Enhanced anti-tumor effect of a gene gun-delivered DNA vaccine encoding the human papillomavirus type 16 oncoproteins genetically fused to the herpes simplex virus glycoprotein D

Anti-cancer DNA vaccines have attracted growing interest as a simple and non-invasive method for both the treatment and prevention of tumors induced by human papillomaviruses. Nonetheless, the low immunogenicity of parenterally administered vaccines, particularly regarding the activation of cytotoxic CD8+ T cell responses, suggests that further improvements in both vaccine composition and administration routes are still required. In the present study, we report the immune responses and anti-tumor effects of a DNA vaccine (pgD-E7E6E5) expressing three proteins (E7, E6, and E5) of the human papillomavirus type 16 genetically fused to the glycoprotein D of the human herpes simplex virus type 1, which was administered to mice by the intradermal (id) route using a gene gun. A single id dose of pgD-E7E6E5 (2 µg/dose) induced a strong activation of E7-specific interferon-γ (INF-γ)-producing CD8+ T cells and full prophylactic anti-tumor effects in the vaccinated mice. Three vaccine doses inhibited tumor growth in 70% of the mice with established tumors. In addition, a single vaccine dose consisting of the co-administration of pgD-E7E6E5 and the vector encoding interleukin-12 or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor further enhanced the therapeutic anti-tumor effects and conferred protection to 60 and 50% of the vaccinated mice, respectively. In conclusion, id administration of pgD-E7E6E5 significantly enhanced the immunogenicity and anti-tumor effects of the DNA vaccine, representing a promising administration route for future clinical trials.

Effect of TNF-α production inhibitors on the production of pro-inflammatory cytokines by peripheral blood mononuclear cells from HTLV-1-infected individuals

Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the causal agent of myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), a disease mediated by the immune response. HTLV-1 induces a spontaneous proliferation and production of pro-inflammatory cytokines by T cells, and increasing interferon-γ (IFN-γ) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels are potentially involved in tissue damage in diseases related to HTLV-1. This exaggerated immune response is also due to an inability of the natural regulatory mechanisms to down-modulate the immune response in this group of patients. TNF-α inhibitors reduce inflammation and have been shown to improve chronic inflammatory diseases in clinical trials. The aim of this study was to evaluate the ability of pentoxifylline, forskolin, rolipram, and thalidomide to decrease in vitro production of TNF-α and IFN-γ in cells of HTLV-1-infected subjects. Participants of the study included 19 patients with HAM/TSP (mean age, 53 ± 11; male:female ratio, 1:1) and 18 HTLV-1 carriers (mean age, 47 ± 11; male:female ratio, 1:2.6). Cytokines were determined by ELISA in supernatants of mononuclear cell cultures. Pentoxifylline inhibited TNF-α and IFN-γ synthesis with the minimum dose used (50 µM). The results with forskolin were similar to those observed with pentoxifylline. The doses of rolipram used were 0.01-1 µM and the best inhibition of TNF-α production was achieved with 1 µM and for IFN-γ production it was 0.01 µM. The minimum dose of thalidomide used (1 µM) inhibited TNF-α production but thalidomide did not inhibit IFN-γ production even when the maximum dose (50 µM) was used. All drugs had an in vitro inhibitory effect on TNF-α production and, with the exception of thalidomide, all of them also decreased IFN-γ production.

The role of keratin intermediate filaments in the colon epithelial cells

Keratins (K) are cytoskeletal proteins mainly expressed in the epithelium and constitute the largest subgroup of intermediate filaments (IFs). Simple epithelial keratins (SEKs) K7-K8 and K18-K20 are the major IF elements in the colon. SEK mutations are known to cause around 30 human diseases, mainly affecting liver and skin. However, so far no strong associations between K8 mutations and the development of human colitis have been found. The keratin contribution to colonic health comes from the K8 knock-out (K8-/-) mouse model, which develops an early chronic inflammation and hyperproliferation in the colon. The aim of this thesis was to investigate how keratins contribute to intestinal health and disease mainly by the experimental analysis using the K8-/- mouse colon and cell culture models. The work described here is divided into three studies. The first study revealed involvement of keratins in Notch1 signaling, which is the master regulator of cell fate in the colon. Immunoprecipitation and immunostaining, both in vitro and in vivo showed that K8 binds and co-localizes with Notch1. Interestingly, overexpression of keratins enhanced Notch1 levels and stabilized Notch intracellular domain (NICD), leading to higher activity of Notch signaling. The dramatic decrease in Notch activity in the K8-/- colon resulted in a differentiation shift towards goblet and enteroendocrine cells. The second study focused on the involvement of keratins in colitis-associated cancer (CAC). Although, the K8-/- inflamed colon did not develop colorectal cancer (CRC) spontaneously, it was dramatically more susceptible to induced CRC in two CRC models: azoxymethane (AOM) and multiple intestinal neoplasia (ApcMin/+). To understand how the loss of K8 contributes to CAC, the epithelial inflammasome signaling pathway was analyzed. The released component of active inflammasome, cleaved caspase-1 and its downstream protein, interleukin (IL)-18, were significantly increased in K8-/- and K8-/-ApcMin/+ colons. The inflammasome pathway has recently been suggested to control the levels of IL-22 binding protein (IL-22BP), which is a negative regulator of IL-22 activity. Interestingly, the activated inflammasome correlated with an upregulation of IL-22 and a complete loss of IL-22BP in the K8-null colons. The activation of IL-22 was confirmed by increased levels of downstream signaling, which is phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 (P-STAT3), a transcription factor promoting proliferation and tissue regeneration in the colon. The objective of the third study, was to examine the role of keratins in colon energy metabolism. A proteomic analysis identified mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 (HMGCS2) as the major ownregulated protein in the K8-/- colonocytes. HMGCS2 is the rate-limiting enzyme in ketogenesis, where energy from bacterially produced short chain fatty acids (SCFAs), mainly butyrate, is converted into ketone bodies in colonic epithelium. Lower levels and activity of HMGCS2 in the K8-/- colon resulted in a blunted ketogenesis. The studies upstream from HMGCS2, identified decreased levels of the SCFA-transporter monocarboxylate transporter 1 (MCT1), which led to increased SCFA content in the stool suggesting impaired butyrate transport through the colonic epithelium. Taken together, the results of the herein thesis indicate that keratins are essential regulators of colon homeostasis, in particular epithelial differentiation, tumorigenesis and energy metabolism.

PBURWELL #1-87

This sample contains two main domains. One is a light brown sediment domain with mainly small clasts which are clustered together. Only a few larger clasts can be seen in this domain. The other one is dark brown with well dispersed clasts. The light brown domain contains clasts that range from sub-angular to sub-rounded in shape. Lineations can be commonly seen in this domain. Grain crushing is also common with minor amounts of rotation. In the dark brown domain, clasts range from small to medium in size. They range from sub-angular to sub-rounded in shape. A few lineations and rotation structures can be seen in this domain.

La protéine majeure de la capside de l’HSV-1 est ubiquitinée

Le virus de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1) est le pathogène humain responsable des lésions herpétiques labiales, plus communément appelé « feux sauvages ». Annuellement, il est responsable de plusieurs cas d’encéphalites et d’infections de l’appareil visuel qui sont la principale cause de cécité en Amérique du Nord. Bien qu’il existe quelques traitements antiviraux, aucun vaccin ou médicament ne permet de prévenir ou de guérir les infections causées par ce virus. Aujourd’hui, les infections produites par l’HSV-1 sont présentes partout sur la planète. Récemment, une étude en protéomique effectuée sur les virus matures extracellulaires a permis d’identifier la présence d’ubiquitines libres et d’enzymes reliées à la machinerie d’ubiquitination dans le virus. De plus, le virus exploite cette machinerie au cours de l’infection. Il est connu que certaines protéines virales sont ubiquitinées durant une infection et que le virus imite même certaines enzymes d’ubiquitination. Nous avons donc entrepris des recherches afin d’identifier des protéines virales ubiquitinées qui pourraient être présentes dans les virus matures ainsi que leurs rôles potentiels. La protéine majeure de la capside, VP5, un constituant très important du virus, a été identifiée. Nos recherches nous ont permis de caractériser le type d’ubiquitination, une monoubiquitination sur les lysines K810 et/ou K1275 de VP5. Le rôle que pourrait jouer l’ubiquitination de VP5 dans le cycle de réplication virale et dans les virus matures n’est toutefois pas encore connu.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

Contribution de la Glycoprotéine M dans la Sortie de HSV-1

Le Virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) est un agent infectieux qui cause l’herpès chez une grande proportion de la population mondiale. L’herpès est généralement considéré comme une maladie bénigne dont la forme la plus commune est l'herpès labial (communément appelé « bouton de fièvre »), mais elle peut se révéler très sérieuse et causer la cécité et l’encéphalite, voir létale dans certain cas. Le virus persiste toute la vie dans le corps de son hôte. Jusqu'à présent, aucun traitement ne peut éliminer le virus et aucun vaccin n’a été prouvé efficace pour contrôler l’infection herpétique. HSV-1 est un virus avec un génome d’ADN bicaténaire contenu dans une capside icosaèdrale entourée d’une enveloppe lipidique. Treize glycoprotéines virales se trouvent dans cette enveloppe et sont connues ou supposées jouer des rôles distincts dans différentes étapes du cycle de réplication viral, incluant l'attachement, l'entrée, l’assemblage, et la propagation des virus. La glycoprotéine M (gM) qui figure parmi ces glycoprotéines d’enveloppe, est la seule glycoprotéine non essentielle mais est conservée dans toute la famille herpesviridae. Récemment, l’homologue de gM dans le Pseudorabies virus (PRV), un autre herpesvirus, a été impliqué dans la phase finale de l’assemblage (i.e. l’enveloppement cytoplasmique) au niveau du réseau trans-Golgi (TGN) en reconnaissant spécifiquement des protéines tégumentaires et d’autres glycoprotéines d’enveloppe ([1]). Toutefois, il a été proposé que cette hypothèse ne s’applique pas pour le HSV-1 ([2]). De plus, contrairement à la localisation au TGN dans les cellules transfectées, HSV-1 gM se localise dans la membrane nucléaire et sur les virions périnucléaires durant une infection. L’objectif du projet présenté ici était d’éclaircir la relation de la localisation et la fonction de HSV-1 gM dans le contexte d’une infection. Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons tout abord un mécanisme spécifique de ciblage nucléaire de HSV-1 gM. En phase précoce d’une infection, gM est ciblée à la membrane nucléaire d'une manière virus ii dépendante. Cela se produit avant la réorganisation du TGN normalement induite par l’infection et avant que gM n’entre dans la voie de sécrétion. Ce ciblage nucléaire actif et spécifique de gM ne semble pas dépendre des plusieurs des partenaires d’interaction proposés dans la littérature. Ces données suggèrent que la forme nucléaire de gM pourrait avoir un nouveau rôle indépendant de l’enveloppement final dans le cytoplasme. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons concentré nos efforts sur le rôle de gM dans l’assemblage du virus en phase tardive de l’infection et en identifiant un domaine critique de gM. Nos résultats mettent en valeur l’importance du domaine carboxyl-terminal cytoplasmique de gM dans le transport de gM du réticulum endoplasmique (RE) à l’appareil de Golgi, dans l’enveloppement cytoplasmique et la propagation intercellulaire du virus. Ainsi, l’export du RE de gM a été complètement compromis dans les cellules transfectées exprimant un mutant de gM dépourvu de sa région C-terminale. La délétion la queue cytoplasmique de gM cause une réduction légère du titre viral et de la taille des plaques. L'analyse de ces mutants par microscopie électronique a démontré une accumulation des nucléocapsides sans enveloppe dans le cytoplasme par rapport aux virus de type sauvage. Étrangement, ce phénotype était apparent dans les cellules BHK mais absent dans les cellules 143B, suggérant que la fonction de gM dépende du type cellulaire. Finalement, le criblage de partenaires d’interaction du domaine C-terminal de gM identifiés par le système de double-hybride nous a permis de proposer plusieurs candidats susceptibles de réguler la fonction de gM dans la morphogénèse et la propagation de virus.

GREBP, un nouveau facteur de transcription contrôlant l’expression de la guanylate cyclase A, récepteur de l’ANP, via l’élément de réponse au cGMP

La découverte du système des peptides natriurétiques (NP), au début des années 80, fut une découverte majeure qui révéla le rôle endocrinien du cœur. Les connaissances sur la relaxation vasculaire, la diurèse et la natriurèse provoquées par ce système ont évolué vers un niveau de complexité insoupçonné à cette époque. Nous savons à présent que les NP sont impliqués dans plusieurs autres mécanismes dont la prolifération cellulaire, l’apoptose, l’inhibition du système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS) et le métabolisme des adipocytes. Le métabolisme des lipides est maintenant devenu une cible de choix dans la lutte contre l’obésité. Cette condition aux proportions pandémiques est un facteur de risque majeur dans l’apparition de l’hypertension et du syndrome métabolique (MetS). La compréhension des mécanismes et des défauts de la voie des NP pourrait avoir un impact positif sur le contrôle du MetS et de l’hypertension. L’expression du récepteur des peptides natriuretiques de type 1 (NPR1/GCA) est contrôlée par plusieurs agents incluant son propre ligand, le peptide natriurétique de l’oreillette (ANP). La découverte d’une boucle de retro-inhibition, dans les années 90, a été un événement majeur dans le domaine des NP. En effet, suite à une stimulation à l’ANP, le NPR1/GCA peut inhiber l’activité transcriptionnelle de son propre gène par un mécanisme dépendant du cGMP. Notre groupe a identifié un élément cis-régulateur responsable de cette sensibilité au cGMP et mon projet consistait à identifier la ou les protéine(s) liant cet élément de réponse au cGMP (cGMP-RE). Nous avons identifié un clone liant le cGMP-RE en utilisant la technique du simple hybride chez la levure et une banque d’ADN complémentaire (ADNc) de rein humain. Ce clone provient d’un ADNc de 1083-bp dont le gène est localisé sur le chromosome 1 humain (1p33.36) et codant pour une protéine dont la fonction était inconnue jusqu’ici. Nous avons nommé cette nouvelle protéine GREBP en raison de sa fonction de cGMP Response Element Binding Protein. Des essais de liaison à l’ADN ont montré que cette protéine possède une affinité 18 fois plus élevée pour le cGMP-RE que le contrôle, tandis que des expériences de retard sur gel (EMSA) ont confirmé la spécificité des interactions protéine-ADN. De plus, l’immuno-précipitation de la chromatine (ChIP) a prouvé que GREBP lie le cGMP-RE dans des conditions physiologiques. La liaison de GREBP au cGMP-RE inhibe l’expression du gène rapporteur luciférase sous contrôle du promoteur de npr1/gca. L’inhibition de GREBP à l’aide d’ARN interférant active le promoteur de npr1/gca. Dans les cellules NCI-H295R, l’ANP stimule l’expression de grebp de 60% après seulement 3 heures et inhibe l’expression de npr1/gca de 30%. GREBP est une protéine nucléaire surtout exprimée dans le cœur et ayant le facteur eIF3F comme partenaire. Les variations nucléotidiques du gène sont plus fréquentes chez les patients hypertendus que chez des patients normotendus ou hypertendus souffrant de MetS. Nous rapportons ici l’existence d’un gène spécifique à l’humain qui agit comme répresseur transcriptionnel de npr1/gca et potentiellement impliqué dans le développement de l’hypertension.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Étude du mécanisme du changement programmé -1 du cadre de lecture par le ribosome

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Importance des protéines cellulaires incorporées dans les virions matures d’HSV-1

Pour compléter leur cycle de vie, les virus interagissent avec de nombreux facteurs de la cellule-hôte. Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) ne fait pas exception. Une récente étude protéomique du virus effectuée par notre laboratoire a permis d’identifier 49protéines cellulaires potentiellement incorporées dans les virions matures d’HSV-1 [1]. Étant donné que certaines de ces protéines peuvent jouer des rôles importants au cours du cycle de vie du virus, elles constituent des cibles de choix pour identifier et caractériser de nouvelles interactions hôte-pathogène dans le contexte d’HSV-1. D’ailleurs le laboratoire a été effectué un criblage aux petits ARN d’interférence qui a démontré qu'au moins 15 des protéines incorporées sont impliqués dans le cycle de réplication de HSV-1 en culture cellulaire (Annexe 1). Des nombreuses études rapportent l'incorporation des protéines de l'hôte dans les virions matures mais très peu abordent l'importance de la fraction des protéines cellulaires incorporée dans les virions pour le cycle virale. Pour vérifier ça, nous avons déplété ces protéines des virions matures extracellulaires en utilisant des petits ARN d’interférence. Par la suite, nous avons utilisé ces virus déplétés pour réinfecter des cellules déplétées ou normales. Cette méthode nous a permis d'identifier pour la première fois 8 protéines (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A, Rab10 et 14-3-3ζ) dont l'absence dans les virions réduit la production virale d'au moins 50%. Pour mieux comprendre à quelle étape du cycle viral ces protéines sont nécessaires, nous avons aussi quantifié les virus intracellulaires, produits des cellules déplétées individuellement des quinze protéines cellulaires. Ainsi, nous avons trouvé que dans nos conditions 7 de ces 8 protéines cellulaires (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A et Rab10) semblent impliquées dans la production des virus intracellulaires, ce qui nous a stimulés à débuter une série de tests plus approfondis de l’entrée d’HSV-1. Les résultats préliminaires, démontrent l’implication dans l’entrée d’HSV-1 d’au moins 3 à 4 de ces protéines (HSPA8, KRT10, Rab5A et Rab10).

Étude de la traduction IRES-dépendante du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH.

Mécanismes moléculaires de la réplication préférentielle du VIH-1 dans les cellules à polarisation Th1Th17 versus Th1 : rôle de PPARG dans la régulation négative de la réplication virale

Les cellules T CD4+ humaines sont hétérogènes du point de vue de la permissivité à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Notre laboratoire a préalablement démontré que les cellules Th1 à phénotype CXCR3+CCR6- sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 alors que les cellules Th1Th17 à phénotype CXCR3+CCR6+ y sont hautement permissives. La réplication du VIH dépend de plusieurs facteurs cellulaires de restriction ou de permissivité agissant à différentes étapes du cycle viral. Toutefois, malgré plusieurs avancées, la compréhension des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation de la réplication du VIH est encore limitée. L’objectif majeur de ce projet de maîtrise est de caractériser les mécanismes moléculaires de la permissivité et de la résistance au VIH respectivement dans les cellules Th1Th17 et Th1. Ce mémoire est divisé en quatre parties qui visent: (i) l’identification des voies canoniques et des fonctions biologiques différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 par l’analyse de leur transcriptome au niveau du génome entier; (ii) la validation de l’expression différentielle des gènes d’intérêt identifiés par biopuces au niveau des transcrits et des protéines; (iii) la caractérisation du rôle fonctionnel de certains de ces facteurs (i.e., PPARG, AhR) sur la réplication du VIH dans les cellules Th1Th17 versus Th1; et (iv) l’identification du niveau auquel ces facteurs interfèrent avec le cycle de réplication du VIH. Nos résultats d’analyse du transcriptome du génome entier par Gene Set Enrichment Analysis et Ingenuity Pathway Analysis indiquent que les cellules à profil Th1Th17 sont plus susceptibles à l’activation cellulaire et à l’apoptose, favorisent plus l’inflammation et expriment moins fortement les gènes liés à la dégradation protéosomale comparé aux cellules à profil Th1. Ces différences dans la régulation de diverses voies et fonctions biologiques permettent en partie d’expliquer la susceptibilité à l’infection par le VIH dans ces cellules. Nous avons ensuite confirmé l’expression différentielle de certains gènes d’intérêt dans les cellules Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) au niveau de l’ARNm et des protéines. Finalement, nous avons démontré le rôle des facteurs de transcription PPARG et AhR dans la régulation de la réplication du VIH. L’activation de la voie PPARG par la rosiglitazone induit la diminution importante de la réplication du VIH dans les cellules T CD4+, alors que l’activation de la voie AhR par les ligands exogènes TCDD et FICZ augmente de façon significative la réplication virale. Nous proposons que la voie PPARG agit comme un régulateur négatif de la réplication du VIH dans ces cellules, en interférant avec la polarisation Th17 et probablement en inhibant l’activité transcriptionnelle du facteur NF-kB. Les rôles des formes nucléaires versus cytoplasmiques du récepteur Ahr semblent être diamétralement opposés, dans la mesure où l’interférence ARN contre AhR s’associe également à l’augmentation de la réplication virale. Il est ainsi possible que la forme cytoplasmique d’AhR, connue par son activité E3 ligase, participe à la dégradation protéosomale des particules virales. Le mécanisme par lequel le AhR nucléaire versus cytoplasmique interfère avec la réplication virale est en cours d’étude au laboratoire. Cette étude représente la première caractérisation de l’expression différentielle de gènes au niveau du génome entier de sous-populations T CD4+ permissives versus résistantes à l’infection par le VIH. Nos résultats identifient de nouvelles cibles moléculaires pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4+ primaires.

The role of Microsomal prostaglandin synthase-1 (mPGES-1) and Ephrin B2 in Scleroderma

La sclérodermie (sclérose systémique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractérisée  par  l’épaississement  de  la  peau,  l’apparition  spontanée de lésions cicatricielles, des maladies   des   vaisseaux   sanguins,   divers   degrés   d’inflammation,   en   association   avec   un   système   immunitaire hyperactif. La pathogénèse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement approprié   n’est   disponible.   La fibrose est un élément distinctif de la maladie de ScS et est considérée   résulter   d’une   incapacité   à   mettre   fin   de   façon   appropriée   à   la   réponse   normale   de   réparation   des   plaies.   L’analyse   histologique   du   stade   initial   de   la   ScS   révèle   une   infiltration   périvasculaire de cellules mononucléaires dans le derme, associée à une synthèse accrue de collagène dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la compréhension des moyens de contrôler le stade inflammatoire de la ScS pourrait être bénéfique pour contrôler la progression de la maladie peu après son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygénase (COX) pour catalyser spécifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1  joue  un  rôle  clé  dans  l’inflammation,  la  douleur  et  l’arthrite;;  toutefois,  le   rôle de la mPGES-1 dans les mécanismes de fibrose, spécifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a précédemment montré que les souris à mPGES-1 nulle sont résistantes à la fibrose   cutanée   induite   par   la   bléomycine,   à   l’inflammation,   à   l’épaississement  cutané,  à  la  production  de  collagène  et  à  la  formation  de  myofibroblastes.  Sur  la   base  de  ces  résultats,  j’ai  formulé  l’hypothèse  que  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1 régulera à la baisse la production de médiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie   de   ScS.   Afin   d’explorer   le   rôle   de   la   mPGES-1   dans   l’inflammation   et   la   fibrose   associées  à  la  maladie  de  ScS,  j’ai  d’abord  examiné  l’expression  de  la  mPGES-1 dans la peau normale comparativement à des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes résultats ont montré que la mPGES-1 est nettement élevée dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 dérivés de la mPGES-1 étaient également significativement plus élevés dans les fibroblastes cutanés isolés de patients  atteints  de  ScS  comparativement  aux  fibroblastes  isolés  de  témoins  sains.  J’ai  également   étudié  l’effet  de  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1  sur  l’expression  de  marqueurs  pro- fibreux.   Mes   études   ont   montré   que   l’expression   de   médiateurs   pro-fibreux clés (α-SMA, endothéline-1, collagène de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est élevée dans les fibroblastes cutanés ScS en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de réduire significativement l’expression  de  l’α-SMA,  de  l’endothéline-1, du collagène de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes  ScS,  sans  effet  significatif  sur  les  fibroblastes  normaux.  J’ai  en  outre  examiné  l’effet   de  l’inhibition  de  la  mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires clés impliquées dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1.  L’inhibition  pharmacologique  de  la  mPGES- 1 a eu pour effet de réduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lésion ScS comparativement à des fibroblastes non traités. De plus, les patients atteints de ScS ont présenté des niveaux plus élevés de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. L’inhibiteur  de  la  mPGES-1 a pu réguler à la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3,  dans  les  fibroblastes  ScS.  Ces  résultats  ont  suggéré  que  l’inhibition   de la mPGES-1 pourrait être une méthode viable pour réduire le développement de sclérose cutanée et constituent une cible thérapeutique potentielle pour contrôler les mécanismes fibreux et inflammatoires associés à la pathophysiologie de la maladie de ScS. L’un   des   autres   processus   critiques   reliés   à   l’évolution de la réponse fibreuse associée à la maladie de ScS est la différenciation des fibroblastes en des cellules activées spécialisées iii iv appelées myofibroblastes, responsables de déclencher une signalisation adhésive excessive et le dépôt excessif de matrice extracellulaire,   conduisant   à   la   destruction   de   l’architecture   de   l’organe.   Ainsi,   l’identification   des   facteurs   endogènes   qui   initient/   favorisent   la   différenciation   fibroblaste-myofibroblaste peut mener à des stratégies thérapeutiques prometteuses pour contrôler  l’excès  de  signalisation  adhésive  et  de  fibrose  associé  à  la  maladie  de  ScS.  Des  études   antérieures  dans  le  domaine  de  la  biologie  du  cancer  ont  suggéré  que  l’éphrine  B2,  une  protéine   transmembranaire appartenant à la famille des éphrines, est impliquée dans la signalisation adhésive   et   le   remodelage   extracellulaire.   Cependant,   son   rôle   dans   la   fibrose   n’a   jamais   été   exploré.   Dans   la   deuxième   partie   de   mon   étude,   j’ai   donc   étudié   le   rôle   de   l’éphrine   B2   dans   la   fibrose.   Mes   études   montrent   que   l’expression   de   l’éphrine   B2   est   significativement   augmentée   dans la peau humaine ScS comparativement à la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de   fibroblastes   de   la   peau   humaine   normale   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractéristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de  fibres  de  tension,  des  adhérences  focales,  l’activation  accrue  de  la  FAK,  un  accroissement  de   l’expression  et  de  la  migration  de  fibroblastes  et  de  leur  adhérence  à  la  fibronectine  à  la  fois  chez   les   fibroblastes   cutanés   normaux   et   ScS.   En   outre,   j’ai   traité   des   souris   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante et montré que ces souris ont développé une fibrose cutanée significative associée à une épaisseur dermique et à une synthèse de collagène augmentées, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagène) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de   l’α-SMA, une activation augmentée de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagène de type 1 et le FCTC. Dans  l’ensemble,  mes  études  ont  identifié  deux  médiateurs  endogènes  cruciaux  impliqués  dans  la   propagation  de  l’inflammation  et  de  la  fibrose  associées  à  la  maladie  de  ScS.  L’inhibition  de  la   mPGES-1   pourrait   représenter   une   bonne   stratégie   alternative   pour   contrer   l’inflammation   et   la   fibrose au moins durant les stades précoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive   de   l’éphrine B2 favorise la signalisation adhésive et fibreuse en déclenchant la différenciation   de   fibroblastes   en   myofibroblastes   par   l’activation   de   la   voie   de   signalisation   de   la  FAK.  Ainsi,  l’inhibition  d’éphrine  B2  bloquera  la  formation  de  fibroblastes-myofibroblastes et régulera à la baisse la fibrose associée à la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1  et  l’éphrine   B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont reliés.

Les cadres de lectures alternatifs : une approche non-conventionnelle pour le développement de vecteurs vaccinaux

Introduction: Les cadres de lectures alternatifs (CLA) sont utilisés par de multiples virus afin de générer plusieurs protéines à partir d'une seule séquence nucléotidique. Les épitopes dits « cryptiques », c’est-à-dire les épitopes dérivés de protéines codées dans des CLAs, ont étés dernièrement l’objet de différentes études portant sur la réponse immunitaire antivirale et les lymphocytes T cytotoxiques. Méthodologie: Afin de vérifier le potentiel immunogène d'épitopes encodés dans des CLAs programmés, trois cassettes ont été construites pour mener à l'expression de trois épitopes bien caractérisés (épitope GAG77–85 du virus de l'immunodéficience humaine de type 1; épitope NS31406-1415 du virus de l'hépatite C; épitope core18-27 du virus de l'hépatite B) à partir de trois cadres de lectures superposés. La première cassette permet une initiation alternative de la traduction, la deuxième comprend deux signaux bipartites en tandem permettant un frameshift ribosomique et la troisième est une cassette contrôle. Ces éléments ont été introduits dans des vecteurs adénoviraux. Les virions générés ont servi à immuniser des souris C57BL/6 transgéniques pour HLA-A*0201 et HLA-DR1. La réponse immunitaire induite une semaine post-immunisation a été mesurée par essai ELISpot IFN . Résultats: Dans le contexte de cassettes vaccinales, les peptides dérivés d'une initiation alternative de traduction et de changement de cadre de lecture ribosomique ribosomal peuvent être exprimés et détectés par le système immunitaire dans un modèle animal. Conclusion: Ces expériences suggèrent la possibilité de développer de nouvelles stratégies vaccinales dans le but de prévenir ou de guérir certaines maladies associées aux infections virales chroniques telles que celles causées par le virus de l’immunodéficience humaine et le virus de l’hépatite C.