The tale of a person and a peptide: Wylie W. Vale Jr. and the role of corticotropin- releasing factor in the stress response

The studies reviewed in this article certainly do not constitute the entire body of research conducted by Wylie Vale's group and his collaborators, they might constitute turning points in CRF research. In addition, the studies reviewed here show that, over the course of 31 years (from 1981 to 2012), Wylie tirelessly pursued the answers to fundamental questions regarding CRF. He was a man whose drive never seemed to falter

Clostridium difficile: Entdeckung und Charakterisierung der autokatalytischen Prozessierung von Toxin B

Clostridium difficile, der Auslöser der nosokomialen Antibiotika-assoziierten Durchfälle und der Pseudomembranösen Kolitis, besitzt zwei Hauptvirulenzfaktoren: die Toxine A und B. In vorangegangenen Veröffentlichungen wurde gezeigt, dass Toxin B durch einen zytosolischen Faktor der eukaryotischen Zielzelle während des Aufnahmeweges in die Zelle gespalten wird. Nur die N-terminale katalytische Domäne erreicht das Zytosol. Hierbei wurde davon ausgegangen, dass eine Protease der Zielzelle die Spaltung katalysiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Spaltung von Toxin B ein intramolekularer Prozess ist, der zytosolisches Inositolphosphat der Zielzelle als Kofaktor zur Aktivierung der intrinsischen Protease benötigt. Die Freisetzung der katalytischen Domäne durch Inositolphosphat-induzierte Spaltung ist nicht nur das Prinzip des Clostridium difficile Toxin B sondern auch des Toxin A, als auch des alpha Toxin von Clostridium novyi und das Letale Toxin von Clostridium sordellii. Der kovalente Inhibitor von Aspartatproteasen 1,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propan (EPNP), wurde dazu verwendet die intrinsische Protease von Toxin B zu blockieren und ermöglichte die Identifikation des katalytischen Zentrums. EPNP modifiziertes Toxin B verliert die intrinsische Proteaseaktivität und Zytotoxizität, aber wenn es direkt in das Zytosol der Wirtszelle injiziert ist, bleibt die Toxizität erhalten. Diese ist damit der erste Bericht eines bakteriellen Toxins, das eukaryotische Signale zur induzierten Autoproteolyse nutzt, um seine katalytisch-toxische Domäne in das Zytosol der Zielzelle freizusetzen. Durch diese Ergebnisse kann das Modell der Toxin-Prozessierung nun um einen weiteren entscheidenden Schritt vervollständigt werden.

Charakterisierung zellulärer Interaktionspartner des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das große L-Hüllprotein (L) des Hepatitis B - Virus. L bildet eine ungewöhnliche duale Topologie in der ER-Membran aus, welche auch im reifen Viruspartikel erhalten bleibt. In einem partiellen, posttranslationalen Reifungsprozess wird die sogenannte PräS-Region von der zytosolischen Seite der Membran aus in das ER-Lumen transloziert. Aufgrund seiner dualen Topologie und der damit verbundenen Multifunktionalität übernimmt L eine Schlüsselfunktion im viralen Lebenszyklus. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag deshalb darin, neue zelluläre Interaktionspartner des L-Hüllproteins zu identifizieren. Ihre Analyse sollte helfen, das Zusammenspiel des Virus mit der Wirtszelle besser zu verstehen. Hierfür wurde das Split - Ubiquitin Hefe - Zwei - Hybrid System eingesetzt, das die Interaktionsanalyse von Membranproteinen und Membran-assoziierten Proteinen ermöglicht. Zwei der neu identifizierten Interaktionspartner, der v-SNARE Bet1 und Sec24A, die Cargo-bindende Untereinheit des CoPII-vermittelten vesikulären Transports, wurden weitergehend im humanen Zellkultursystem untersucht. Sowohl für Bet1 als auch für Sec24A konnte die Interaktion mit dem L-Hüllprotein bestätigt und der Bindungsbereich eingegrenzt werden. Die Depletion des endogenen Bet1 reduzierte die Freisetzung L-haltiger, nicht aber S-haltiger subviraler Partikel (SVP) deutlich. Im Gegensatz zu Bet1 interagierte Sec24A auch mit dem mittleren M- und kleinen S-Hüllprotein von HBV. Die Inhibition des CoPII-vermittelten vesikulären Transportweges durch kombinierte Depletion der vier Sec24 Isoformen blockierte die Freisetzung sowohl L- als auch S-haltiger SVP. Dies bedeutet, dass die HBV - Hüllproteine das ER CoPII-vermittelt verlassen, wobei sie aktiv Kontakt zur Cargo-bindenden Untereinheit Sec24A aufnehmen. Der effiziente Export der Hüllproteine aus dem ER ist für die Virusmorphogenese und somit für den HBV - Lebenszyklus essentiell. rnEin weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit basierte auf der Interaktion des L-Hüllproteins mit dem ER-luminalen Chaperon BiP. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob BiP, ähnlich wie das zytosolische Chaperon Hsc70, an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt ist. Hierfür wurde BiP durch die ektopische Expression seiner Ko-Chaperone BAP und ERdj4 in seiner Substrat-bindenen Kapazität manipuliert. ERdj4, ein Mitglied der Hsp40 - Proteinfamilie, stimuliert die ATPase-Aktivität von BiP, was die Substratbindung stabilisiert. Der Nukleotid - Austauschfaktor BAP hingegen vermittelt die Auflösung des BiP - Substrat - Komplexes. Die Auswirkung der veränderten in vivo-Aktivität von BiP auf die posttranslationale PräS-Translokation wurde mit Proteaseschutz - Versuchen untersucht. Die ektopische Expression des positiven als auch des negativen Regulators von BiP resultierte in einer drastischen Reduktion der posttranslationalen PräS-Translokation. Ein vergleichbarer Effekt wurde nach Manipulation des BiP ATPase - Zyklus durch Depletion der zellulären ATP - Konzentration beobachtet. Dies spricht dafür, dass das ER-luminale Chaperon BiP, zusammen mit Hsc70, eine zentrale Rolle in der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins spielt. rnZwei weitere Proteine, Sec62 und Sec63, die sich für die posttranslationale Translokation in der Hefe als essentiell erwiesen haben, wurden in die Analyse der dualen Topologie des L-Hüllproteins einbezogen. Interessanterweise konnte eine rein luminale Ausrichtung der PräS-Region nach kombinierter Depletion des endogenen Sec62 und Sec63 beobachtet werden. Dies deutet an, dass sowohl Sec62 als auch Sec63 an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt sind. In Analogie zur Posttranslokation der Hefe könnte Sec62 als Translokon-assoziierter Rezeptor für Substrate der Posttranslokation, und damit der PräS-Region, dienen. Sec63 könnte mit seiner J-Domäne BiP zum Translokon rekrutieren und daraufhin dessen Substrat-bindende Aktivität stimulieren. BiP würde dann, einer molekularen Ratsche gleich, die PräS-Region durch wiederholtes Binden und Freisetzen aktiv in das ER-Lumen hereinziehen, bis eine stabile duale Topologie des L-Hüllproteins ausgebildet ist. Die Bedeutung von Sec62 und Sec63 für den HBV - Lebenszyklus wird dadurch untermauert, dass sowohl die ektopische Expression als auch die Depletion des endogenen Sec63 die Freisetzung L-haltiger SVP deutlich reduziert. rn

Leaf level VOC emissions of single plants from Amazonian and Mediterranean ecosystems: Ontogeny and flooding as stress factor for VOC emissions

Die Vegetation ist die wichtigste Quelle von organischen flüchtigen Verbindungen (auf Englisch volatile organic compounds,VOCs), die einen bemerkenswerten Einfluss auf der Chemie und Physik der Atmosphäre haben. VOCs beeinflussen die oxidative Kapazität der Atmosphäre und tragen zu der Bildung und zum Wachstum von sekundären organischen Aerosolen bei, welche einerseits eine Streuung und Reflektierung der Energie verursachen und andererseits sich an der Bildung und Entwicklung von Wolken beteiligen. Ziel dieser Arbeit war die Beschreibung und der Vergleich von VOC Emissionen aus Pflanzen aus zwei verschiedenen Ökosystemen: Mediterranes Ökosystem und Tropisches Ökosystem. Für diese Aufgabe wurden gewöhnliche Pflanzen von beiden Ökosystemen untersucht. Siebzehn Pflanzenspezies aus der Mittelmeergebiet, welches bekannt ist für seine Vielfalt an VOC emittierenden Pflanzen, wurden in die Untersuchungen einbezogen. Im Gegensatz zum mediterranen Ökosystem sind nur wenig Information verfügbar über VOC Emissionen aus Blättern tropischer Baumspezies. Vor diesem Hintergrund wurden sechsundzwanzig Baumspezies aus verschiedenen Ökotypen des Amazonasbeckens (Terra firme, Várzea und Igapó) wurden auf VOC Emissionen auf Blattebene mit einem Küvetten-System untersucht. Analysen von flüchtigen organischen Verbindungen wurden online mit PTR-MS und offline mittels Sammlung auf entsprechenden Adsorbern (Kartuschen) und nachfolgender GC-FID Analyse untersucht. Die höchsten Emissionen wurden für Isoprene beobachtete, gefolgt durch Monoterpene, Methanol und Aceton. Die meisten Mittelmeer Spezies emittierten eine hohe Vielfalt an Monoterpenspezies, hingegen zeigten nur fünf tropische Pflanzenspezies eine Monoterpene mit einen sehr konservativen Emissionsprofil (α-Pinen>Limonen>Sabinen >ß-Pinen). Mittelmeerpflanzen zeigten zusätzlich Emissionen von Sesquiterpenen, während bei der Pflanzen des Amazonas Beckens keine Sesquiterpenemissionen gefunden wurden. Dieser letzte Befund könnte aber auch durch eine niedrigere Sensitivität des Messsystems während der Arbeiten im Amazonasgebiet erklärt werden. Zusätzlich zu den Isoprenoidemissionen waren Methanolemissionen als Indikator für Wachtumsvorgänge sehr verbreitet in den meisten Pflanzenspezies aus tropischen und mediterranen Gebieten. Einige Pflanzenspezies beider Ökosystemen zeigten Acetonemissionen. rnrnVOC Emissionen werde durch eine große Vielfalt an biotischen und abiotischen Faktoren wie Lichtintensität, Temperatur, CO2 und Trockenheit beeinflusst. Ein anderer, öfter übersehener Faktor, der aber sehr wichtig ist für das Amazonas Becken, ist die regelmäßige Überflutung. In dieser Untersuchung wir fanden heraus, dass am Anfang einer Wurzelanoxie, die durch die Überflutung verursacht wurde, Ethanol und Acetaldehyd emittiert werden können, vor allem in Pflanzenspezies, die schlechter an eine unzureichende Sauerstoffversorgung bei Flutung adaptiert sind, wie z.B. Vatairea guianensis. Die Spezies Hevea spruceana, welche besser an Überflutung adaptiert ist, könnte möglicherweise der gebildete Ethanol sofort remetabolisieren ohne es zu emittieren. Nach einer langen Periode einer Überflutung konnte allerdings keine Emission mehr beobachtet werden, was auf eine vollständige Adaptation mit zunehmender Dauer schließen lässt. Als Reaktion auf den ausgelösten Stress können Isoprenoidemissionen ebenfalls kurzfristig nach einigen Tage an Überflutung zunehmen, fallen dann aber dann nach einer langen Periode zusammen mit der Photosynthese, Transpiration und stomatäre Leitfähigkeit deutlich ab.rnrnPflanzen Ontogenese ist anscheinend von Bedeutung für die Qualität und Quantität von VOC Emissionen. Aus diesem Grund wurden junge und erwachsene Blätter einiger gut charakterisierten Pflanzen Spezies aus dem Mittelmeerraum auf VOC Emissionen untersucht. Standard Emissionsfaktoren von Isopren waren niedriger in jungen Blättern als in erwachsene Blätter. Hingegen wurden höhere Monoterpen- und Sesquiterpenemissionen in jungen Blätter einiger Pflanzenspezies gefunden. Dieser Befund deutet auf eine potentielle Rolle dieser VOCs als Abwehrkomponenten gegen Pflanzenfresser oder Pathogene bei jungen Blätter hin. In einigen Fällen variierte auch die Zusammensetzung der Monoterpen- und Sesquiterpenspezies bei jungen und erwachsenen Blättern. Methanolemissionen waren, wie erwartet, höher in jungen Blättern als in ausgewachsenen Blättern, was mit der Demethylierung von Pectin bei der Zellwandreifung erklärt werden kann. Diese Befunde zu Änderungen der Emissionskapazität der Vegetation können für zukünftige Modellierungen herangezogen werden. rn

Hepatoprotective effect of tumour necrosis factor alpha blockade in psoriatic arthritis: a cross-sectional study

Objective To evaluate the impact of tumour necrosis factor α (TNFα) blockers on the presence of liver fibrosis in patients with rheumatoid arthritis (RA) and psoriatic arthritis (PsA) treated with methotrexate (MTX). Methods Participants were consecutive patients with RA and PsA who had undergone MTX treatment for at least 1 year ± TNF blockade for over 6 months. Liver fibrosis was assessed using non-invasive transient elastography (FibroScan). Regression models were used to compare FibroScan values of patients with RA and patients with PsA receiving TNFα blockers with those who were not. Results FibroScan assessments were performed on 51 patients with RA and 43 patients with PsA. Compared to patients with RA, those with PsA were predominantly young men, received lower cumulative dosages of MTX and exhibited a higher incidence of liver steatosis and hyperlipidaemia. An abnormal result was observed in 7.1% of the anti-TNFα-naïve and in 13% of the anti-TNFα-treated patients in the RA group and in 30% of the anti-TNFα-naïve and 4.3% of the anti-TNFα-treated patients in the PsA group (OR=0.11, 95% CI 0.02 to 0.98). Results of the PsA group were robust when adjusted for baseline characteristics. Conclusion The results suggest a protective effect of TNFα inhibitors against the development of liver fibrosis in patients with PsA.

Global lymphoid tissue remodeling during a viral infection is orchestrated by a B cell-lymphotoxin-dependent pathway

Adaptive immune responses are characterized by substantial restructuring of secondary lymphoid organs. The molecular and cellular factors responsible for virus-induced lymphoid remodeling are not well known to date. Here we applied optical projection tomography, a mesoscopic imaging technique, for a global analysis of the entire 3-dimensional structure of mouse peripheral lymph nodes (PLNs), focusing on B-cell areas and high endothelial venule (HEV) networks. Structural homeostasis of PLNs was characterized by a strict correlation between total PLN volume, B-cell volume, B-cell follicle number, and HEV length. After infection with lymphocytic choriomeningitis virus, we observed a substantial, lymphotoxin (LT) beta-receptor-dependent reorganization of the PLN microarchitecture, in which an initial B-cell influx was followed by 3-fold increases in PLN volume and HEV network length on day 8 after infection. Adoptive transfer experiments revealed that virus-induced PLN and HEV network remodeling required LTalpha(1)beta(2)-expressing B cells, whereas the inhibition of vascular endothelial growth factor-A signaling pathways had no significant effect on PLN expansion. In summary, lymphocytic choriomeningitis virus-induced PLN growth depends on a vascular endothelial growth factor-A-independent, LT- and B cell-dependent morphogenic pathway, as revealed by an in-depth mesoscopic analysis of the global PLN structure.

Tumor necrosis factor sensitizes primary murine hepatocytes to Fas/CD95-induced apoptosis in a Bim- and Bid-dependent manner

Fas/CD95 is a critical mediator of cell death in many chronic and acute liver diseases and induces apoptosis in primary hepatocytes in vitro. In contrast, the proinflammatory cytokine tumor necrosis factor α (TNFα) fails to provoke cell death in isolated hepatocytes but has been implicated in hepatocyte apoptosis during liver diseases associated with chronic inflammation. Here we report that TNFα sensitizes primary murine hepatocytes cultured on collagen to Fas ligand (FasL)-induced apoptosis. This synergism is time-dependent and is specifically mediated by TNFα. Fas itself is essential for the sensitization, but neither Fas up-regulation nor endogenous FasL is responsible for this effect. Although FasL is shown to induce Bid-independent apoptosis in hepatocytes cultured on collagen, the sensitizing effect of TNFα is clearly dependent on Bid. Moreover, both c-Jun N-terminal kinase activation and Bim, another B cell lymphoma 2 homology domain 3 (BH3)-only protein, are crucial mediators of TNFα-induced apoptosis sensitization. Bim and Bid activate the mitochondrial amplification loop and induce cytochrome c release, a hallmark of type II apoptosis. The mechanism of TNFα-induced sensitization is supported by a mathematical model that correctly reproduces the biological findings. Finally, our results are physiologically relevant because TNFα also induces sensitivity to agonistic anti-Fas-induced liver damage. CONCLUSION: Our data suggest that TNFα can cooperate with FasL to induce hepatocyte apoptosis by activating the BH3-only proteins Bim and Bid.

Low-dose recombinant factor VIIa for massive bleeding: A single centre observational cohort study with 73 patients

recombinant activated factor VII (rFVIIa) is used off-label for massive bleeding. There is no convincing evidence of the benefits of this practice and the minimal effective dose is unknown. The aim of the study was to evaluate our in-house guideline recommending a low dose of 60 μg/kg for off-label use of rFVIIa.

The transcriptional regulator megakaryoblastic leukemia-1 mediates serum response factor-independent activation of tenascin-C transcription by mechanical stress

The extracellular matrix protein tenascin-C (TNC) is up-regulated in processes influenced by mechanical stress, such as inflammation, tissue remodeling, wound healing, and tumorigenesis. Cyclic strain-induced TNC expression depends on RhoA-actin signaling, the pathway that regulates transcriptional activity of serum response factor (SRF) by its coactivator megakaryoblastic leukemia-1 (MKL1). Therefore, we tested whether MKL1 controls TNC transcription. We demonstrate that overexpression of MKL1 strongly induces TNC expression in mouse NIH3T3 fibroblasts and normal HC11 and transformed 4T1 mammary epithelial cells. Part of the induction was dependant on SRF and a newly identified atypical CArG box in the TNC promoter. Another part was independent of SRF but required the SAP domain of MKL1. An MKL1 mutant incapable of binding to SRF still strongly induced TNC, while induction of the SRF target c-fos was abolished. Cyclic strain failed to induce TNC in MKL1-deficient but not in SRF-deficient fibroblasts, and strain-induced TNC expression strongly depended on the SAP domain of MKL1. Promoter-reporter and chromatin immunoprecipitation experiments unraveled a SAP-dependent, SRF-independent interaction of MKL1 with the proximal promoter region of TNC, attributing for the first time a functional role to the SAP domain of MKL1 in regulating gene expression.

German validation of the Conners Adult ADHD Rating Scales–self-report (CAARS-S) I: Factor structure and normative data

Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) often persists into adulthood. Instruments for diagnosing ADHD in childhood are well validated and reliable, but diagnosis of ADHD in adults remains problematic. Attempts have been made to develop criteria specific for adult ADHD, resulting in the development of self-report and observer-rated questionnaires. To date, the Conners Adult ADHD Rating Scales (CAARS) are the international standard for questionnaire assessment of ADHD. The current study evaluates a German version of the CAARS self-report (CAARS-S).

Recombinant ADAMTS13 normalizes von Willebrand factor-cleaving activity in plasma of acquired TTP patients by overriding inhibitory antibodies

Severe deficiency of the von Willebrand factor (VWF)-cleaving protease ADAMTS13 as observed in acquired thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) is caused by inhibitory and non-inhibitory autoantibodies directed against the protease. Current treatment with plasma exchange is considered to remove circulating antibodies and to concurrently replenish the deficient enzyme.

Differential effects of dexamethasone on the chondrogenesis of mesenchymal stromal cells: influence of microenvironment, tissue origin and growth factor

Mesenchymal stromal cells (MSCs), which reside within various tissues, are utilized in the engineering of cartilage tissue. Dexamethasone (DEX)--a synthetic glucocorticoid--is almost invariably applied to potentiate the growth-factor-induced chondrogenesis of MSCs in vitro, albeit that this effect has been experimentally demonstrated only for transforming-growth-factor-beta (TGF-β)-stimulated bone-marrow-derived MSCs. Clinically, systemic glucocorticoid therapy is associated with untoward side effects (e.g., bone loss and increased susceptibility to infection). Hence, the use of these agents should be avoided or limited. We hypothesize that the influence of DEX on the chondrogenesis of MSCs depends upon their tissue origin and microenvironment [absence or presence of an extracellular matrix (ECM)], as well as upon the nature of the growth factor. We investigated its effects upon the TGF-β1- and bone-morphogenetic-protein 2 (BMP-2)-induced chondrogenesis of MSCs as a function of tissue source (bone marrow vs. synovium) and microenvironment [cell aggregates (no ECM) vs. explants (presence of a natural ECM)]. In aggregates of bone-marrow-derived MSCs, DEX enhanced TGF-β1-induced chondrogenesis by an up-regulation of cartilaginous genes, but had little influence on the BMP-2-induced response. In aggregates of synovial MSCs, DEX exerted no remarkable effect on either TGF-β1- or BMP-2-induced chondrogenesis. In synovial explants, DEX inhibited BMP-2-induced chondrogenesis almost completely, but had little impact on the TGF-β1-induced response. Our data reveal that steroids are not indispensable for the chondrogenesis of MSCs in vitro. Their influence is context dependent (tissue source of the MSCs, their microenvironment and the nature of the growth-factor). This finding has important implications for MSC based approaches to cartilage repair.

Induction of p38, tumour necrosis factor-α and RANTES by mechanical stretching of keratinocytes expressing mutant keratin 10R156H

Epidermolytic hyperkeratosis (bullous congenital ichthyosiform erythroderma), characterized by ichthyotic, rippled hyperkeratosis, erythroderma and skin blistering, is a rare autosomal dominant disease caused by mutations in keratin 1 or keratin 10 (K10) genes. A severe phenotype is caused by a missense mutation in a highly conserved arginine residue at position 156 (R156) in K10.

Investigation of a large community-based outbreak of hepatitis B infection in the United Kingdom

We describe the largest outbreak of hepatitis B virus infection reported to date in the UK. Between July 2001 and December 2005, 237 cases were identified in Avon, South West England. The likely route of transmission was injecting drug use in 44% (104/237) and heterosexual intercourse in 30% (71/237) of cases. A case-control study in injectors showed that injecting crack cocaine [adjusted odds ratio (aOR) 23·8, 95% confidence interval (CI) 3·04-186, P<0·001] and sharing injecting paraphernalia in the year before diagnosis (aOR 16·67, 95% CI 1·78-100, P=0·010) were strongly associated with acute hepatitis B. In non-IDUs number of sexual partners and lack of consistent condom use were high compared to a national sample. We describe the control measures implemented in response to the outbreak. This outbreak has highlighted the problems associated with the low uptake from the national hepatitis B vaccination policy which targets high-risk groups, the difficulties of identifying those at risk of acquiring hepatitis B infection through heterosexual sex, and injecting crack cocaine as a risk factor for hepatitis B.