Développement du cartilage articulaire équin du fœtus à l’adulte : imagerie par résonance magnétique et microscopie en lumière polarisée

La structure du cartilage articulaire adulte est caractérisée par la présence de couches créées par l’orientation des fibres de collagène (Benninghoff, 1925). Avant de présenter la structure adulte classique en arcades “de Benninghoff”, le cartilage subit une série de changements au cours de sa maturation (Julkunen et al., 2010; Lecocq et al., 2008). Toutefois, un faible nombre d’études s’est intéressé à la structure du collagène du cartilage articulaire in utero. Notre objectif était d’étudier la maturation de la surface articulaire de l’épiphyse fémorale distale chez le cheval, en employant à la fois l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la microscopie en lumière polarisée après coloration au rouge picrosirius, au niveau de sites utilisés dans les études de réparation tissulaire et de sites prédisposés à l’ostéochondrose (OC). Le but était de décrire le développement normal du réseau de collagène et la relation entre les images IRM et la structure histologique. Des sections provenant de cinq sites de l’épiphyse fémorale distale de 14 fœtus et 10 poulains et adultes ont été colorées au rouge picrosirius, après que le grasset ait été imagé par IRM, dans l’optique de visualiser l’agencement des fibres de collagène de type II. Les deux modalités utilisées, IRM et microscopie en lumière polarisée, ont démontré la mise en place progressive d’une structure en couches du réseau de collagène, avant la naissance et la mise en charge de l’articulation.

The role of Microsomal prostaglandin synthase-1 (mPGES-1) and Ephrin B2 in Scleroderma

La sclérodermie (sclérose systémique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractérisée  par  l’épaississement  de  la  peau,  l’apparition  spontanée de lésions cicatricielles, des maladies   des   vaisseaux   sanguins,   divers   degrés   d’inflammation,   en   association   avec   un   système   immunitaire hyperactif. La pathogénèse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement approprié   n’est   disponible.   La fibrose est un élément distinctif de la maladie de ScS et est considérée   résulter   d’une   incapacité   à   mettre   fin   de   façon   appropriée   à   la   réponse   normale   de   réparation   des   plaies.   L’analyse   histologique   du   stade   initial   de   la   ScS   révèle   une   infiltration   périvasculaire de cellules mononucléaires dans le derme, associée à une synthèse accrue de collagène dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la compréhension des moyens de contrôler le stade inflammatoire de la ScS pourrait être bénéfique pour contrôler la progression de la maladie peu après son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygénase (COX) pour catalyser spécifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1  joue  un  rôle  clé  dans  l’inflammation,  la  douleur  et  l’arthrite;;  toutefois,  le   rôle de la mPGES-1 dans les mécanismes de fibrose, spécifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a précédemment montré que les souris à mPGES-1 nulle sont résistantes à la fibrose   cutanée   induite   par   la   bléomycine,   à   l’inflammation,   à   l’épaississement  cutané,  à  la  production  de  collagène  et  à  la  formation  de  myofibroblastes.  Sur  la   base  de  ces  résultats,  j’ai  formulé  l’hypothèse  que  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1 régulera à la baisse la production de médiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie   de   ScS.   Afin   d’explorer   le   rôle   de   la   mPGES-1   dans   l’inflammation   et   la   fibrose   associées  à  la  maladie  de  ScS,  j’ai  d’abord  examiné  l’expression  de  la  mPGES-1 dans la peau normale comparativement à des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes résultats ont montré que la mPGES-1 est nettement élevée dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 dérivés de la mPGES-1 étaient également significativement plus élevés dans les fibroblastes cutanés isolés de patients  atteints  de  ScS  comparativement  aux  fibroblastes  isolés  de  témoins  sains.  J’ai  également   étudié  l’effet  de  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1  sur  l’expression  de  marqueurs  pro- fibreux.   Mes   études   ont   montré   que   l’expression   de   médiateurs   pro-fibreux clés (α-SMA, endothéline-1, collagène de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est élevée dans les fibroblastes cutanés ScS en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de réduire significativement l’expression  de  l’α-SMA,  de  l’endothéline-1, du collagène de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes  ScS,  sans  effet  significatif  sur  les  fibroblastes  normaux.  J’ai  en  outre  examiné  l’effet   de  l’inhibition  de  la  mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires clés impliquées dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1.  L’inhibition  pharmacologique  de  la  mPGES- 1 a eu pour effet de réduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lésion ScS comparativement à des fibroblastes non traités. De plus, les patients atteints de ScS ont présenté des niveaux plus élevés de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. L’inhibiteur  de  la  mPGES-1 a pu réguler à la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3,  dans  les  fibroblastes  ScS.  Ces  résultats  ont  suggéré  que  l’inhibition   de la mPGES-1 pourrait être une méthode viable pour réduire le développement de sclérose cutanée et constituent une cible thérapeutique potentielle pour contrôler les mécanismes fibreux et inflammatoires associés à la pathophysiologie de la maladie de ScS. L’un   des   autres   processus   critiques   reliés   à   l’évolution de la réponse fibreuse associée à la maladie de ScS est la différenciation des fibroblastes en des cellules activées spécialisées iii iv appelées myofibroblastes, responsables de déclencher une signalisation adhésive excessive et le dépôt excessif de matrice extracellulaire,   conduisant   à   la   destruction   de   l’architecture   de   l’organe.   Ainsi,   l’identification   des   facteurs   endogènes   qui   initient/   favorisent   la   différenciation   fibroblaste-myofibroblaste peut mener à des stratégies thérapeutiques prometteuses pour contrôler  l’excès  de  signalisation  adhésive  et  de  fibrose  associé  à  la  maladie  de  ScS.  Des  études   antérieures  dans  le  domaine  de  la  biologie  du  cancer  ont  suggéré  que  l’éphrine  B2,  une  protéine   transmembranaire appartenant à la famille des éphrines, est impliquée dans la signalisation adhésive   et   le   remodelage   extracellulaire.   Cependant,   son   rôle   dans   la   fibrose   n’a   jamais   été   exploré.   Dans   la   deuxième   partie   de   mon   étude,   j’ai   donc   étudié   le   rôle   de   l’éphrine   B2   dans   la   fibrose.   Mes   études   montrent   que   l’expression   de   l’éphrine   B2   est   significativement   augmentée   dans la peau humaine ScS comparativement à la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de   fibroblastes   de   la   peau   humaine   normale   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractéristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de  fibres  de  tension,  des  adhérences  focales,  l’activation  accrue  de  la  FAK,  un  accroissement  de   l’expression  et  de  la  migration  de  fibroblastes  et  de  leur  adhérence  à  la  fibronectine  à  la  fois  chez   les   fibroblastes   cutanés   normaux   et   ScS.   En   outre,   j’ai   traité   des   souris   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante et montré que ces souris ont développé une fibrose cutanée significative associée à une épaisseur dermique et à une synthèse de collagène augmentées, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagène) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de   l’α-SMA, une activation augmentée de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagène de type 1 et le FCTC. Dans  l’ensemble,  mes  études  ont  identifié  deux  médiateurs  endogènes  cruciaux  impliqués  dans  la   propagation  de  l’inflammation  et  de  la  fibrose  associées  à  la  maladie  de  ScS.  L’inhibition  de  la   mPGES-1   pourrait   représenter   une   bonne   stratégie   alternative   pour   contrer   l’inflammation   et   la   fibrose au moins durant les stades précoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive   de   l’éphrine B2 favorise la signalisation adhésive et fibreuse en déclenchant la différenciation   de   fibroblastes   en   myofibroblastes   par   l’activation   de   la   voie   de   signalisation   de   la  FAK.  Ainsi,  l’inhibition  d’éphrine  B2  bloquera  la  formation  de  fibroblastes-myofibroblastes et régulera à la baisse la fibrose associée à la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1  et  l’éphrine   B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont reliés.

Étude in vitro de l’implication des cytokines de type Th17 dans la fibrose hépatique

Introduction: L’activation des cellules stellaires hépatiques (CSHs) est un point clé du processus de fibrose hépatique. Les lymphocytes T CD4+ intra-hépatiques sont une source majeure de cytokines anti-inflammatoires comme l’IL-10 et pro-inflammatoire (IL-17A), hépatoprotectrice (IL-22) produites par les Th17. Les Th17 sont impliqués dans de nombreuses pathologies inflammatoires mais l’effet de ces cellules sur les CSHs n’est pas encore élucidé. Objectif: Comprendre le rôle des cytokines de type Th17 dans le processus d’activation des CSHs. Méthodes: La lignée de CSHs humaine LX2 a été stimulée par l’IL-17A ou l’IL-22 puis comparée à des cellules traitées par le TGF-b et le tampon phosphate salin (PBS). L’activation des CSHs a été évaluée en examinant les molécules profibrotique alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagène de type I (COL1A1) et inhibiteur produits par les tissus des métalloprotéases matricielles I (TIMP-I) par q-PCR. L’expression protéique a été validée par immunobuvardage ou coloration au rouge de picro Sirius. L’expression membranaire de l’IL-10Rb, du TGF-b-RII et de l’IL-17RA a été mesurée par cytométrie en flux. Résultats: L’IL-17A et l’IL-22 n’activent pas les cellules LX2, car aucune induction d’a-SMA, de COL1A1 et de TIMP-I n’a été observée. Cependant, l’IL-17A et l’IL-22 sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b, tel que démontré par une forte expression et production d’a-SMA, collagène type I et TIMP-I. L’IL-17A, mais pas l’IL-22, induit la surexpression à la surface cellulaire du TGF-b-RII et inhibe partiellement la baisse d’expression du TGF--RII après stimulation au TGF-b. Conclusion: Nos résultats démontrent une fonction pro-fibrotique de l’IL-17A et de l’IL-22, car les deux cytokines sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b. L’IL-17A agit via la surexpression et la stabilisation du TGF-b-RII tandis que l’IL-22 agit probablement par des mécanismes intracellulaires.

Reconstruction et étude de la variabilité du régime alimentaire des sociétés préhispaniques de la basse vallée de Santa, Pérou

Ce projet de recherche porte principalement sur la reconstruction du régime alimentaire à l’aide d’une approche paléochimique. Des analyses isotopiques du carbone de l’azote ont été réalisées sur le collagène des os sur un échantillon de trente-huit individus provenant de trois sites différents de la basse vallée de Santa, sur la côte nord du Pérou : El Castillo, Guadalupito et Huaca China. Parmi les individus sélectionnés, certains sont affiliés aux groupes des Gallinazo, des Mochica, des Tanguche ou des Chimú couvrant ainsi la Période intermédiaire ancienne, l’Horizon moyen et la Période intermédiaire récente. L’approche isotopique a été utilisée afin de caractériser dans un premier temps, le régime alimentaire de la population globale en la comparant à d’autres groupes préhispaniques de l’Aire andine. Les résultats obtenus sur trente-deux individus suggèrent une alimentation variée incluant le maïs ainsi que des ressources marines, illustrant que ces groupes agriculteurs exploitaient les deux types d’écosystèmes à leur portée. Ces résultats sont supportés par l’analyse du carbone sur l’apatite pour cinq individus. Le second but fut d’étudier la variabilité du régime alimentaire entre les différents individus de l’échantillon, en fonction de la période d’occupation, du site de provenance, de l’affiliation culturelle, de l’âge et du sexe et du statut social. La petite taille de l’échantillon a limité considérablement la discussion de ces différents paramètres. Il a toutefois été possible de remarquer un accès aux ressources riches en protéines plus avantageux pour les hommes et la présence de possibles différences dans l’alimentation chez les individus juvéniles. Finalement, la confrontation des données funéraires à la reconstruction du régime alimentaire a été faite pour cinq cas particuliers de pratiques funéraires provenant du site El Castillo, premier centre régional de la civilisation Mochica dans la basse vallée de Santa. Dans tous les cas, le régime alimentaire suggéré par les compositions isotopiques supporte les interprétations des statuts sociaux de ces individus faites à partir des contextes funéraires.

La rigidité artérielle, induite par une calcification des carotides, altère l’homéostasie cérébrale chez la souris

La rigidité artérielle est considérée comme un facteur de risque important pour le développement du déclin cognitif. Toutefois, les effets précis de la rigidité artérielle sur le cerveau sont peu connus et, à ce jour, aucun modèle animal ne permet d’étudier l’effet isolé de ce facteur sur l’homéostasie cérébrale. Dans cette étude, nous avons développé un nouveau modèle de rigidité artérielle qui se base sur la calcification de l’artère carotide chez la souris. Au niveau artériel, ce modèle présente une fragmentation de l’élastine, une augmentation de la distribution du collagène et de l’épaisseur intima-média ainsi qu’une diminution de la compliance et de la distensibilité artérielles démontrant la rigidité artérielle. De plus, le modèle ne présente pas d’augmentation de pression artérielle ni de changement de rayon du lumen indiquant une absence d’hypoperfusion globale et d’anévrisme. Au niveau cérébral, les résultats montrent que la rigidité artérielle induit une augmentation de la pulsatilité du flux sanguin cérébral menant ainsi à une augmentation du stress oxydatif. Ce dernier induit une inflammation cérébrale, détectée par l’activation de la microglie et des astrocytes, induisant ultimement une neurodégénérescence. Ces effets sont surtout observés au niveau de l’hippocampe, la région cruciale pour la mémoire et la cognition. Ainsi, cette étude montre que la rigidité artérielle altère l’homéostasie cérébrale et mérite d’être considérée comme une cible potentielle dans la prévention et le traitement des dysfonctions cognitives chez les personnes âgées.

Description du développement épiphysaire du tarse et du grasset équin à l’IRM et au CT : un pas vers la compréhension de l’OCD

L’ostéochondrite disséquante (OCD) est un défaut focal du processus d’ossification endochondrale en des sites spécifiques au niveau épiphysaire. Elle est caractérisée par la présence de fragments ostéochondraux pouvant se détacher de la surface articulaire. Cette maladie a un impact majeur sur les performances athlétiques des chevaux. Les deux hypothèses principales présentement véhiculées quant à sa pathogénie sont une nécrose ischémique du cartilage de croissance et une altération du métabolisme de la matrice de collagène de type II au sein du cartilage de croissance. Malgré de nombreuses années de recherche sur le sujet, plusieurs aspects de cette maladie demeurent inconnus. L’objectif de cette étude était de décrire le développement épiphysaire équin au niveau du membre pelvien à l’aide de l’imagerie médicale afin de déterminer si des variations du processus de maturation à certains sites pouvaient être un facteur prédisposant au développement de lésions d’OCD. Des membres pelviens de fœtus et de jeunes poulains ont été étudiés post-mortem. L’épiphyse du fémur distal, tibia distal et du talus ont été examinées par tomodensitométrie (CT) et résonnance magnétique 1.5 Tesla (IRM) dans le but de documenter le degré et le patron d’ossification, la régularité du front d’ossification, de même que le pourcentage du diamètre épiphysaire demeurant occupé par le complexe de cartilage articulaire-épiphysaire, et ce au niveau de certains sites prédéterminés. Les centres secondaires d’ossification (SOCs) ont été détectés pour la première fois à 7 mois de gestation (MOG) au niveau de l’épiphyse fémorale distale et à 8 MOG au niveau de l’épiphyse tibiale distale et du talus. À 8-9 MOG la lèvre latérale de la trochlée fémorale, la malléole médiale du tibia (MM) et la partie crâniale de la crête intermédiaire du tibia distal (DIRT(Cr)), tous des sites prédisposés à la maladie, avaient le plus haut pourcentage de cartilage de tous les sites évalués. Post-partum, le pourcentage de cartilage de la MM et de la DIRT(Cr) sont demeurés importants. Le CT et l’IRM ont su illustrer le développement épiphysaire équin et soutenir d’avantage le fait qu’un cartilage plus épais à certains sites articulaires pourrait avoir un rôle dans le développement de lésions d’OCD.

The roles of TL1A and Pno1 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique. Elle est caractérisée par une inflammation persistante touchant de multiples petites articulations, causant douleurs, rougeurs, gonflements et déformations. Des études menées auprès de patients et d’animaux ont démontré que certains auto-anticorps, cytokines et enzymes tissue-déstructives sont des médiateurs importants dans le développement de la PR. Au cours des deux dernières décennies, les traitements de fond (DMARDs en anglais) ont été démontrés très efficaces pour traiter la PR. D'autre part, des effets secondaires ont été rapportés pour ces traitements, par exemple l'augmentation du risque d'infections opportunistes. L’objectif de ce travail est d’acquérir des connaissances sur le rôle du TL1A (TNF-like molécule 1 A; TNFSF15) et son partenaire Nob1 (Pno1 ; YOR145c) dans la pathogenèse de la PR afin de découvrir de nouveaux médicaments contre ces molécules dans l'avenir. TL1A est un membre de la famille du TNF. Il déclenche des signaux co-stimulateurs via le récepteur de mort 3 (DR3) et induit la prolifération ainsi que la production des cytokines pro inflammatoires par les lymphocytes. Des données multiples suggèrent l'implication de la cascade TL1A-DR3 dans plusieurs maladies auto-immunes. Donc, nous avons proposé les hypothèses suivantes:1) la production locale de TL1A dans les articulations est un composant d’un cercle vicieux qui aggrave la PR; 2) dans la PR, la production de TL1A dans les organes lymphoïde augmente la production d’auto-anticorps pathogénique. Au cours de ce travail, nous avons démontré que la TL1A aggrave la maladie chez les souris où l’arthrite a été induite par le collagène (AIC). Par ailleurs, nous avons constaté que l’expression de TL1A est élevée dans les tissus atteints de PR ainsi que dans les ganglions lymphatiques drainant de la souris AIC. Mécaniquement, nous avons découvert que la TL1A est induite par le TNF-α et IL-17 produits par les cellules T in vitro. Ces résultats montrent directement que les TL1A-DR3 jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la PR. De plus, afin de poursuivre notre étude, la TL1A a été génétiquement supprimée dans les souris (TL1A KO). Nous avons montré que les souris TL1A KO n’ont aucune anomalie apparente et aucun dysfonctionnement du système immunitaire dans des conditions normales. Cependant, ces souris manifestent des AIC améliorées et une réduction significative des niveaux d'anticorps, anti-collagène du type II i dans le sérum. Nous avons trouvé que les ganglions lymphatiques de drainage (dLNs) de souris KO étaient plus petites avec une cellularité inférieure comparativement aux souris WT de 14 jours après l’immunisation. De plus, nous avons découvert que le DR3 a été exprimé par les cellules plasmatiques dans l’étape de la différenciation terminale et ces cellules surviennent mieux en présence de TL1A. La conclusion de cette étude apporte des nouvelles connaissances sur le rôle de TL1A qui amplifie les réponses humorales d’AIC. Nous avons suggéré que TL1A pourrait augmenter la réponse d’initiation d'anticorps contre collagène II (CII) ainsi que prolonger la survie des cellules plasmatiques. Une autre molécule qui nous intéresse est Pno1. Des études antérieures menées chez la levure ont suggéré que Pno1 est essentielle pour la néogénèse du protéasome et du ribosome Le protéasome étant crucial pour la différenciation terminale des cellules plasmatiques pendant les réponses humorales chez les mammifères, nous avons donc supposé que Pno1 joue un rôle dans la production d'anticorps pathogenique dans la PR via la voie du protéasome. Nous avons donc généré des souris génétiquement modifiées pour Pno1 afin d’étudier la fonction de Pno1 in vivo. Cependant, une mutation non-sens dans le Pno1 provoque une létalité embryonnaire à un stade très précoce chez les souris. D'autre part, une réduction de 50% de Pno1 ou une surexpression de Pno1 n’ont aucun effet ni sur le fonctionnent des cellules T et B, ni sur les activités du protéasome ainsi que sur la réponse humorale dans l’AIC. Ces résultats suggèrent que Pno1 est une molécule essentielle sans redondance. Par conséquent, il n’est pas une cible appropriée pour le développement de médicaments thérapeutiques. En conclusion, nos études ont révélé que la TL1A n’est pas essentielle pour maintenir les fonctions du système immunitaire dans des conditions normales. En revanche, il joue un rôle critique dans la pathogenèse de la PR en favorisant l'inflammation locale et la réponse humorale contre des auto-antigènes. Par conséquent, une inhibition de la TL1A pourrait être une stratégie thérapeutique pour le traitement de la PR. Au contraire, Pno1 est essentiel pour la fonction normale des cellules. Une délétion totale pourrait entraîner des conséquences graves. Il n’est pas une cible appropriée pour développer des médicaments de la PR.

Identification et caractérisation des principaux fragments du collagène de type II du cartilage équin, produit in vitro par l'enzyme cathepsine K

La dégradation protéolytique du collagène de type II est considérée comme étant un facteur majeur dans le processus irréversible de dégradation de la matrice cartilagineuse lors d’ostéoarthrose. Outre les collagénases de la famille des métaloprotéinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dégrader la triple hélice intacte du collagène de type II, devenant ainsi un élément pertinent pour les recherches sur l’ostéoarthrose. L’objectif à court terme de notre étude consiste en l’identification et la caractérisation de sites de clivage spécifiques de la cathepsine K sur le collagène de type II équin. La technique d’électrophorèse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des résultats de la caractérisation moléculaire des fragments protéolytiques. La caractérisation est réalisée en combinant la digestion trypsique précédant l’analyse HPLC-ESI/MS. Les résultats ont permis d’établir les sites, présents sur la carte peptidique de la molécule de collagène de type II équin, des 48 résidus prolines (P) et 5 résidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, différents de ceux produits par les MMPs, sont observés par SDS-PAGE 1D puis confirmés par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifié suggère un site de clivage différent de l’étude antérieure sur le collagène de type II bovin et humain. L’objectif à long terme serait le développement d’anticorps spécifiques au site identifié, permettant de suivre l’activité protéolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et ÉLISA, dans le cadre du diagnostic de l’ostéoarthrose.

The specific in vivo role of PPARgamma and its downstream signaling pathway in the pathophysiology of Osteoarthritis

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative, avec une pathogenèse inconnue. Des études récentes suggèrent que l'activation du facteur de transcription du récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thérapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPARγ inhibent l'inflammation et réduisent la synthèse des produits de dégradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des études utilisant des agonistes du PPARγ n’élucident pas les effets exacts médiés par ce gène complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacité de régulariser d'autres voies de signalisation indépendantes de PPARγ, ainsi entraînant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacité thérapeutique avec potentiellement moins de problèmes de sécurité, il est donc essentiel d'élucider, in vivo, le rôle exact de PPARγ dans la physiopathologie OA. Mon projet de thèse permettra de déterminer, pour la première fois, le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle du gène PPARγ dans le cartilage. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Pour tester cette hypothèse, j'ai généré deux types de souris avec une délétion au PPARγ, (a) une suppression du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage germinale pour l'étude de l'arthrose liée au développement et à l'âge et (b) la suppression inductible du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les études OA. L’étude précédente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une délétion au gène PPARγ germinales, montre que ces souris présentent des anomalies du développement du cartilage. J'ai également exploré si ces souris qui présentent des défauts précoces du développement ont toutes les modifications phénotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes résultats ont montré que les souris adultes, ayant une délétion au gène PPARγ, ont présenter un phénotype de l'arthrose spontanée associée à une dégradation du cartilage, l’hypocellularité, la fibrose synoviale. Cette étude a montré que PPARγ est un régulateur essentiel pour le cartilage, et c’est le manque (l’absence) de ce dernier qui conduit à un phénotype de l'arthrose spontanée accélérée (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'étude, on n’a pas pu vérifier si ces souris présentaient l’OA spontanée en raison des défauts de développement ou à la suite de la délétion du gène PPARγ. Pour contourner les défauts de développement, j'ai généré des souris ayant une délétion du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage inductible avec le système Col2rTACre. Ces souris ont été soumises à modèle de la chirurgie OA (DMM: déstabilisation du ménisque médial) et les résultats révèlent que les souris PPARγ KO ont une dégradation accélérée du cartilage, une hypocellularité, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un évènement critique qui initie la dégradation de cartilage dans OA. Les études récentes suggèrent que le procès d’autophagie, une forme de survie cellulaire programmée, est altéré pendant l’OA et peut contribuer vers une protection diminuée des cellules, résultant la dégradation du cartilage. J’ai donc exploré le rôle de PPARγ dans la protection des cellules en déterminant l’effet de manque de PPARγ dans le cartilage par l’expression de mTOR (régulateur négatif principal d’autophagie) et les gènes d’autophagie durant OA. Mes résultats ont montré que les souris KO PPARγ présentent également une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur l’expression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isolés des souris contrôles OA. J'ai suggéré l'hypothèse que PPARγ contrôle la régulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et l’expression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothèse, j’ai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPARγ-KO avec le vecteur d’expression de PPARγ pour déterminer si la restauration de l'expression de PPARγ peut sauver le phénotype des cellules PPARγ-KO OA. J'ai observé que la restauration de l'expression de PPARγ dans les cellules PPARγ-KO en présence du vecteur d'expression PPARγ, a pu considérablement régulariser négativement l'expression de mTOR et mettre en règle positivement l'expression des gènes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagène de type II et l’aggrecan et de baisser de manière significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que l’augmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phénotype OA accélérée observée dans les souris PPARγ KO in vivo, j'ai généré les souris doubles KO PPARγ- mTOR inductible spécifique du cartilage en utilisant le système Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris à DMM modèle de l'arthrose. Mes résultants démontrent que les souris avec PPARγ- mTOR doubles KO ont été significativement protégés contre les OA DMM induites associées à une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protéoglycanes et la perte de chondro-cellularité par rapport aux souris témoins. Considérant que mTOR est un répresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouvé que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a été significativement plus élevée dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPARγ-mTOR par rapport aux souris témoins. En plus, les études de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les études in vivo utilisant les souris doubles KO PPARγ- mTOR montrent que PPARγ est impliqué dans la régulation de la protéine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces résultats contournent PPARγ et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose.

Influence de la fibrose hépatique sur le développement du carcinome hépatocellulaire

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un cancer au pronostic sombre, car il est souvent diagnostiqué trop tardivement pour entreprendre un traitement curatif. Il se développe dans 80-90% des cas sur fond de cirrhose. On connait mal comment la fibrose, étape préliminaire à la cirrhose, et son principal constituant, le collagène de type 1 (COL1), peuvent jouer un rôle dans le processus du CHC. Nous avons tout d’abord étudié le développement de la fibrose dans un modèle utilisant la souris nue. Nous avons déterminé qu’après 16 semaines d’administration de thioacétamide dans l’eau de boisson, il est possible d’obtenir une fibrose suffisante pour induire une hépatoprotection en présence de différents hépatotoxiques (AST dans le sérum de souris fibrotiques vs non-fibrotiques : Anti-Fas JO2 (4665 ± 2596 vs. 13953 ± 2260 U/L; P<0.05), acétaminophène (292 ± 66 vs. 4087 ± 2205 U/L; P<0.01) et CCL4 (888 ± 268 vs. 15673 ± 2782 U/L; P<0.001)). Ces résultats confirment que la présence de COL1 et de fibrose favorise la survie des hépatocytes normaux tel qu’observé précédemment au laboratoire. Par la suite, nous avons sélectionné in vivo, par injection intrasplénique de la lignée de CHC Hepa1-6, une lignée à forte tumorigénicité nommée dt-Hepa1-6 (28±12 lésions vs. 0±0 lésions à 21 jours). Cette lignée était composée d’une sous-population cellulaire arborant la protéine de surface EpCAM (34.0±0.1%). Par tri cellulaire, nous avons démontré que ces cellules étaient partiellement responsables de la tumorigénicité accrue (EpCAM + (86.7±2.3%) :1093±74 lésions vs. EpCAM- (15.3±1.0%) :473±100 lésions; P<0.01). Nous avons alors démontré que la présence de fibrose favorise le développement de la lignée dt-Hepa1-6 in vivo (604±242 vs 22±9 lésions; P<0.05). De plus, la présence de fibrose réduit l’efficacité du traitement au cisplatin in vivo (44.5±4.9 vs. 78.7±6.9%; P<0.01) confirmant les résultats obtenus in vitro (Apoptose : COL1 13.75±0.44% vs. plastique 31.45±1.37%; P<0.001). En conclusion, la présence de fibrose et de son principal constituant, le COL1, favorise la survie et la progression du CHC.

Effect of osteogenesis imperfecta on orthodontic tooth movement in a mouse model

Thesis written in co-mentorship with director: Nelly Huynh; co-directors: Frank Rauch and Jean-Marc Retrouvey; collaborators: Clarice Nishio, Duy-Dat Vu and Nathalie Alos

Caractérisation du gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-2 dans le rein diabétique et implication dans le développement de la néphropathie diabétique et de l'hypertension

De nombreuses études ont bien démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) joue un rôle important dans le développement de l’hypertension et de la néphropathie diabétique (DN). La découverte de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) et l’identification du récepteur MAS, spécifique pour l’angiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis d’identifier deux nouveaux membres du RAS. L’axe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de l’axe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs évidences impliquent la contribution du RAS intrarénal dans la DN. Des études réalisées dans notre laboratoire avec des souris transgéniques surexprimant l’angiotensinogène de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rénaux (RPTCs) ont permis de démontrer l’importance du RAS intrarénal dans l’induction de l’hypertension et les dommages rénaux. Nous avons également observé que l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’ANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabète de type 1) et qu’un traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser l’expression de l’ACE2 et de prévenir le développement de l’hypertension dans le modèle des souris Akita. Dans un milieu diabétique, à la fois la glycémie et l’angiotensine II (Ang II) peuvent induire la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS), contribuant ainsi aux dommages rénaux. Afin d’explorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons créé des souris Akita transgéniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabétique de type 1 à notre modèle de souris transgéniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde étude, des souris Akita ont été traitées avec l’Ang 1-7 ou une combinaison d’Ang 1-7 et de son antagoniste, A779, afin d’étudier la relation entre l’action de l’Ang 1-7, l’hypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rénaux, ACE2 et l’expression du récepteur Mas. Nos résultats ont montré que la surexpression de Cat atténue le stress oxydatif rénal; prévient l’hypertension, améliore le taux de filtration glomérulaire, l’albuminurie, l’hypertrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’apoptose tubulaire; et supprime l’expression des gènes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque comparées aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’Ang 1-7. D’autre part, l’administration d’Ang 1-7 prévient l’hypertension systémique, normalise le ratio albumine/créatinine urinaire et atténue l’hyperfiltration glomérulaire des souris Akita, sans affecter la glycémie sanguine. De plus, le traitement avec l’Ang 1-7 atténue aussi le stress oxydatif et l’expression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) et collagène IV, tout en augmentant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renversés par la co-admininstration d’A779. Ces résultats démontrent que la surexpression de Cat prévient l’hypertension et la progression de la néphropathie, en plus de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif intrarénal et l’expression de l’ACE2 comme facteurs contribuant à l’hypertension et les dommages rénaux observés dans le diabète. En outre, nos données suggèrent que l’Ang 1-7 joue un rôle protecteur dans l’hypertension et les dommages aux RPTC dans le diabète, principalement en réduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas. Nos résultats indiquent aussi que l’Ang 1-7 pourrait agir comme un agent thérapeutique potentiel dans le traitement de l’hypertension systémique et les dommages rénaux observés dans le diabète. En conséquence, l’Ang 1-7 est responsable du rôle protecteur de l’ACE2 dans l’hypertension et la DN.

Cardiac cell fate control by the imidazoline I1 receptor/nischarin : application in cardiac pathology

La moxonidine, un médicament antihypertenseur sympatholytique de type imidazolinique, agit au niveau de la médulla du tronc cérébral pour diminuer la pression artérielle, suite à l’activation sélective du récepteur aux imidazolines I1 (récepteur I1, aussi nommé nischarine). Traitement avec de la moxonidine prévient le développement de l’hypertrophie du ventricule gauche chez des rats hypertendus (SHR), associé à une diminution de la synthèse et une élévation transitoire de la fragmentation d’ADN, des effets antiprolifératifs et apoptotiques. Ces effets se présentent probablement chez les fibroblastes, car l’apoptose des cardiomyocytes pourrait détériorer la fonction cardiaque. Ces effets apparaissent aussi avec des doses non hypotensives de moxonidine, suggérant l’existence d’effets cardiaques directes. Le récepteur I1 se trouvé aussi dans les tissus cardiaques; son activation ex vivo par la moxonidine stimule la libération de l’ANP, ce qui montre que les récepteurs I1 cardiaques sont fonctionnels malgré l’absence de stimulation centrale. Sur la base de ces informations, en plus du i) rôle des peptides natriurétiques comme inhibiteurs de l’apoptose cardiaque et ii) des études qui lient le récepteur I1 avec la maintenance de la matrix extracellulaire, on propose que, à part les effets sympatholytiques centrales, les récepteurs I1 cardiaques peuvent contrôler la croissance-mort cellulaire. L’activation du récepteur I1 peut retarder la progression des cardiopathies vers la défaillance cardiaque, en inhibant des signaux mal adaptatifs de prolifération et apoptose. Des études ont été effectuées pour : 1. Explorer les effets in vivo sur la structure et la fonction cardiaque suite au traitement avec moxonidine chez le SHR et le hamster cardiomyopathique. 2. Définir les voies de signalisation impliquées dans les changements secondaires au traitement avec moxonidine, spécifiquement sur les marqueurs inflammatoires et les voies de signalisation régulant la croissance et la survie cellulaire (MAPK et Akt). 3. Explorer les effets in vitro de la surexpression et l’activation du récepteur I1 sur la survie cellulaire dans des cellules HEK293. 4. Rechercher la localisation, régulation et implication dans la croissance-mort cellulaire du récepteur I1 in vitro (cardiomyocytes et fibroblastes), en réponse aux stimuli associés au remodelage cardiaque : norépinephrine, cytokines (IL-1β, TNF-α) et oxydants (H2O2). Nos études démontrent que la moxonidine, en doses hypotensives et non-hypotensives, améliore la structure et la performance cardiaque chez le SHR par des mécanismes impliquant l’inhibition des cytokines et des voies de signalisation p38 MAPK et Akt. Chez le hamster cardiomyopathique, la moxonidine améliore la fonction cardiaque, module la réponse inflammatoire/anti-inflammatoire et atténue la mort cellulaire et la fibrose cardiaque. Les cellules HEK293 surexprimant la nischarine survivent et prolifèrent plus en réponse à la moxonidine; cet effet est associé à l’inhibition des voies ERK, JNK et p38 MAPK. La surexpression de la nischarine protège aussi de la mort cellulaire induite par le TNF-α, l’IL-1β et le H2O2. En outre, le récepteur I1 s’exprime dans les cardiomyocytes et fibroblastes, son activation inhibe la mort des cardiomyocytes et la prolifération des fibroblastes induite par la norépinephrine, par des effets différentiels sur les MAPK et l’Akt. Dans des conditions inflammatoires, la moxonidine/récepteur aux imidazolines I1 protège les cardiomyocytes et facilite l’élimination des myofibroblastes par des effets contraires sur JNK, p38 MAPK et iNOS. Ces études démontrent le potentiel du récepteur I1/nischarine comme cible anti-hypertrophique et anti-fibrose à niveau cardiaque. L’identification des mécanismes cardioprotecteurs de la nischarine peut amener au développement des traitements basés sur la surexpression de la nischarine chez des patients avec hypertrophie ventriculaire. Finalement, même si l’effet antihypertenseur des agonistes du récepteur I1 centraux est salutaire, le développement de nouveaux agonistes cardiosélectifs du récepteur I1 pourrait donner des bénéfices additionnels chez des patients non hypertendus.

Role of Nuclear Angiotensin-II Receptor Mediated Signalling in Cardiovascular Remodelling

Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle. Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.

Évolution des pratiques alimentaires en cours de vie : une étude isotopique multi-matérielle de la population du cimetière Saint-Matthew (Québec, 1771-1860)

En tant que population majoritairement immigrante, les protestants inhumés au cimetière Saint-Matthew, ville de Québec (1771-1860) ont dû s'adapter à un nouvel environnement à leur arrivée au Québec, et donc à de nouvelles ressources. Parallèlement, les 18e et 19e siècles sont marqués par un contexte socio-économique en pleine mutation avec l'arrivée graduelle de la période industrielle, et la ville de Québec, avec son contexte portuaire, a ainsi été au coeur de ces changements. L'objectif de ce mémoire est d'évaluer si la géochimie des isotopes stables appliquée à plusieurs matériaux du squelette humain (collagène et apatite de l'os, collagène de la dentine, et carbonate de l'émail) permet de mieux comprendre comment les comportements alimentaires des individus analysés provenant de ce cimetière cosmopolite (n=40) ont évolué en cours de vie. L'alimentation étant influencée par des conditions socio-économiques, culturelles et environnementales, cela peut nous informer indirectement sur les processus d'adaptation et l'identité d'un individu. C'est dans cette perspective d'écologie culturelle que nous avons interprété les données recueillies lors de ce projet, en complément aux analyses effectuées précédemment par Morland (2009) et Caron (2013). Nos résultats corroborent les tendances déjà observées, soit des pratiques alimentaires semblables à celles que l'on retrouve en Europe, et des immigrants provenant majoritairement des Îles Britanniques. Ils démontrent également une légère augmentation de la consommation de ressources C4, comme le maïs et la canne à sucre, à l'âge adulte pour 90% des individus analysés, de même qu'une baisse du niveau de protéines. Par ailleurs, les individus étudiés ont généralement eu tendance à conserver le même niveau alimentaire les uns par rapport aux autres tout au cours de leur vie, même si les pratiques étaient moins diversifiés à l'âge adulte. Finalement, on constate des similarités de comportements avec les populations irlandaises et britanniques plus pauvres durant l'enfance, alors qu'ils ressemblent davantage à ceux visibles dans la vallée laurentienne en fin de vie, notamment en ce qui concerne l'apport en protéines. Nos résultats suggèrent donc des changements alimentaires significatifs, fort possiblement liés aux processus de migration et à une adaptation constante à un nouvel environnement de la part des individus étudiés.