Klonierung und Charakterisierung eines Konsensusgenoms des Hepatitis C Virus als Grundlage der Etablierung eines Zellkultursystems

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist der Haupterreger der parenteral übertragenen non-A non-B Hepatitis. Bisher wurde die Erforschung der Replikation und Pathogenese des HCV durch das Fehlen eines effizienten und verläßlichen Zellkultursystems behindert.Virale RNA aus infizierten humanen Leberzellen wurde isoliert und kloniert. Mit Hilfe eines Vergleichs mehrerer Klone wurde eine isolatspezifische Konsensussequenz bestimmt, auf deren Basis ein Konsensusgenom konstruiert wurde. Mit dem Konsensusgenom als Grundlage wurden subgenomische RNA-Moleküle, sogenannte „selektionierbare Replikons“ hergestellt. Nach Transfektion der Replikons in humane HuH-7 Hepatoma-Zellen konnte gezeigt werden, daß die Replikons autonom und in hohem Maße in den Wirtszellen replizierten.Die Arbeit definiert die Struktur von HCV-Replikons, die in Zellkultur funktionell sind. Damit wird die Basis für ein lange gesuchtes HCV-Zellkultursystem geschaffen, welches das Studium der HCV-Replikation im Detail und die Entwicklung antiviral wirksamer Substanzen ermöglicht.

Einfluss von Stickstoffmonoxid, Hydroxylradikalen und Peroxynitrit auf DNA-Schäden, DNA-Reparatur und Mutationen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht über welche Mechanismen und unter welchen Bedingungen Stickstoffmonoxid (NO) und verwandte reaktive Spezies wie Peroxynitrit und Hydroxylradikale zur Krebsentstehung beitragen können. NO führte an zellfreier DNA kaum zu oxidativen DNA-Schäden. Peroxynitrit, generiert aus 3-Morpholinosydnonimin (SIN-1), induzierte neben Einzel-strangbrüchen und AP-Läsionen vor allem oxidierte Purinmodifikationen (50 % 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)). Hydroxylradikale, freigesetzt aus 4-Hydroxypyridinthion, induzierten neben Einzelstrangbrüchen und AP-Läsionen oxidierte Pyrimidinmodifikationen in der DNA. Nach Transformation und Replikation der geschädigten DNA in E. coli DT-2 wurden überwiegend GC nach AT Transitionen (Hydroxylradikalschädigung), wahrscheinlich verursacht durch das in der DNA induzierte 5-Hydroxycytidin, bzw. GC nach TA Transversionen (Peroxynitrit), verursacht durch das induzierte 8-oxoG, detektiert. In Zellkulturexperimenten führte endogenes NO, freigesetzt von B6-INOS-Zellen (8µM) nicht zu einem Anstieg der Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Schäden, hatte keinen Einfluss auf deren Induzierbarkeit und Reparatur, die Zellpro-liferation und den Glutathionspiegel, schützte jedoch vor der Induktion von Einzelstrangbrüchen und Mikrokernen durch Wasserstoffperoxid. Exogenes NO, freigesetzt durch den Zerfall von Dipropylentriamin-NONOat, hemmte in Konzentrationen ab 0,5 mM spezifisch die Reparatur oxidativer DNA-Schäden, nicht jedoch die von Pyrimidindimeren, AP-Läsionen und Einzelstrangbrüchen,und führte in Konzentrationen > 1 mM zu einer Induktion von DNA-Schäden in den B6-Mausfibroblasten. Dabei ähnelte das induzierte Schadensprofil sehr dem von SIN-1.

Identifizierung und Charakterisierung cis regulatorischer Elemente des humanen Gens für Keratin 20 in vitro und im transgenen Mausmodell

ZusammenfassungKeratin 20 (K20) ist ein Intermediärfilament, das als Strukturelement in den Epithelien des Intestinaltrakts und den Merkelzellen der Haut exprimiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene K20 Expressionsvektoren generiert, mit denen regulatorische Elemente des humanen Gens für K20 charakterisiert wurden. Analysiert wurde der Bereich von –4,8 kb bzw. –21,5 kb bis 12,9 kb vom Transkriptionsstart. Die Vektoren, welche die Sequenz von –21,5 kb bis 12,9 kb umfassten, konnten die Expression des EGFP Reportergens in HT-29 Zellen signifikant steigern. Zwei Enhancer-Elemente zwischen –21,5 und –18,4 kb bzw. –18,4 und –14,9 kb verstärkten die Expression der Reporterkonstrukte in vitro signifikant. Die Analyse der Vektoren in transgenen Mäusen zeigte, dass diese das Transgen gewebespezifisch exprimieren. Mit dem Bereich von –4,8 kb bis 12,9 kb ließ sich transgenspezifische mRNA Expression in intestinalen Geweben mittels RT-PCR nachweisen. Die Verwendung der Sequenz von –21,5 kb bis 21,8 kb steigerte die Expression in vivo nicht weiter.Für die gewebespezifische Expression des K20 Vektors reicht die 4,8 kb 5´upstream Sequenz aus, der Bereich bis –21,5 kb verstärkt die Expression in vitro, allerdings fehlen für die starke gewebespezifische Expression von Transgenen in vivo noch weitere Kontrollelemente.

Synaptic connectivity in micropatterned networks of neuronal cells

The presented thesis describes the formation of functional neuronal networks on an underlying micropattern. Small circuits of interconnected neurons defined by the geometry of the patterned substrate could be observed and were utilised as a model system of reduced complexity for the behaviour of neuronal network formation and activity. The first set of experiments was conducted to investigate aspects of the substrate preparation. Micropatterned substrates were created by microcontact printing of physiological proteins onto polystyrene culture dishes. The substrates displayed a high contrast between the repellant background and the cell attracting pattern, such that neurons seeded onto these surfaces aligned with the stamped structure. Both the patterning process and the cell culture were optimised, yielding highly compliant low-density networks of living neuronal cells. In the second step, cellular physiology of the cells grown on these substrates was investigated by patch-clamp measurements and compared to cells cultivated under control conditions. It could be shown that the growth on a patterned substrate did not result in an impairment of cellular integrity nor that it had an impact on synapse formation or synaptic efficacy. Due to the extremely low-density cell culture that was applied, cellular connectivity through chemical synapses could be observed at the single cell level. Having established that single cells were not negatively affected by the growth on patterned substrates, aspects of network formation were investigated. The formation of physical contact between two cells was analysed through microinjection studies and related to the rate at which functional synaptic contacts formed between two neighbouring cells. Surprisingly, the rate of synapse formation between physically contacting cells was shown to be unaltered in spite of the drastic reduction of potential interaction partners on the micropattern. Additional features of network formation were investigated and found consistent with results reported by other groups: A different rate of synapse formation by excitatory and inhibitory neurons could be reproduced as well as a different rate of frequency-dependent depression at excitatory and inhibitory synapses. Furthermore, regarding simple feedback loops, a significant enrichment of reciprocal connectivity between mixed pairs of excitatory and inhibitory neurons relative to uniform pairs could be demonstrated. This phenomenon has also been described by others in unpatterned cultures [Muller, 1997] and may therefore be a feature underlying neuronal network formation in general. Based on these findings, it can be assumed that inherent features of neuronal behaviour and cellular recognition mechanisms were found in the cultured networks and appear to be undisturbed by patterned growth. At the same time, it was possible to reduce the complexity of the forming networks dramatically in a cell culture on a patterned surface. Thus, features of network architecture and synaptic connectivity could be investigated on the single cell level under highly defined conditions.

Algorithms for on-line image registration from multiple views

Images of a scene, static or dynamic, are generally acquired at different epochs from different viewpoints. They potentially gather information about the whole scene and its relative motion with respect to the acquisition device. Data from different (in the spatial or temporal domain) visual sources can be fused together to provide a unique consistent representation of the whole scene, even recovering the third dimension, permitting a more complete understanding of the scene content. Moreover, the pose of the acquisition device can be achieved by estimating the relative motion parameters linking different views, thus providing localization information for automatic guidance purposes. Image registration is based on the use of pattern recognition techniques to match among corresponding parts of different views of the acquired scene. Depending on hypotheses or prior information about the sensor model, the motion model and/or the scene model, this information can be used to estimate global or local geometrical mapping functions between different images or different parts of them. These mapping functions contain relative motion parameters between the scene and the sensor(s) and can be used to integrate accordingly informations coming from the different sources to build a wider or even augmented representation of the scene. Accordingly, for their scene reconstruction and pose estimation capabilities, nowadays image registration techniques from multiple views are increasingly stirring up the interest of the scientific and industrial community. Depending on the applicative domain, accuracy, robustness, and computational payload of the algorithms represent important issues to be addressed and generally a trade-off among them has to be reached. Moreover, on-line performance is desirable in order to guarantee the direct interaction of the vision device with human actors or control systems. This thesis follows a general research approach to cope with these issues, almost independently from the scene content, under the constraint of rigid motions. This approach has been motivated by the portability to very different domains as a very desirable property to achieve. A general image registration approach suitable for on-line applications has been devised and assessed through two challenging case studies in different applicative domains. The first case study regards scene reconstruction through on-line mosaicing of optical microscopy cell images acquired with non automated equipment, while moving manually the microscope holder. By registering the images the field of view of the microscope can be widened, preserving the resolution while reconstructing the whole cell culture and permitting the microscopist to interactively explore the cell culture. In the second case study, the registration of terrestrial satellite images acquired by a camera integral with the satellite is utilized to estimate its three-dimensional orientation from visual data, for automatic guidance purposes. Critical aspects of these applications are emphasized and the choices adopted are motivated accordingly. Results are discussed in view of promising future developments.

Etablierung einer Ko-Kultur von Alveolarepithel und mikrovaskulärem Endothel als in-vitro-Modell einer humanen respiratorischen Einheit

Ziel der Promotionsarbeit war die Etablierung einer humanen respiratorischen Einheit in vitro zur Untersuchung von Wirkmechanismen einer akuten Lungenschädigung. Als Ko-Kulturmodell wurde eine Kultur humaner Alveoloarepithelzellen vom Typ II (A549, NCI H441, primäre hATII Zellen) mit mikrovaskulären Endothelzellen (ISO-HAS-1, primäre HPMEC) auf den beiden Seiten einer mikroporösen Filtermembran (Bilayer) gewählt. Ein differenzierter Monolayer von NCI H441 konnte in Bilayer-Ko-Kultur mit ISO-HAS-1 oder HPMEC durch die Zugabe von Dexamethason (1 µM) unter Verwendung eines serumhaltigen Mediums induziert werden. Dabei wurde eine von Tag 10 bis Tag 12 phänotypisch stabile Ko-Kultur mit TER-Werten um 500 Ohm x cm2 erhalten. Im Hinblick auf die Freisetzung von IL-8 und MCP-1 und die fehlende Freisetzung von RANTES nach Stimulation waren NCI H441 den hATII Zellen ähnlicher als die häufig als hATII-analog eingesetzte Zell-Linie A549, die RANTES freisetzte. Außerdem bildeten A549 trotz zahlreicher Variatione

Proteolysis of the receptor for advanced glycation end products by matrix metalloproteinases

RAGE mediates diverse physiological and pathological effects by binding a variety of ligands. Despite incomplete understanding of RAGE-mediated disorders soluble RAGE (sRAGE) has been identified as a potential biomarker for RAGE-related diseases and possibly represents a hopeful pharmaceutical against RAGE-mediated disorders. Nevertheless, the source of sRAGE remains poorly investigated. Currently sRAGE is thought to be derived exclusively from alternative splicing of mRNA. In this thesis it was investigated whether sRAGE can also be released as a result of ectodomain shedding of full-length RAGE. Using cells overexpressing RAGE as a model system, it was demonstrated clearly that RAGE undergoes ectodomain shedding in both constitutive and regulated manner. Several stimuli including PMA, AMPA, calcium and chelerythrine stimulated the release of sRAGE into cell culture medium. Moreover, possible mechanisms that regulate ectodomain shedding of RAGE were investigated and it was found that shedding of RAGE is likely independent from PKC and MAPK pathways. By using gain of function and loss of function approaches MMP9 but not ADAM10, ADAM17 or MT1-MMP was characterized as the metalloproteinase that mediates shedding of RAGE. Furthermore, it was shown that cytoplasmic domain of RAGE is not essential for shedding of RAGE. In addition, the potential cleavage site of RAGE by MMP9 was investigated and a lack of sequence specificity for the RAGE processing proteinase was demonstrated by mutation analysis. Finally the physiopathological significance of shedding of RAGE is discussed. In conclusion, for the first time ectodomain shedding of human RAGE and the underlying regulatory mechanisms were investigated. The data open a new field for modulation of RAGE shedding as a novel intervention approach against RAGE-mediated diseases.

Sprühgetrocknete Polylaktid, Poly(laktid-co-glykolid) Mikropartikel zur Steuerung der Freisetzung aus pulmonalen Arzneiformen

Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, pharmazeutisch-technologische Möglichkeiten der Retardierung bei ausgewählten Antiasthmatika zur pulmonalen Applikation anzuwenden. Dafür sollten Mikropartikel hergestellt und pharmazeutisch sowie biopharmazeutisch charakterisiert werden. Als Modellsubstanzen werden das Glukokortikoid Budesonid und das β2-Sympathomimetikum Salbutamol in Form seiner Base und seines Salzes verwendet. Die Auswahl erfolgt nach physikochemischen (Lipophilie, Molekulargewicht) und therapeutischen (Halbwertszeit der Wirkung, Applikationsfrequenz) Gesichtspunkten. Mikropartikel auf Polymerbasis ermöglichen eine kontrollierte Freigabe der Arzneistoffe über einen vorausbestimmten Zeitraum. Es erfolgt die Auswahl physiologisch unbedenklicher Hilfsstoffe (Polylaktide R 202H/ Poly(laktid-co-glykolide) RG 502H, RG 752-S) mit unterschiedlichen Anteilen an Coglykolid sowie unterschiedlichen Molekulargewichten, die sich prinzipiell zur Verzögerung der Freisetzung eignen und sich bei der parenteralen Applikation bereits bewährt haben. Die Sprühtrocknung wird als geeignetes pharmazeutisch-technologisches Verfahren zur Präparation von Mikropartikeln im Teilchengrößenbereich von 1- 10 Mikrometern beschrieben, welche den Wirkstoff mit möglichst hoher Beladung verkapselt. Die sprühgetrockneten Pulver sollen pharmazeutisch physikochemisch mittels Rasterelektronenmikroskopie (Morphologie), Laserdiffraktometrie (Teilchengrößenverteilung), DSC und Röntgenpulverdiffraktometrie (thermisches Verhalten) und mittels Stickstoff-Tief-Temperatur Adsorptionsverfahren (spezifische Oberfläche) charakterisiert werden. Zusätzlich wird die Wirkstoffbeladung der sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikel mittels HPLC ermittelt. Die biopharmazeutische Charakterisierung der sprühgetrockneten Pulver erfolgt über die in-vitro Freigabekinetik und die Stabilität der Mikropartikel. Zusätzlich werden Versuche an Zellkulturen und in-vivo Versuche an Mäusen durchgeführt, um die Effekte der sprühgetrockneten Mikropartikel und des Hilfsstoffs hinsichtlich der Freisetzungsretardierung zu testen. Bei den in-vivo Versuchen werden der Atemwegswiderstand und die Verlängerung der exspiratorischen Phase (penh) als Parameter für einen antiasthmatischen Effekt gewählt. Die Lungenlavage Flüssigkeit wird zusätzlich überprüft. Die Ergebnisse zeigen, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung möglich ist, Polymer-Mikropartikel herzustellen, die aufgrund ihrer Partikelgröße von d50 ≤ 5,8 µm fähig sind, die unteren Abschnitte der Lunge zu erreichen. Die Morphologie der Mikropartikel ist abhängig vom zu versprühenden Produkt. Thermodynamisch und röntgenpulverdiffraktometrisch betrachtet handelt es sich um amorphe Produkte, die aber über lange Zeit in diesem Zustand stabil sind. Die Wiederfindung der eingesetzten Arzneistoffmenge in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln und die Freigabeversuche zur Charakterisierung der Retardierungseigenschaften der verwendeten Polymere ergeben, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung von Budesonid und Salbutamol mit den Polymeren möglich ist, retardierende Mikropartikel herzustellen. Die Wiederfindung von Budesonid und Salbutamol in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln entspricht nahezu der eingesetzten Menge. Bei Salbutamolsulfat ist dies nicht der Fall. In Zellkulturversuchen der murinen Zellinie RAW 264.7 ergaben sich Hinweise darauf, dass bei Konzentrationen von 10-6 M und 10-8 M, die Downregulation der IL-6 Konzentration durch die Sprüheinbettung von 9,1 % Budesonid mit PLGA in stärkerem Ausmaß erfolgte, als bei unverkapseltem Budesonid. Zusätzlich wurden in-vivo Versuche mit intranasaler und intraperitonealer Gabe durchgeführt. Die Budesonid-Polymer Sprüheinbettung wurde mit unverkapseltem Budesonid vergleichen. Nach intraperitonealer Gabe hatte die Sprüheinbettung mit Budesonid die besten Effekte hinsichtlich der Unterdrückung des penh und des Atemwegswiderstands auch bei steigenden Metacholinkonzentrationen. Die Auswertung der Lungenlavage Flüssigkeit zeigt sehr deutlich die Downregulation der IL-6 Konzentration in der Lunge durch die Sprüheinbettung mit Budesonid. Zur Zeit werden Vorbereitungen getroffen, ein Gerät zu testen, das in der Lage ist, ein Mikrospray zu generieren, so dass eine intratracheale Verabreichung möglich wäre.

In vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Immunantwort und Parasitenentwicklung bei Infektionen mit dem Darmparasiten Cryptosporidium parvum

Cryptosporidium parvum ist ein intrazellulärer protozoischer Darmparasit (Apikomplexa), der weltweit zu den bedeutendsten Erregern von Diarrhöen beim Menschen und einer Reihe von Nutztieren zählt. Vor allem immunkompromittierte Personen wie zum Beispiel AIDS-Patienten erleiden schwere, chronische bis lebensbedrohende Erkrankungen. Da nach wie vor keine effektive Therapie gegen eine Kryptosporidiose in Form eines spezifisch wirkenden Chemotherapeutikums oder einer Vakzine existiert, ist es notwendig, die Immunantwort des Wirtes gegen den Parasiten und dessen Bindung, Invasion und die intrazelluläre Entwicklung in den Epithelzellen eingehend zu studieren, um neue Ansatzpunkte zu entwickeln. Wohingegen Menschen zeitlebens suszeptibel für eine Infektion mit C. parvum sind, entwickeln Mäuse eine natürliche Resistenz und können als adulte Tiere nicht mehr infiziert werden. Daher sind Mausmodelle der Kryptosporidiose auf neonatale oder immunsupprimierte und immundefiziente adulte Mäuse beschränkt. Bei der Überwindung einer C. parvum-Infektion sind Effektoren der natürlichen und adaptiven Immunität beteiligt. Die zentrale Rolle spielen CD4+-T-Zellen, sowie Interferon-gamma und Interleukin-12. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Infektionen in IFN-gamma (GKO)- und IL-12 p40 (IL12KO)-Knockout-Mäusen (C57BL/6) etabliert, für die bereits gezeigt wurde, dass sie eine Suszeptibilität gegenüber einer Erstinfektion besitzen. Erstmals wurden die beiden Infektionsmodelle parallel unter denselben Bedingungen analysiert, um Rückschlüsse auf die Funktion und die Bedeutung der beiden Th1-Zytokine IFN-gamma und IL-12 bei der Auseinandersetzung mit dem Parasiten und der Überwindung einer Infektion ziehen zu können. Es wurden deutliche Unterschiede im Infektionsverlauf, bei der Höhe und Dauer der Parasitenausscheidung und der induzierten systemischen und mukosalen Antikörperantwort beobachtet. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass neben IL12KO auch GKO in der Lage sind, eine erste Infektion zu überwinden und eine Resistenz gegenüber einer erneuten Konfrontation mit dem Parasiten zu entwickeln. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Etablierung einer protektiven Immunität gegen eine Kryptosporidiose generell unabhängig von der Anwesenheit der Zytokine IFN-gamma und IL-12 ist, der Verlust von IFN-gamma jedoch schwerer wiegt. Bei GKO-Mäusen persistierte der Parasit in Form einer niedriggradigen chronischen Infektion. Die beiden Infektionsmodelle stellten sich als ideales System für die Etablierung einer effektiven Immunisierungsstrategie heraus. Intranasale Immunisierungen, welche neben einer systemischen auch eine mukosale Immunantwort induzieren können, schienen einen richtigen Ansatz darzustellen. Intraperitoneale und subkutane Immunisierungen führten zwar zur Ausbildung einer starken spezifischen IgG-Antwort im Serum, diese war jedoch nicht in der Lage, einen Schutz vor einer Infektion zu vermitteln. Neben den in vivo Untersuchungen wurde des Weiteren auch die intrazelluläre Entwicklung von C. parvum in einem in vitro Kultursystem verfolgt. Zum ersten Mal wurde die Genexpression von vier Oberflächenproteinen der invasiven Zoitenstadien und eines Oozystenwandproteins parallel durch RT-PCR analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Gene während der intrazellulären Entwicklung differentiell exprimiert werden, was eine unterschiedliche Funktion der Proteine während des Entwicklungszyklus nahe legt. Das Expressionsmuster der verschiedenen Gene charakterisiert bestimmte Abschnitte innerhalb des Entwicklungszyklus. Dabei wurden Marker für die Invasion (CP17) sowie für die asexuelle (GP900) und sexuelle Replikation (COWP) identifiziert.

Einfluss immunevasiver Strategien des humanen Cytomegalovirus auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der viralen Antigene pp65 und IE1

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) stellt eine große Bedrohung für Patienten mit geschwächtem oder unausgereiftem Immunsystem dar. Bei immunkompetenten Personen hingegen werden schwere Erkrankungen insbesondere durch die Wirkung antiviraler zytotoxischer CD8+-T-Lymphozyten (CTL) weitgehend verhindert. Aus Zellkultur-Systemen war bekannt, dass virale Glykoproteine, welche in der US2-US11-Region des HCMV-Genoms kodiert werden, inhibitorisch in den MHC-Klasse-I-Präsentationsweg eingreifen und somit die entsprechende Präsentation durch infizierte Zellen behindern. Über die Bedeutung dieser US2-US11-vermittelten Immunevasion für die Präsentation viraler Antigene im Kontext der Virusinfektion war jedoch nichts bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher der Einfluss der Immunevasion auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der beiden wichtigsten CTL-Zielstrukturen von HCMV, dem Tegumentprotein pp65 und dem regulatorischen immediate early Protein IE1, untersucht werden. In Ergänzung dazu sollte das immunevasive Potential eines durch HCMV kodierten Homologs des immunmodulatorischen Zytokins Interleukin-10 (cmvIL-10) analysiert werden. Hierzu wurden über Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener Mäuse CTL-Klone hergestellt, welche ausgesuchte Peptide aus pp65 und IE1 in Assoziation mit HLA-A2 mit hoher Spezifität und Sensitivität erkannten. Auf diese Weise konnte eine direkte Beeinflussung der MHC-Klasse-I-Präsentation durch cmvIL-10 falsifiziert und somit der Hypothese, dass das von infizierten Zellen freigesetzte Zytokin die MHC-Klasse-I-Präsentation nicht infizierter Nachbarzellen beeinflussen könnte, widersprochen werden. Mit Hilfe einer US2-US11-Deletionsmutante des Virus konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Präsentation von sowohl pp65 als auch IE1 durch die Immunevasion beeinträchtigt wird. Dabei war die Präsentation des IE1-Peptids zu jedem untersuchten Zeitpunkt nach Infektion vollständig unterdrückt. Die Präsentation des pp65-Peptids hingegen war noch bis zu 72 Stunden nach Infektion detektierbar. Diese anhaltende Präsentation wurde dabei durch MHC-Klasse-I-Komplexe hervorgerufen, die trotz der Expression der US2-US11-Region an die Zelloberfläche transportiert wurden. Anhand des pp65 konnte somit erstmals gezeigt werden, dass die Immunevasion von HCMV Bildung und Transport bestimmter MHC-Klasse-I-Peptid-Komplexe zwar beeinträchtigen, jedoch nicht vollständig blockieren kann. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Präsentation von IE1-Peptiden durch das Vorhandensein des pp65-Proteins nicht beeinflusst wurde. Damit konnten aus der Literatur bekannte Daten anderer widerlegt werden. Mit Hilfe einer weiteren Virusmutante konnte schließlich gezeigt werden, das die Expression eines der Immunevasine, des gpUS11, hinreichend ist, die IE1-Präsentation vollständig zu unterdrücken, jedoch keinerlei messbaren Einfluss auf die Präsentation von pp65 ausübt. Die vorliegende Arbeit hat wichtige Erkenntnisse erbracht, die die Grundlage für weiterführende Untersuchungen zur Aufklärung der Bedeutung der einzelnen Immunevasionsgene für die Präsentation viraler Antigene im Rahmen der Virusinfektion darstellen.

Identifizierung von T-Zell-erkannten Nierenzellkarzinom-Antigenen

Eine Voraussetzung für die Entwicklung neuer immunmodulatorischer Therapieverfahren ist die Kenntnis immunogener Tumorantigene, die von tumorreaktiven T-Zellen erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL, cytotoxic T-lymphocytes) aus dem Blut eines HLA (human leukocyte antigen)-kompatiblen Fremdspenders generiert. Methodisch wurden hierzu CD8-selektionierte periphere Blutlymphozyten repetitiv mit der klarzelligen Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC (RCC, renal cell carcinoma) in einer allogenen gemischten Lymphozyten-Tumorzell Kultur (MLTC, mixed lymphocyte tumor cell culture) stimuliert. Aus den Responderlymphozyten wurden mit Hilfe des Grenzverdünnungsverfahrens klonale zytotoxische T-Zellen generiert und expandiert. Die CTL-Klone wurden anschließend phänotypisch mittels Durchflußzytometrie sowie funktionell mittels HLA-Antikörper-Blockadeexperimenten und Kreuzreaktivitätstests detailliert charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß aus dem Blut eines allogenen gesunden Spenders CD8+ T-Zellen isoliert werden können, welche Reaktivität gegen Nierenzellkarzinome (NZK) aufweisen und über verschiedene HLA-Klasse-I-Allele restringiert sind. Die von den einzelnen CTL-Klonen erkannten Zielstrukturen zeigten entweder ubiquitäre (z.B. HLA-Cw*0704-reaktiver CTL-Klon E77) oder eine tumorspezifische (z.B. HLA-B*0702-restringierter CTL-Klon A4) Gewebeexpression. Zur Identifizierung der natürlich prozessierten Peptidliganden wurden die HLA-B/C-Allele unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers B123.2 aus einem zuvor hergestellten Detergenslysat der Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC immunchromatographisch aufgereinigt. Aus den so isolierten HLA-Peptid-Komplexen wurden die tumorassoziierten Peptidliganden nach Säureeluation und Filtration abgespalten und über eine „reverse phase“-HPLC (high performance liquid chromatography) fraktioniert. Die Überprüfung der einzelnen HPLC-Fraktionen auf Bioaktivität erfolgte mit den korrespondierenden CTL-Klonen in 51Cr-Zytotoxizitätstests. Dabei wurde eine HPLC-Fraktion identifiziert, die die lytische Funktion des HLA-B*0702-restringierten CTL-Klons A4 auslösen konnte. Die bioaktive HPLC-Fraktion wurde dazu durch eine zweite (second dimension) Kapillar-Flüssigkeitschromatographie (Cap-LC, capillar liquid chromatography) in Subfraktionen geringerer Komplexität aufgetrennt und die darin enthaltenen Peptidepitope durch das MALDI-TOF/TOF (matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight/time of flight)-Analyseverfahren sequenziert. Innerhalb dieser HPLC-Fraktion wurden eine Vielzahl von HLA-B/C-assoziierten Peptidliganden erfolgreich sequenziert, was die Effektivität dieser Verfahrenstechnik zur Identifizierung natürlich prozessierter HLA-Klasse-I-bindender Peptide unter Beweis stellt. Leider war es mit dieser Methode bisher nicht möglich, das von CTL-Klon A4 detektierte Peptidepitop zu sequenzieren. Dies liegt möglicherweise in der unzureichenden Konzentration des Peptidepitops in der bioaktiven HPLC-Fraktion begründet. In Folgearbeiten soll nun mit erhöhter Probenmenge beziehungsweise verbesserter Analytik der erneute Versuch unternommen werden, das Zielantigen des CTL-Klons A4 zu identifizieren. Die Kenntnis von Antigenen, die tumorspezifisch exprimiert und von CD8+ CTL aus gesunden Spendern erkannt werden, eröffnet neue therapeutische Möglichkeiten, das spezifische Immunsystem des Stammzellspenders nach allogener Blutstammzelltransplantation gezielt zur Steigerung von Tumorabstoßungsreaktionen (z.B. durch Vakzinierung oder adoptivem T-Zelltransfer) zu nutzen.

Impact of folate absorption and transport for nutrition and drug targeting

In this thesis, interactions of folic acid with tea and tea components at the level of intestinal absorption have been investigated. Firstly, the interaction between folic acid and tea as well as tea catechins was studied in vitro, using Caco-2 cell monolayers and secondly, a clinical trial was designed and carried out. In addition, targeting of folic acid conjugated nanoparticles to FR expressing Caco-2 cells was studied in order to evaluate the principle of nutrient-receptor-coupled transport for drug targeting. In the first part of this work, it was shown that EGCG and ECG (gallated catechins) inhibit folic acid uptake (IC50 of 34.8 and 30.8 µmol/L) comparable to MTX (methotrexate) under these experimental conditions. Moreover, commercial green and black tea extracts inhibited folic acid uptake with IC50 values of approximately 7.5 and 3.6 mg/mL, respectively. These results clearly indicate an interaction between folic acid and green tea catechins at the level of intestinal uptake. The mechanism responsible for the inhibition process might be the inhibition of the influx transport routes for folates such as via RFC and/or PCFT. For understanding the in vivo relevance of this in vitro interaction, a phase one, open-labeled, randomized, cross-over clinical study in seven healthy volunteers was designed. For the 0.4 mg folic acid dose, the mean Cmax decreased by 39.2% and 38.6% and the mean AUC0 decreased by 26.6% and 17.9% by green tea and black tea, respectively. For the 5 mg folic acid dose, the mean Cmax decreased by 27.4% and mean AUC0 decreased by 39.9% when taken with green tea. The results of the clinical study confirm the interaction between tea and folic acid in vivo leading to lower bioavailabilities of folic acid. In the second part of the thesis, targeting studies using folic acid conjugated nanoparticles were conducted. Folic acid conjugated nanoparticles were shown to be internalized by the cell via FR (folate receptor) mediated endocytosis. DNA block copolymer micelles equipped with 2, 11 and 28 folic acid units respectively were applied on FR expressing Caco-2 cells. There was a direct proportion in the amount of internalized nanoparticle and the number of folic acid units on the periphery of the nanoparticle. To sum up, throughout this thesis, the importance of folic acid for nutrition and nutrient and drug related interactions of folic acid at intestinal level was shown. Furthermore, significance of FRs in targeting for cancer chemotherapy was demonstrated in in vitro cell culture experiments. Folic acid conjugated DNA block copolymer micelles were suggested as efficient nanoparticles for targeted drug delivery.

Konditionale Mutagenese von Desmoglein 2 in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte interzelluläre Verbindungen, die Zellverbänden eine mechanische Stabilität verleihen. Die Intermediärfilamentnetzwerke benachbarter Zellen werden mit Hilfe der desmosomalen Cadherine vom Desmoglein- und Desmocollin-Typ miteinander verknüpft. Diese Glykoproteine interagieren miteinander im Interzellularspalt zwischen benachbarten Zellen und stellen mit ihren zytoplasmatischen Domänen einen Ankerpunkt für desmosomale Brückenproteine dar, an welche wiederum die Proteine des Intermediärfilament-Zytoskeletts binden. Bei der Maus spielt das desmosomale Cadherin Desmoglein 2 (DSG2) bereits in frühen Stadien der Embryogenese eine entscheidende Rolle. Homozygote DSG2-Knockout-Mäuse sterben bereits vor der Implantation des Embryos ab. Im adulten Tier ist Dsg2 die am weitesten verbreitete Isoform, in Darm, Leber und Herzmuskel wird es zudem exklusiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von Dsg2 in differenzierten Gewebeverbänden adulter Tiere zu untersuchen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden mehrere transgene Mauslinien hergestellt, in denen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems eine Deletion im DSG2-Gen konditional und gewebsspezifisch induziert werden konnte. Dazu wurden zuerst zwei loxP-Sequenzen und eine mit zwei FRT-Stellen flankierte Neomyzinresistenzgen-Kassette in das DSG2-Gen von embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination eines Targeting-Konstrukts inseriert. Diese Zellen wurden in Blastozysten injiziert und Mauslinien hergestellt. Mit Hilfe der Flpe-Rekombinase wurde anschließend die Resistenzenzgen-Kassette entfernt. Diese Stämme wurden mit Mäusen verpaart, die eine induzierbare und gewebsspezifische Synthese der Cre-Rekombinase ermöglichen. Im Darmepithel und der Leber konnte eine gewebsspezifische Rekombination des DSG2-Gens induziert werden. Untersuchungen der DSG2-mRNA zeigten, dass die DSG2-Rekombination in der Darmschleimhaut nahezu vollständig erfolgte. Immunfluoreszenz-Analysen an Gewebsfragmenten induzierter Tiere mit Isotyp-spezifischen Antikörpern, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellt worden waren, zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede der Desmosomenzahl und -verteilung. Daher wurden eGFP-Hybride des zu erwartenden mutierten Dsg2-Proteins in Zellen exprimiert und mit wildtypischem Dsg2 verglichen. Es konnte hinsichtlich der Verteilung und Morphologie der Desmosomen keine Unterschiede zwischen beiden Dsg2-Proteinen festgestellt werden. Der Dsg2-Mutante fehlen wichtige Proteinbereiche, die für die trans-Interaktion der extrazellulären Domäne verantwortlich sind, die Haupt-N-Glykosylierungsstelle, sowie eine der insgesamt vier Kalzium-Bindestellen. Dies sind Eigenschaften, von denen man bisher annahm, dass sie eine zentrale Bedeutung für die desmosomale Adhäsion besitzen. Weitere Experimente werden zeigen, inwieweit die hergestellte Dsg2-Mutante in „Stresssituationen“, wie sie z.B. bei Regenerationsvorgängen oder der Tumorgenese auftreten, zu veränderten adhäsiven Eigenschaften führt.

Die Beteiligung von wildtypischer SOD1 an der Pathogenese der SOD1-vermittelten amyotrophen Lateralsklerose (ALS1)

Bei der amyotrophen Lateralsklerose 1 (ALS1) handelt es sich um eine altersabhängige Motoneuronenerkrankung, die durch Mutationen im Gen der Cu/Zn-Superoxid Dismutase (hSOD1mut) ausgelöst wird. Die toxischen Eigen¬schaften von hSOD1mut (z. B. Aggregations- oder oxidative Stress-Hypothese) und der Einfluss wildtypischer hSOD1 (hSOD1WT) auf den Krankheitsverlauf sind weithin ungeklärt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen von hSOD1mut-hSOD1WT-Heterodimeren im Vergleich zu mutanten Homodimeren auf die Pathogenese der ALS1 zu untersuchen. Nachdem gezeigt werden konnte, dass es in humanen Zellen in der Tat zu einer Bil¬dung hetero- und homodimerer mutanter hSOD1-Spezies kommt, wurden Dimerfusionsproteine aus zwei hSOD1-Monomeren generiert, die durch einen flexiblen Peptidlinker verbunden und C-terminal mit eGFP markiert waren. Neben hSOD1WT-WT wurden hSOD1mut-mut- und hSOD1mut-WT-Dimere mit vier verschiedenen hSOD1-Mu¬tanten untersucht. Die biochemische Charakterisierung zeigte, dass alle Dimere, die wildtyp-ähnliche hSOD1mut enthielten, eine Dismutaseaktivität aufwiesen. Im Gegensatz dazu war das Homodimer aus zwei metalldefizienten hSOD1G85R inaktiv, wobei interessanterweise hSOD1G85R mit hSOD1WT ein Dismutase-aktives Dimer bilden konnte. Sowohl in Zellkultursystemen als auch in einem C. elegans-Modell bildeten alle mutanten Homodimere vermehrt Aggregate im Vergleich zu den dazugehörigen Heterodimeren. Dieses Aggregationsverhalten korrelierte aber nicht mit der Toxizität der Dimerproteine in Überlebensassays und einer C. elegans Bewe¬gungs¬analyse. In diesen funktionellen Studien assoziierte die Toxizität der dimeren Fusionsproteine mit der enzy¬matischen Aktivität. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass hSOD1WT nicht in hSOD1mut-abhängigen Aggregaten vorkommt. Die Ergebnisse dieser Studie sprechen gegen die Aggregation als primäre toxische Eigen¬schaft der hSOD1mut und unterstützen die oxidative Stress-Hypothese. Dis¬mutase-inaktive hSOD1mut können eine untypische Enzymaktivität durch die Heterodimerisierung mit hSODWT erlangen, die auf diese Weise maßgeblich an der Pathogenese der ALS1 beteiligt sein könnte.

Nukleation pflanzlicher Mikrotubuli: Expression relevanter Gene

Die wichtigsten Bestandteile des Cytoskeletts in pflanzlichen Zellen sind die Actinfilamente und die Mikrotubuli. Die Mikrotubuli spielen in der Organisation und der Morphogenese von pflanzlichen Zellen eine wichtige Rolle. Sie sind zusammen mit den Cellulosefibrillen an der Formgebung der Pflanzenzelle beteiligt. Sie bilden das Präprophaseband, das die Zellteilungsebene bestimmt und die Mitosespindel, die für die Trennung der Chromosomen sorgt, sowie den Phragmoplasten, der die Zellwand zwischen den Tochterzellen bildet. Weiterhin geben die Mikrotubuli durch Interaktion mit den Cellulose-Synthase-Komplexen die Richtung der Zellexpansion vor (GRANGER und CYR, 2001; LLOYD und CHAN, 2002; BASKIN, 2002). Die Mikrotubuli sind auch an der Stabilisierung der Zellform und an Transportprozessen beteiligt. Als Bestandteil der Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOCs) wurde das γ-Tubulin identifiziert, das sehr wahrscheinlich an der Nukleation der Mikrotubuli beteiligt ist, indem es die Assemblierung der αβ-Tubulindimere zu Mikrotubuli einleitet. In tierischen Zellen ist durch intensive Forschung inzwischen relativ viel über die Funktion von γ-Tubulin, vor allem im Verlauf der Zellteilung bekannt, wie z. B. die Lokalisation in Centrosomen mit ihren paarweise angeordneten Centriolen, die die MTOCs darstellen. In pflanzlichen Zellen sind bisher nur wenige Funktionen des Proteins hinreichend geklärt. Die höheren Pflanzen besitzen keine Centriolen und keine Centrosomen. Über die Zellteilung hinaus gibt es kaum Anhaltspunkte über das Vorhandensein oder eventuelle Aufgaben von γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellkulturen und Pflanzengeweben. In dieser Arbeit wurde die Expression über PCR und die Messung des Proteingehalts von cytoskelett-relevanten Proteinen in den Entwicklungsstadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und von Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) von Nicotiana tabacum gemessen. Primäres Ziel war es eine Aussage zu erhalten, in welchem Ausmaß γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellen noch exprimiert wird und ob bzw. wie eine Regulation (transkriptionell oder posttranskriptionell) des γ-Tubulins in der Pflanze stattfindet. Für den Nachweis des γ-Tubulins auf der Proteinebene wurde ein pflanzenspezifischer γ-Tubulin Antikörper zu entwickelt. Bei diesem Antikörper handelte es sich um einen polyklonalen Antikörper, der spezifisch gegen eine Sequenz in pflanzlichem γ-Tubulin gerichtet ist. Dabei zeigte der in der Arbeit entwickelte Antikörper gegen die pflanzliche JOSHI-Domäne spezifische Signale. Der erfolgte Nachweis von γ-Tubulin auf der Proteinebene und der Transkripte zeigte bis in die ältesten untersuchten Stadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und in Geweben der Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) deutliche Signale für γ-Tubulin. Es war somit nicht nur in meristematisch aktiven Zellen und Geweben von Nicotiana tabacum, sondern auch in nichtmitotischen Zellen und Geweben vorhanden. Hierbei war über die Phasen der Zellteilung und der Zellformgebung hinweg auf beiden Ebenen eine parallele Entwicklung mit relativ konstanten starken Signalen zu beobachten. Nach dem Einstellen der Teilungsaktivität fiel der Gehalt an mRNA deutlich ab. Dabei nahm die Konzentration des Proteins im Vergleich zur mRNA zeitlich verzögert ab. Diese Ergebnisse bei der Zellsuspensionskultur (BY-2) und Tabakpflanze (SR1) gehen mit der möglichen Nukleationstätigkeit des Proteins konform. Es waren geringere aber doch deutlichen Signale bei Absterbenden Zellen der Zellkultur, bzw. bei expandierenden und voll expandierten und seneszenten Blättern der Tabakpflanze (SR1) nachzuweisen. Dies lässt die Folgerung zu, dass die nachgewiesene mRNA von γ-Tubulin nicht posttranskriptionell reguliert wird, sondern dass das γ-Tubulin auch eine wichtige Rolle außerhalb der Zellteilung in den postmitotischen Stadien, z. B. als organisierender Faktor bei der Umgestaltung oder Stabilisierung des Mikrotubuli-Cytoskeletts, spielt. Der γ-Tubulin-Gehalt in den Geweben der SR1-Pflanze zeigte über die Zellkultur hinaus, dass die Expression von α-Tubulin nach Einstellen der Teilungsaktivität kontinuierlich abnimmt. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass γ-Tubulin in älteren Blattgeweben zusätzliche Aufgaben übernehmen könnte, die nicht auf eine gleichzeitige Expression von α-Tubulin angewiesen sind. So kann beispielsweise eine Beteiligung von γ-Tubulin an der Stabilisierung der Mikrotubuli, und damit einhergehend eine Abnahme der dynamischen Instabilität dieser Filamente, eine denkbare Funktion des Proteins in expandierendem und voll expandiertem Gewebe sein. Die Aufgaben von γ-Tubulin in sehr altem Gewebe mit deutlichen Anzeichen der Seneszenz können allerdings nach dem derzeitigen Stand der Forschung nicht eindeutig beantwortet werden und bedürfen weitergehenden Untersuchungen, da dadurch ein die Komplexität und die Dynamik des pflanzlichen Cytoskeletts geklärt werden kann.