Extração de DNA genômico de tecidos foliares maduros de espécies nativas do cerrado

Grandes quantidades de contaminantes na amostra de DNA dificultam a obtenção de DNA genômico de qualidade durante a extração. A presença de polissacarídeos, fenóis e outros compostos secundários representa o principal problema com o procedimento de isolamento do DNA e sua aplicação subsequente, por inibir a atividade das enzimas Taq DNA polimera-se e enzimas de restrição. Neste estudo, descreveu-se um procedimento modificado baseado no hexadecyltrimethylammonium (CTAB), rendendo DNA genômico satisfatório para técnicas de manipulação subsequente, como reações de PCR e digestão com enzima de restrição. Nesse protocolo foram utilizadas diferentes concentrações de β-mercaptoetanol no tampão de extração (0,0; 0,2; 10; 15; 25; e 50 uL de β-mercaptoetanol/mL do tampão de extração: 100 mM de Tris-HCl, pH 8; 20 mM de EDTA; 1,4 mM de NaCl; 2% de CTAB; 1% de PVP), cujo procedimento foi aplicado no caso de folhas maduras e testado em Annona crassiflora (arati-cum), Eugenia dysenterica (cagaita), Anacardium humilis (caju-do-campo), Hancornia speciosa (mangaba) e Caryocar brasiliense (pequi). O protocolo foi eficiente no isolamento de DNA livre de polissacarídeos e polifenóis, com rendimento do DNA com alto peso molecu-lar, utilizando-se concentrações a partir de 1% de β-mercaptoetanol no tampão de extração. O DNA isolado por esse método mostrou alta pureza, de acordo com as análises de digestão por restrição e amplificação por PCR.

Application of morphometry, static DNA ploidy analysis, and steroid receptor expression in diagnosis and prognosis of Libyan breast cancer

The aim of this study was to describe the demographic, clinicopathological, biological and morphometric features of Libyan breast cancer patients. The supporting value of nuclear morphometry and static image cytometry in the sensitivity for detecting breast cancer in conventional fine-needle aspiration biopsies were estimated. The findings were compared with findings in breast cancer in Finland and Nigeria. In addation, the value of ER and PR were evaluated. There were 131 histological samples, 41 cytological samples, and demographic and clinicopathological data from 234 Libyan patients. The Libyan breast cancer is dominantly premenopausal and in this feature it is similar to breast cancer in sub-Saharan Africans, but clearly different from breast cancer in Europeans, whose cancers are dominantly postmenopausal in character. At presention most Libyan patients have locally advanced disease, which is associated with poor survival rates. Nuclear morphometry and image DNA cytometry agree with earlier published data in the Finnish population and indicate that nuclear size and DNA analysis of nuclear content can be used to increase the cytological sensitivity and specificity in doubtful breast lesions, particularly when free cell sampling method is used. Combination of the morphometric data with earlier free cell data gave the following diagnostic guidelines: Range of overlap in free cell samples: 55 μm2 -71 μm2. Cut-off values for diagnostic purposes: Mean nuclear area (MNA) >54 μm2 for 100% detection of malignant cases (specificity 84 %), MNA < 72 μm2 for 100% detection of benign cases (sensitivity 91%). Histomorphometry showed a significant correlation between the MNA and most clinicopathological features, with the strongest association observed for histological grade (p <0.0001). MNA seems to be a prognosticator in Libyan breast cancer (Pearson’s test r = - 0.29, p = 0.019), but at lower level of significance than in the European material. A corresponding relationship was not found in shape-related morphometric features. ER and PR staining scores were in correlation with the clinical stage (p= 0.017, and 0.015, respectively), and also associated with lymph node negative patients (p=0.03, p=0.05, respectively). Receptor-positive (HR+) patients had a better survival. The fraction of HR+ cases among Libyan breast cancers is about the same as the fraction of positive cases in European breast cancer. The study suggests that also weak staining (corresponding to as few as 1% positive cells) has prognostic value. The prognostic significance may be associated with the practice to use antihormonal therapy in HR+ cases. The low survival and advanced presentation is associated with active cell proliferation, atypical nuclear morphology and aneuploid nuclear DNA content in Libyan breast cancer patients. The findings support the idea that breast cancer is not one type of disease, but should probably be classified into premenopausal and post menopausal types.

Detecção do DNA do papilomavírus humano após excisão da zona de transformação com alça diatérmica para tratamento de neoplasia intra-epitelial cervical

OBJETIVO: avaliar a presença do DNA do papilomavírus humano (HPV) de alto risco oncológico antes e quatro meses após excisão da zona de transformação com alça diatérmica em mulheres com neoplasia intra-epitelial cervical (NIC). MÉTODOS: neste estudo clínico prospectivo foram incluídas 78 mulheres submetidas à excisão da zona de transformação tratadas no período de fevereiro a dezembro de 2001. Todas foram submetidas a colposcopia, citologia oncológica e captura híbrida II (CH II) antes da cirurgia e após 4±1,25 meses. Para análise estatística utilizou-se o cálculo do odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC 95%). RESULTADOS: antes da excisão, 67 (86%) mulheres apresentavam CH II positiva para DNA-HPV de alto risco oncológico e destas, apenas 22 (33%) mantiveram a CH II positiva quatro meses após. A detecção do DNA-HPV após o tratamento não se relacionou com a carga viral prévia, presença de doença nas margens da peça cirúrgica ou idade da mulher. Após quatro meses, a detecção do DNA-HPV associou-se significativamente com a presença de alterações citológicas (OR = 4,8; IC 95% = 1,7-13,7), porém não se relacionou com doença residual ou recidiva histológica (OR = 6,0; IC 95% = 0,8-52,3). CONCLUSÃO: após o tratamento da NIC, a detecção do DNA-HPV diminuiu significativamente porém não se observou relação com a presença de doença residual ou recidiva histológica.

Determinação pré-natal do sexo fetal por meio da análise de DNA no plasma materno

OBJETIVO: avaliar um novo método de determinação do sexo fetal pela análise de DNA obtido do plasma materno. MÉTODOS: sangue periférico (10 mL) foi coletado de mulheres grávidas em diferentes idades gestacionais. O plasma foi separado e o DNA isolado do mesmo foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores derivados do gene DYS14 específico do cromossomo Y. RESULTADOS: foram analisadas amostras de 212 pacientes. O resultado da PCR foi comparado ao sexo determinado pela ultra-sonografia e/ou do nascimento. Houve concordância em 209 das 212 pacientes. Nos 3 casos discordantes a PCR apontou resultado feminino, sendo as três amostras coletadas antes da 8ª semana de gravidez. CONCLUSÃO: o método de PCR desenvolvido para a determinação do sexo fetal possui excelente sensibilidade e especificidade, permitindo seu uso rotineiro. O resultado de sexo masculino possui maior confiabilidade que o feminino, principalmente em idade gestacional precoce. Novas aplicações para o DNA fetal no plasma materno estão sendo pesquisadas, permitindo no futuro o diagnóstico não invasivo de uma série de doenças.

Avaliação de métodos alternativos à citologia no rastreamento de lesões cervicais: detecção de DNA-HPV e inspeção visual

OBJETIVO: avaliar o desempenho da citologia oncológica (CO), de captura híbrida II (CH II) e da inspeção visual com ácido acético na detecção de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas cervicais. MÉTODOS: 2281 mulheres foram submetidas a exame clínico além da coleta de material para citologia, para CH II para detecção de DNA-HPV. Foi feita a inspeção visual do colo após aplicação do ácido acético a 5% (IVA). As mulheres com pelo menos um exame positivo eram convocadas para colposcopia, que também foi realizada em 420 mulheres com todos os exames normais. O desempenho dos testes foi calculado utilizando como padrão ouro a colposcopia com ou sem biopsia. RESULTADOS: a CO foi anormal em 209 mulheres (9,2%); a CH II foi positiva em 399 (17,5%) e em 249 (10,9%) foram encontradas alterações na IVA. Entre as 2281 mulheres avaliadas, 671 (29,4%) apresentaram pelo menos um resultado de exame positivo, embora apenas 82 (3,6%) apresentassem doença confirmada histologicamente (50 NIC1, 20 NIC2, sete NIC3 e cinco carcinomas invasores). As sensibilidades da IVA e da CH II foram semelhantes e significativamente maiores que a da CO. A especificidade da CO foi maior que a da IVA e da CH II. Nos casos com resultado de CO negativo, a IVA apresentou melhor desempenho comparada à CH II. CONCLUSÃO: o desempenho da CO associada à IVA foi melhor que o da CO associada à CH II e do que o da CO isolada.

Vaginose bacteriana e DNA de papilomavírus humano de alto risco oncogênico em mulheres submetidas a conização com alça diatérmica para tratamento de neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau

OBJETIVO: avaliar a associação entre vaginose bacteriana (VB), DNA de papilomavírus humano (HPV) de alto risco e anormalidades citopatológicas cervicais em mulheres submetidas a conização diatérmica devido a neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau (NIC 2 ou 3). MÉTODOS: estudo clínico descritivo, no qual foram incluídas 81 mulheres submetidas a conização diatérmica devido a NIC 2 ou 3. A citologia (CO) inicial foi colhida na época da realização da biópsia dos casos suspeitos e também foi utilizada para verificar a presença de VB. Antes da conização diatérmica foi coletado material para a detecção de DNA de HPV de alto risco, por meio da captura de híbridos II (CH II). Após a conização diatérmica foi agendado retorno em 4 meses, no qual eram realizadas novas coletas de CO e de CH II. Vinte e sete mulheres apresentaram VB e 54 não apresentaram esta alteração. A análise estatística foi realizada por meio do cálculo dos odds ratios (OR) para as relações entre a detecção do HPV e a presença de anormalidades citológicas com a presença de VB, antes e após a conização, considerando-se intervalos de confiança de 95% (IC 95%). RESULTADOS: a detecção de DNA de HPV de alto risco antes da conização foi semelhante nos dois grupos (89%). Após a conização, esta detecção foi igual a 26 e 18%, respectivamente, nos grupos com e sem VB (OR=1,5 IC 95% 0,5 a 4,6). Ainda após a conização, 41% das pacientes com VB e 20% das sem VB apresentaram anormalidades citológicas (OR=2,7; IC 95% 1,0 a 7,4). Analisando-se exclusivamente as 22 mulheres com anormalidades citológicas em seus exames realizados aproximadamente quatro meses após a conização diatérmica, 83% daquelas com VB também apresentaram testes positivos para DNA de HPV, comparadas a 50% daquelas sem VB (OR=5,0; IC 95% 0,5 a 52,9). CONCLUSÃO: mulheres com VB apresentaram maior proporção de anormalidades citopatológicas depois da conização em relação às mulheres sem VB, ainda que estatisticamente não significativa. Esta associação não foi relacionada à presença do DNA de HPV de alto risco.

Determinação precoce do sexo fetal pela análise do DNA no plasma materno

OBJETIVO: avaliar a possibilidade do diagnóstico precoce do sexo fetal no plasma materno pela técnica da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) a partir da 5ª semana de gestação. MÉTODOS: nesse estudo prospectivo foi coletado sangue periférico de gestantes com feto único a partir da 5ª semana de gestação. Após centrifugação do sangue, 0,4 mL de plasma foi separado para extração de DNA fetal. O DNA foi analisado em duplicata por PCR em tempo real para duas regiões genômicas (uma do cromossomo Y e outra comum a ambos os sexos) pelo método de TaqMan®, o qual utiliza um par de primers e uma sonda fluorescente. Foram excluídos da amostragem os casos que evoluíram para aborto. Para o cálculo da sensibilidade e especificidade, usamos o método de comparação com padrão-ouro, que foi o sexo ao nascimento. RESULTADOS: foram realizados 79 exames de DNA fetal no plasma materno de 52 gestantes. O resultado dos exames foi comparado com o sexo da criança após o parto. O índice de acerto conforme a idade gestacional foi de 92,6% (25 de 27 casos) na 5ª semana, conferindo sensibilidade de 87% e 95,6% (22 de 23 casos) na 6ª semana, com sensibilidade de 92%. A partir da 7ª semana de gestação o acerto foi em 100% (29 de 29 casos). A especificidade foi de 100% independente da idade gestacional. CONCLUSÕES: a técnica de PCR em tempo real para detecção do sexo fetal a partir da 5ª semana no plasma materno possui boa sensibilidade e excelente especificidade. Houve concordância do resultado em 100% dos casos em que o diagnóstico foi masculino, independente da idade gestacional, e no caso de feminino, a partir da 7ª semana de gestação.

Genotype characterization of Haematobia irritans from different Brazilian geographic regions based on randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis

Blood-sucking diptera are important parasites in bovine production systems, especially regarding confinement conditions. Haematobia irritans, the horn fly, is one of the most troublesome species within bovine production systems, due to the intense stress imposed to the animals. An important aspect while studying the variability within a species is the study of the geographic structure of its populations and, attempting to find out the genetic flow of Brazilian populations of horn fly, the RAPD technique, which is suited for this purpose, has been used. The use of molecular markers generated from RAPD made it possible to identify the geographic origin of samples from different Brazilian geographic regions, as well as to estimate the genotypic flow among the different Brazilian populations of the horn fly.

Clonal study of avian Escherichia coli strains by fliC conserved-DNA-sequence regions analysis

The clonal relationship among avian Escherichia coli strains and their genetic proximity with human pathogenic E. coli, Salmonela enterica, Yersinia enterocolitica and Proteus mirabilis, was determined by the DNA sequencing of the conserved 5' and 3'regions fliC gene (flagellin encoded gene). Among 30 commensal avian E. coli strains and 49 pathogenic avian E. coli strains (APEC), 24 commensal and 39 APEC strains harbored fliC gene with fragments size varying from 670bp to 1,900bp. The comparative analysis of these regions allowed the construction of a dendrogram of similarity possessing two main clusters: one compounded mainly by APEC strains and by H-antigens from human E. coli, and another one compounded by commensal avian E. coli strains, S. enterica, and by other H-antigens from human E. coli. Overall, this work demonstrated that fliC conserved regions may be associated with pathogenic clones of APEC strains, and also shows a great similarity among APEC and H-antigens of E. coli strains isolated from humans. These data, can add evidence that APEC strains can exhibit a zoonotic risk.

Development and evaluation of a recombinant DNA vaccine candidate expressing porcine circovirus 2 structural protein

Porcine circovirus 2 (PCV2) is generally associated with the porcine circovirosis syndrome, which is considered an important disease of swine and has potentially serious economic impact on the swine industry worldwide. This article describes the construction of a recombinant plasmid expressing the PCV2 structural protein and the evaluation of cellular and humoral immune responses produced by this recombinant vaccine in BALB/c mice. The vaccine candidate was obtained and analyzed in vivo, in an effort to determine the ability to induce a specific immune response in mice. DNA was extracted from a Brazilian PCV2 isolate and the gene coding for Cap protein was amplified by PCR and inserted into an expression plasmid. Groups of BALB/c mice were inoculated intra-muscularly and intradermally in a 15-day interval, with 100 µg and 50 µg of the vaccine construct, respectively. Another group was inoculated intramuscularly with 100 µg of empty plasmid, corresponding to the control group. Seroconversion and cellular response in BALB/c mice were compared and used for vaccine evaluation. Seroconversion was analyzed by ELISA. After a series of 3 immunizations the spleen cells of the immunized animals were used to perform lymphocyte proliferation assays. Seroconversion to PCV2 was detected by ELISA in the animals inoculated with the vaccine construct when compared with control groups. Lymphocyte proliferation assays showed a stronger cell proliferation in the inoculated animals compared with the control group. Thus, the vaccine candidate construct demonstrated to be able to induce both humoral and cellular responses in inoculated mice.