The Secreted Protein Rv1860 of Mycobacterium tuberculosis Stimulates Human Polyfunctional CD8(+) T Cells

We previously reported that Rv1860 protein from Mycobacterium tuberculosis stimulated CD4(+) and CD8(+) T cells secreting gamma interferon (IFN-gamma) in healthy purified protein derivative (PPD)-positive individuals and protected guinea pigs immunized with a DNA vaccine and a recombinant poxvirus expressing Rv1860 from a challenge with virulent M. tuberculosis. We now show Rv1860-specific polyfunctional T (PFT) cell responses in the blood of healthy latently M. tuberculosis-infected individuals dominated by CD8(+) T cells, using a panel of 32 overlapping peptides spanning the length of Rv1860. Multiple subsets of CD8(+) PFT cells were significantly more numerous in healthy latently infected volunteers (HV) than in tuberculosis (TB) patients (PAT). The responses of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from PAT to the peptides of Rv1860 were dominated by tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin-10 (IL-10) secretions, the former coming predominantly from non-T cell sources. Notably, the pattern of the T cell response to Rv1860 was distinctly different from those of the widely studied M. tuberculosis antigens ESAT-6, CFP-10, Ag85A, and Ag85B, which elicited CD4(+) T cell-dominated responses as previously reported in other cohorts. We further identified a peptide spanning amino acids 21 to 39 of the Rv1860 protein with the potential to distinguish latent TB infection from disease due to its ability to stimulate differential cytokine signatures in HV and PAT. We suggest that a TB vaccine carrying these and other CD8(+) T-cell-stimulating antigens has the potential to prevent progression of latent M. tuberculosis infection to TB disease.

Toxicity and imaging of multi-walled carbon nanotubes in human macrophage cells.

Multi-walled carbon nanotubes (MWNTs) have been proposed for use in many applications and concerns about their potential effect on human health have led to the interest in understanding the interactions between MWNTs and human cells. One important technique is the visualisation of the intracellular distribution of MWNTs. We exposed human macrophage cells to unpurified MWNTs and found that a decrease in cell viability was correlated with uptake of MWNTs due to mainly necrosis. Cells treated with purified MWNTs and the main contaminant Fe(2)O(3) itself yielded toxicity only from the nanotubes and not from the Fe(2)O(3). We used 3-D dark-field scanning transmission electron microscopy (DF-STEM) tomography of freeze-dried whole cells as well as confocal and scanning electron microscopy (SEM) to image the cellular uptake and distribution of unpurified MWNTs. We observed that unpurified MWNTs entered the cell both actively and passively frequently inserting through the plasma membrane into the cytoplasm and the nucleus. These suggest that MWNTs may cause incomplete phagocytosis or mechanically pierce through the plasma membrane and result in oxidative stress and cell death.

Quantifying Cell Binding Kinetics Mediated By Surface-Bound Blood Type B Antigen To Immobilized Antibodies

Cell adhesion is crucial to many biological processes, such as inflammatory responses, tumor metastasis and thrombosis formation. Recently a commercial surface plasmon resonance (SPR)-based BIAcore biosensor has been extended to determine cell binding mediated by surface-bound biomolecular interactions. How such cell binding is quantitatively governed by kinetic rates and regulating factors, however, has been poorly understood. Here we developed a novel assay to determine the binding kinetics of surface-bound biomolecular interactions using a commercial BIAcore 3000 biosensor. Human red blood cells (RBCs) presenting blood group B antigen and CM5 chip bearing immobilized anti-B monoclonal antibody (mAb) were used to obtain the time courses of response unit, or sensorgrams, when flowing RBCs over the chip surface. A cellular kinetic model was proposed to correlate the sensorgrams with kinetic rates. Impacts of regulating factors, such as cell concentration, flow duration and rate, antibody-presenting level, as well as pH value and osmotic pressure of suspending medium were tested systematically, which imparted the confidence that the approach can be applied to kinetic measurements of cell adhesion mediated by surface-bound biomolecular interactions. These results provided a new insight into quantifying cell binding using a commercial SPR-based BIAcore biosensor.

Increased expression of cystine/glutamate antiporter in multiple sclerosis

Background: Glutamate excitotoxicity contributes to oligodendrocyte and tissue damage in multiple sclerosis (MS). Intriguingly, glutamate level in plasma and cerebrospinal fluid of MS patients is elevated, a feature which may be related to the pathophysiology of this disease. In addition to glutamate transporters, levels of extracellular glutamate are controlled by cystine/glutamate antiporter x(c)(-), an exchanger that provides intracellular cystine for production of glutathione, the major cellular antioxidant. The objective of this study was to analyze the role of the system x(c)(-) in glutamate homeostasis alterations in MS pathology. -- Methods: Primary cultures of human monocytes and the cell line U-937 were used to investigate the mechanism of glutamate release. Expression of cystine glutamate exchanger (xCT) was quantified by quantitative PCR, Western blot, flow cytometry and immunohistochemistry in monocytes in vitro, in animals with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the animal model of MS, and in samples of MS patients. -- Results and discussion: We show here that human activated monocytes release glutamate through cystine/glutamate antiporter x(c)(-) and that the expression of the catalytic subunit xCT is upregulated as a consequence of monocyte activation. In addition, xCT expression is also increased in EAE and in the disease proper. In the later, high expression of xCT occurs both in the central nervous system (CNS) and in peripheral blood cells. In particular, cells from monocyte-macrophage-microglia lineage have higher xCT expression in MS and in EAE, indicating that immune activation upregulates xCT levels, which may result in higher glutamate release and contribution to excitotoxic damage to oligodendrocytes. -- Conclusions: Together, these results reveal that increased expression of the cystine/glutamate antiporter system x(c)(-) in MS provides a link between inflammation and excitotoxicity in demyelinating diseases.

The Oxidative State of Chylomicron Remnants Influences Their Modulation of Human Monocyte Activation

8 p.

Fast and Efficient Neural Conversion of Human Hematopoietic Cells

Neurons obtained directly from human somatic cells hold great promise for disease modeling and drug screening. Available protocols rely on overexpression of transcription factors using integrative vectors and are often slow, complex, and inefficient. We report a fast and efficient approach for generating induced neural cells (iNCs) directly from human hematopoietic cells using Sendai virus. Upon SOX2 and c-MYC expression, CD133-positive cord blood cells rapidly adopt a neuroepithelial morphology and exhibit high expansion capacity. Under defined neurogenic culture conditions, they express mature neuronal markers and fire spontaneous action potentials that can be modulated with neurotransmitters. SOX2 and c-MYC are also sufficient to convert peripheral blood mononuclear cells into iNCs. However, the conversion process is less efficient and resulting iNCs have limited expansion capacity and electrophysiological activity upon differentiation. Our study demonstrates rapid and efficient generation of iNCs from hematopoietic cells while underscoring the impact of target cells on conversion efficiency.

Impacto da exposição fetal ao HIV-1 na função das células T e das células dendríticas de neonatos não infectados

A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), é uma das epidemias mais impactantes do milênio e, desde o início, o número de mulheres jovens infectadas vem aumentando vertiginosamente, principalmente nos países em desenvolvimento onde muitas destas engravidam precocemente. Apesar da grande maioria dos casos de AIDS pediátrico no mundo resultar da transmissão vertical, aproximadamente dois terços dos neonatos expostos ao HIV durante a vida fetal não são contaminados. Neste sentido, seguindo as recomendações do consenso brasileiro (Ministério da Saúde), toda criança cuja transmissão vertical tenha sido descartada laboratorialmente não necessita de acompanhamento ambulatorial particularizado. Entretanto, resultados anteriores obtidos pelo nosso grupo demonstraram que, gestantes infectadas pelo HIV-1 que não controlam a carga viral plasmática (CVP), apresentam níveis elevados de citocinas inflamatórias e, no presente estudo, resultados revelam que neonatos não-infectados nascidos dessas gestantes apresentam anormalidades imunofuncionais no compartimento das células T do cordão umbilical quando expostos in vitro a ativadores policlonais, mas não aos antígenos do HIV-1. Ademais, quando comparada a neonatos não expostos, a ativação in vitro das células T de neonatos expostos ao HIV-1 com anti-CD3/anti-CD28 induziu a produção de níveis elevados de IL-17 e reduzidos de IL-10. Interessantemente, essa tendência das células T em secretar IL-17 parece estar relacionada à liberação de níveis elevados de IL-23 pelas células dendríticas derivadas de monócitos do sangue do cordão umbilical estimuladas com lipopolissacarídeo bacteriano. Uma ausência de sensibilização uterina aos antígenos do HIV-1 sugere que essas alterações possam traduzir um efeito adverso da produção elevada de citocinas inflamatórias maternas sobre o sistema imune do neonato, o que pode desequilibrar os eventos envolvidos na maturação e homeostasia imune fetal e neonatal, favorecendo o predomínio de fenótipos Th anômalos, tal como Th17. Essa hiper-responsividade das células Th17 pode vir a comprometer não apenas a capacidade da criança em responder de forma adequada a diferentes estímulos antigênicos ao longo de sua vida, como também pode torná-la mais suscetível a desordens imunomediadas

Efeito da metformina no remodelamento miocárdico e renal em ratos obesos com resistência à insulina

Diversas evidências comprovam que a obesidade está associada a alterações estruturais e funcionais do coração em modelos humanos e animais. Outros estudos recentes também demonstram que a obesidade humana está associada com alterações na função e na estrutura vascular, especialmente em grandes e médias artérias. Estudos epidemiológicos têm confirmado que a obesidade é um fator de risco significativo para o aparecimento de proteinúria e de doença renal terminal em uma população normal. Com o objetivo de determinar as alterações morfológicas relacionadas ao remodelamento cardíaco, vascular e renal em um modelo experimental de obesidade induzida pelo glutamato monossódico (MSG) e os efeitos da metformina sobre estes achados, foram estudados 25 ratos divididos em cinco grupos: controle com 16 e 22 semanas (CON-16 e CON-22); obeso com 16 e 22 semanas (MSG-16 e MSG-22) e obeso + metformina (MET-22) 300mg/Kg/dia por via oral. A caracterização da resistência à insulina foi feita através da medida da insulina plasmática e cálculo do índice de HOMA-IR. As análises morfológicas e quantificação do colágeno miocárdico foram feitos pelo sistema de imagem Image Pro Plus analysis. A pressão arterial sistólica foi levemente maior no grupo MSG-22, adquirindo significância estatística quando comparada com o grupo MSG-16 (1222 vs 1082 mmHg, p<0,05). Por outro lado, o grupo MET-22 mostrou níveis mais baixos de pressão arterial (1181 mmHg), sem alcançar diferença significativa. No grupo de animais obesos, foi observado aumento na relação média-lumen com 16 semanas (39,93,7 vs 30,22,0 %, p<0,05) e com 22 semanas (39,81,3 vs 29,51,2%, p<0,05), que foi reduzida com o uso da metformina (31,50,9%). O depósito de colágeno na área perivascular no ventrículo esquerdo foi significativamente maior no grupo MSG-22 (1,390,06 vs 0,830,06 % no CON-22, p<0,01), sendo atenuado pela metformina (1,020,04%). No rim, a área seccional transversa das arteríolas intrarrenais foi semelhante entre os grupos (18,52,2 no CON-16; 19,93,7 no MSG-16; 18,93,1 no CON-22; 21,81,5 no MSG-22; 20,21,4 no MET-22). Foi observado aumento da área glomerular no grupo MSG-22 (141,34,5 vs 129,50,5 m2), mas sem significância estatística. Em conclusão, nos ratos com obesidade induzida pelo MSG, com resistência à insulina, as alterações cardíacas foram mais proeminentes do que as alterações renais. No coração foram observados sinais de remodelamento vascular hipertrófico nas pequenas artérias intramiocárdicas e evidências de fibrose miocárdica mais proeminente na área perivascular, alterações que foram, pelo menos parcialmente, atenuadas com o uso de metformina durante seis semanas, mostrando que esta droga pode ser benéfica na prevenção de complicações cardíacas, vasculares e renais associadas com a obesidade.

Human LDL Structural Diversity Studied by IR Spectroscopy

Lipoproteins are responsible for cholesterol traffic in humans. Low density lipoprotein (LDL) delivers cholesterol from liver to peripheral tissues. A misleading delivery can lead to the formation of atherosclerotic plaques. LDL has a single protein, apoB-100, that binds to a specific receptor. It is known that the failure associated with a deficient protein-receptor binding leads to plaque formation. ApoB-100 is a large single lipid-associated polypeptide difficulting the study of its structure. IR spectroscopy is a technique suitable to follow the different conformational changes produced in apoB-100 because it is not affected by the size of the protein or the turbidity of the sample. We have analyzed LDL spectra of different individuals and shown that, even if there are not big structural changes, a different pattern in the intensity of the band located around 1617 cm 21 related with strands embedded in the lipid monolayer, can be associated with a different conformational rearrangement that could affect to a protein interacting region with the receptor.

Evaluation of Fentanyl Disposition and Effects in Newborn Piglets as an Experimental Model for Human Neonates

Background: Fentanyl is widely used off-label in NICU. Our aim was to investigate its cerebral, cardiovascular and pulmonary effects as well as pharmacokinetics in an experimental model for neonates. Methods: Fentanyl (5 mu g/kg bolus immediately followed by a 90 minute infusion of 3 mu g/kg/h) was administered to six mechanically ventilated newborn piglets. Cardiovascular, ventilation, pulmonary and oxygenation indexes as well as brain activity were monitored from T = 0 up to the end of experiments (T = 225-300 min). Also plasma samples for quantification of fentanyl were drawn. Results: A "reliable degree of sedation" was observed up to T = 210-240 min, consistent with the selected dosing regimen and the observed fentanyl plasma levels. Unlike cardiovascular parameters, which were unmodified except for an increasing trend in heart rate, some of the ventilation and oxygenation indexes as well as brain activity were significantly altered. The pulmonary and brain effects of fentanyl were mostly recovered from T = 210 min to the end of experiment. Conclusion: The newborn piglet was shown to be a suitable experimental model for studying fentanyl disposition as well as respiratory and cardiovascular effects in human neonates. Therefore, it could be extremely useful for further investigating the drug behaviour under pathophysiological conditions.

Human Endogenous Retrovirus HERV-Fc1 Association with Multiple Sclerosis Susceptibility: A Meta-Analysis

Background: Human endogenous retroviruses (HERVs) are repetitive sequences derived from ancestral germ-line infections by exogenous retroviruses and different HERV families have been integrated in the genome. HERV-Fc1 in chromosome X has been previously associated with multiple sclerosis (MS) in Northern European populations. Additionally, HERV-Fc1 RNA levels of expression have been found increased in plasma of MS patients with active disease. Considering the North-South latitude gradient in MS prevalence, we aimed to evaluate the role of HERV-Fc1on MS risk in three independent Spanish cohorts. Methods: A single nucleotide polymorphism near HERV-Fc1, rs391745, was genotyped by Taqman chemistry in a total of 2473 MS patients and 3031 ethnically matched controls, consecutively recruited from: Northern (569 patients and 980 controls), Central (883 patients and 692 controls) and Southern (1021 patients and 1359 controls) Spain. Our results were pooled in a meta-analysis with previously published data. Results: Significant associations of the HERV-Fc1 polymorphism with MS were observed in two Spanish cohorts and the combined meta-analysis with previous data yielded a significant association [rs391745 C-allele carriers: p(M-H) = 0.0005; ORM-H (95% CI) = 1.27 (1.11-1.45)]. Concordantly to previous findings, when the analysis was restricted to relapsing remitting and secondary progressive MS samples, a slight enhancement in the strength of the association was observed [p(M-H) = 0.0003, ORM-H (95% CI) = 1.32 (1.14-1.53)]. Conclusion: Association of the HERV-Fc1 polymorphism rs391745 with bout-onset MS susceptibility was confirmed in Southern European cohorts.

Evaluación de la posible capacidad genotóxica de fármacos antihipertensivos: losartán e irbesartán

[es] La hipertensión arterial (AHT), estado patológico definido como la elevación persistente de la presión arterial, es considerada uno de los principales problemas de salud pública. El tratamiento de la patología se realiza preferentemente con fármacos antihipertensivos. Los pacientes se encuentran sometidos a una exposición larga e ininterrumpida a estos fármacos. Los fármacos antihipertensivos se clasifican en función del mecanismo de acción por el que logran su efecto. Una de las clases son los antagonistas de los receptores de angiotensina II (ARB). Los ARB son la última clase terapéutica incluida en la terapia antihipertensiva. En este Trabajo Fin de Grado, se ha evaluado la posible capacidad genotóxica in vitro, de dos tipos de fármacos ARB (losartán e irbesartán) mediante el empleo de uno de los métodos citogenéticos más utilizados, el ensayo de micronúcleos (MN). El índice de división nuclear (NDI) fue usado también como medida de genotoxicidad. El análisis se ha realizado en linfocitos de sangre periférica (PBL) de 10 individuos control mediante dos tipos de cultivo uno sin fármaco y otro añadiendo los fármacos a los cultivos en una concentración igual a la que se encuentra en el plasma de pacientes. Los resultados muestran un aumento estadísticamente significativo de la frecuencia de células binucleadas con micronúcleos (BNMN) pero no se observan diferencias estadísticamente significativas en el índice de división nuclear. Estos resultados sugieren un posible efecto genotóxico de los fármacos pero sería necesario llevar a cabo estudios en una población más amplia e in vivo con los mismos fármacos para confirmarlo.

Carcinoma epidermóide invasivo de pênis: subexpressão dos fragmentos C3 e C4A/B do sistema complemento detectado no plasma pela plataforma proteômica ClinProt/MALDI/TOF

O carcinoma epidermóide de pênis (CEP) representa 95% das neoplasias penianas e afeta quase sempre pacientes não circuncidados estando muitas vezes associado à falta de higiene local adequada e à fimose. No Brasil a sua incidência é de 2,7 % porém em algumas áreas do país pode chegar a 17% dos casos diagnosticados por ano. O tumor pode ocorrer em qualquer parte do órgão sexual masculino e o tipo de estadiamento empregado é controverso. A classificação de Broders é a mais utilizada. Estudos sugerem a relação entre o desenvolvimento do carcinoma de pênis com a infecção por HPV (Papiloma Vírus Humano). O método de avaliação dos linfonodos inguinais permanece controverso sendo difícil a diferenciação entre linfadenomegalia inflamatória reacional e metastática. O exame físico não é um preditor confiável do comprometimento linfonodal pois pacientes com linfonodos palpáveis podem não apresentar metástases. Há poucas publicações sobre os mecanismos moleculares envolvidos na gênese e progressão do CEP. Apesar de vários marcadores terem sido avaliados, atualmente a aplicação clínica destes é limitada. A maior parte dos marcadores estudados requer procedimentos invasivos para obtenção do tecido tumoral. Existe a necessidade de encontrar através de uma técnica pouco invasiva marcadores tumorais circulantes capazes de diferenciar portadores de CEP com e sem envolvimento metastático. Neste tipo de neoplasia, a descoberta de biomarcadores que avaliem o prognóstico é relevante, pois o exame físico não é um indicador confiável do comprometimento linfonodal e da sobrevida.Os objetivos foram 1) revisar e discutir a epidemiologia, a etiologia, os diversos tipos de abordagem cirúrgica e as controvérsias no tratamento cirúrgico do câncer de pênis 2) investigar através da plataforma ClinProt/ MALDI / TOF a presença de marcadores plasmáticos capazes de discriminar indivíduos saudáveis de pacientes afetados por carcinoma epidermóide de pênis (CEP) 3) avaliar a importância destes marcadores na evolução da doença. Foram coletados e analisados pela plataforma ClinProt / MALDI / TOF o plasma de 36 indivíduos saudáveis e 25 pacientes com CEP invasivo, submetidos a tratamento cirúrgico entre junho de 2010 e junho de 2011, nos serviços de urologia do Instituto Nacional de Câncer e do Hospital Mário Kröeff (Rio de Janeiro). Nossos resultados apontaram para um conjunto de dois peptídeos (A = m / z 1897,22 + -9 Da e B = m / z 2021,99 + -9 Da) que foram capazes de diferenciar pacientes com CEP de indivíduos controles. Esses peptídeos foram posteriormente identificados como fragmentos C3 e C4 A/B do sistema complemento. A validação cruzada, utilizando toda casuística apresentou 62,5% e 86,76% de sensibilidade e de especificidade, respectivamente, com uma alta sensibilidade (100%) e especificidade (97%) nos pacientes que morreram pela doença. Além disso, os pacientes com envolvimento ganglionar obtiveram uma sensibilidade e uma especificidade de 80 % e 97%, respectivamente. Ficou demonstrado que à medida que a doença progride mais subexpressos está o conjunto de peptídeos quando comparados com indivíduos saudáveis. Estes resultados podem ser úteis como ferramentas para a avaliação do prognóstico destes pacientes.

Avaliação da resposta imune de neonatos não infectados pelo HIV-1 nascidos de gestantes soropositivas

A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), é uma das mais destrutivas epidemias do mundo, e a infecção pelo HIV em mulheres jovens vem aumentando rapidamente nos dias atuais. Esse fato tem um impacto importante na transmissão vertical do vírus. Apesar da grande maioria dos casos de aids pediátrica em todo mundo resultar da transmissão vertical, aproximadamente dois terços das crianças expostas ao HIV durante a vida fetal não são infectadas pelo vírus. Muitos trabalhos sugerem que durante a gestação doenças infecciosas maternas podem ter consequências complexas para o desenvolvimento do feto, e poucos trabalhos têm explorado o impacto da exposição ao HIV sobre a responsividade imunológica de crianças não infectadas a diferentes estímulos, particularmente na era das drogas antirretrovirais. Portanto, esse trabalho teve como objetivo avaliar eventos imunes em neonatos não-infectados expostos ao HIV-1 nascidos de gestantes que controlam (G1) ou não (G2) a carga viral plasmática, usando neonatos não expostos como controle. Para tanto, sangue do cordão umbilical de cada neonato foi coletado, plasma e células mononucleares foram separados e a linfoproliferação e o perfil de citocinas foram avaliados. Os resultados demonstraram que a linfoproliferação in vitro induzido por ativadores policlonais foi maior nos neonatos do G2. Entretanto, nenhuma cultura de célula respondeu a um conjunto de peptídeos sintéticos do envelope do HIV-1. A dosagem de citocinas no plasma e nos sobrenadantes das culturas ativadas policlonalmente demonstrou que, enquanto a IL-4 e IL-10 foram as citocinas dominantes produzidas nos grupos G1 e controle, a secreção de IFN-γ, IL-1, Il-6, IL-17 e TNF-α foi significativamente superior nos neonatos G2. Níveis sistêmicos de IL-10 observados dentre os neonatos G1 foram maiores naqueles nascidos de mães tratadas com drogas inibidoras da transcriptase reversa do vírus. Por outro lado, níveis superiores de citocinas inflamatórias foram observados dentre estes nascidos de gestantes tratadas com terapia antirretroviral de alta eficácia. Em resumo, nossos resultados indicam uma responsividade imune alterada em neonatos expostos in utero ao HIV-1 e reforça o papel do tratamento materno anti-viral com drogas menos potentes em atenuar tais distúrbios.

Toxic effects of dietary seaweeds Sargassum bovianum, Caulera faridii and Gracilaria corticata on blood parameters of albino rats

The present communication deals with the feeding trials of brown (Sargassum bovianum), green (Caulerpa faridii) and red (Gracilaria corticola) seaweeds in albino rats for a period of thirty days in order to investigate their digestibility and acceptability as supplementary food for animals. The parameters used were: changes in blood hemoglobin, ESR, MCHC, PCV and plasma vitamin levels. The result revealed that all the three species of seaweeds had acceptability up to 5% level, as no ill effect was noted during the experiment. But at 10% and 20% levels, marked changes were observed in blood parameters with diarrhea, vomiting and convulsions indicating possibilities of either tissue and muscular dystrophy, gastrointestinal tract necrosis or functional disorder of central nervous system. A heavy mortality was noted due to excessive water loss through diarrhea and vomiting. However, no mortality was observed after 22nd day at both 10% and 20% levels with subsided clinical signs. The results suggest that these three seaweed species could be used safely as a supplementary food, in native form, in animals at low concentrations.