Efeito do número da passagem e do gênero das células doadoras de núcleo no desenvolvimento de bovinos produzidos por transferência nuclear

Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito do número da passagem e do sexo das células doadoras de núcleo no desenvolvimento embrionário e fetal após transferência nuclear. Para isso, oócitos bovinos foram maturados, enucleados e reconstruídos com células somáticas de animal adulto. Após a fusão e ativação química, os zigotos reconstituídos foram cultivados em Charles Rosenkranz 2 (CR2) com monocamada de células da granulosa a 38,8ºC em atmosfera umidificada a 5% de CO2 em ar, durante sete dias, e transferidos para receptoras sincronizadas. As taxas de clivagem e desenvolvimento a blastocisto de embriões reconstruídos com células cultivadas por tempo maior foram inferiores às obtidas com os demais tempos de cultivo. Além disso, os blastocistos produzidos não resultaram no desenvolvimento de uma gestação a termo. Embora a taxa de clivagem em embriões fêmeas tenha sido maior, o número de embriões que atingiram o estádio de blastocisto foi maior nos embriões machos. No período gestacional, fêmeas apresentaram maior taxa de aborto entre 90 e 120 dias de gestação. Esses resultados indicam que células doadoras de núcleos cultivados por longos períodos dificultam a produção de blastocistos e aumentam as chances de perdas durante a gestação. Embriões clonados machos têm maior competência para se desenvolver a blastocisto e resultam em menor taxa de perda gestacional.

Efeitos da administração diária da associação estavudina/nelfinavir sobre os fetos e placentas da rata albina

OBJETIVO: avaliar o efeito da administração da associação estavudina/nelfinavir durante toda a prenhez da rata, avaliando seu peso e dos conceptos, bem como o número de implantações, fetos, placentas, reabsorções e mortalidades materna e fetal. MÉTODOS: quarenta ratas albinas EPM-1 Wistar, prenhes, foram aleatoriamente divididas em quatro grupos: GCtrl (controle do veículo) e três experimentais, ExpI, ExpII e ExpIII, que receberam, respectivamente, 1/40, 3/120 e 9/360 mg/kg por dia de estavudina/nelfinavir por via oral. As drogas e o veículo (água destilada) foram administrados por gavagem em duas tomadas diárias (12/12 horas), desde o dia 0 até o 20º dia da prenhez. No último dia do experimento, todos os animais foram anestesiados e eutanasiados. Foram avaliados a evolução do peso materno no 7º, 14º e 20º dias, número de fetos, placentas, implantações, reabsorções, óbitos intrauterinos, malformações maiores e o peso dos fetos e das placentas. A análise estatística foi realizada por análise de variância (ANOVA), complementada pelo teste de Kruskal-Wallis (p<0,05). RESULTADOS: em relação ao peso corporal das ratas, houve ganho gradual e progressivo durante o decorrer da prenhez em todos os grupos, sendo este ganho mais evidente no período final; porém não foram constatadas diferenças estatisticamente significantes entre eles. O número de fetos, placentas, implantações, assim como os pesos fetais e placentários também não mostraram diferenças estatisticamente significantes entre os grupos analisados. Não foram observadas, também nos grupos experimentais, reabsorções e malformações fetais maiores externas, no entanto, observamos entre o 8º e o 14º dias de gestação um caso de morte materna em cada grupo experimental. CONCLUSÕES: a administração da associação estavudina/nelfinavir não mostrou efeitos deletérios sobre os conceptos.

Análise morfológica e fisiológica dos fígados e rins de ratas prenhes e seus fetos tratados pela associação zidovudina, lamivudina e ritonavir durante toda a prenhez

OBJETIVO: avaliar os efeitos da administração da associação zidovudina-lamivudina-ritonavir nos fígados e rins de ratas prenhes e seus conceptos do ponto de vista morfológico e fisiológico. MÉTODOS: 40 ratas albinas prenhes foram aleatoriamente divididas em 4 grupos: 1 controle (Ctrl: controle de veículo) e 3 experimentais (Exp1x, Exp3x e Exp9x). Estes últimos foram tratados por solução oral de zidovudina/lamivudina/ritonavir (Exp1x: 10/5/20 mg/kg; Exp3x: 30/15/60 mg/kg; Exp9x: 90/45/180 mg/kg). As drogas e o veículo foram administrados por gavagem, desde o 1º até o 20º dia de prenhez. No último dia do experimento, todos os animais foram anestesiados e sangue foi retirado da cavidade cardíaca para avaliação sérica das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT), por método calorimétrico, bem como da ureia, determinada por método cinético-enzimático, e creatinina, por método cinético-colorimétrico. Em seguida, fragmentos dos fígados e rins maternos e fetais foram coletados, fixados em formol a 10% e processados segundo os métodos histológicos para inclusão em parafina. Cortes com 5 µm de espessura foram corados pela hematoxilina-eosina (HE) e analisados por microscopia de luz. Na leitura das lâminas, considerou-se o padrão de normalidade para fígado e rins, tais como: hepatócitos, espaço porta íntegros e veias hepáticas bem definidas. Nos rins, a presença de corpúsculos renais, túbulos contorcidos e alças de Henle típicos. Nos fígados fetais considerou-se, ainda, a morfologia das células da linhagem eritrocitária nas diferentes fases do desenvolvimento, bem como os megacariócitos. Quando houve alteração da coloração padrão estabelecida para as estruturas hepáticas e renais, alteração na morfologia de núcleos, rompimento de limites de alguma organela citoplasmática, presença de congestão vascular, tudo isso foi entendido como provavelmente provocado pelas drogas em sua(s) dose(s) de aplicação. A avaliação estatística foi realizada por análise de variância (ANOVA), completada pelo teste de Tukey-Kramer (p<0,05). RESULTADOS: os fígados maternos dos grupos Ctrl, Exp1x e Exp3x mostraram hepatócitos típicos, espaço porta íntegros e veias hepáticas com aspecto normal. No fígado materno do grupo Exp9x, foram encontrados hepatócitos com sinais de atrofia e apoptose (eosinofilia citoplasmática e núcleos picnóticos). Além disso, identificou-se vasodilatação dos capilares sinusoides (congestão). Os rins maternos dos grupos Ctrl e Exp1x apresentaram-se normais, com corpúsculos renais, túbulos contorcidos e alças de Henle típicos. Já nos grupos Exp3x e Exp9x, foram encontrados congestão vascular, glomérulos pequenos ricos em células contendo núcleos hipercromáticos, sendo mais intensos no Exp9x. Com relação aos fígados e rins fetais, não foram observadas alterações morfológicas ou fisiológicas nos grupos estudados. Encontrou-se aumento significante nos níveis da AST (305,70±55,80; p<0,05) e da creatinina (0,50±0,09; p<0,05) no grupo Exp9x. CONCLUSÕES: nossos resultados evidenciam que a administração da associação zidovudina/lamivudina/ritonavir a ratas prenhes em altas doses causa alterações morfológicas e funcionais nos fígados e rins maternos. Não houve alterações nem morfológicas nem fisiológicas nos fígados e rins fetais.

Effects of uterine cervix constriction on Wistar rats

PURPOSE: To verify if uterine cerclage can induce craniosynostosis or any cranial deformity in new born Wistar rats. METHODS: One pregnant female Wistar rat underwent laparotomy on day 18 of gestation and the uterus cervix was closed with a 3-0 nylon suture to avoid delivery, that occurs normally on the 21 day. The suture was released after 48 hours beyond the normal gestation period. The female rat delivered 11 pups. Six surviving rats from the delivery (group A - constrained group). Two rats were born from another mother and in the same age were used as control group (group B - 2 nonconstrained controls) were allowed to grow. They were sacrificed 1.2 years after their birth all the eight animals. Linear measurement, routine histology and computed tomography of the skull were performed at the time of their death to evaluate the cranial asymmetries by mesurements of the anatomical landmarks of the craniofacial skeleton of the rats on the two groups and compared then. RESULTS: We did not observe statistically significant differences in any of the compared measurements (p>0.05) obtained through the morphologic and radiologic methods. Histologic examinations did not reveal any sign of premature fusion or suture imbrications. Critical decrease in longitudinal body size was noticed as the limbs too in all the animals of group A. CONCLUSION: Constriction of uterine cervix leads to fetus suffering, even death for a few animals, associated to small body size, but not to craniosynostosis.

Hypothyroidism decreases proinsulin gene expression and the attachment of its mRNA and eEF1A protein to the actin cytoskeleton of INS-1E cells

The actions of thyroid hormone (TH) on pancreatic beta cells have not been thoroughly explored, with current knowledge being limited to the modulation of insulin secretion in response to glucose, and beta cell viability by regulation of pro-mitotic and pro-apoptotic factors. Therefore, the effects of TH on proinsulin gene expression are not known. This led us to measure: a) proinsulin mRNA expression, b) proinsulin transcripts and eEF1A protein binding to the actin cytoskeleton, c) actin cytoskeleton arrangement, and d) proinsulin mRNA poly(A) tail length modulation in INS-1E cells cultured in different media containing: i) normal fetal bovine serum - FBS (control); ii) normal FBS plus 1 µM or 10 nM T3, for 12 h, and iii) FBS depleted of TH for 24 h (Tx). A decrease in proinsulin mRNA content and attachment to the cytoskeleton were observed in hypothyroid (Tx) beta cells. The amount of eEF1A protein anchored to the cytoskeleton was also reduced in hypothyroidism, and it is worth mentioning that eEF1A is essential to attach transcripts to the cytoskeleton, which might modulate their stability and rate of translation. Proinsulin poly(A) tail length and cytoskeleton arrangement remained unchanged in hypothyroidism. T3 treatment of control cells for 12 h did not induce any changes in the parameters studied. The data indicate that TH is important for proinsulin mRNA expression and translation, since its total amount and attachment to the cytoskeleton are decreased in hypothyroid beta cells, providing evidence that effects of TH on carbohydrate metabolism also include the control of proinsulin gene expression.

Declarações de nascidos mortos no município de São Paulo: avaliação descritiva do preenchimento

OBJECTIVES: to study the information contained in Stillbirth Registers (SBRs) in the Municipality of São Paulo. METHODS: the adequacy of the filling out of SBR forms was assessed on the basis of the SBRs (6722) made available by the FSEADE (Foundation for Statistical Data Analysis System), using a Data Completion Index (DCI), making it possible to compare the three years studied (2001-3). Variables relating to the mother and the fetus were included where the DCI was greater than 10%. Education, parity, place of residence, birth type, for the mother and weight, gestational age and underlying cause of death, for the fetus. RESULTS: the absolute stillbirth component changed little in the first two of the three years, falling slightly in the third. The variable most frequently registered was sex (98%), followed by place of residence (82.9%) and parity (70%). The data least often registered were those relating to the mother's age and schooling, 20.0% and 16.7%, respectively. The underlying cause was recorded in 46.7%, fetal weight in 37% and type of birth in 25.3%. CONCLUSIONS: the data demonstrate that the difficulty encountered in incorporating this health indicator into the traditional set of indicators is in part due to the inadequacy of the data provided on the SBR form.

Establishment of a protocol for obtention of neuronal stem cells lineages from the dog olfactory epithelium

A morphological and cell culture study from nasal mucosa of dogs was performed in order to establish a protocol to obtain a cell population committed to neuronal lineage, as a proposal for the treatment of traumatic and degenerative lesions in these animals, so that in the future these results could be applied to the human species. Twelve mongrel dogs of 60-day aged pregnancy were collected from urban pound dogs in São Paulo. Tissue from cribriform ethmoidal lamina of the fetuses was collected at necropsy under sterile conditions around 1h to 2h postmortem by uterine sections and sections from the fetal regions described above. Isolated cells of this tissue were added in DMEM/F-12 medium under standard conditions of incubation (5% CO², >37ºC). Cell culture based on isolated cells from biopsies of the olfactory epithelium showed rapid growth when cultured for 24 hours, showing phase-bright sphere cells found floating around the fragments, attached on culture flasks. After 20 days, a specific type of cells, predominantly ellipsoids or fusiform cells was characterized in vitro. The indirect immunofluorescence examination showed cells expressing markers of neuronal precursors (GFAP, neurofilament, oligodendrocyte, and III â-tubulin). The cell proliferation index showed Ki67 immunostaining with a trend to label cell groups throughout the apical region, while PCNA immunostaining label predominantly cell groups lying above the basal lamina. The transmission electron microscopy from the olfactory epithelium of dogs revealed cells with electron-dense cytoplasm and preserving the same distribution as those of positive cell staining for PCNA. Metabolic activity was confirmed by presence of euchromatin in the greatest part of cells. All these aspects give subsidies to support the hypothesis about resident progenitor cells among the basal cells of the olfactory epithelium, committed to renewal of these cell populations, especially neurons.

Chorion biopsy in mongrel dogs

With the great development of the gestational studies in all of the species, we noticed the necessity of adaptations of these techniques for prenatal diagnosis in dogs. Based on this, we studied the feasibility of chorion biopsy guided by ultrasound. Our results demonstrated accuracy on the sex determination being 2 males and 12 females, as well as it would be possible to identify chromosome alteration due to the quality of samplings. Sex determination was accomplished with the identification of Y gene chromosomes in PCR technique. After the collection, fragments were prepared for light microscopy studies and revealed fetal chorion tissue, blood colloid and erythrocyte. In the whole material we found hemosiderin impregnations due to the hemolysis and to the residue of blood of the placental marginal hematomes. The submitted female dogs to this technique demonstrated normal puppy births without death.

Avaliação morfológica das membranas fetais e da placenta de Mazama gouazoubira (veado-catingueiro) de vida livre no terço inicial da gestação

Mazama gouazoubira, o veado-catingueiro, é uma espécie de cervídeo de porte pequeno, que pode ser encontrado na América do Sul, desde o sul do Uruguai até o norte de Mato Grosso, no Brasil. Este estudo teve como objetivo descrever as membranas fetais e a placenta de M. gouazoubira no terço inicial de gestação. As amostras coletadas foram analisadas macroscopicamente e microscopicamente. O exame do útero demonstrou uma gestação univitelina e um embrião com crown-rump de 13mm. Na análise do embrião pode ser observado o olho pigmentado, as saliências auriculares, o mesonefro e e metanefro em desenvolvimento, o fígado e sua proeminência externa, o estômago, os membros torácicos e os brotos dos membros pélvicos. A placenta apresentou-se oligocotiledonária e no útero puderam ser observadas nove carúnculas. O saco gestacional mediu 15cm de comprimento e, como observado no início da gestação dos ruminantes domésticos, os cotilédones não puderam ser identificados macroscopicamente. Uma fraca adesão foi observada entre as carúnculas e a membrana corioalantóica (cotilédones) que formavam os placentônios. A membrana corioalantóica demonstrou um alantóide bem vascularizado composto por uma fina camada de células de núcleos e citoplasmas alongados. Na outra face da membrana, o cório foi composto por células cúbicas, de citoplasmas escassos e núcleos grandes e arredondados, características de células trofoblásticas. Envolvendo o embrião visualizou-se o saco amniótico constituído de duas camadas passíveis de separação mecânica, que apresentaram morfologia similar, sendo formadas por um epitélio pavimentoso avascular. Não foi observado saco vitelino no estágio gestacional do espécime estudado. Conclui-se que a placenta de M. gouazoubira é oligocotiledonária, como observado em outros cervídeos, e que as membranas fetais apresentam semelhanças com a de outros ruminantes, incluindo as características citológicas. Estudos adicionais são necessários para determinar a presença do saco vitelino e quando ocorre sua regressão.

Morphological aspects of buffaloes (Bubalus bubalis) umbilical cord

Buffalo is an important livestock resource, with a great participation in agricultural systems, providing milk, meat, and work power. Umbilical cord is responsible for maternal-fetal nutrients exchange during pregnancy, and its alterations can compromise the fetal development. We investigated ten pregnant uteruses collected from cross-bread buffaloes in different stages of gestation. Pregnancy and fetal age was determined by measuring the apex sacral length and development period was calculated by previously published formula. Umbilical cords were measured for length determination. Umbilical cord vascular net and anastomosis were observed by injection of Neoprene latex. Histological sections of the umbilical cord were studied after stain with HE, picrossirius, toluidine blue, orceine, and PAS reaction. Buffaloes' umbilical cord was formed by two central arteries, an allantois duct and two peripheral veins. The artery wall was composed by large quantity of collagen, elastic fibers, fibroblasts and large number of vasa vasorum. The allantois duct was located between the arteries and presented a great number of small nourishing vessels. Small nourishing vessels should be carefully considered to avoid to be mistaken to the arterials and veins vasa vasorum. Medium length of umbilical cord from buffalos was 11.8cm (minimum of 6.8cm and maximum of 17.4cm).

Morfologia e desenvolvimento ultraestrutural do sistema renal de embriões bovinos com idade gestacional entre 10 e 50 dias

O presente estudo teve como objetivo descrever o desenvolvimento dos sistemas renais de bovinos durante o período embrionário compreendido entre 10 e 50 dias. Embriões bovinos coletados em frigorífico foram fotografados e medidos utilizando-se o método Crow-Rump (CR) para estimar a idade gestacional. Os embriões destinados à miscroscopia óptica foram fixados em solução de Bouin para a avaliação do desenvolvimento do sistema renal, assim como suas estruturas. Alguns embriões também foram fixados em Glutaraldeído 2,5% e destinados à microscopia eletrônica de transmissão para o estudo ultraestrutural das células do sistema renal. Embriões entre o 14° e o 15° dia de desenvolvimento (E14-15) não apresentaram pronefro, mas apresentaram mesonefro, assim como indícios morfológicos que indicam sua atividade funcional. O mesonefro apresentou, no interior de suas células tubulares, inúmeras mitocôndrias e interdigitações, indicando uma alta atividade de transporte iônico. O metanefro, ou rim definitivo, iniciou seu desenvolvimento em E23-24. Os achados emonstram que a involução do mesonefro acontece simultaneamente com a diferenciação metanefrogênica. Em E45-46, já iniciando a fase fetal, o metanefro possuiu unidades filtradoras (néfrons), com seus respectivos glomérulos, túbulos contorcidos proximais e distais e alça de Henle. Nessa fase, o rim ainda não apresenta lobação externa.

IgM e IgG como marcadores da infecção transplacentária por Neospora caninum em fetos bovinos

O objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência de anticorpos anti-Neospora caninum em 260 amostras de soro coletadas de fetos bovinos de julho de 2007 a março de 2008, em abatedouro do município de Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil. Para detecção de anticorpos anti-N. caninum, a técnica de imunofluorescência indireta foi utilizada tanto para a detecção de imunoglobulinas G e M. Amostras com títulos e" 25 foram consideradas positivas. Das 260 amostras testadas, 15% (39/260) foram positivas para anticorpos anti-N. caninum. Destas, em 38 (97,4%) foi detectada a presença de IgG anti-N. caninum e em seis (15,4%) de IgM. Em cinco amostras (12,8%) detectaram-se ambos, IgG e IgM. Os resultados reafirmam a habilidade do N. caninum em determinar infecção fetal. A pesquisa de IgM foi de limitada importância na detecção da infecção via transplacentária em soro fetal bovino.

Rapid detection of bovine coronavirus by a semi-nested RT-PCR

Bovine coronavirus (BCoV) is a member of the group 2 of the Coronavirus (Nidovirales: Coronaviridae) and the causative agent of enteritis in both calves and adult bovine, as well as respiratory disease in calves. The present study aimed to develop a semi-nested RT-PCR for the detection of BCoV based on representative up-to-date sequences of the nucleocapsid gene, a conserved region of coronavirus genome. Three primers were designed, the first round with a 463bp and the second (semi-nested) with a 306bp predicted fragment. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titre: 256) in DEPC treated ultra-pure water, in fetal bovine serum (FBS) and in a BCoV-free fecal suspension, when positive results were found up to the 10-2, 10-3 and 10-7 dilutions, respectively, which suggests that the total amount of RNA in the sample influence the precipitation of pellets by the method of extraction used. When fecal samples was used, a large quantity of total RNA serves as carrier of BCoV RNA, demonstrating a high analytical sensitivity and lack of possible substances inhibiting the PCR. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 25 fecal samples from adult cows, previously tested by a nested RT-PCR RdRp used as a reference test, resulting in 20 and 17 positives for the first and second tests, respectively, and a substantial agreement was found by kappa statistics (0.694). The high sensitivity and specificity of the new proposed method and the fact that primers were designed based on current BCoV sequences give basis to a more accurate diagnosis of BCoV-caused diseases, as well as to further insights on protocols for the detection of other Coronavirus representatives of both Animal and Public Health importance.

Etiologic diagnosis of bovine infectious abortion by PCR

Infectious abortion is a significant cause of reproductive failure and economic losses in cattle. The goal of this study was to detect nucleic acids of several infectious agents known to cause abortion including Arcanobacterium pyogenes, Bovine Herpesvirus 1, Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, Chlamydophila abortus, Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Neospora caninum, and Tritrichomonas foetus. Tissue homogenates from 42 fetuses and paraffin-embedded tissues from 28 fetuses and 14 placentas/endometrium were included in this study. Brucella abortus was detected in 14.2% (12/84) of the samples. Salmonella sp. DNA was amplified from 2 fetuses, and there was one positive for Neospora caninum, and another for Listeria monocytogenes. This PCR-based approach resulted in identification of the etiology in 19% of samples, or 20% if considered fetal tissues only.

Performance of transport and selective media for swine Bordetella bronchiseptica recovery and it comparison to polymerase chain reaction detection

Three comparative assays were performed seeking to improve the sensitivity of the diagnosis of Bordetella bronchiseptica infection analyzing swine nasal swabs. An initial assay compared the recovery of B. bronchiseptica from swabs simultaneously inoculated with B. bronchiseptica and some interfering bacteria, immersed into three transport formulations (Amies with charcoal, trypticase soy broth and phosphate buffer according to Soerensen supplemented with 5% of bovine fetal serum) and submitted to different temperatures (10ºC and 27ºC) and periods of incubation (24, 72 and 120 hours). A subsequent assay compared three selective media (MacConkey agar, modified selective medium G20G and a ceftiofur medium) for their recovery capabilities from clinical specimens. One last assay compared the polymerase chain reaction to the three selective media. In the first assay, the recovery of B. bronchiseptica from transport systems was better at 27ºC and the three formulations had good performances at this temperature, but the collection of qualitative and quantitative analysis indicated the advantage of Amies medium for nasal swabs transportation. The second assay indicated that MacConkey agar and modified G20G had similar results and were superior to the ceftiofur medium. In the final assay, polymerase chain reaction presented superior capability of B. bronchiseptica detection to culture procedures.