Improving the microbial production of biofuels through metabolic engineering

Les défis conjoints du changement climatique d'origine anthropique et la diminution des réserves de combustibles fossiles sont le moteur de recherche intense pour des sources d'énergie alternatives. Une avenue attrayante est d'utiliser un processus biologique pour produire un biocarburant. Parmi les différentes options en matière de biocarburants, le bio-hydrogène gazeux est un futur vecteur énergétique attrayant en raison de son efficacité potentiellement plus élevé de conversion de puissance utilisable, il est faible en génération inexistante de polluants et de haute densité d'énergie. Cependant, les faibles rendements et taux de production ont été les principaux obstacles à l'application pratique des technologies de bio-hydrogène. Des recherches intensives sur bio-hydrogène sont en cours, et dans les dernières années, plusieurs nouvelles approches ont été proposées et étudiées pour dépasser ces inconvénients. À cette fin, l'objectif principal de cette thèse était d'améliorer le rendement en hydrogène moléculaire avec un accent particulier sur l'ingénierie métabolique et l’utilisation de bioprocédés à variables indépendantes. Une de nos hypothèses était que la production d’hydrogène pourrait être améliorée et rendue plus économiquement viable par ingénierie métabolique de souches d’Escherichia coli producteurs d’hydrogène en utilisant le glucose ainsi que diverses autres sources de carbone, y compris les pentoses. Les effets du pH, de la température et de sources de carbone ont été étudiés. La production maximale d'hydrogène a été obtenue à partir de glucose, à un pH initial de 6.5 et une température de 35°C. Les études de cinétiques de croissance ont montré que la μmax était 0.0495 h-1 avec un Ks de 0.0274 g L-1 lorsque le glucose est la seule source de carbone en milieu minimal M9. .Parmi les nombreux sucres et les dérivés de sucres testés, les rendements les plus élevés d'hydrogène sont avec du fructose, sorbitol et D-glucose; 1.27, 1.46 et 1.51 mol H2 mol-1 de substrat, respectivement. En outre, pour obtenir les interactions entre les variables importantes et pour atteindre une production maximale d'hydrogène, un design 3K factoriel complet Box-Behnken et la méthodologie de réponse de surface (RSM) ont été employées pour la conception expérimentale et l'analyse de la souche d'Escherichia coli DJT135. Le rendement en hydrogène molaire maximale de 1.69 mol H2 mol-1 de glucose a été obtenu dans les conditions optimales de 75 mM de glucose, à 35°C et un pH de 6.5. Ainsi, la RSM avec un design Box-Behken était un outil statistique utile pour atteindre des rendements plus élevés d'hydrogène molaires par des organismes modifiés génétiquement. Ensuite, l'expression hétérologue de l’hydrogénases soluble [Ni-Fe] de Ralstonia eutropha H16 (l'hydrogénase SH) a tenté de démontrer que la mise en place d'une voie capable de dériver l'hydrogène à partir de NADH pourrait surpasser le rendement stoechiométrique en hydrogène.. L’expression a été démontrée par des tests in vitro de l'activité enzymatique. Par ailleurs, l'expression de SH a restaurée la croissance en anaérobie de souches mutantes pour adhE, normalement inhibées en raison de l'incapacité de réoxyder le NADH. La mesure de la production d'hydrogène in vivo a montré que plusieurs souches modifiées métaboliquement sont capables d'utiliser l'hydrogénase SH pour dériver deux moles d’hydrogène par mole de glucose consommé, proche du maximum théorique. Une autre stratégie a montré que le glycérol brut pourrait être converti en hydrogène par photofermentation utilisant Rhodopseudomonas palustris par photofermentation. Les effets de la source d'azote et de différentes concentrations de glycérol brut sur ce processus ont été évalués. À 20 mM de glycérol, 4 mM glutamate, 6.1 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus dans des conditions optimales, un rendement de 87% de la théorie, et significativement plus élevés que ce qui a été réalisé auparavant. En prolongement de cette étude, l'optimisation des paramètres a également été utilisée. Dans des conditions optimales, une intensité lumineuse de 175 W/m2, 30 mM glycérol et 4.5 mM de glutamate, 6.69 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus, soit un rendement de 96% de la valeur théorique. La détermination de l'activité de la nitrogénase et ses niveaux d'expression ont montré qu'il y avait relativement peu de variation de la quantité de nitrogénase avec le changement des variables alors que l'activité de la nitrogénase variait considérablement, avec une activité maximale (228 nmol de C2H4/ml/min) au point central optimal. Dans la dernière section, la production d'hydrogène à partir du glucose via la photofermentation en une seule étape a été examinée avec la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-). La méthodologie de surface de réponse avec Box-Behnken a été utilisée pour optimiser les variables expérimentales de façon indépendante, soit la concentration de glucose, la concentration du glutamate et l'intensité lumineuse, ainsi que d'examiner leurs effets interactifs pour la maximisation du rendement en hydrogène moléculaire. Dans des conditions optimales, avec une intensité lumineuse de 175 W/m2, 35 mM de glucose, et 4.5 mM de glutamate,, un rendement maximal d'hydrogène de 5.5 (± 0.15) mol hydrogène /mol glucose, et un maximum d'activité de la nitrogénase de 246 (± 3.5) nmol C2H4/ml/min ont été obtenus. L'analyse densitométrique de l'expression de la protéine-Fe nitrogenase dans les différentes conditions a montré une variation significative de l'expression protéique avec un maximum au point central optimisé. Même dans des conditions optimales pour la production d'hydrogène, une fraction significative de la protéine Fe a été trouvée dans l'état ADP-ribosylée, suggérant que d'autres améliorations des rendements pourraient être possibles. À cette fin, un mutant amtB dérivé de Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-) a été créé en utilisant le vecteur de suicide pSUP202. Les résultats expérimentaux préliminaires montrent que la souche nouvellement conçue métaboliquement, R. capsulatus DG9, produit 8.2 (± 0.06) mol hydrogène / mole de glucose dans des conditions optimales de cultures discontinues (intensité lumineuse, 175 W/m2, 35 mM de glucose et 4.5 mM glutamate). Le statut d'ADP-ribosylation de la nitrogénase-protéine Fe a été obtenu par Western Blot pour la souche R. capsulatus DG9. En bref, la production d'hydrogène est limitée par une barrière métabolique. La principale barrière métabolique est due au manque d'outils moléculaires possibles pour atteindre ou dépasser le rendement stochiométrique en bio-hydrogène depuis les dernières décennies en utilisant les microbes. À cette fin, une nouvelle approche d’ingénierie métabolique semble très prometteuse pour surmonter cette contrainte vers l'industrialisation et s'assurer de la faisabilité de la technologie de la production d'hydrogène. Dans la présente étude, il a été démontré que l’ingénierie métabolique de bactéries anaérobiques facultatives (Escherichia coli) et de bactéries anaérobiques photosynthétiques (Rhodobacter capsulatus et Rhodopseudomonas palustris) peuvent produire de l'hydrogène en tant que produit majeur à travers le mode de fermentation par redirection métabolique vers la production d'énergie potentielle. D'autre part, la méthodologie de surface de réponse utilisée dans cette étude représente un outil potentiel pour optimiser la production d'hydrogène en générant des informations appropriées concernant la corrélation entre les variables et des producteurs de bio-de hydrogène modifiés par ingénierie métabolique. Ainsi, un outil d'optimisation des paramètres représente une nouvelle avenue pour faire un pont entre le laboratoire et la production d'hydrogène à l'échelle industrielle en fournissant un modèle mathématique potentiel pour intensifier la production de bio-hydrogène. Par conséquent, il a été clairement mis en évidence dans ce projet que l'effort combiné de l'ingénierie métabolique et la méthodologie de surface de réponse peut rendre la technologie de production de bio-hydrogène potentiellement possible vers sa commercialisation dans un avenir rapproché.

Detection of methotrexate using surface plasmon resonance biosensors for chemotherapy monitoring

Le méthotrexate (MTX), un agent anti-cancéreux fréquemment utilisé en chimiothérapie, requiert généralement un suivi thérapeutique de la médication (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) pour surveiller son niveau sanguin chez le patient afin de maximiser son efficacité tout en limitant ses effets secondaires. Malgré la fenêtre thérapeutique étroite entre l’efficacité et la toxicité, le MTX reste, à ce jour, un des agents anti-cancéreux les plus utilisés au monde. Les techniques analytiques existantes pour le TDM du MTX sont coûteuses, requièrent temps et efforts, sans nécessairement fournir promptement les résultats dans le délai requis. Afin d’accélérer le processus de dosage du MTX en TDM, une stratégie a été proposée basée sur un essai compétitif caractérisé principalement par le couplage plasmonique d’une surface métallique et de nanoparticules d’or. Plus précisément, l’essai quantitatif exploite la réaction de compétition entre le MTX et une nanoparticule d’or fonctionnalisée avec l’acide folique (FA-AuNP) ayant une affinité pour un récepteur moléculaire, la réductase humaine de dihydrofolate (hDHFR), une enzyme associée aux maladies prolifératives. Le MTX libre mixé avec les FA-AuNP, entre en compétition pour les sites de liaison de hDHFR immobilisés sur une surface active en SPR ou libres en solution. Par la suite, les FA-AuNP liées au hDHFR fournissent une amplification du signal qui est inversement proportionnelle à la concentration de MTX. La résonance des plasmons de surface (SPR) est généralement utilisée comme une technique spectroscopique pour l’interrogation des interactions biomoléculaires. Les instruments SPR commerciaux sont généralement retrouvés dans les grands laboratoires d’analyse. Ils sont également encombrants, coûteux et manquent de sélectivité dans les analyses en matrice complexe. De plus, ceux-ci n’ont pas encore démontré de l’adaptabilité en milieu clinique. Par ailleurs, les analyses SPR des petites molécules comme les médicaments n’ont pas été explorés de manière intensive dû au défi posé par le manque de la sensibilité de la technique pour cette classe de molécules. Les développements récents en science des matériaux et chimie de surfaces exploitant l’intégration des nanoparticules d’or pour l’amplification de la réponse SPR et la chimie de surface peptidique ont démontré le potentiel de franchir les limites posées par le manque de sensibilité et l’adsorption non-spécifique pour les analyses directes dans les milieux biologiques. Ces nouveaux concepts de la technologie SPR seront incorporés à un système SPR miniaturisé et compact pour exécuter des analyses rapides, fiables et sensibles pour le suivi du niveau du MTX dans le sérum de patients durant les traitements de chimiothérapie. L’objectif de cette thèse est d’explorer différentes stratégies pour améliorer l’analyse des médicaments dans les milieux complexes par les biocapteurs SPR et de mettre en perspective le potentiel des biocapteurs SPR comme un outil utile pour le TDM dans le laboratoire clinique ou au chevet du patient. Pour atteindre ces objectifs, un essai compétitif colorimétrique basé sur la résonance des plasmons de surface localisée (LSPR) pour le MTX fut établi avec des nanoparticules d’or marquées avec du FA. Ensuite, cet essai compétitif colorimétrique en solution fut adapté à une plateforme SPR. Pour les deux essais développés, la sensibilité, sélectivité, limite de détection, l’optimisation de la gamme dynamique et l’analyse du MTX dans les milieux complexes ont été inspectés. De plus, le prototype de la plateforme SPR miniaturisée fut validé par sa performance équivalente aux systèmes SPR existants ainsi que son utilité pour analyser les échantillons cliniques des patients sous chimiothérapie du MTX. Les concentrations de MTX obtenues par le prototype furent comparées avec des techniques standards, soit un essai immunologique basé sur la polarisation en fluorescence (FPIA) et la chromatographie liquide couplée avec de la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour valider l’utilité du prototype comme un outil clinique pour les tests rapides de quantification du MTX. En dernier lieu, le déploiement du prototype à un laboratoire de biochimie dans un hôpital démontre l’énorme potentiel des biocapteurs SPR pour utilisation en milieux clinique.

Staffing Optimization with Chance Constraints in Call Centers

Les centres d’appels sont des éléments clés de presque n’importe quelle grande organisation. Le problème de gestion du travail a reçu beaucoup d’attention dans la littérature. Une formulation typique se base sur des mesures de performance sur un horizon infini, et le problème d’affectation d’agents est habituellement résolu en combinant des méthodes d’optimisation et de simulation. Dans cette thèse, nous considérons un problème d’affection d’agents pour des centres d’appels soumis a des contraintes en probabilité. Nous introduisons une formulation qui exige que les contraintes de qualité de service (QoS) soient satisfaites avec une forte probabilité, et définissons une approximation de ce problème par moyenne échantillonnale dans un cadre de compétences multiples. Nous établissons la convergence de la solution du problème approximatif vers celle du problème initial quand la taille de l’échantillon croit. Pour le cas particulier où tous les agents ont toutes les compétences (un seul groupe d’agents), nous concevons trois méthodes d’optimisation basées sur la simulation pour le problème de moyenne échantillonnale. Étant donné un niveau initial de personnel, nous augmentons le nombre d’agents pour les périodes où les contraintes sont violées, et nous diminuons le nombre d’agents pour les périodes telles que les contraintes soient toujours satisfaites après cette réduction. Des expériences numériques sont menées sur plusieurs modèles de centre d’appels à faible occupation, au cours desquelles les algorithmes donnent de bonnes solutions, i.e. la plupart des contraintes en probabilité sont satisfaites, et nous ne pouvons pas réduire le personnel dans une période donnée sont introduire de violation de contraintes. Un avantage de ces algorithmes, par rapport à d’autres méthodes, est la facilité d’implémentation.

Identification et caractérisation des principaux fragments du collagène de type II du cartilage équin, produit in vitro par l'enzyme cathepsine K

La dégradation protéolytique du collagène de type II est considérée comme étant un facteur majeur dans le processus irréversible de dégradation de la matrice cartilagineuse lors d’ostéoarthrose. Outre les collagénases de la famille des métaloprotéinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dégrader la triple hélice intacte du collagène de type II, devenant ainsi un élément pertinent pour les recherches sur l’ostéoarthrose. L’objectif à court terme de notre étude consiste en l’identification et la caractérisation de sites de clivage spécifiques de la cathepsine K sur le collagène de type II équin. La technique d’électrophorèse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des résultats de la caractérisation moléculaire des fragments protéolytiques. La caractérisation est réalisée en combinant la digestion trypsique précédant l’analyse HPLC-ESI/MS. Les résultats ont permis d’établir les sites, présents sur la carte peptidique de la molécule de collagène de type II équin, des 48 résidus prolines (P) et 5 résidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, différents de ceux produits par les MMPs, sont observés par SDS-PAGE 1D puis confirmés par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifié suggère un site de clivage différent de l’étude antérieure sur le collagène de type II bovin et humain. L’objectif à long terme serait le développement d’anticorps spécifiques au site identifié, permettant de suivre l’activité protéolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et ÉLISA, dans le cadre du diagnostic de l’ostéoarthrose.

Improving sampling, optimization and feature extraction in Boltzmann machines

L’apprentissage supervisé de réseaux hiérarchiques à grande échelle connaît présentement un succès fulgurant. Malgré cette effervescence, l’apprentissage non-supervisé représente toujours, selon plusieurs chercheurs, un élément clé de l’Intelligence Artificielle, où les agents doivent apprendre à partir d’un nombre potentiellement limité de données. Cette thèse s’inscrit dans cette pensée et aborde divers sujets de recherche liés au problème d’estimation de densité par l’entremise des machines de Boltzmann (BM), modèles graphiques probabilistes au coeur de l’apprentissage profond. Nos contributions touchent les domaines de l’échantillonnage, l’estimation de fonctions de partition, l’optimisation ainsi que l’apprentissage de représentations invariantes. Cette thèse débute par l’exposition d’un nouvel algorithme d'échantillonnage adaptatif, qui ajuste (de fa ̧con automatique) la température des chaînes de Markov sous simulation, afin de maintenir une vitesse de convergence élevée tout au long de l’apprentissage. Lorsqu’utilisé dans le contexte de l’apprentissage par maximum de vraisemblance stochastique (SML), notre algorithme engendre une robustesse accrue face à la sélection du taux d’apprentissage, ainsi qu’une meilleure vitesse de convergence. Nos résultats sont présent ́es dans le domaine des BMs, mais la méthode est générale et applicable à l’apprentissage de tout modèle probabiliste exploitant l’échantillonnage par chaînes de Markov. Tandis que le gradient du maximum de vraisemblance peut-être approximé par échantillonnage, l’évaluation de la log-vraisemblance nécessite un estimé de la fonction de partition. Contrairement aux approches traditionnelles qui considèrent un modèle donné comme une boîte noire, nous proposons plutôt d’exploiter la dynamique de l’apprentissage en estimant les changements successifs de log-partition encourus à chaque mise à jour des paramètres. Le problème d’estimation est reformulé comme un problème d’inférence similaire au filtre de Kalman, mais sur un graphe bi-dimensionnel, où les dimensions correspondent aux axes du temps et au paramètre de température. Sur le thème de l’optimisation, nous présentons également un algorithme permettant d’appliquer, de manière efficace, le gradient naturel à des machines de Boltzmann comportant des milliers d’unités. Jusqu’à présent, son adoption était limitée par son haut coût computationel ainsi que sa demande en mémoire. Notre algorithme, Metric-Free Natural Gradient (MFNG), permet d’éviter le calcul explicite de la matrice d’information de Fisher (et son inverse) en exploitant un solveur linéaire combiné à un produit matrice-vecteur efficace. L’algorithme est prometteur: en terme du nombre d’évaluations de fonctions, MFNG converge plus rapidement que SML. Son implémentation demeure malheureusement inefficace en temps de calcul. Ces travaux explorent également les mécanismes sous-jacents à l’apprentissage de représentations invariantes. À cette fin, nous utilisons la famille de machines de Boltzmann restreintes “spike & slab” (ssRBM), que nous modifions afin de pouvoir modéliser des distributions binaires et parcimonieuses. Les variables latentes binaires de la ssRBM peuvent être rendues invariantes à un sous-espace vectoriel, en associant à chacune d’elles, un vecteur de variables latentes continues (dénommées “slabs”). Ceci se traduit par une invariance accrue au niveau de la représentation et un meilleur taux de classification lorsque peu de données étiquetées sont disponibles. Nous terminons cette thèse sur un sujet ambitieux: l’apprentissage de représentations pouvant séparer les facteurs de variations présents dans le signal d’entrée. Nous proposons une solution à base de ssRBM bilinéaire (avec deux groupes de facteurs latents) et formulons le problème comme l’un de “pooling” dans des sous-espaces vectoriels complémentaires.

Caractérisation du gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-2 dans le rein diabétique et implication dans le développement de la néphropathie diabétique et de l'hypertension

De nombreuses études ont bien démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) joue un rôle important dans le développement de l’hypertension et de la néphropathie diabétique (DN). La découverte de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) et l’identification du récepteur MAS, spécifique pour l’angiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis d’identifier deux nouveaux membres du RAS. L’axe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de l’axe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs évidences impliquent la contribution du RAS intrarénal dans la DN. Des études réalisées dans notre laboratoire avec des souris transgéniques surexprimant l’angiotensinogène de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rénaux (RPTCs) ont permis de démontrer l’importance du RAS intrarénal dans l’induction de l’hypertension et les dommages rénaux. Nous avons également observé que l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’ANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabète de type 1) et qu’un traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser l’expression de l’ACE2 et de prévenir le développement de l’hypertension dans le modèle des souris Akita. Dans un milieu diabétique, à la fois la glycémie et l’angiotensine II (Ang II) peuvent induire la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS), contribuant ainsi aux dommages rénaux. Afin d’explorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons créé des souris Akita transgéniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabétique de type 1 à notre modèle de souris transgéniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde étude, des souris Akita ont été traitées avec l’Ang 1-7 ou une combinaison d’Ang 1-7 et de son antagoniste, A779, afin d’étudier la relation entre l’action de l’Ang 1-7, l’hypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rénaux, ACE2 et l’expression du récepteur Mas. Nos résultats ont montré que la surexpression de Cat atténue le stress oxydatif rénal; prévient l’hypertension, améliore le taux de filtration glomérulaire, l’albuminurie, l’hypertrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’apoptose tubulaire; et supprime l’expression des gènes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque comparées aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’Ang 1-7. D’autre part, l’administration d’Ang 1-7 prévient l’hypertension systémique, normalise le ratio albumine/créatinine urinaire et atténue l’hyperfiltration glomérulaire des souris Akita, sans affecter la glycémie sanguine. De plus, le traitement avec l’Ang 1-7 atténue aussi le stress oxydatif et l’expression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) et collagène IV, tout en augmentant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renversés par la co-admininstration d’A779. Ces résultats démontrent que la surexpression de Cat prévient l’hypertension et la progression de la néphropathie, en plus de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif intrarénal et l’expression de l’ACE2 comme facteurs contribuant à l’hypertension et les dommages rénaux observés dans le diabète. En outre, nos données suggèrent que l’Ang 1-7 joue un rôle protecteur dans l’hypertension et les dommages aux RPTC dans le diabète, principalement en réduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas. Nos résultats indiquent aussi que l’Ang 1-7 pourrait agir comme un agent thérapeutique potentiel dans le traitement de l’hypertension systémique et les dommages rénaux observés dans le diabète. En conséquence, l’Ang 1-7 est responsable du rôle protecteur de l’ACE2 dans l’hypertension et la DN.

Characterization of glutaraldehyde-immobilized chymotrypsin and an in-situ immobilized enzyme reactor using capillary electrophoresis-based peptide mapping

La digestion enzymatique des protéines est une méthode de base pour les études protéomiques ainsi que pour le séquençage en mode « bottom-up ». Les enzymes sont ajoutées soit en solution (phase homogène), soit directement sur le gel polyacrylamide selon la méthode déjà utilisée pour l’isolation de la protéine. Les enzymes protéolytiques immobilisées, c’est-à-dire insolubles, offrent plusieurs avantages tels que la réutilisation de l’enzyme, un rapport élevé d’enzyme-sur-substrat, et une intégration facile avec les systèmes fluidiques. Dans cette étude, la chymotrypsine (CT) a été immobilisée par réticulation avec le glutaraldehyde (GA), ce qui crée des particules insolubles. L’efficacité d’immobilisation, déterminée par spectrophotométrie d’absorbance, était de 96% de la masse totale de la CT ajouté. Plusieurs différentes conditions d’immobilisation (i.e., réticulation) tels que la composition/pH du tampon et la masse de CT durant la réticulation ainsi que les différentes conditions d’entreposage tels que la température, durée et humidité pour les particules GA-CT ont été évaluées par comparaison des cartes peptidiques en électrophorèse capillaire (CE) des protéines standards digérées par les particules. Les particules de GA-CT ont été utilisés pour digérer la BSA comme exemple d’une protéine repliée large qui requit une dénaturation préalable à la digestion, et pour digérer la caséine marquée avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme exemple d’un substrat dérivé afin de vérifier l’activité enzymatique du GA-CT dans la présence des groupements fluorescents liés au substrat. La cartographie peptidique des digestions par les particules GA-CT a été réalisée par CE avec la détection par absorbance ultraviolet (UV) ou fluorescence induite par laser. La caséine-FITC a été, en effet, digérée par GA-CT au même degré que par la CT libre (i.e., soluble). Un microréacteur enzymatique (IMER) a été fabriqué par immobilisation de la CT dans un capillaire de silice fondu du diamètre interne de 250 µm prétraité avec du 3-aminopropyltriéthoxysilane afin de fonctionnaliser la paroi interne avec les groupements amines. Le GA a été réagit avec les groupements amine puis la CT a été immobilisée par réticulation avec le GA. Les IMERs à base de GA-CT étaient préparé à l’aide d’un système CE automatisé puis utilisé pour digérer la BSA, la myoglobine, un peptide ayant 9 résidus et un dipeptide comme exemples des substrats ayant taille large, moyenne et petite, respectivement. La comparaison des cartes peptidiques des digestats obtenues par CE-UV ou CE-spectrométrie de masse nous permettent d’étudier les conditions d’immobilisation en fonction de la composition et le pH du tampon et le temps de réaction de la réticulation. Une étude par microscopie de fluorescence, un outil utilisé pour examiner l’étendue et les endroits d’immobilisation GA-CT dans l’IMER, ont montré que l’immobilisation a eu lieu majoritairement sur la paroi et que la réticulation ne s’est étendue pas si loin au centre du capillaire qu’anticipée.

Optimization of pH and Direct Imaging Conditions of Complexed Methylene Blue Sensitized Poly(vinyl chloride) Films

Significant results of our experimental investigations on the dependence of pH on real time transmission characteristics on recording media fabricated by doping PVC with complexed methylene blue are presented. The optimum pH value for faster bleaching was found to be 4×5. In typical applications, the illumination from one side, normal to the surface of this material, initiates a chemical sequence that records the incident light pattern in the polymer. Thus direct imaging can be successfully done on this sample. The recorded letters were very legible with good contrast and no scattering centres. Diffraction efficiency measurements were also carried out on this material.

Optimization of pH and Direct Imaging Conditions of Complexed Methylene Blue Sensitized Poly(vinyl chloride) Films

Significant results of our experimental investigations on the dependence of pH on real time transmission characteristics on recording media fabricated by doping PVC with complexed methylene blue are presented. The optimum pH value for faster bleaching was found to be 4×5. In typical applications, the illumination from one side, normal to the surface of this material, initiates a chemical sequence that records the incident light pattern in the polymer. Thus direct imaging can be successfully done on this sample. The recorded letters were very legible with good contrast and no scattering centres. Diffraction efficiency measurements were also carried out on this material.

Optimization of pH and direct imaging conditions of complexed methylene blue sensitized poly(vinyl chloride) films

Significant results of our experimental investigations on the dependence of pH on real time transmission characteristics on recording media fabricated by doping PVC with complexed methylene blue are presented. The optimum pH value for faster bleaching was found to be 4 . 5. In typical applications, the illumination from one side, normal to the surface of this material, initiates a chemical sequence that records the incident light pattern in the polymer. Thus direct imaging can be successfully done on this sample. The recorded letters were very legible with good contrast and no scattering centres. Diffraction efficiency measurements were also carried out on this material.

Alkaline protease production by marine fungus engyodontium BTMFS 10

The thesis entitled “Alkaline Protease Production by Marine Fungus Engyodontium BTMFS 10”.Proteases are the single class of enzymes, which occupy a pivotal position with respect to their application in both physiological and commercial filed. Protease in the industrial market is expected to increase further in the coming year. The current trend is to use microbial enzymes since they provide a greater diversity of catalytic activities and can be produced more economically. Main objective of theses studies are the optimization of various physicochemical factors in the solid state fermentation for the production of alkaline protease enzyme, characterization of the enzyme, evaluation of the enzyme for various industrial application. The result obtained the during the course of theses study indicate the scope for the utilization of this study Marine Fungus E. Album for extra cellular protease production employing solid state fermentation

Optimization of carbon and nitrogen sources and growth factors for the production of an aquaculture probiotic (Pseudomonas MCCB 103) using response surface methodology

Aim: To develop a new medium for enhanced production of biomass of an aquaculture probiotic Pseudomonas MCCB 103 and its antagonistic phenazine compound, pyocyanin. Methods and Results: Carbon and nitrogen sources and growth factors, such as amino acids and vitamins, were screened initially in a mineral medium for the biomass and antagonistic compound of Pseudomonas MCCB 103. The selected ingredients were further optimized using a full-factorial central composite design of the response surface methodology. The medium optimized as per the model for biomass contained mannitol (20 g l)1), glycerol (20 g l)1), sodium chloride (5 g l)1), urea (3Æ3 g l)1) and mineral salts solution (20 ml l)1), and the one optimized for the antagonistic compound contained mannitol (2 g l)1), glycerol (20 g l)1), sodium chloride (5Æ1 g l)1), urea (3Æ6 g l)1) and mineral salts solution (20 ml l)1). Subsequently, the model was validated experimentally with a biomass increase by 19% and fivefold increase of the antagonistic compound. Conclusion: Significant increase in the biomass and antagonistic compound production could be obtained in the new media. Significance and Impact of the Study: Media formulation and optimization are the primary steps involved in bioprocess technology, an attempt not made so far in the production of aquaculture probiotics.

Effect of Dietary Proteins on Growth, Food Conversion and Digestive Enzyme Activity of Juvenile Macrobrachium Rosenbergii

School of Industrial Fisheries, Cochin University of Science and Technology