧化物酶的cDNA。克隆的青蒿过氧化物酶氨基酸序列与白羽扇豆、辣根菜、小麦、烟草、蕃茄的过氧化物酶的同源性分别为42.0%、36.2%、38.9%、33.6%和32.8%。青蒿过氧化物酶的编码区被克隆进原核表达载体PET-30a，并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达，过量表达产物主要以包涵体形式存在，但也有相当一部分可溶性蛋白出现。表达的蛋白具有明显催化抗坏血酸、愈创木酚的过氧化物酶活性，催化愈创木酚活性大约是催化抗坏血酸的1.8倍。氨基酸同源性分析与过氧化反应表明克隆的过氧化物酶属于植物第三大类过氧化物酶。青蒿过氧化物酶间接促进了青蒿细胞提取液中青蒿酸向青蒿素的生物转化，但不能直接以青蒿酸作为催化底物。 五、外源赤霉素处理与开花对青蒿素、青蒿酸生物合成的影响 　　研究结果发现在青蒿的营养生长期喷施外源赤霉素明显促进了青蒿素的生物合成，同时青蒿酸含量呈下降趋势;从营养期至生殖期，青蒿酸的含量逐渐下降，至开化前期青蒿酸含量下降到最低，从开化前期至开花后期，青蒿酸的含量无多大变化，随着青蒿的发育，从营养生长期至开花期，青蒿素的含量呈上升趋势，至开化盛期时青蒿素含量达到最高。外源赤霉素处理与开花打破了青蒿素生物合成的瓶颈，诱导了青蒿酸向青蒿素的生物转化。

植物络合素合酶基因的功能分析及其应用

植物络合素（phytochelatins，PCs）是含有γ-Glu-Cys重复结构的小分子多肽，其结构通式为：（γ-Glu-Cys）n-Gly（n=2-11）。植物络合素（PCs）由植物络合素合酶（PCS）催化谷胱甘肽（GSH）聚合而成，能够络合重金属离子而具有解毒功能，这是植物解毒重金属胁迫的重要机制之一。本文克隆了来源于重金属抗性植物绊根草（Cynodon dactylon cv Goldensun）的植物络合素合酶基因，通过基因工程手段使其在烟草中过量表达，得到了一些有望用于植物修复（phytoremediation）的工程植株。同时，在水稻（Oryza sativa）种子中利用RNAi技术抑制植物络合素合酶基因的表达，以降低重金属离子在人类最重要的粮食作物水稻的籽粒中的积累。 1. 通过RACE���Rapid Amplification of cDNA Ends）方法从抗性植物绊根草中克隆了植物络合素合酶基因CdPCS1，其1515 bp的读码框编码一个含505个氨基酸的蛋白质，蛋白质序列分析表明它具有植物络合素合酶的结构特征，同时还具有磷酸化位点和亮氨酸拉链结构。 2. CdPCS1基因可以互补对铜和镉离子敏感的酵母突变株ABDE-1（cup1Δ）中缺失的金属硫蛋白基因CUP1的功能，也可以互补对砷离子敏感的酵母突变体FD236-6A（acr-3Δ）中的离子外排载体基因ARC3的缺失。 3. 将CdPCS1转入烟草，共获得过表达CdPCS1的烟草44个株系，其中融合GFP的株系16个。对T0代的转基因植株的PCs含量以及重金属抗性和吸收能力进行了分析，其中抗性实验表明，在300μmol/L 的Cd2+离子胁迫11天之后，野生型植株的叶片出现斑点状坏死，而两个转基因烟草株系S6和K49的植株没有出现受伤害症状。在100μmol/L的CdSO4处理一周后，转基因植株中的PCs含量比对照有不同程度的提高，最多提高了2.88倍。当用300μmol/L Cd2+处理9天再用600μmol/L Cd2+处理2天后，Cd的积累量比野生型植株增加了2倍多;用50μmol/L As3+处理7天再用100μmol/L As3+处理2天后，转基因植株对As的积累量最多增加了3倍多。说明转入绊根草PC合酶基因的烟草增加了植物络合素的合成，并由此增加了对镉离子的抗性以及对镉离子和砷离子的积累。 4. 对转基因烟草中的CdPCS1进行了亚细胞定位研究。在激光共聚焦显微镜和荧光显微镜下分别用转基因烟草叶片组织和叶肉细胞原生质体观察融合GFP的CdPCS1，结果表明融合蛋白定位于细胞核中。 5. .利用RNAi技术抑制水稻种子中植物络合素合酶基因的表达，共获得39个转基因株系。其中35个株系为种子特异性ZMM1启动子驱动OsPCS1基因的RNAi，其余4个株系由组成型的Ubiquitin启动子驱动。RT-PCR的分析结果表明：一个由ZMM1启动子驱动的RNAi转基因水稻株系的种子中，OsPCS1的mRNA水平比对照中的下降了一半。

绊根草重金属抗性相关基因的克隆及其功能分析及可耐受偏二甲肼的芦苇变异株系的筛选

本研究利用酵母功能互补方法和RACE���方法从具有较强抗逆能力的绊根草中克隆了9个与重金属抗性相关的克隆，并对部分基因的表达调控及功能进行了初步研究。同时还利用细胞工程技术筛选到了具有较强的耐受火箭推进齐-偏二甲肼(UDMH)的芦苇的变异株系，为以后用人工湿地系统处理受偏二甲肼污染的废水奠定了基础。 本研究通过酵母功能互补法克隆到了五个基因，分别为CdSRP、CdTETH、 CdASP、CdMT2和CdTER1。CdSRP可能是一种衰老相关基因;CdTETH编码的产物可能是组成TRAPP复合体的一个亚基;CdASP是一个功能未知的基因;CdMT2是一个编码Type Ⅱ型金属硫蛋白基因;CdTER1可能是编码一个TERl-like家族蛋白成员的基因。用这五个基因分别转化因Acr基因缺失而对As敏感的酵母菌株FD236-6A，所获得的转化子对As的抗性均有提高，其中以CdMT2、CdTER1和CdASP的作用最为明显。这些基因的表达调控方式以及与其它重金属抗性的关系正在研究中。 本研究还利用RACE���方法克隆了一个谷胱甘肽S-转移酶基因，CdGSTFl;两个植物络合素合酶基因，CdPCSI和CdPCSⅡ，和一个TypeⅠ型金属硫蛋白基因CdMT1。CdGSTF1属于phi类GST基因，Northern-blotting分析表明，CdGSTF1在绊根草根部的表达受Cd2+的诱导，暗示其可能具有解除氧自由基或氢过氧化物的毒性的作用。CdPCSI和CdPCSⅡ的同源性较高，表明绊根草含有两个以上的PCs合酶的基因。参照前人的方法对CdPCSI和CdPCSII的氨基酸序列进行分析，发现它们含有六个非常相近的Cd2+结合位点，这两个基因的功能及其调控方式有何差异尚需进一步的研究。cdMT1与用酵母功能互补法克隆到的CdMT2属于不同类型的MT基因，对它们之间很可能存在的功能、组织特异性等方面的差异性进行了讨论。 四氧化二氮／偏二甲肼是常用的航天器双组元液体推进剂。偏二甲肼易挥发，有致癌、致畸、致突变的毒性。在推进剂贮存、运输、转注、火箭发动机试车、火箭发射、管道及设备冲洗中产生的含有偏二甲肼的废水能够对卫星发射基地的地下水源和空气造成污染。因此迫切需要培育能够净化偏二甲肼污水的植物。 本研究利用生长在卫星发射基地的野生芦苇的种子诱导愈伤组织，进而通过逐步提高偏二甲肼筛选压力的方式从中筛选出具有较强抗性的愈伤组织，然后诱导其分化。目前已经得到能够在含有1.63 mmol/L和3.26 mmol/L偏二甲肼的分化培养基中生长良好的芦苇再生苗，并已成功转移至温室中。抗性分化苗对污水的处理效果和耐受偏二甲肼的机理正在研究中。

MADS-box基因在水稻和太行花中的相关研究& SAGE 在水稻上应用的生物信息学分析

本论文主要涉及两部分内容：第一部分是水稻和太行花中MADS-box基因的相关研究，第二部分是水稻中SAGE技术的生物信息学分析。 MADS-box基因家族在花发育过程中起着重要的作用。水稻是单子叶植物的模式植物，其基因组序列的公布为在基因组水平上鉴定MADS-box基因提供了条件。根据已发表的水稻MADS-box基因序列，利用关键词搜索、HMMER分析、同源比较、系统进化树分析等手段，对GeneBank和TIGR水稻基因组注释中所有已知和未知的水稻MADS-box基因进行了分析。结果表明，水稻中有64个MADS-box基因编码不同氨基酸，其中已知cDNA序列的为43个。在64个基因中，有23个属于ABCDE类基因，并且其cDNA序列已知，其中的10个已有功能方面的研究。通过3’-RACE���筛选水稻花器官的cDNA文库，得到了一个A类基因片断（A5B2），两个E类基因片断（MW1，MW2）。这三个基因分别与OsMADS14，OsMADS7和OsMADS5相似或相同。禾本科植物花器官的起源，尤其是内外稃的起源仍存在疑问，A功能基因是否以及如何参与其形成成为问题的关键。初步原位杂交分析表明，OsMADS14在花发育的早期开始表达。在小穗原基发育过程中，OsMADS14在内外稃原基中有较强的表达。随着小穗的发育，OsMADS14在整个花序中都有表达。在小穗发育的后期，OsMADS14在胚珠中有较强的表达。OsMADS14的表达模式与FUL类基因一致，并且证明了其在花发育的后期仍然表达强烈，暗示其可能与胚珠发育有重要关系。 SEPALLATA基因被认为是花的特异因子，参与了花的四轮花器官的决定过程。在本文中，通过3’-，5’-RACE���从太行花花芽中克隆了一个MADS-box基因。该基因推导的的氨基酸序列含有典型的M，I，K和C四个结构域，与FBP2和SEP3的相似性较高，系统进化树分析表明该基因属于SEP3亚家族，于是将其命名为TrSEP3。TrSEP3首先在花分生组织中表达，然后在雌雄蕊原基及花瓣中表达;在成熟花中，TrSEP3仅在花瓣和雌蕊中表达。这种表达模式与其它的SEP-like基因有稍不同。TrSEP3拟南芥中过量表达后并未导致表型的改变，暗示其功能与拟南芥的SEP基因可能存在差异。选择压力分析显示TrSEP3受到了不显著的负选择压力。这些结果暗示TrSEP3的功能可能与其它的SEP-like基因有差别，值得进一步研究。 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)是对比样品间转录谱的差异、发现新基因的有效的方法。tag mapping是将SAGE-tag与其转录本匹配的过程，其效率直接影响对转录谱的解释，该过程受多种因素影响。目前，对水稻tag mapping过程缺少详细研究，导致其效率不高。为了确定参考数据库和其它合适的条件，我们利用EST序列和基因组序列构建了不同的参考图谱，从全长cDNA数据库中提取虚拟的SAGE-tag，研究了参考图谱、锚定酶、tag长度以及匹配方法对tag mapping效率的影响，并比较了tag mapping的准确率。结果表明，用EST序列构建的参考图谱能够匹配大多数的SAGE-tag，并具有较高的准确率;利用迭代的方法，可以充分利用基因组序列。各种锚定酶之间的差别不明显，其中NlaIII， HpyCH4V 和 AluI 表现较好;17bp的tag比较适合水稻;而用双锚定酶和17bp的tag则可以显著提高tag mapping的效率和准确率。

MADS-box基因在单子叶植物花发育中的功能研究

第一部分 水稻E类MADS-box 基因在花发育中的功能分析 MADS-box 基因是一个大的转录因子家族，在花发育过程中起重要作用。根据对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛遗传突变体的研究，提出了花发育的ABCDE模型。该模型认为：A、B、C、D、E代表了5类功能不同的花器官特征基因，单独或联合控制花器官的发育。A类基因控制萼片的发育;A、B和E类基因控制花瓣的发育;B、C和E类基因控制雄蕊的发育;C和E类基因控制心皮的发育;D类基因控制胚珠的发育;A和C类基因相互抑制。在这5类基因中，E类基因的功能较为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且具有花分生组织决定性（Floral meristem determinency）。在单子叶植物中，E类基因的功能发生了很大的分化。水稻是单子叶植物的模式植物，水稻中至少有5个E类基因，分别是OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，在这5个E类基因中，除了对OsMADS1基因有较深入的研究外，对其它几个E类基因的功能了解甚少。我们在现有的研究基础上，根据对双子叶植物中E类基因的研究结果，以OsMADS8基因为出发点，利用组织原位杂交，RNAi技术对水稻中的E类基因进行了深入的研究。结果表明：OsMADS8/7基因早在花序枝梗分生组织原基就有转录，随着小穗的生长发育，逐渐集中在小穗分生组织原基，小花分生组织原基，浆片、雄蕊和心皮中表达;在胚珠形成时，内外珠被有很强的杂交信号，而且在幼胚和胚乳中也有表达。OsMADS5在幼花时期，四轮花器官均有表达，在小穗发育后期及受精后的表达方式与OsMADS8/7基因相同。OsMADS8基因被抑制后，转基因植株没有任何表型变化，说明很可能有其它E类基因弥补了OsMADS8基因的功能缺失;当同时抑制其它E类基因的表达时，转基因植株抽穗期明显延长，四轮花器官的发育均受到影响：稃片类似叶片状;浆片转变为稃片类的结构;雄蕊没有花粉;心皮具有了稃片的特点;没有胚珠结构的形成，同时失去了花分生组织决定性，在心皮的部位产生了新的花器官或花分生组织逆转为花序分生组织。说明水稻四轮花器官及胚珠的正常发育需要E类基因的参与，但其功能与双子叶植物如拟南芥，西红柿、矮牵牛等直系同源基因相比已经发生变化;水稻中的E类基因在维持花分生组织特征性方面起重要作用;另外对抽穗期有影响。 第二部分 玉米MADS-box基因ZAG2转录调控区的研究 基因的时空表达受基因中的顺式作用元件及其反式作用因子调控。顺式作用元件由位于基因编码区上游的启动子区域和位置不确定的增强子区域组成。顺式作用元件对基因表达的开启至关重要。MADS-box 基因编码一类控制花器官发育的转录因子，在花的发育过程中顺序表达。MADS-box 基因突变，花器官发生同源异型转换。研究MADS-box 基因的调控序列可以进一步揭示影响基因时空表达的内外因素。ZAG2是玉米MADS-box 基因中的D类基因，控制胚珠的发育，在胚珠和心皮的内表面特异表达。ZAG2基因有7个外显子和6个内含子。我们从玉米基因组分离到了ZAG2基因翻译起始点上游3040bp的序列，并利用5’-RACE���法鉴定出了转录起始点的位置。序列比较发现，在 5’-UTR内有一个1299bp的内含子，这个内含子可能对基因的表达有调控作用，因此构建了两个与GUS基因融合的表达载体：一个是pZAG2-1::GUS，包括翻译起始点以上所有的调控序列;另一个是pZAG2-2::GUS，去掉了5’-UTR中的内含子序列，转化水稻。结果这两个构建都没有使GUS基因在正确的位置表达。pZAG2-1::GUS构建在心皮基部类似花托的部位及稃片顶端着色，pZAG2-2::GUS构建在内外稃片沿稃脉的部位有很强的着色，说明翻译起始点上游的调控序列不足以使基因正常表达。两个构建着色方式不同，可能pZAG2-1::GUS构建在5’-UTR部分含有抑制ZAG2基因在稃片表达的顺式元件，或者启用了在5’-UTR中的转录起始点，因为在5’-UTR的内含子中也有一个很典型的TATA-box。我们推测，在ZAG2基因编码区的第一内含子可能存在另外一些使基因正常表达的增强元件，需要进一步的序列缺失实验加以验证。

太行花MADS-box基因克隆、表达模式及功能分析

基因的重复（duplication）及其功能的多样性（diversification）为生物体新的形态进化提供了原材料。重复的基因通过表达方式和（或）编码序列的改变而导致其亚功能化（subfunctionalization）和（或）新功能化（neofunctionalization），从而使这些重复基因有可能保留在生物体中，增添生物的遗传稳定性（robustness）和多样性。MADS-box基因在植物（特别是在被子植物）的进化过程中发生了大量的基因重复事件而形成一个多基因家族。MADS-box基因家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用，在调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征，以及调控根、叶、胚珠及果实的发育中起着广泛的作用。开展对MADS-box基因家族成员的序列结构、表达模式及编码蛋白的功能研究可以为这些同源基因在生物体中的可能命运提供很好的实验依据。本研究以我国特有的蔷薇科物种太行花做实验材料，通过3’ RACE���5’ RACE���法从太行花中克隆了7个MADS-box家族的基因。序列和系统进化树分析表明这7个基因分别与拟南芥的MADS-box基因AG、SHP（SHP1/2）、PI、AP1、FUL和SEP1以及与矮牵牛MADS-box基因PhTM6具有很高的同源性并聚为一支，从而将这7个MADS-box基因分别命名为TrAG（Taihangia rupestris AG）、TrSHP（Taihangia rupestris SHP）、TrPI（Taihangia rupestris PI）、TrAP1（Taihangia rupestris AP1）、TrFUL（Taihangia rupestris FUL）、TrSEP1（Taihangia rupestris SEP1）和TrTM6（Taihangia rupestris PhTM6）。针对克隆的这些基因，具体进行了以下几方面的研究： 第一，对TrAG和TrSHP两个MADS-box基因进行了研究，它们分别属于AG亚家族中旁系同源进化系euAG和PLE进化系的成员。通过原位杂交的方法分析了旁系同源基因TrAG和TrSHP的表达方式是否发生了分化;构建组成型表达载体转化野生型拟南芥，分析了TrAG和TrSHP的编码蛋白的功能是否发生了改变;并进一步通过酵母双杂交的方法比较了TrAG和TrSHP的相互作用方式是否发生了分化。原位杂交分析表明，TrAG和TrSHP主要在雄蕊、心皮和胚珠中表达。在花发育过程中，TrAG起始表达比TrSHP早，在随后将形成雄蕊和心皮原基的分生组织区域以及雄蕊原基中表达;然而直到雄蕊原基出现前未检测到TrSHP的表达。在雄蕊原基形成之后，TrAG和TrSHP在发育的雄蕊、随后将产生心皮原基的分生组织区域以及心皮原基中表达。在花发育的晚期，TrAG在发育的柱头、花柱以及胚珠中均有表达，而TrSHP仅在胚珠中表达。35S::TrAG和35S::TrSHP转基因拟南芥植株表现出相似的表型，包括开花提前;莲座叶和茎生叶向腹卷曲、变小;花芽在时期13前即开放，萼片包裹不住花芽;萼片和花瓣分别被同源异型转化为心皮化和雄蕊化器官，并在萼片向腹面产生异位的胚珠;在茎生叶上产生柱头化的乳突和胚珠;子房弯曲;果实提前沿着开裂区裂开，暴露出胚珠。此外，也观察到35S::TrAG和35S::TrSHP转基因拟南芥植株的一些表型差异，35S::TrAG转基因拟南芥植株花芽呈暗绿色，而35S::TrSHP转基因拟南芥植株花芽呈黄绿色;不同与35S::TrAG转基因植株表型的是，35S::TrSHP转基因拟南芥植株花被脱落受到了抑制，偶尔可以观察到花丝基部融合，果实变短、育性降低。酵母双杂交分析表明TrAG可以与TrSEP3相互作用，而TrSHP不能与TrSEP3形成异源二聚体。以上研究结果表明做为旁系同源基因，TrAG和TrSHP在表达方式上发生了改变，在蛋白编码序列上保持了其祖先的功能，但是编码序列的一些差异还是导致它们之间生化作用方式的不同和一定程度上的亚功能化。基于以上研究结果并结合先前报道的在拟南芥、金鱼草和矮牵牛等物种中旁系同源基因的表达和功能数据，我们提出在不同物种中旁系同源基因在进化过程中维持部分功能冗余（redundant），但是也通过改变表达方式、编码蛋白的功能及蛋白相互作用方式呈现出不同形式的亚功能化和（或）新功能化。 第二，对TrPI基因的功能也进行了初步研究，它属于AP3/PI亚家族PI-like进化系的成员。原位杂交结果表明，TrPI主要在花瓣、雄蕊和胚珠中表达。显示出TrPI与拟南芥同源基因PI保守的表达模式。35S::TrPI转基因拟南芥植株莲座叶发生延迟、变小、并且第一至第三片莲座叶呈白色针状;莲座叶和茎生叶并不像野生型呈有规则的螺旋状排列;花序茎基部、中间或顶端发生2-3个分支;在茎生叶的叶腋内的花序抽出时间明显晚于野生型，并且很小甚至不能完全抽出而藏在叶腋内。低温条件下转基因植株莲座叶的表型更加明显，表现为莲座叶变为针状，无叶片，仅有叶柄结构。这明显不同于35S::PI转基因拟南芥植株的表型。此外，酵母双杂交分析表明TrPI自身可以形成同源二聚体。这种相互作用方式也不同与拟南芥中PI的相互作用方式。以上研究结果表明，TrPI可能与拟南芥PI具有保守的表达模式但编码的蛋白可能获得了新的功能。 第三，构建了一个AP1-like基因（TrAP1）的过量表达载体，转化野生型拟南芥植株，通过反向遗传学分析了TrAP1的功能。35S::TrAP1转基因拟南芥植株开花提前;花序以两朵花终止，形成terminal flower的表型;偶尔可以观察到雄蕊转化为花瓣化的器官;莲座叶呈黄绿色并且其边缘呈锯齿状。酵母双杂交分析表明TrAP1蛋白自身可以形成同源二聚体。这些结果表明TrAP1可能与拟南芥同源基因AP1具有保守的功能。

盐角草（Salicornia europaea L.）SePSY和SeLCY基因克隆及功能分析

盐角草（Salicornia europaea L.）是一种叶片退化而茎肉质化，不具有盐腺和盐囊泡的真盐生植物，可以在1020 mM NaCl下生存。其特殊的形态适应特点使其成为研究植物抗盐性的良好实验材料。但目前与盐角草抗盐机理相关的生理和分子方面的研究还非常有限。本文以盐角草为材料，首先探讨了盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡的影响，在此基础上进一步克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶，八氢番茄红素合成酶（SePSY）和番茄红素β-环化酶（SeLCY）基因，并进行了功能分析。该研究对于了解类胡萝卜素在植物抗盐性中所起的作用具有重要意义。 盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡影响的实验结果表明：200 mM NaCl是盐生植物盐角草生长的最适盐浓度，在该盐度下盐角草中叶绿素a/b的比值和光饱和点升高，植株的光合作用表现出增强的效应，植株生长最佳。而27％ PEG-6000所模拟的渗透胁迫显著降低了盐角草中叶绿色a/b的比值，抑制其光合作用和生长。200 mM NaCl下，Na+的含量显著增加，但脯氨酸含量保持不变，说明Na+对盐角草渗透平衡的作用要强于脯氨酸。同时盐角草中液泡H+-ATPase（V-H+-ATPase）活性增强，而盐角草Na+/H+逆向转运蛋白基因（SeNHX1）在盐分和渗透胁迫下却表现为组成型表达;我们因此推断在盐分胁迫下，Na+的吸收是由于液泡H+-ATPase活性的增强，而不是诱导SeNHX1基因的表达。同时Na+的吸收可能进一步诱导了与光合作用相关基因的表达。 盐分对植物的影响涉及植物体内包括光合作用和活性氧代谢在内的多个代谢过程。在植物中，类胡萝卜素是植物捕光天线复合体（LHC）和光系统反应中心叶绿素结合蛋白的重要组成部分。植物体内类胡萝卜素能够清除植物叶绿体，线粒体和过氧化物体在电子传递过程中产生的活性氧。同时类胡萝卜素是植物激素ABA的前体。200 mM NaCl虽然增加了盐角草细胞的渗透势，但并没有对其造成氧化胁迫和离子毒害，相反提高了其光合能力。类胡萝卜素作为植物活性氧的淬灭剂和光系统的组成成分，可能在盐角草抗盐机理中发挥着比较重要的作用。在过去的十年中，类胡萝卜素研究大多集中在其生物合成和提高作物中类胡萝卜素含量方面，可是，在植物对非生物逆境（如氧化和盐分胁迫）的适应机制中，类胡萝卜素合成途径究竟发挥什么作用目前还不是很清楚。为了了解盐角草中类胡萝卜素合成途径在植物逆境的适应机制中所发挥的作用，本文采用RACE���方法克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶基因 SePSY和SeLCY，将它们构建到植物表达载体SN1301中，转化拟南芥，并对它们进行了初步的功能分析。 研究发现盐角草SePSY基因全长1655 bp，编码419个氨基酸，推测分子量为47.2 kDa，等电点为8.92。其蛋白在1-65个氨基酸处有一个信号肽。在1-19和242-264氨基酸处有2个跨膜区。盐角草SeLCY基因全长1937 bp，编码498个氨基酸，推测分子量为56.1 kDa，等电点为8.41。其蛋白在1-37个氨基酸处有一个信号肽。在79-96，367-385和454-474氨基酸处有3个跨膜区。SePSY和SeLCY基因过量表达均促进转基因拟南芥的生长，转SePSY基因拟南芥次生根数目比野生型拟南芥明显增多。SePSY和SeLCY基因的过量表达还使转基因拟南芥对百草枯的抗性得到提高;SePSY基 因的过量表达增强了植株体内抗氧化保护酶过氧化物酶（POD），超氧化物歧化酶（SOD）活性，但过氧化氢酶 （CAT）的变化不显著;转SeLCY基因株系POD，SOD，CAT的活性都有所增强，但转SePSY基因株系中POD活性明显高于 转SeLCY基因株系。转SePSY和SeLCY基因拟南芥叶片中丙二醛（MDA）和H2O2含量均降低，但转SePSY基因株系中MDA和H2O2含量明显低于转SeLCY基因株系。说明转基因拟南芥对氧化胁迫的抗性得到了提高，同时使得光系统II（PSII）和细胞膜的结构和功能不被破坏。而转SePSY基因株系对盐分和氧化胁迫的抗性明显高于转SeLCY基因株系。SePSY和SeLCY基因的过量表达还提高了转基因拟南芥的光合效率，气孔导度和Fv/Fm比值。 SePSY和SeLCY基因转化拟南芥及其功能分析的初步结果表明，SePSY和SeLCY基因的过量表达提高了转基因拟南芥对体内活性氧（ROS）的清除能力，增强了拟南芥的光合能力，进而提高了拟南芥的抗盐性。

青蒿素生物合成相关基因的功能分析及遗传转化研究

从中国传统药用植物青蒿（Artemisia annua L.）中提取的青蒿素及其半合成衍生物如蒿甲醚等是一类新型的抗疟特效药，特别是对抗氯喹的恶性疟疾和脑型疟疾有很好的疗效。由于青蒿素在植物中的含量极低，使得其价格很高，特别是对于亚非拉等第三世界国家来说。因此如何提高青蒿素的产量成为近年来研究的热点。各种传统的育种、生理生化手段和细胞培养技术均未取得较好的结果，因此，利用植物基因工程技术提高青蒿素产量已成为研究的重点之一。 本论文围绕青蒿素的生物合成途径开展了以下的工作： 一、中药青蒿紫穗槐二烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 利用RT-PCR方法，从中药青蒿高产株系001中克隆到的中药青蒿紫穗槐二烯合酶(ADS) cDNA, 其推测编码蛋白与前人报道的有两个位点的突变。将其开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建N端携带有HIS6表达标签的紫穗槐二烯合酶重组表达载体pETADS。将pETADS转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta -D-thiogalactoside)诱导重组紫穗槐二烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组紫穗槐二烯合酶可以催化FPP向紫穗槐二烯的转化。体外酶促动力学分析表明，两个位点的氨基酸突变，并没有影响到青蒿紫穗槐二烯合酶的催化活性。基因组DNA杂交表明，紫穗槐二烯合酶基因在001株系基因组中至少有4个拷贝。 二、中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 将经RACE���法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464) 开放阅读框的3'末端截短99 bp，插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA。将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thio galactoside)诱导重组鲨烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP和NADPH），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化。青蒿鲨烯合酶的功能鉴定，为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成，从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础。 三、中药青蒿法呢醇合酶原核表达、纯化与功能鉴定 将经RACE���法克隆到的中药青蒿倍半萜合酶cDNA ( AF304444) 开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的重组表达载体pET30SESQ。将pET30SESQ转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thioga lactoside)诱导蛋白表达，表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示此重组酶可以催化FPP向法呢醇的转化。 四、中药青蒿FPS、ADS双功能酶基因的构建、表达与功能鉴定 将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶：法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶的基因进行融合，经大肠杆菌表达后鉴定融合蛋白的功能，结果表明融合蛋白具有了双功能酶活性。进一步将融合酶基因转入酿酒酵母中，发酵后检测紫穗槐二烯的含量，并与同时转入法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶单个基因的酵母、单独转入紫穗槐二烯合酶基因的酵母进行了比较，结果表明，转入双功能酶的酵母发酵获得的紫穗槐二烯含量要比两个对照酵母高，这表明，获得的双功能酶的催化效率要比两个单独酶的催化效率高。 五、过量表达青蒿紫穗槐二烯合酶对青蒿中青蒿素及其前体物含量的影响 利用根癌农杆菌介导，将青蒿紫穗槐二烯合酶转入青蒿株系001，分子检测证明，紫穗槐二烯合酶整合到了青蒿基因组中并在mRNA水平得到了高效表达。部分转基因青蒿的青蒿素含量有明显增加，最多的比001株系提高了41%。青蒿酸和二氢青蒿酸含量测定表明，转基因青蒿株系的青蒿酸和二氢青蒿酸含量最多的比对照分别提高了47%和79%。这些结果表明，紫穗槐二烯合成在青蒿素生物合成途径中是一个限速步骤，同时，也显示青蒿酸或二氢青蒿酸的进一步转化也可能是青蒿素生物合成中下游的限速步骤。

水稻AP2/EREBP转录因子基因OsDRE和OsRAF的功能分析

AP2是一个大的转录因子家族，因其成员含有一个60-70 个氨基酸残基的保守结构域即AP2结构域而得名，它们的功能涉及植物花的发育以及植物对生物或非生物逆境的应答反应。根据它们所含的AP2 结构域的数目，这个家族可分为AP2亚家族和EREBP 亚家族。 AP2亚家族成员含两个AP2结构域，EREBP 亚家族成员含一个AP2结构域。一般来说，AP2 亚家族的成员主要参与植物发育过程的调控;EREBP 亚家族成员则主要参与对逆境的应答反应。按照它们响应外界刺激的类型和AP2结构域中结合顺式作用元件的核心氨基酸的不同，EREBP亚家族又可分为ERF和CBF/DREB两大类群，ERF 类主要响应生物类逆境的诱导，CBF/DREB类则响应干旱、低温等非生物胁迫的刺激。 根据AP2保守结构域搜索，水稻基因组中一共有147个AP2/EREBP成员，但其中功能得到证实的还非常有限。为了解更多AP2基因在植物生长发育过程中的功能，我们先从水稻基因组数据库中搜索到含有AP2/EREBP 结构域的推测基因序列，选择其中40个扩增并成功扩增出31个，将这些DNA片段点在尼龙膜上，然后用水稻叶片cDNA 作模板标记探针，与固定在膜上的推测基因杂交。杂交结果作为选择基因进行功能分析的重要依据。 OsDRE就是我们选择进行研究的一个表达较强的基因。首先，通过RACE 克隆得到OsDRE 的cDNA全长 1589bp，它编码318个氨基酸。Blast 搜索和保守结构域序列比对分析以及进化树分析显示它是一个新的ERF 基因。RT-PCR分析表明该基因在水稻各种组织中表达量比较一致，而且，OsDRE 既不对植物生长物质如乙烯，水杨酸（SA），茉莉酸甲酯（MJ），脱落酸（ABA），赤霉素（GA3），油菜素内酯（BR）的诱导起反应，同样也不响应环境因子如低温、干旱条件的处理。这些结果说明OsDRE是一个不响应胁迫相关因素的诱导的、组成型表达的水稻基因。用OsDRE的非保守区域构建的RNAi 载体转入水稻后未能使转基因水稻产生异常表型，然而，OsDRE在水稻和拟南芥中的过量表达都导致转基因植物出现植株矮小、开花延迟、生长周期延长以及育性降低等表型，说明OsDRE对生长和发育的影响在水稻和拟南芥中是一致的。 基于以上原因，我们选择在遗传分析方面有明显优势的拟南芥作为材料，对OsDRE基因功能进行研究并得出以下结论：（1）瞬时表达和随后的过量表达证明OsDRE定位于细胞核中，过量表达OsDRE引起转基因植株的生长周期变长、抽苔时间延迟和抽苔时莲座叶的数量增多;（2）过量表达OsDRE通过一种不影响细胞数量的方式抑制了细胞的膨胀从而导致植物器官以致整个植株变小，而且，在此过程中部分器官的形态也受到了影响;（3）OsDRE过量表达能激活已知位于乙烯信号途径下游的基因表达并且转基因植株幼苗在黑暗中出现下胚轴及根缩短变粗的现象，提示OsDRE 可能部分参与了乙烯信号途径下游的反应。 除此之外，我们还初步分析了另一个EREBP基因，并将其命名为OsRAF。氨基酸序列分析表明该基因与大麦的RAF 基因在蛋白水平上相似性最高。Northern 杂交结果进一步显示，与RAF 一样，OsRAF 也是根中优势表达的基因，并且它的表达量在乙烯或低温的诱导下增加。对转基因植株的观察和瞬时表达表明OsRAF 定位于细胞核中。 综上所述，对水稻基因OsDRE 和OsRAF的分析表明， OsDRE是一个新的ERF基因，它不受乙烯等因素的诱导并且过量表达该基因导致转基因植株出现细胞膨胀受到抑制等一系列的表型。另外，OsRAF在水稻根中优势表达并受乙烯和低温的诱导，目前，与之相关的功能研究正在进行。

复苏植物牛耳草干旱诱导的ACC氧化酶及乙烯调控的引导蛋白基因的克隆、表达与功能分析

本文以耐旱的牛耳草(Boea hygrometirica)为材料，研究了乙烯合成关键酶之一——ACC氧化酶编码基因（BhACO1）在干旱复苏过程中的诱导表达及其编码蛋白的酶活，分析了乙烯在干旱复苏过程中的积累及其对叶片复苏能力的影响和对干旱诱导基因的调控，探讨了一个受乙烯调控的干旱诱导的引导蛋白编码基因（BhDIR1）的表达及其功能。 利用cDNA微阵列技术从牛耳草干旱2h的叶片中得到一个ACC氧化酶基因片段，经5’-RACE���到全长cDNA，命名为BhACO1。BhACO1包含317个氨基酸，与其它植物中的ACC氧化酶具有80%左右的序列相似性。BhACO1基因受乙烯和干旱诱导、但ACC氧化酶抑制剂氯化钴可抑制其干旱诱导表达。BhACO1基因受ABA、2,4-D、SA、H2O2、CaCl2、EGTA及热害和盐害的诱导，但不受冷害诱导。原核表达的GST-BhACO1融合蛋白在体内体外均表现出ACC氧化酶的活性，而过量表达BhACO1的转基因植物的蛋白提取物也表现出较野生型更强的ACC氧化酶活性。 乙烯在牛耳草叶片干旱复水过程中随着时间延长而逐步积累。外源乙烯可诱导叶片黄化，但不影响叶片在复水后的复苏能力;氯化钴处理可部分地抑制乙烯合成而降低牛耳草叶片在干旱过程中乙烯的释放量，同时导致叶片失去复苏能力。与对照相比，氯化钴处理的叶片在干旱时仍可维持较低的离子渗漏水平，但复水后发生大量离子外渗，表明细胞膜完整性也遭到破坏;光系统ІІ活性下降程度在干旱时与对照相似，但复水后完全丧失。 乙烯诱导牛耳草干旱响应基因BhDohb561，BhLEA2和BhDIR1的表达，但不影响牛耳草干旱响应基因BhCML1，BhGRP1，BhSGP和BhLEA1的表达。除BhLEA1外，上述基因在干旱过程中的诱导表达均可被氯化钴预处理所抑制，尤其是BhSGP最明显。 BhDIR1在牛耳草干旱复水过程中mRNA明显地积累，乙烯、ABA、CaCl2、EGTA、H2O2、SA和热害、冷害、盐害都可诱导其表达。BhDIR1编码一个199个氨基酸的小分子量蛋白质，与松柏等植物中发现的可能参与木质素合成的引导蛋白具有约20-30%的序列相似性。与其它引导蛋白相同，BhDIR1在N’端包含一个外泌的信号肽，GFP定位分析表明BhDIR1定位于细胞膜和壁上。 上述结果表明，乙烯在牛耳草叶片耐脱水复苏反应中有不可或缺的作用，而ACC氧化酶所催化的反应是干旱诱导的乙烯合成中的关键步骤。氯化钴预处理通过抑制干旱过程中的乙烯合成，影响一系列基因的干旱诱导表达导致叶片在生理水平和细胞水平上造成了损伤，或是使牛耳草失去了在复水过程中原有的修复能力而无法恢复生命力。BhDIR1作为乙烯调控的下游靶基因之一，可能通过调控木质素的单体间的连接方式而改变木质素的物理性质来影响细胞壁的机械强度和柔韧性，减少干旱对细胞造成的机械伤害。

复苏植物牛耳草Boea hygrometrica耐旱复苏过程中LEA基因表达调控及功能研究

本实验室以复苏被子植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica (Bunge) R Br，牛耳草）为实验材料，利用cDNA微阵列技术，筛选到2个LEA蛋白的cDNA片段。它们在干旱条件下表达水平增加一倍以上。在上述基础上，通过5’-RACE���方法扩增得到这两个LEA基因的全长cDNA，BhLEA1和BhLEA2，发现二者编码蛋白均与玄参科复苏植物Craterostigma plantagineum中的第4组LEA蛋白pcCC2具有最高的同源性。PCR扩增得到的基因组序列中发现BhLEA1和BhLEA2在靠近5’端处各有一内含子，分别为97和171bp。利用tail-PCR和inverse-PCR扩增得到BhLEA2的1215bp的启动子序列，其中含ABRE、W-box、HDEs、MYB、MYC、和生长素响应元件等。两个基因在不同胁迫、激素等处理下都有诱导表达。构建过量表达载体, 转化烟草。筛选T2代的纯合体植株进行抗旱试验，测定了干旱过程中的土壤和叶片含水量，PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm、SOD和POD酶的活性及蛋白质降解程度，发现BhLEA1和BhLEA2过量表达的烟草抗旱性有明显提高，与野生型相比，叶片含水量和光系统Ⅱ活性下降慢、SOD和POD活性增高、蛋白质降解减少。Western blot检测发现在干旱时，野生型烟草的RbcL、LHCⅡ和PsBO蛋白明显降解，而转基因植物的几乎没有降解，或者降解较少，说明BhLEA的过量表达可以在一定程度上抑制干旱诱导的蛋白质降解。这些结果表明，BhLEA基因可能直接或间接地在牛耳草干旱过程中参与了保护蛋白质的作用，为牛耳草叶片的复苏提供了基础。

羊草cDNA文库的构建及果聚糖水解酶的分离与鉴定

羊草(Leymus chinensis(Trin.) Tzvel.)又称碱草，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。作为一种兼具重要经济价值和生态价值的优良牧草，羊草受到了广泛的关注。但长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，在分子生物学方面知之甚少。为了保存羊草基因资源，并在基因水平上研究羊草生物代谢的调控机理，本研究采用羊草根、叶片混合后做为材料，构建cDNA文库，并对文库中部分基因序列进行了分析。同时从中克隆获得羊草果聚糖水解酶全长基因并对这些基因进行了深入的生物信息学分析、转化毕赤酵母研究初步确定其功能，为深入了解羊草代谢的分子机制提供理论依据。主要结果如下： 1. 成功地构建了羊草根、叶混合cDNA文库，原始文库滴度达到4×106 pfu/ml，扩增文库滴度接近1011 pfu/ml ，重组率达97% 。PCR检测插入片段，均在0.5 kb到3 kb之间，l kb以上占68%。从文库中检测到了TC、γ-TMT、FEH基因，文库覆盖度达到要求且为PCR筛选文库提供了可能。 2. 随机挑取经检测过的597个单克隆进行测序，去除插入片段小于和污染序列后，获得了584条高质量的序列。所有584条EST序列与NCBI的核酸数据库比对时，有30.99%的EST序列与己知序列有很大的同源性：而与蛋白质数据库进行比对时，有61.27%的EST序列与已知序列有很大的同源性。核酸比对中，有32.87%的序列为未知功能新基因，而蛋白质比对结果只有11.27%的序列为未知功能新基因。其中获得5条全长基因。 3. 文库中测序得到果聚糖水解酶（FEH）片段，依据其核酸、蛋白序列，以羊草根茎为材料，结合果聚糖水解酶基因的保守序列设计引物，通过 RACE 方法，获得羊草果聚糖水解酶基因 Lc 1-FEH 的全长序列（2040bp），包含一个 1803bp 的开放阅读框，采用生物信息学方法对该基因编码蛋白质进行功能分析，该基因编码的氨基酸序列具有明显的果聚糖水解酶类蛋白特征(NDPNG，FRDP 和[WEC (V/P)D] 结构域)，其分子量为 66.8kD，等电点 pI 为 5.49，是一种酸性蛋白质。同源性分析结果表明Lc1-FEH与单子叶植物小麦、大麦和黑麦草细胞壁类酵素酶同源性最高，分别为89％、87％ 和72％。运用实时定量方法对Lc 1-FEH表达量在羊草发育各时期及不同逆境处理下进行测定，结果发现，幼苗中以叶中表达量最低，根茎中表达较高，成苗中花梗中的表达量最高；Lc1-FEH在转录水平明显受碱、ABA、SA及低温胁迫诱导，随着胁迫时间延长，表达量迅速增加，到达到最大值，之后表达水平逐渐降低，在盐、干旱的诱导下的表达量迅速降低。 4. 羊草果聚糖水解酶Lc1-FEH基因在毕赤酵母中的高效表达 将pMD-Lc1-FEH 质粒经双酶切后构建果聚糖酵母表达载体 pPICZα- Lc1-FEH 。将重组表达载体线性化后电击转化毕赤酵母Pichia pastoris X33，经抗生素 Zeocin 和酵母 PCR 筛选获得高效表达酵母工程菌。毕赤酵母表达的果聚糖水解酶蛋白经SDS-PAGE 分析表明Lc1-FEH表观分子量为 67 kD 左右。其最适反应 pH 值为 5.5，在 pH 值为 4.5~6.5 的范围内能保持较高的酶活力；表达Lc1-FEH的最适反应温度为 30 ℃；在温度在 20～30℃度范围内有较高的酶活。 Lc 1-FEH能够水解含有β-2，1糖苷键类型果聚糖：蔗果四糖、菊粉、6-蔗果三糖；而对β-2，6糖苷键类型果聚糖：6-蔗果三糖、新蔗果三糖、细菌类果聚糖及蔗糖基本不具水解活性。