Automated Segmentation and Non-Rigid Registration for the Quantitative Evaluation of Myocardial Perfusion from Magnetic Resonance Images

Myocardial perfusion quantification by means of Contrast-Enhanced Cardiac Magnetic Resonance images relies on time consuming frame-by-frame manual tracing of regions of interest. In this Thesis, a novel automated technique for myocardial segmentation and non-rigid registration as a basis for perfusion quantification is presented. The proposed technique is based on three steps: reference frame selection, myocardial segmentation and non-rigid registration. In the first step, the reference frame in which both endo- and epicardial segmentation will be performed is chosen. Endocardial segmentation is achieved by means of a statistical region-based level-set technique followed by a curvature-based regularization motion. Epicardial segmentation is achieved by means of an edge-based level-set technique followed again by a regularization motion. To take into account the changes in position, size and shape of myocardium throughout the sequence due to out of plane respiratory motion, a non-rigid registration algorithm is required. The proposed non-rigid registration scheme consists in a novel multiscale extension of the normalized cross-correlation algorithm in combination with level-set methods. The myocardium is then divided into standard segments. Contrast enhancement curves are computed measuring the mean pixel intensity of each segment over time, and perfusion indices are extracted from each curve. The overall approach has been tested on synthetic and real datasets. For validation purposes, the sequences have been manually traced by an experienced interpreter, and contrast enhancement curves as well as perfusion indices have been computed. Comparisons between automatically extracted and manually obtained contours and enhancement curves showed high inter-technique agreement. Comparisons of perfusion indices computed using both approaches against quantitative coronary angiography and visual interpretation demonstrated that the two technique have similar diagnostic accuracy. In conclusion, the proposed technique allows fast, automated and accurate measurement of intra-myocardial contrast dynamics, and may thus address the strong clinical need for quantitative evaluation of myocardial perfusion.

Objektive Schläfrigkeitsmessung unter Alkoholeinfluss

Alkohol und Schläfrigkeit sind die wichtigsten fahrerbezogenen Faktoren bei der Entstehung von Autounfällen. Bislang gibt es relativ wenige konkrete Erkenntnisse über die schläfrigkeitsfördernde Wirkung von Alkohol. Mit der vorliegenden Arbeit sollte erstmals eine quantitative und objektive Analyse der (Tages-)Schläfrigkeit unter Alkoholeinfluss während der gesamten Alkoholumsetzungskurve erstellt werden. Mit dem pupillographischen Schläfrigkeitstest (PST) steht ein Verfahren zur Verfügung, mit dem es möglich ist, Schläfrigkeit unter Alkoholeinfluss quantitativ zu bestimmen. Diese Methode beruht auf der Vermessung der Pupille, deren Durchmesser der efferenten sympathischen Steuerung unterliegt. Bei zunehmender Schläfrigkeit lässt der sympathische Einfluss auf die Pupillenweite nach und es kommt zu typischen Oszillationen der Pupille. Diese Oszillationen, sogenannte „Fatigue Waves“, werden in einem ruhigen, abgedunkelten Raum mittels Infrarotkamera über 11 Minuten kontinuierlich aufgezeichnet und als Pupillen-Unruhe-Index (PUI) in mm / min ausgegeben. Für diesen Wert existieren Normwerte, welche eine Einteilung der PUI-Werte in „normal“, „erhöht“ und „pathologisch“ ermöglichen. Es wurde ein standardisiertes Kollektiv von 53 Probanden zwischen 20 und 60 Jahren untersucht. Dieses bestand aus 28 Männern und 25 Frauen. Die Probanden wurden wahlweise mit Bier oder Wein stufenweise unter Blutalkohohol-konzentrationen von annähernd 0,3, 0,5 und 0,8 ‰ gesetzt, die genaue BAK wurde jeweils durch Gaschromatographie und ADH-Methode bestimmt. Während dieser Anflutungsphase wurde bei jeder der drei Stufen die Schläfrigkeit bestimmt. Dies geschah zum einen mittels objektivem PST und zum anderen durch die subjektive Stanford Sleepiness Scale (SSS), eine siebenstufige Skala zur Einschätzung der eigenen Schläfrigkeit. In der Eliminationsphase der Alkoholumsetzungskurve wurde wiederum bei 0,5 und 0,3 ‰ sowohl die subjektive als auch die objektive Schläfrigkeit gemessen. Eine Kontrollgruppe von 11 Probanden aus dem genannten Kollektiv wurde zu einem späteren Zeitpunkt unter gleichen Bedingungen ohne Alkoholeinfluss untersucht. Im Ergebnis zeigte die Anflutungsphase zunächst ein signifikantes Absinken des PUI um 5,9 %, gleichbedeutend mit einer höheren Vigilanz. Im weiteren Verlauf war das Maximum der Schläfrigkeit in der Eliminationsphase bei einer verhältnismäßig geringen BAK von durchschnittlich 0,54 ‰ zu beobachten. Der PUI hatte sich im Vergleich zum Ausgangswert um durchschnittlich 17,4 % erhöht und 40,4 % der Probanden wiesen erhöhte oder pathologische Schläfrigkeitswerte auf. Dieser Anteil lag um hochsignifikante 110 % höher als bei der Ausgangsmessung. Insgesamt ließ sich keine Korrelation zwischen objektiver und subjektiver Schläfrigkeit feststellen, obwohl auch die subjektive Schläfrigkeit stieg. Das Maximum der subjektiven Schläfrigkeit fiel zusammen mit dem Maximum der Alkoholisierung von 0,8 ‰. Wirkung auf das Ausmaß der Schläfrigkeit hatten die Häufigkeit des Alkoholkonsums, der Body-Mass-Index (BMI) und das Geschlecht. Je häufiger die Probanden nach eigenen Angaben Alkohol tranken und je höher der jeweilige BMI war, desto geringer war der Einfluss des Alkohols auf die Schläfrigkeit. Mit der Eigenschaft „weibliches Geschlecht“ ging eine höhere objektive Schläfrigkeit einher, allerdings auch eine höhere subjektive Einschätzung der eigenen Schläfrigkeit. Ein Einfluss der Getränkeart ließ sich hingegen nicht nachweisen. Für die Abnahme der Vigilanz spielte es keine Rolle, ob dies durch Bier oder Wein verursacht worden war. Bedenklich erschien die Tatsache, dass zum einen die Probanden das Ausmaß der eigenen Schläfrigkeit sogar unter relativ geringer Alkoholisierung nicht adäquat einschätzen konnten, und dass zum anderen das Maximum der Schläfrigkeit – und damit auch des mutmaßlichen Unfallrisikos – in der Eliminationsphase lag. Ein Zeitpunkt, zu dem sicherlich die meisten Alkoholfahrten unternommen werden.

Quantitative differential proteomics for analysis of posttranslational modifications of proteins

In this work we developed a new and convenient method for high resolution IEF of proteins, which we termed: “daisy chain”. Usually an IEF is accomplished with IPG strips of a desired pH range. For high resolution focusing we are using strips with pH range, which covers only one or two pH units. Thereby the pro-teins, which have isoelectrical point outside of this pH range, are lost. We evalu-ated commercially available IPG strips with consecutive or overlapping pH ranges and connected them serially acidic to basic end, to construct in this way a high resolution IEF-system. For the first time, we showed that a high resolution IEF is possible in such a system and that results were by no means worse than those obtained when the same sample was analyzed on individual single IPGs. The great advantage of our system is that amount of sample used in serial IPG IEF is explicitly lower than when same sample was analyzed on individual single IPGs. This method was subsequently successfully applied to valuable clinical samples from cancer patients and to mitochondrial preparations related to a European project in gerontology. We thus developed a suite of experimental strategies, which adequately address complex biological situations, in particular on the level of protein expression.

Morphologische und quantitative Untersuchungen synaptischer Körperchen in Retina und Zirbeldrüse von Säugetieren und Mensch

Um mit sehr hoher Geschwindigkeit Sinnesreize zur Weiterverarbeitung übertragen zu können, besitzen im Ruhezustand Dauerimpulse liefernde Rezeptorzellen in Sinnesorganen, wie z.B. der Netzhaut (Retina), spezialisierte glutamaterge Synapsen, die durch präsynapti-sche Körperchen (SK) charakterisiert sind, die außerdem nur in Parenchymzellen der Zirbel-drüse vorkommen. SK binden mit hoher Affinität Neurotransmittervesikel und zeigen licht- bzw. reizabhängige morphologische Veränderungen. Sie dienen der Speicherung, eventuell auch dem Transport dieser Vesikel zum Ort der Reizübertragung, der nahen aktiven Zone der Ribbonsynapse. Um Dynamik und Funktion der Zellorganellen zu verstehen, ist es wichtig, ihre genaue Topo-graphie und dreidimensionale (3D) Struktur unter verschiedenen Bedingungen zu kennen. So wurden aus Serienschnitten der Retina und Zirbeldrüse mit Hilfe geeigneter, teils selbst programmierter Software 3D-Rekonstruktionen der SK durchgeführt. Untersucht wurden die ersten und zweiten Synapsen der Sehbahn in Retinae von Mensch, Maus und Ratte, Zapfen-terminale des Hühnchens und SK in Zirbeldrüsen von Ratte, Meerschweinchen und Kaninchen. Analysiert wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Photoperiode oder unter experimentellen Bedingungen entnommenes Frischgewebe sowie Material aus Organkultu-ren. Außerdem wurden SK unter diversen Bedingungen quantifiziert, wobei eine neue Zähl-methode entwickelt wurde, die auf einer Modifikation des Disektors basiert und die Quantifi-zierung auch anderer seltener Ultrastrukturen am Elektronenmikroskop ermöglicht. Im Gegensatz zur etablierten Zählmethode, die die Profilzahl von SK in einer definierten Fläche (PZ) angibt, liefert die vorgestellte Methode die aussagekräftigere Zahl der SK in definierten Volumina und hängt weder von deren Form noch Größe ab. Diverse Kalkulationen zeigten, daß eine Umrechnung von am selben Material gewonnenen PZ in validere Disektor Werte nicht präzise genug möglich ist. Um sinnvolle Aussagen zur Quantität von SK machen zu können, ist es daher erforderlich, die Methode für jedes Tier einer identisch behandelten Gruppe anzuwenden. Es konnte gezeigt werden, daß SK eine konstante Dicke von 35 nm haben. In der Retina sind sie meist nur in einer Ebene C-förmig gebogene Bänder, weshalb sie auch als "synaptic ribbons" bezeichnet werden, oder Platten mit Breite zu Höhe Verhältnissen zwischen 6:1 bis 3:1. Die elektronendichten, unter Normalbedingungen durch regelmäßig polymerisierte Dimere des Hauptproteins RIBEYE pentalamellären SK binden über dünne Proteinbrücken glutamathaltige Neurotransmittervesikel. Ihre untere lange schmale Kante ist über feines elektronendichtes Material an einem, als arciform density (ad) bezeichneten Plaque der Zell-membran verankert, der die Form einer gebogenen Rinne hat. Die zumeist senkrecht darauf stehenden SK zeigen an ihrer membranfernen langen Kante zu Beginn der Lichtphase, ins-besondere aber unter Dauerlicht partiell verdickte Ränder, die auf An- bzw. Abbauvorgänge hinweisen. Diese Veränderungen waren nur in Stäbchenterminalen und Pinealozyten in Ver-bindung mit dem Auftreten kleinerer klumpiger bis kugelförmiger SK nachweisbar und zeig-ten sich in den Schnitten als runde oder irreguläre Profile, die dann neben den "üblichen" stabförmigen SK-Anschnitten vorlagen. Die 3D-Rekonstruktion von Stäbchenterminalen der menschlichen Retina zeigte, daß diese entsprechend der Zahl ihrer SK 1-3 Ribbonsynapsen aufweisen. Letztere bestehen aus einem an der Zellmembran senkrecht über eine ad verankerten SK und der aktiven Zone, die einem ca. 200 nm breiten Bereich der Zellmembran in Fortsetzung der ad nach seitlich oben entspricht. Die boomerang- bis hufeisenförmigen SK haben 2 parallele flache Hauptflächen. Postsynaptisch liegen zwei Horizontalzellfortsätze, welche mit variabeln Aufspaltungen von einem engen Hilus aus tief in Stäbchenendkolben invaginiert sind. Sie verbreitern sich termi-nal und zeigen große breite oft aufgefächerte bzw. verzweigte Auftreibungen. Die Ribbon-synapsen sind in die zwischen solchen Endauftreibungen entstehenden Rinnen eingesenkt. Unterhalb ihrer ad berühren sich die Horizontalzellterminale. Etwas darunter enden 1-2 ca. 100 nm breite Bipolarzelldendriten, die vom Zentrum der Invagination des Stäbchenterminals zum Hilus hin dünner werden, um zum Soma invaginierender ON-Bipolarzellen weiterzulau-fen. Da die Zahl der in den Stäbchenendkolben eintretenden Fortsätze variabel ist, fanden sich Konstellationen von 1-3 SK, 1-3 Horizontal- und 1-4 Bipolarzellterminalen, wie sie auch in der Literatur beschrieben sind. Drei zentrale Ausschnitte menschlicher Zapfenpedikel wurden aus lückenlosen Serienschnit-ten mit ihren Mitochondrien, SK und den in Form von Triaden hier invaginierenden postrib-bonsynaptischen Fortsätzen rekonstruiert. Der Grundbauplan der Ribbonsynapsen ist hier dem der Stäbchen ähnlich, jedoch sind die SK kürzer, die Invaginationen deutlich kleiner und nie verzweigt, die Bipolarzelldendriten breiter und die Horizontalzellfortsätze terminal weniger stark und nur rundlich aufgetrieben. Zapfen-SK sind nur in einer Ebene schwach gebogene Bänder. Die gefundene Zahl von Zapfen SK paßt zu Literaturdaten, deren Zusammenfas-sung für Primaten foveanah 10-20 und peripher 30-40 SK zeigt. In Bipolarzellaxonen des Menschen waren SK nicht immer über leistenartige Membranplaques am Plasmalemm ver-ankert. Die hier flachen Ribbonsynapsen zeigten kleinere bandförmige oder nur ca. 250 x 150 x 35 nm große plattenförmige SK mit etwas größerem Abstand zu den aktiven Zonen als in Photorezeptoren. Bei BALB/c Mäusen, deren SK besonders deutlich auf Veränderungen der Photoperiode oder experimentelle Bedingungen reagieren, zeigten Rekonstruktionen von Stäbchenribbon-synapsen am Ende der Dunkelphase band- bis boomerangförmige SK und weder Klumpen noch Kugeln. Im ersten Drittel und gegen Ende der Lichtphase fanden sich jedoch ca. 20 Prozent solch veränderter SK. Gleichzeitig waren die mittleren Abschnitte vieler SK unter beiden Lichtbedingungen dünner als am Ende der Dunkelphase. Die langen, oft mehrfach gebogenen und verdrehten Zapfen-SK dieser Mäuse waren unabhängig von den Lichtbedin-gungen oft deutlich größer als die der Stäbchen, wohingegen beim Menschen Zapfen-SK re-lativ gerade, bandförmige Zellorganellen geringerer Größe als in Stäbchen darstellten. Während in Stäbchenterminalen nur ausnahmsweise mehr als ein größeres bandförmiges SK (neben eventuellen kugelförmigen) vorlag, zeigten sich in den Zapfen orts- und spezies-abhängig 15 bis über 25 meist bandförmige Organellen, die in wenigen Fällen mit zwei ge-legentlich sogar 3 verschiedenen Triaden aus 2 Horizontal- und einem Bipolarzellfortsatz ver-bunden waren. Dies ist bei BALB/c Mäusen, die weniger, aber größere Zapfen-SK zeigten, häufiger als beim Menschen. Die SK der Bipolarzellen in der inneren plexiformen Schicht waren speziesübergreifend meist lange Bänder oder kleine Platten mit ca. 250 x 150 nm großen Hauptflächen und nur ge-ringen Verdrehungen. Verschiedene Bipolarzelltypen haben unterschiedlich viele SK. Im Rahmen der Arbeit erstmals erstellte 3D-Rekonstruktion ektopischer synaptischer Körper-chen (eSK) konnten belegen, daß diese in Bipolarzelldendriten lokalisiert sind. Die kleinen, leicht gebogenen, 35 nm dicken Platten, deren große Oberflächen Dimensionen von meist nur ca. 100 x 200 nm hatten, sind praktisch nie an der Zellmembran verankert, sondern ste-hen in einigen Fällen über zu langen Tubuli fusionierte Vesikel mit dem Interzellularspalt in Verbindung. Dies könnte ein Hinweis auf eine "compound" Endo- oder Exozytose sein. Sel-ten finden sich zwei, ausnahmsweise auch drei parallel zueinander angeordnete SK im Inne-ren der Bipolarzelldendriten, meistens nahe deren Eintritt in Stäbchenendkolben. Im Gegen-satz zur Ratte fanden sich eSK bei seit Geburt unter Dauerdunkelheit gehaltenen BALB/c Mäusen sogar im in Stäbchen- bzw. Zapfenterminal invaginierten Abschnitt von Bipolarzell-dendriten. Neben plattenförmigen SK lagen bei diesen Mäusen auch innen hohle klumpen-förmige Organellen in Stäbchenbipolarzelldendriten vor. Unter Organkultur und Ca++-Entzug fanden sich in Stäbchen die massivsten Veränderungen von SK, die entweder als Klumpen oder Kugeln vorlagen oder massive Protrusionen an ei-nem kleinen plattenförmigen Abschnitt zeigten, der noch an der ad befestigt blieb. Die Be-funde deuten darauf hin, daß Licht über Kalziumentzug zu Verklumpungen an SK und zur Abschnürung von klumpen- bis kugelförmigen SK Fragmenten führt. Bei der Rekonstruktion mit anti-β-Dystroglykan Immunogold-markierter Zapfenterminalen der Hühnchenretina konnte erstmals gezeigt werden, daß sich dieses zum Dystrophin-assozierten Glykoproteinkomplex gehörende Protein in perisynaptischen Fortsätzen der Pho-torezeptoren seitlich und an ihren Spitzen fand, während Horizontal- und Bipolarzellfortsätze nicht markiert waren. Dies deutet auf eine neue strukturelle oder funktionelle Domäne in Pho-torezeptorterminalen hin, die eine noch im Detail zu klärende Rolle bei der synaptischen Transmission spielt, da bei Mutationen im Dystrophin-assoziierten Proteinkomplex eine Ver-änderung der synaptischen Kommunikation in der äußeren plexiformen Schicht zu beobach-ten ist. In der Zirbeldrüse sind die meisten SK wenig gebogene, flache, plattenförmige Strukturen, die bei der Ratte meist ca. 300x150x35 nm groß sind. Daneben gibt es deutlich längere bandförmige Organellen und unter Normalbedingungen bei Ratte und Hühnchen praktisch keine, bei Meerschweinchen nur wenige klumpige oder kugelförmige SK. Pinealozyten der Meerschweinchenzirbeldrüse weisen üblicherweise Felder parallel gruppierter plattenförmi-ger synaptischer Körperchen auf. Unter Dauerlicht zeigten sich an der Membran benachbar-ter Zellen einander gegenüberliegende Felder stark verbogener, partiell verdickter SK, die vermutlich aus verschmolzenen Einzelplatten entstanden waren sowie deutlich mehr kugeli-ge bzw. klumpige SK. Die Organellen nehmen nachts an Größe zu, wodurch sich ihre Ober-fläche vergrößert, bei Ratten nimmt sie um 19,3 Prozent von 0,041 auf 0,0501 µm² zu. Da die plattenförmigen SK eine konstante Dicke von 35 nm hatten, läßt sich so ein durchschnitt-liches Volumen von 1,47x10-3 µm³ für 12.00 und von 1,75x10-3 µm³ für Mitternacht mit einer Zunahme von 0,28x10-3 µm³ (entspricht 19,3 %) errechnen. Der Vergleich von Pinealocyten-SK von unter LD 4:20 zu LD 20:4 gehaltenen Ratten zeigte unter LD 20:4 insignifikant mehr SK, die signifikant längere Profile hatten, was auf eine Größenzunahme der Organellen hin-deutet. Überlegungen und mathematische Berechnungen, was Profillängenmessungen bedeuten und wieviele Profile für sinnvolle Vergleiche ausgewertet werden müßten, werden kritisch diskutiert. Die selbst erhobenen Befunde werden im Kontext mit allen verfügbaren Literaturdaten de origine, dem Auftreten von SK in der Ontogenese sowie SK betreffenden pathologischen und Altersveränderungen betrachtet. Hierbei deutet die Analyse der Chronobiologie von SK in quantitativer und morphologischer Hinsicht auf eine Abhängigkeit von der Photoperiode bzw. Licht und Dunkelheit und nicht auf eine endogene zirkadiane Rhythmik hin. Die oberhalb funktionell wichtiger Ca++-Känale lokalisierten SK setzen in Photorezeptoren die Lichtinformation in exozytierte Glutamatquanten um, wobei das Glutamat an verschiedenen postsynaptischen Orten wirkt. Die zuvor nie so anschaulich durch 3D-Stereoanimationen visualisierten Befunde zeigen, daß die Morphologie von SK hier für eine maximal schnelle Freisetzung der gebundenen Transmittervesikel an in unmittelbarer Nähe gelegenen aktiven Zonen der Ribbonsynapsen optimiert ist. Der molekulare Aufbau von SK wird ultrastrukturell nachvollzogen und die Funktion der Organellen diskutiert. Diesbezüglich ist die Vesikelspei-cherung erwiesen, das "Priming" für die Exozytose beinahe bewiesen, eine Koordinations-funktion für multivesikuläre Transmitterfreisetzung ist denkbar, während eine Förderband-funktion eher unwahrscheinlich ist. In breve haben die im Rahmen dieser Habilitation ge-wonnenen Erkenntnisse und entwickelten Methoden einige Beiträge zur Klärung des mor-phologisch funktionellen Gesamtverständnisses der Ribbonsynapsen geleistet.

Lesion detection and classification in breast cancer: evaluation of approaches based on morphological features, tracer kinetic modelling and semi-quantitative parameters in MR functional imaging (DCE-MRI)

The diagnosis, grading and classification of tumours has benefited considerably from the development of DCE-MRI which is now essential to the adequate clinical management of many tumour types due to its capability in detecting active angiogenesis. Several strategies have been proposed for DCE-MRI evaluation. Visual inspection of contrast agent concentration curves vs time is a very simple yet operator dependent procedure, therefore more objective approaches have been developed in order to facilitate comparison between studies. In so called model free approaches, descriptive or heuristic information extracted from time series raw data have been used for tissue classification. The main issue concerning these schemes is that they have not a direct interpretation in terms of physiological properties of the tissues. On the other hand, model based investigations typically involve compartmental tracer kinetic modelling and pixel-by-pixel estimation of kinetic parameters via non-linear regression applied on region of interests opportunely selected by the physician. This approach has the advantage to provide parameters directly related to the pathophysiological properties of the tissue such as vessel permeability, local regional blood flow, extraction fraction, concentration gradient between plasma and extravascular-extracellular space. Anyway, nonlinear modelling is computational demanding and the accuracy of the estimates can be affected by the signal-to-noise ratio and by the initial solutions. The principal aim of this thesis is investigate the use of semi-quantitative and quantitative parameters for segmentation and classification of breast lesion. The objectives can be subdivided as follow: describe the principal techniques to evaluate time intensity curve in DCE-MRI with focus on kinetic model proposed in literature; to evaluate the influence in parametrization choice for a classic bi-compartmental kinetic models; to evaluate the performance of a method for simultaneous tracer kinetic modelling and pixel classification; to evaluate performance of machine learning techniques training for segmentation and classification of breast lesion.

Demokratie, good governance und Entwicklung: Eine quantitative Analyse für 191 Staaten im Zeitraum 1996 bis 2005

Das Jahr 1989 markiert nicht nur den Beginn entscheidender geopolitischer Veränderungen, sondern gleichzeitig den Ursprung eines bedeutsamen Wandels in der internationalen Entwicklungszusammenarbeit. Mit der viel beachteten Studie ‚Sub-Saharan Africa – From Crisis to Sustainable Growth’ initiierte die Weltbank eine Debatte über die Relevanz institutioneller Faktoren für wirtschaftliche Entwicklung, die in den folgenden Jahren unter dem Titel ‚Good Governance’ erhebliche Bedeutung erlangte. Nahezu alle zentralen Akteure begannen, entsprechende Aspekte in ihrer praktischen Arbeit zu berücksichtigen, und entwickelten eigene Konzepte zu dieser Thematik. Wenn auch mit der Konzentration auf Institutionen als Entwicklungsdeterminanten eine grundlegende Gemeinsamkeit der Ansätze festzustellen ist, unterscheiden sie sich jedoch erheblich im Hinblick auf die Einbeziehung politischer Faktoren, so dass von einem einheitlichen Verständnis von ‚Good Governance’ nicht gesprochen werden kann. Während die meisten bilateralen Akteure sowie DAC und UNDP Demokratie und Menschenrechte explizit als zentrale Bestandteile betrachten, identifiziert die Weltbank einen Kern von Good Governance, der unabhängig von der Herrschaftsform, also sowohl in Demokratien wie auch in Autokratien, verwirklicht werden kann. Die Implikationen dieser Feststellung sind weit reichend. Zunächst erlaubt erst diese Sichtweise der Bank überhaupt, entsprechende Aspekte aufzugreifen, da ihr eine Berücksichtigung politischer Faktoren durch ihre Statuten verboten ist. Bedeutsamer ist allerdings, dass die Behauptung der Trennbarkeit von Good Governance und der Form politischer Herrschaft die Möglichkeit eröffnet, Entwicklung zu erreichen ohne eine demokratische Ordnung zu etablieren, da folglich autokratische Systeme in gleicher Weise wie Demokratien in der Lage sind, die institutionellen Voraussetzungen zu verwirklichen, welche als zentrale Determinanten für wirtschaftlichen Fortschritt identifiziert wurden. Damit entfällt nicht nur ein bedeutsamer Rechtfertigungsgrund für demokratische Herrschaft als solche, sondern rekurrierend auf bestimmte, dieser zu attestierende, entwicklungshemmende Charakteristika können Autokratien nun möglicherweise als überlegene Herrschaftsform verstanden werden, da sie durch jene nicht gekennzeichnet sind. Die Schlussfolgerungen der Weltbank unterstützen somit auch die vor allem im Zusammenhang mit der Erfolgsgeschichte der ostasiatischen Tigerstaaten vertretene Idee der Entwicklungsdiktatur, die heute mit dem Aufstieg der Volksrepublik China eine Renaissance erlebt. Der wirtschaftliche Erfolg dieser Staaten ist danach auf die überlegene Handlungsfähigkeit autokratischer Systeme zurückzuführen, während Demokratien aufgrund der Verantwortlichkeitsbeziehungen zwischen Regierenden und Regierten nicht in der Lage sind, die notwendigen Entscheidungen zu treffen und durchzusetzen. Die dargestellte Sichtweise der Weltbank ist allerdings von verschiedenen Autoren in Zweifel gezogen worden, die auch für ein im Wesentlichen auf technische Elemente beschränktes Good Governance-Konzept einen Zusammenhang mit der Form politischer Herrschaft erkennen. So wird beispielsweise vertreten, das Konzept der Bank bewege sich ausdrücklich nicht in einem systemneutralen Vakuum, sondern propagiere zumindest implizit die Etablierung demokratischer Regierungsformen. Im Übrigen steht die aus den Annahmen der Weltbank neuerlich abgeleitete Idee der Entwicklungsdiktatur in einem erheblichen Widerspruch zu der von multilateralen wie bilateralen Akteuren verstärkt verfolgten Förderung demokratischer Herrschaft als Mittel für wirtschaftliche Entwicklung sowie der fortschreitenden Verbreitung der Demokratie. Besteht nun doch ein Einfluss der Herrschaftsform auf die Verwirklichung von Good Governance als zentraler Entwicklungsdeterminante und kann zudem davon ausgegangen werden, dass Demokratien diesbezüglich Vorteile besitzen, dann ist eine Entwicklungsdiktatur keine denkbare Möglichkeit, sondern im Gegenteil demokratische Herrschaft der gebotene Weg zu wirtschaftlichem Wachstum bzw. einer Verbesserung der Lebensverhältnisse. Aufgrund der mit den Schlussfolgerungen der Weltbank verbundenen bedeutsamen Implikationen und der bisher weitestgehend fehlenden ausführlichen Thematisierung dieses Gegenstands in der Literatur ist eine detaillierte theoretische Betrachtung der Zusammenhänge zwischen den zentralen Elementen von Good Governance und demokratischer Herrschaft notwendig. Darüber hinaus sollen die angesprochenen Beziehungen auch einer empirischen Analyse unterzogen werden. Gegenstand dieser Arbeit ist deshalb die Fragestellung, ob Good Governance eine von demokratischer Herrschaft theoretisch und empirisch unabhängige Entwicklungsstrategie darstellt.

Semi-synthetic bile acids as novel drug candidate in liver diseases: physico-chemical characterization and HPLC-ES-MS/MS methods for their quali-quantitative analysis in different experimental animal models

The physico-chemical characterization, structure-pharmacokinetic and metabolism studies of new semi synthetic analogues of natural bile acids (BAs) drug candidates have been performed. Recent studies discovered a role of BAs as agonists of FXR and TGR5 receptor, thus opening new therapeutic target for the treatment of liver diseases or metabolic disorders. Up to twenty new semisynthetic analogues have been synthesized and studied in order to find promising novel drugs candidates. In order to define the BAs structure-activity relationship, their main physico-chemical properties (solubility, detergency, lipophilicity and affinity with serum albumin) have been measured with validated analytical methodologies. Their metabolism and biodistribution has been studied in “bile fistula rat”, model where each BA is acutely administered through duodenal and femoral infusion and bile collected at different time interval allowing to define the relationship between structure and intestinal absorption and hepatic uptake ,metabolism and systemic spill-over. One of the studied analogues, 6α-ethyl-3α7α-dihydroxy-5β-cholanic acid, analogue of CDCA (INT 747, Obeticholic Acid (OCA)), recently under approval for the treatment of cholestatic liver diseases, requires additional studies to ensure its safety and lack of toxicity when administered to patients with a strong liver impairment. For this purpose, CCl4 inhalation to rat causing hepatic decompensation (cirrhosis) animal model has been developed and used to define the difference of OCA biodistribution in respect to control animals trying to define whether peripheral tissues might be also exposed as a result of toxic plasma levels of OCA, evaluating also the endogenous BAs biodistribution. An accurate and sensitive HPLC-ES-MS/MS method is developed to identify and quantify all BAs in biological matrices (bile, plasma, urine, liver, kidney, intestinal content and tissue) for which a sample pretreatment have been optimized.

Qualitative and absolute quantitative studies of the cell-nanoparticle interaction

This thesis focused on the polymer’s influence on the interaction of polymeric NPs with epithelial cells. Furthermore, the measurement of single submicron nanoparticles in a commercially available flow cytometer was established, to provide a new method in the toolbox for nanoparticle-cell studies. This gave way to develop a routine for the absolute quantification of intracellular NPs via flow cytometry. rnThe cellular uptake of poly(methyl methacrylate) (PMMA), polystyrene (PS) and poly(L-lactide) (PLLA) nanoparticles was investigated via flow cytometry. PLLA-NPs were internalized the most efficiently. But upon co-incubation of PS and PLLA particles with cells, the two particles mutually influenced their uptake, slightly shifting the relative uptake efficiencies. This phenomenon should be based on specific properties of the different polymer materials. The findings indicated a competition (which is strongly influenced by properties of the respective polymeric material) for the uptake into the cells, allegedly due to competition for specific coatings with serum components that enhances the NPs’ cellular uptake. The fluorescence of single 150 nm particles was determined with a benchtop cytometer, breaching the machine’s detection limit but yielding precise NP fluorescence standardization factors. Up to now, these standardization factors are mostly determined by spectroscopic analysis of the particles’ dye content. Finally a flow cytometric routine for absolute particle counting in cells was devised. This quantitation revealed a low uptake efficiency for un-functionalized PMMA NPs of less than 150 NPs (approx. 0,001 % of added) per cell.rn

New analytical LC-mass spectrometry methodologies for the quali-quantitative determination of natural substances and drugs in complex matrices

This thesis reports an integrated analytical and physicochemical approach for the study of natural substances and new drugs based on mass spectrometry techniques combined with liquid chromatography. In particular, Chapter 1 concerns the study of Berberine a natural substance with pharmacological activity for the treatment of hepatobiliary and intestinal diseases. The first part focused on the relationships between physicochemical properties, pharmacokinetics and metabolism of Berberine and its metabolites. For this purpose a sensitive HPLC-ES-MS/MS method have been developed, validated and used to determine these compounds during their physicochemical properties studies and plasma levels of berberine and its metabolites including berberrubine(M1), demethylenberberine(M3), and jatrorrhizine(M4) in humans. Data show that M1, could have an efficient intestinal absorption by passive diffusion due to a keto-enol tautomerism confirmed by NMR studies and its higher plasma concentration. In the second part of Chapter 1, a comparison between M1 and BBR in vivo biodistribution in rat has been studied. In Chapter 2 a new HPLC-ES-MS/MS method for the simultaneous determination and quantification of glucosinolates, as glucoraphanin, glucoerucin and sinigrin, and isothiocyanates, as sulforaphane and erucin, has developed and validated. This method has been used for the analysis of functional foods enriched with vegetable extracts. Chapter 3 focused on a physicochemical study of the interaction between the bile acid sequestrants used in the treatment of hypercholesterolemia including colesevelam and cholestyramine with obeticolic acid (OCA), potent agonist of nuclear receptor farnesoid X (FXR). In particular, a new experimental model for the determination of equilibrium binding isotherm was developed. Chapter 4 focused on methodological aspects of new hard ionization coupled with liquid chromatography (Direct-EI-UHPLC-MS) not yet commercially available and potentially useful for qualitative analysis and for “transparent” molecules to soft ionization techniques. This method was applied to the analysis of several steroid derivatives.

Sviluppo di un algoritmo di calibrazione per analisi quantitative di immagini in microscopia a fluorescenza

Questo progetto di tesi ha come obiettivo lo sviluppo di un algoritmo per la correzione e la calibrazione delle immagini in microscopia a fluorescenza e della sua implementazione come programma. Infatti, senza tale calibrazione le immagini di microscopia a fluorescenza sarebbero intrinsecamente affette da molteplici tipi di distorsioni ottiche. Questo limita fortemente la possibilità di effettuare analisi quantitative del livello di fluorescenza osservato. Il difetto sul quale ci siamo soffermati è la disomogeneità di campo, ossia una non uniforme fluorescenza causata dalla forma irregolare del fascio di eccitazione. Per conseguire l'obiettivo da noi proposto è necessaria l'acquisizione, in parallelo al campione in esame, di immagini di calibrazione contenenti sfere nanometriche a fluorescenza nota. A partire da queste, tramite procedure di image processing da noi implementate, abbiamo stimato la funzione di correzione della fluorescenza, localmente per ogni punto dell'immagine. Per la creazione di tale algoritmo abbiamo ipotizzato una possibile distribuzione dell'intensità dovuta alla non omogeneità del fascio ed abbiamo quindi stimato i parametri tramite un'apposita procedura di maximum likelihood. Tale stima è stata eseguita tenendo conto di possibili effetti dovuti alla luminosità di background, alla sovrapposizione di più nanosfere e ad effetti di bordo nel corso dell'elaborazione. Questa procedura è stata ripetuta su quattro diverse immagini di calibrazione, per valutarne la consistenza e la validità. Inoltre, per poter verificare che il software di elaborazione abbia le desiderate proprietà di linearità tra segnale misurato ed intensità nota, ci siamo serviti di un'ulteriore immagine di calibrazione contenente una mistura di sfere nanometriche con intensità variabili su due ordini di grandezza. Il risultato di questo lavoro di tesi verrà incluso in un programma per la calibrazione delle immagini in fluorescenza acquisite al laboratorio di biofisica del Dipartimento di Fisica ed Astronomia di Bologna.

Cascading events triggering industrial accidents: quantitative assessment of NaTech and domino scenarios

The so called cascading events, which lead to high-impact low-frequency scenarios are rising concern worldwide. A chain of events result in a major industrial accident with dreadful (and often unpredicted) consequences. Cascading events can be the result of the realization of an external threat, like a terrorist attack a natural disaster or of “domino effect”. During domino events the escalation of a primary accident is driven by the propagation of the primary event to nearby units, causing an overall increment of the accident severity and an increment of the risk associated to an industrial installation. Also natural disasters, like intense flooding, hurricanes, earthquake and lightning are found capable to enhance the risk of an industrial area, triggering loss of containment of hazardous materials and in major accidents. The scientific community usually refers to those accidents as “NaTechs”: natural events triggering industrial accidents. In this document, a state of the art of available approaches to the modelling, assessment, prevention and management of domino and NaTech events is described. On the other hand, the relevant work carried out during past studies still needs to be consolidated and completed, in order to be applicable in a real industrial framework. New methodologies, developed during my research activity, aimed at the quantitative assessment of domino and NaTech accidents are presented. The tools and methods provided within this very study had the aim to assist the progress toward a consolidated and universal methodology for the assessment and prevention of cascading events, contributing to enhance safety and sustainability of the chemical and process industry.

Quantitative risk analysis as a tool in process design

La Quantitative Risk Analysis costituisce un valido strumento per la determinazione del rischio associato ad un’installazione industriale e per la successiva attuazione di piani di emergenza. Tuttavia, la sua applicazione nella progettazione di un lay-out richiede la scelta di un criterio in grado di valutare quale sia la disposizione ottimale al fine di minimizzare il rischio. In tal senso, le numerose procedure esistenti, sebbene efficaci, risultano piuttosto faticose e time-consuming. Nel presente lavoro viene dunque proposto un criterio semplice ed oggettivo per comparare i risultati di QRA applicate a differenti designs. Valutando l’area racchiusa nelle curve iso-rischio, vengono confrontate dapprima le metodologie esistenti per lo studio dell’effetto domino, e successivamente, viene applicata al caso di serbatoi in pressione una procedura integrata di Quantitative Risk Domino Assessment. I risultati ottenuti dimostrano chiaramente come sia possibile ridurre notevolmente il rischio di un’attività industriale agendo sulla disposizione delle apparecchiature, con l’obiettivo di limitare gli effetti di possibili scenari accidentali.

Qualitatitive and quantitative analysis of fish spoilage processes for development of new food monitoring systems

This study investigates the growth and metabolite production of microorganisms causing spoilage of Atlantic cod (Gadus morhua) fillets packaged under air and modified atmosphere (60 % CO2, 40 % O2). Samples were provided by two different retailers (A and B). Storage of packaged fillets occurred at 4 °C and 8 °C. Microbiological quality and metabolite production of cod fillets stored in MAP 4 °C, MAP 8 °C and air were monitored during 13 days, 7 days and 3 days of storage, respectively. Volatile compounds concentration in the headspace were quantified by Selective ion flow tube mass spectrometry and a correlation with microbiological spoilage was studied. The onset of volatile compounds detection was observed to be mostly around 7 log cfu/g of total psychrotrophic count. Trimethylamine and dimethyl sulfide were found to be the dominant volatiles in all of the tested storage conditions, nevertheless there was no close correlation between concentrations of each main VOC and percentages of rejection based on sensory evaluation. According to results it was concluded that they cannot be considered as only indicators of the quality of cod fillets stored in modified atmosphere and air.  

Quantitative analysis of extracapsular extension of metastatic lymph nodes and its significance in radiotherapy planning in head and neck squamous cell carcinoma

We performed a histopathologic analysis to assess the extent of the extracapsular extension (ECE) beyond the capsule of metastatic lymph nodes (LN) in head and neck cancer to determine appropriate clinical target volume (CTV) expansions.

Quantitative 1-Step DNA Methylation Analysis with Native Genomic DNA as Template

DNA methylation analysis currently requires complex multistep procedures based on bisulfite conversion of unmethylated cytosines or on methylation-sensitive endonucleases. To facilitate DNA methylation analysis, we have developed a quantitative 1-step assay for DNA methylation analysis.