STAT3α interacts with nuclear GSK3beta and cytoplasmic RISK pathway and stabilizes rhythm in the anoxic-reoxygenated embryonic heart.

Activation of the Janus Kinase 2/Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (JAK2/STAT3) pathway is known to play a key role in cardiogenesis and to afford cardioprotection against ischemia-reperfusion in adult. However, involvement of JAK2/STAT3 pathway and its interaction with other signaling pathways in developing heart transiently submitted to anoxia remains to be explored. Hearts isolated from 4-day-old chick embryos were submitted to anoxia (30 min) and reoxygenation (80 min) with or without the antioxidant MPG, the JAK2/STAT3 inhibitor AG490 or the PhosphoInositide-3-Kinase (PI3K)/Akt inhibitor LY-294002. Time course of phosphorylation of STAT3α(tyrosine705) and Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK) proteins [PI3K, Akt, Glycogen Synthase Kinase 3beta (GSK3beta), Extracellular signal-Regulated Kinase 2 (ERK2)] was determined in homogenate and in enriched nuclear and cytoplasmic fractions of the ventricle. STAT3 DNA-binding was determined. The chrono-, dromo- and inotropic disturbances were also investigated by electrocardiogram and mechanical recordings. Phosphorylation of STAT3α(tyr705) was increased by reoxygenation, reduced (~50%) by MPG or AG490 but not affected by LY-294002. STAT3 and GSK3beta were detected both in nuclear and cytoplasmic fractions while PI3K, Akt and ERK2 were restricted to cytoplasm. Reoxygenation led to nuclear accumulation of STAT3 but unexpectedly without DNA-binding. AG490 decreased the reoxygenation-induced phosphorylation of Akt and ERK2 and phosphorylation/inhibition of GSK3beta in the nucleus, exclusively. Inhibition of JAK2/STAT3 delayed recovery of atrial rate, worsened variability of cardiac cycle length and prolonged arrhythmias as compared to control hearts. Thus, besides its nuclear translocation without transcriptional activity, oxyradicals-activated STAT3α can rapidly interact with RISK proteins present in nucleus and cytoplasm, without dual interaction, and reduce the anoxia-reoxygenation-induced arrhythmias in the embryonic heart.

Fusaric acid-producing strains of Fusarium oxysporum alter 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthetic gene expression in Pseudomonas fluorescens CHA0 in vitro and in the rhizosphere of wheat.

The phytotoxic pathogenicity factor fusaric acid (FA) represses the production of 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG), a key factor in the antimicrobial activity of the biocontrol strain Pseudomonas fluorescens CHA0. FA production by 12 Fusarium oxysporum strains varied substantially. We measured the effect of FA production on expression of the phlACBDE biosynthetic operon of strain CHA0 in culture media and in the wheat rhizosphere by using a translational phlA'-'lacZ fusion. Only FA-producing F. oxysporum strains could suppress DAPG production in strain CHA0, and the FA concentration was strongly correlated with the degree of phlA repression. The repressing effect of FA on phlA'-'lacZ expression was abolished in a mutant that lacked the DAPG pathway-specific repressor PhlF. One FA-producing strain (798) and one nonproducing strain (242) of F. oxysporum were tested for their influence on phlA expression in CHA0 in the rhizosphere of wheat in a gnotobiotic system containing a sand and clay mineral-based artificial soil. F. oxysporum strain 798 (FA(+)) repressed phlA expression in CHA0 significantly, whereas strain 242 (FA(-)) did not. In the phlF mutant CHA638, phlA expression was not altered by the presence of either F. oxysporum strain 242 or 798. phlA expression levels were seven to eight times higher in strain CHA638 than in the wild-type CHA0, indicating that PhlF limits phlA expression in the wheat rhizosphere.

Spatio-temporal sequence of cross-regulatory events in root meristem growth.

A central question in developmental biology is how multicellular organisms coordinate cell division and differentiation to determine organ size. In Arabidopsis roots, this balance is controlled by cytokinin-induced expression of SHORT HYPOCOTYL 2 (SHY2) in the so-called transition zone of the meristem, where SHY2 negatively regulates auxin response factors (ARFs) by protein-protein interaction. The resulting down-regulation of PIN-FORMED (PIN) auxin efflux carriers is considered the key event in promoting differentiation of meristematic cells. Here we show that this regulation involves additional, intermediary factors and is spatio-temporally constrained. We found that the described cytokinin-auxin crosstalk antagonizes BREVIS RADIX (BRX) activity in the developing protophloem. BRX is an auxin-responsive target of the prototypical ARF MONOPTEROS (MP), a key promoter of vascular development, and transiently enhances PIN3 expression to promote meristem growth in young roots. At later stages, cytokinin induction of SHY2 in the vascular transition zone restricts BRX expression to down-regulate PIN3 and thus limit meristem growth. Interestingly, proper SHY2 expression requires BRX, which could reflect feedback on the auxin responsiveness of SHY2 because BRX protein can directly interact with MP, likely acting as a cofactor. Thus, cross-regulatory antagonism between BRX and SHY2 could determine ARF activity in the protophloem. Our data suggest a model in which the regulatory interactions favor BRX expression in the early proximal meristem and SHY2 prevails because of supplementary cytokinin induction in the later distal meristem. The complex equilibrium of this regulatory module might represent a universal switch in the transition toward differentiation in various developmental contexts.

Cocoa flavonoid-enriched diet modulates systemic and intestinal immunoglobulin synthesis in adult Lewis rats

Previous studies have reported that a diet containing 10% cocoa, a rich source of flavonoids, has immunomodulatory effects on rats and, among others effects, is able to attenuate the immunoglobulin (Ig) synthesis in both systemic and intestinal compartments. The purpose of the present study was focused on investigating whether these effects were attributed exclusively to the flavonoid content or to other compounds present in cocoa. To this end, eight-week-old Lewis rats were fed, for two weeks, either a standard diet or three isoenergetic diets containing increasing proportions of cocoa flavonoids from different sources: one with 0.2% polyphenols from conventional defatted cocoa, and two others with 0.4% and 0.8% polyphenols, respectively, from non-fermented cocoa. Diet intake and body weight were monitored and fecal samples were obtained throughout the study to determine fecal pH, IgA, bacteria proportions, and IgA-coated bacteria. Moreover, IgG and IgM concentrations in serum samples collected during the study were quantified. At the end of the dietary intervention no clear changes of serum IgG or IgM concentrations were quantified, showing few effects of cocoa polyphenol diets at the systemic level. However, in the intestine, all cocoa polyphenol-enriched diets attenuated the age-related increase of both fecal IgA and IgA-coated bacteria, as well as the proportion of bacteria in feces. As these effects were not dependent on the dose of polyphenol present in the diets, other compounds and/or the precise polyphenol composition present in cocoa raw material used for the diets could be key factors in this effect.

Pheomelanin-based coloration and the ability to cope with variation in food supply and parasitism.

Although gene by environment interactions may play a key role in the maintenance of genetic polymorphisms, little is known about the ecological factors involved in these interactions. We investigated whether food supply and parasites can mediate covariation between the degree of adult pheomelanin-based coloration, a heritable trait, and offspring body mass in the tawny owl (Strix aluco). We swapped clutches between nests to allocate genotypes randomly among environments. Three weeks after hatching, we challenged the immune system of 80 unrelated nestlings with either a phytohemagglutinin (PHA) or a lipopolysaccharide, surrogates of alternative parasites, and then fed them ad lib. or food-restricted them during the following 6 days in the laboratory. Whatever the immune challenge, nestlings fed ad lib. converted food more efficiently into body mass when their biological mother was dark pheomelanic. In contrast, food-restricted nestlings challenged with PHA lost less body mass when their biological mother was pale pheomelanic. Nestling tawny owls born from differently melanic mothers thus show differing reaction norms relative to food availability and parasitism. This suggests that dark and pale pheomelanic owls reflect alternative adaptations to food availability and parasites, factors known to vary in space and time.

Characterising the role of T-cell subsets in experimental allograft rejection and transplantation tolerance

SUMMARY : The recognition by recipient T cells of the allograft major histocompatibility complex (MHC)mismatched antigens is the primary event that ultimately leads to rejection. In the transplantation setting, circulating alloreactive CD4+ T cells play a central role in the initiation and the coordination of the immune response and can initiate the rejection of an allograft via three distinct pathways: the direct, indirect and the recently described semi-direct pathway. However, the exact role of individual CD4+ T-cell subsets in the development of allograft rejection is not clearly defined. Furthermore, besides pathogenic effector T cells, a new subset of T cells with regulatory properties, the CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) cells, has come under increased scrutiny over the last decade. The experiments presented in this thesis were designed to better define the phenotype and functional characteristics of CD4+ T-cell subsets and Treg cells in vitro and in vivo in a marine adoptive transfer and skin transplantation model. As Treg cells play a key role in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance, we have explored whether donor-antigen specific Treg cells could be expanded in vitro. Here we describe a robust protocol for the ex-vivo generation and expansion of antigen-specific Treg cells, without loss of their characteristic phenotype and suppressive function. In our in vivo transplantation model, antigen-specific Treg cells induced donor-specific tolerance to skin allografts in lymphopenic recipients and significantly delayed skin graft rejection in wild-type mice in the absence of any other immunosuppression. Naïve and memory CD4+ T cells have distinct phenotypes, effector functions and in vivo homeostatsis, and thus may play different roles in anti-donor immunity after transplantation. We have analyzed in vitro and in vivo primary alloresponses of naïve and cross-reactive memory CD4+ T cells. We found that the CD4+CD45RBlo memory T-cell pool was heterogeneous and contained cells with regulatory potentials, both in the CD4+CD25+ and CD4+CD25- populations. CD4+ T cells capable of inducing strong primary alloreactive responses in vitro and rejection of a first allograft in vivo were mainly contained within the CD45RBhi naïve CD4+ T-cell compartment. Taken together, the work described in this thesis provides new insights into the mechanisms that drive allograft rejection or donor-specific transplantation tolerance. These results will help to optimise current clinical immunosuppressive regimens used after solid organ transplantation and design new immunotherapeutic strategies to prevent transplant rejection. RÉSUMÉ : ROLE DES SOUS-POPULATIONS DE CELLULES T DANS LE REJET DE GREFFE ET L'INDUCTION DE TOLERANCE EN TRANSPLANTATION La reconnaissance par les cellules T du receveur des alloantigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMIT) présentés par une greffe allogénique, est le premier événement qui aboutira au rejet de l'organe greffé. Dans le contexte d'une transplantation, les cellules alloréactives T CD4+ circulantes jouent un rôle central dans l'initiation et la coordination de 1a réponse immune, et peuvent initier le rejet par 3 voies distinctes : la voie directe, indirecte et la voie servi-directe, plus récemment décrite. Toutefois, le rôle exact des sous-populations de cellules T CD4+ dans les différentes étapes menant au rejet d'une allogreffe n'est pas clairement établi. Par ailleurs, hormis les cellules T effectrices pathogéniques, une sous-population de cellules T ayant des propriétés régulatrices, les cellules T CD4+CD25+Foxp3+ (Treg), a été nouvellement décrite et est intensément étudiée depuis environ dix ans. Les expériences présentées dans cette thèse ont été planifiées afin de mieux définir le phénotype et les caractéristiques fonctionnels des sous-populations de cellules T CD4+ et des Treg in vitro et in vivo dans un modèle marin de transfert adoptif de cellules et de transplantation de peau. Comme les cellules Treg jouent un rôle clé dans l'induction et le maintien de la tolérance périphérique en transplantation, nous avons investigué la possibilité de multiplier in vitro des cellules Treg avec spécificité antigénique pour le donneur. Nous décrivons ici un protocole reproductible pour la génération et l'expansion ex-vivo de cellules Treg avec spécificité antigénique, sans perte de leur phénotype caractéristique et de leur fonction suppressive. Dans notre modèle in vivo de transplantation de peau, ces cellules Treg pouvaient induire une tolérance spécifique vis-à-vis du donneur chez des souris lymphopéniques, et, chez des souris normales non-lymphopéniques ces Treg ont permis de retarder significativement le rejet en l'absence de tout traitement immunosuppresseur. Les cellules T CD4+ naïves et mémoires se distinguent par leur phénotype, fonction effectrice et leur homéostasie in vivo, et peuvent donc moduler différemment la réponse immune contre le donneur après transplantation. Nous avons analysé in vitro et in vivo les réponses allogéniques primaires de cellules T CD4+ naïves et mémoires non-spécifiques (cross-réactives). Nos résultats ont montré que le pool de cellules T CD4+CD45RB'° mémoires était hétérogène et contenait des cellules avec un potentiel régulateur, aussi bien parmi la sous-population de cellules CD4+CD25+ que CD4+CD25+. Les cellules T CD4+ capables d'induire une alloréponse primaire intense in vitro et le rejet d'une première allogreffe in vivo étaient essentiellement contenues dans le pool de cellules T CD4+CD45RBhi naïves. En conclusion, le travail décrit dans cette thèse amène un nouvel éclairage sur les mécanismes responsables du rejet d'une allogreffe ou de l'induction de tolérance en transplantation. Ces résultats permettront d'optimaliser les traitements immunosuppresseurs utilisés en transplantation clinique et de concevoir des nouvelles stratégies irnmuno-thérapeutiques pour prévenir le rejet de greffe allogénique.

Esquemes de xifrat homomòrfics per a votació electrònica

This bachelor's degree thesis deals with homomorphic public-key cryptography, or in other words cryptosystems with special addition properties. Such cryptosystems are widely used in real life situations, for instance to make electronic voting secure. In Chapter 1 a few basic algebra results and other key concepts are introduced. Chapters 2 and 3 contain the algorithms and properties of the two cryptosystems which are considered to be the best for e-voting: Paillier and Joye-Libert. The thesis is concluded in Chapter 4, by comparing running times of the two above-mentioned cryptosystems, in simulations of real-life e-voting systems, with up to tens of thousands of voters, and different levels of security. Through these simulations, we discern the situations where each of the two cryptosystems is preferable.

CD4+CD25+ T cell depletion impairs tolerance induction in a murine model of asthma.

BACKGROUND: Regulatory T cells (Tregs) are key players in controlling the development of airway inflammation. However, their role in the mechanisms leading to tolerance in established allergic asthma is unclear. OBJECTIVE: To examine the role of Tregs in tolerance induction in a murine model of asthma. METHODS: Ovalbumin (OVA) sensitized asthmatic mice were depleted or not of CD25(+) T cells by anti-CD25 PC61 monoclonal antibody (mAb) before intranasal treatment (INT) with OVA, then challenged with OVA aerosol. To further evaluate the respective regulatory activity of CD4(+)CD25(+) and CD4(+)CD25(-) T cells, both T cell subsets were transferred from tolerized or non-tolerized animals to asthmatic recipients. Bronchoalveolar lavage fluid (BALF), T cell proliferation and cytokine secretion were examined. RESULTS: Intranasal treatment with OVA led to increased levels of IL-10, TGF-beta and IL-17 in lung homogenates, inhibition of eosinophil recruitment into the BALF and antigen specific T cell hyporesponsiveness. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells were markedly upregulated in lungs and suppressed in vitro and in vivo OVA-specific T cell responses. Depletion of CD25(+) cells before OVA INT severely hampered tolerance induction as indicated by a strong recruitment of eosinophils into BALF and a vigorous T cell response to OVA upon challenge. However, the transfer of CD4(+)CD25(-) T cells not only suppressed antigen specific T cell responsiveness but also significantly reduced eosinophil recruitment as opposed to CD4(+)CD25(+) T cells. As compared with control mice, a significantly higher proportion of CD4(+)CD25(-) T cells from OVA treated mice expressed mTGF-beta. CONCLUSION: Both CD4(+)CD25(+) and CD4(+)CD25(-) T cells appear to be essential to tolerance induction. The relationship between both subsets and the mechanisms of their regulatory activity will have to be further analyzed.

Endothelial cells as key determinants of the tumor microenvironment: interaction with tumor cells, extracellular matrix and immune killer cells.

Besides tumor cells, the tumor microenvironment harbors a variety of host-derived cells, such as endothelial cells, fibroblasts, innate and adaptive immune cells. It is a complex and highly dynamic environment, providing very important cues to tumor development and progression. Tumor-associated endothelial cells play a key role in this process. On the one hand, they form tumor-associated (angiogenic) vessels through sprouting from locally preexisting vessels or recruitment of bone marrow-derived endothelial progenitor cells, to provide nutritional support to the growing tumor. On the other hand, they are the interface between circulating blood cells, tumor cells and the extracellular matrix, thereby playing a central role in controlling leukocyte recruitment, tumor cell behavior and metastasis formation. Hypoxia is a critical parameter modulating the tumor microenvironment and endothelial/tumor cell interactions. Under hypoxic stress, tumor cells produce factors that promote tumor angiogenesis, tumor cell motility and metastasis. Among these factors, VEGF, a main angiogenesis modulator, can also play a critical role in the control of immune tolerance. This review discusses some aspects of the role of endothelial cells within tumor microenvironment and emphasizes their interaction with tumor cells, the extracellular matrix and with immune killer cells. We will also address the role played by circulating endothelial progenitor cells and illustrate their features and mechanism of recruitment to the tumor microenvironment and their role in tumor angiogenesis.

Role for JIP-1/IB1 in pancreatic β-cell and adipocyte dysfunctions in type 2 diabetes and obesity

L'insuline, produite par les cellules β du pancréas, joue un rôle central dans le contrôle de la glycémie. Un manque d'insuline entraine le diabète de type 2, une maladie répandue au stade d'épidémie au niveau mondial. L'augmentation du nombre de personnes obèses est une des causes principales du développement de la maladie. Avec l'obésité les tissus tels que le foie, le muscle, et le tissu adipeux deviennent résistants à l'insuline. En général, cette résistance est équilibrée par une augmentation de la sécrétion d'insuline. De ce fait, un grand nombre d'individus obèses ne deviennent pas diabétiques. Lorsque les cellules β ne produisent plus suffisamment d'insuline, alors le diabète se développe. Dans l'obésité, les cellules graisseuses sont résistantes à l'insuline et relâchent des lipides et autres produits qui affectent le bon fonctionnement et la vie des cellules β. «c-Jun Ν terminal Kinase» (JNK) est une enzyme qui joue un rôle important dans la résistance de l'insuline des cellules graisseuses. Cette même en2yme contribue aussi au déclin de la cellule β dans les conditions diabétogènes, et représente ainsi une cible thérapeutique potentielle du diabète. L'objectif de cette thèse a été de comprendre le mécanisme conduisant à l'activité de JNK dans les adipocytes et cellules β, dans l'obésité et le diabète de type 2. Nous montrons que les variations de JNK sont la conséquence de taux anormaux de JIP-1/EB1, une protéine qui a été impliquée dans certaines formes génétiques de diabète de type 2. En outre nous décrivons le mécanisme responsable des anomalies de JIP1/IB1 dans les adipocytes et cellules β. La restauration des taux de JIP-1/EB1 dans les deux types cellulaires pourrait être un objectif des thérapeutiques antidiabétiques actuelles et futures. - Le nombre d'individus touchés par le diabète de type 2 atteint aujourd'hui des proportions épidémiques à l'échelle mondiale. L'augmentation de la prévalence de l'obésité est la cause principale du développement de la maladie, qui, en général, survient suite à une perte de la sensibilité à l'insuline des tissus périphériques. Dans un grand nombre des cas, l'insulino-résistance est compensée par une augmentation de la sécrétion de l'insuline par les cellules β pancréatiques. Le diabète apparaît lorsque l'insuline n'est plus produite en quantité suffisante pour contrecarrer la résistance à l'insuline des tissus. Le défaut de production de l'insuline résulte du dysfonctionnement et de la réduction massive des cellules β. Les acides gras libres non estérifiés, en particulier le palmitate, provenant d'une alimentation riche en lipides et libérés par les adipocytes insulino-résistants contribuent au déclin de la cellule β en activant la voie de signalisation «cJun N-terminal kinase» (JNK). L'activation de JNK contribue aussi à la résistance à l'insuline des adipocytes dans l'obésité, soulignant ainsi l'importance de cette voie de signalisation dans la pathophysiologie du diabète. L'objectif de cette thèse a été de comprendre les mécanismes qui régulent JNK dans les cellules β et les adipocytes. Nous montrons que l'activation de JNK dans ces deux types cellulaires est la conséquence de la variation des taux de «JNK interacting protein 1» appelé aussi «islet brain 1» (JEP-1/ΓΒΙ), une protéine qui attache les kinases de la signalisation de JNK et dont des variations génétiques ont été associées avec le diabète de type 2. Dans les cellules β cultivées avec du palmitate, ainsi que dans les adipocytes dans l'obésité, l'expression de JEP-l/BBl est modifiée. Les modulations de l'expression de JEP-1/ΓΒΙ sont réalisées par le facteur de transcription «inducible cAMP early repressor» (ICER). L'expression d'ICER dans les adipocytes est diminuée dans l'obésité, et corrèle avec l'augmentation des niveaux de JEP-1/IB1. A l'inverse, le niveau d'expression d'ICER est augmenté dans les cellules β cultivées avec du palmitate, et cette augmentation perturbe le bon fonctionnement des cellules en réduisant les niveaux de JEP-l/IBl. Comme le palmitate, les particules pro-athérogéniques LDL-cholesterol oxydés, sont élevées chez les personnes obèses et diabétiques et sont délétères aux cellules β. Ces particules modifiées activent JNK dans les cellules β en diminuant l'expression de JIP-1/IB1 via ICER. Tous ces résultats montrent que le dérèglement de l'expression de JIP-l/EBl par ICER joue un rôle central dans l'activation de JNK dans les adipocytes et cellules β en souffrance dans l'obésité et le diabète de type 2. La restauration appropriée des niveaux de JEPl/IBl et d'ICER pourrait être considérée comme un objectif pour mesurer l'efficacité des traitements antidiabétiques actuels et futurs. - Type 2 diabetes has reached epidemic proportions worldwide, and poses a major socio-economic burden on developed and developing societies. The disease is often accompanied by obesity, and arises when β-cells produce insufficient insulin to meet the increased hormone demand, caused by insulin resistance. In obesity, enlargement of adipocytes contribute to their dysfunction, which is characterized by the abnormal release of some bioactive products such as non-esterified free fatty acids (NEF As). Chronic plasma elevation of NEF As elicits β-cell dysfunction and death, thereby, representing a key feature for development of diabetes in obesity (diabesity). Palmitate is the most abundant circulating NEF As in obesity, which triggers adipocytes and β-cell dysfunction. The effects of palmitate rely on the induction of the cJun N-terminal kinase (JNK) pathway. Activation of JNK promotes both β-cells dysfunction and insulin resistance in adipocytes. This thesis was undertaken to investigate the mechanisms accounting for the induction of the JNK pathway caused by palmitate. JNK is regulated by the scaffold protein JNK interacting protein-1, also called islet brain 1 (JIP-1/IB1). The levels of JDM/IB1 are critical for glucose homeostasis, as genetic variations within the gene were associated with diabetes. We found that activation of JNK in both, β-cells exposed to palmitate, and in adipocytes of obese mice, results from variations in the expression of JIP-l/EBl. Modifications in the JIP-1/IB1 levels were the consequence of abnormal expression of the inducible cAMP early repressor (ICER) in the two cell types. In addition, our data show that this repressor plays a key role in abnormal production of adipocyte hormones and β-cell dysfunction evoked by the pro-atherogenic oxidized LDL. Taken together, this study proposes that fine-tuning of appropriate levels of JIP-l/EBl, and ICER could circumvent β-cell failure, adipocyte dysfunction, and thereby, development of diabesity.

Improved flooding of broadcast messages using extended multipoint relaying

A common operation in wireless ad hoc networks is the flooding of broadcast messages to establish network topologies and routing tables. The flooding of broadcast messages is, however, a resource consuming process. It might require the retransmission of messages by most network nodes. It is, therefore, very important to optimize this operation. In this paper, we first analyze the multipoint relaying (MPR) flooding mechanism used by the Optimized Link State Routing (OLSR) protocol to distribute topology control (TC) messages among all the system nodes. We then propose a new flooding method, based on the fusion of two key concepts: distance-enabled multipoint relaying and connected dominating set (CDS) flooding. We present experimental simulationsthat show that our approach improves the performance of previous existing proposals.

Role of CD4+CD25+ regulatory T cells in the antigen specific induction of tolerance "via" the nasal route

ABSTRACT Asthma is a complex inflammatory syndrome caused by environmental factors in predisposed individuals (atopics). Its severity correlates with the presence of activated T lymphocytes and eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Induction of tolerance via the nasal route results in reduced recruitment of eosinophils into BALF upon challenge, inhibition of TH2 pro-inflammatory cytokine secretion and T cell hyporesponsiveness. Recently, CD4+CD25+ natural regulatory T cells (Treg) were proposed as key players in controlling the development of asthma and allergic disease. The objective of the present study is to investigate the role of CD4+CD25+ regulatory T cells in the mechanisms leading to tolerance in an established model of asthma. In this goal we depleted CD4+CD25+ T cells at different times during asthma and tolerance induction protocol in mice and looked at efficiency of tolerization (intranasal application of high dose of allergen) in the absence of natural Tregs. First, ovalbumin-sensitized mice were depleted of CD25+ T cells by intraperitoneal injection of anti-CD25 mAb (PC61) either for along-term (repeated injections of anti-CD25 from day 31 until the end of the protocol) or a short-term period (single injection of anti-CD25 before or after tolerance induction). We demonstrated that the long-term depletion of CD4+CD25+ T cells severely hampered tolerance induction (marked enhancement in eosinophil recruitment into BALF and a vigorous antigen specific T cell response to OVA upon allergen challenge) whereas transient depletions were not sufficient to do so. We then characterized T cell subsets by flow cytometry and observed that a large part of CD4+CD25+ T cells express Foxp3, an established marker of regulatory T cells. We also tested in-vitro suppressor activity of CD4+CD25+ T cells from tolerized mice by cell proliferation assay in coculture and observed a strong suppressive activity. Our data suggest that CD4+CD25+ T cells with regulatory properties play a crucial role in the induction of tolerance via the nasal route. The relationship between CD25+ natural Treg and inducible IL-10+ TRl-type Treg will have to be defined. RESUME L'asthme est un syndrome inflammatoire complexe provoqué par des facteurs environnementaux chez des individus génétiquement prédisposés (atopiques). Sa sévérité corrèle avec la présence des lymphocytes T activés et d'éosinophiles dans le lavage bronchoalvéolaire (BAL). L'induction de la tolérance par la voie nasale résulte en une diminution du recrutement des eosinophils dans le BAL, une inhibition de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires de type TH2 et de l'hypo-réponse des cellules T à l'allergène. Récemment, les cellules régulatrices «naturelles » de type CD4+CD25+ T (Tregs) ont été proposées comme acteurs essentiels dans le développement de l'asthme et de l'allergie. L'objectif de cette étude est d'étudier le rôle des cellules régulatrices CD4+CD25+ T dans les mécanismes menant à la tolérance dans un modèle établi d'asthme. Dans ce but nous avons déplété les cellules de CD4+CD25+ T à différents temps au cours du protocole d'induction d'asthme et de tolérance et nous avons regardé l'efficacité de l'induction de tolérance (application intranasale d'une dose importante d'allergène) en l'absence de Tregs. Dans un premier temps des souris sensibilisées à l'ovalbumine (OVA) ont été déplétées en cellules CD25+ T par l'injection intrapéritonéale d'anti-CD25 mAb (PC61) pour une longue période (injections répétées d'anti-CD25 du jour 31 jusqu'à la fin du protocole) ou pour une courte période (injection unique d'anti-CD25 avant ou après l'induction de tolérance). Nous avons démontré que la déplétion à long t erme des cellules de CD4+CD25+ T a empêché l'induction de tolérance (recrutement accru d'éosinophiles dans le BAL et une réponse vigoureuse des cellules T spécifiques de l'antigène après exposition à l'allergène) tandis des déplétions à court-terme n'ont pas cet effet. Nous avons ensuite caractérisé des sous-populations de cellules T par cytométrie de flux. Nous avons observé que la majorité des cellules CD4+CD25+ T expriment Foxp3, un marqueur établi des cellules régulatrices. Nous avons également examiné in vitro l'activité régulatrice des cellules T CD4+CD25+ issues de souris tolérisées. La prolifération de cellules T en coculture a démontré une forte activité suppressive des cellules CD4+CD25+. Nos données suggèrent que des cellules T CD4+CD25+ ayant des propriétés régulatrices jouent un rôle crucial dans l'induction de la tolérance par la voie nasale. Le rapport entre les cellules régulatrices naturelles CD4+CD25+ et les cellules régulatrices inductible de type TR1 I1-10+ devra être défini. RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC L'asthme est une maladie inflammatoire des bronches, caractérisée par des crises de dyspnée (gêne respiratoire) témoignant d'une activation brutale des muscles bronchoconstricteurs, auxquelles s'associent un oedème et une hypersécrétion des muqueuses des voies aériennes ainsi qu'une importante production d'anticorps de l'allergie (IgE). Chez la plupart des enfants atteints et chez près de la moitié des adultes concernés par l'asthme, c'est une allergie à des substances présentes dans l'air environnant (acariens, pollens ou poils d'animaux) qui est à l'origine de la maladie. . Le traitement actuel de l'asthme repose d'une part sur le soulagement des symptômes grâce à des produits à base de stéroïdes ou des bronchodilatateurs. D'autre part, l'immunothérapie spécifique (aussi appelée désensibilisation) permet d'améliorer l'asthme et de «reprogrammer» le système immunitaire. C'est à ce jour, le seul moyen connu de faire régresser une allergie. Cependant l'immunothérapie prend beaucoup de temps (3 à 5 ans) et ne marche pas à tous les coups ni pour tous les antigènes. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes impliqués lors d'un tel traitement afin d'en améliorer l'efficacité. Af n de pouvoir investiguer en détail ces mécanismes des modèles d'immunothérapie ont été mis au point chez la souris. Notre étude se base sur un modèle d'asthme allergique chez la souris. Des souris sont rendues allergiques à l'ovalbumine (OVA) et présentent alors les caractéristiques majeures de l'asthme humain (recrutement de cellules inflammatoires dans les poumons, augmentation de la production d'IgE et de la résistance des bronches aux flux respiratoires). Ces souris asthmatiques une fois traitées par l'application nasale d'OVA (forme d'immunothérapie muqueuse) ne développent plus de réaction allergique lors d'une ré-exposition à l'allergène. Notre hypothèse est que cette «guérison» (tolérance) est liée à l'action de cellules (lymphocytes T CD4) dites «régulatrices» et caractérisées par le marqueur CD25. Pour le démontrer, nous avons éliminé ces cellules «régulatrices» CD25 de nos souris asthmatiques grâce à un anticorps monoclonal spécifique. Nous n'avons dès lors plus été en mesure d'induire une tolérance à l'allergène. Ceci suggère donc un rôle clé des cellules «régulatrices» T CD4+CD25+ dans la réussite de l'immunothérapie nasale dans notre modèle. Nos résultats n'excluent pas la participation d'autres cellules telles que les lymphocytes producteurs d'IL-10 (lymphocytes régulateurs induits). Le rôle respectif de ces sous-populations régulatrices devra être examiné dans les études à venir. Une meilleure maîtrise des mécanismes de régulation pourrait s'avérer cruciale pour améliorer les thérapies de l'asthme.

Focal degeneration of astrocytes in amyotrophic lateral sclerosis

Astrocytes emerge as key players in motor neuron degeneration in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Whether astrocytes cause direct damage by releasing toxic factors or contribute indirectly through the loss of physiological functions is unclear. Here we identify in the hSOD1(G93A) transgenic mouse model of ALS a degenerative process of the astrocytes, restricted to those directly surrounding spinal motor neurons. This phenomenon manifests with an early onset and becomes significant concomitant with the loss of motor cells and the appearance of clinical symptoms. Contrary to wild-type astrocytes, mutant hSOD1-expressing astrocytes are highly vulnerable to glutamate and undergo cell death mediated by the metabotropic type-5 receptor (mGluR5). Blocking mGluR5 in vivo slows down astrocytic degeneration, delays the onset of the disease and slightly extends survival in hSOD1(G93A) transgenic mice. We propose that excitotoxicity in ALS affects both motor neurons and astrocytes, favouring their local interactive degeneration. This new mechanistic hypothesis has implications for therapeutic interventions.Cell Death and Differentiation advance online publication, 11 July 2008; doi:10.1038/cdd.2008.99.

Regulatory Mechanisms involved in Th2 Cell Differentiation. A Proteomics Approach.

Th2-solujen erilaistumista ohjaavat säätelyverkostot ja niiden tutkiminen proteomiikan avulla Astma ja allergiat ovat laajalle levinneitä ja vakavia sairauksia, joista kärsivät miljoonat ihmiset ympäri maailmaa. Koe-eläimillä tehdyt tutkimukset osoittavat, että interleukiini-4 (IL-4) on tärkeä allergisen astman ja allergioiden kehittymiselle ja kroonistumiselle. Se ohjaa T-auttajasolujen (Th-solujen) kehittymistä Th2-tyypin soluiksi, joilla on merkittävä rooli näiden tautien puhkeamisessa. Th2-solut tuottavat myös itse IL-4:ä, joka edesauttaa taudin seuraavien vaiheiden kehittymistä. Erityisesti STAT6-proteiini, joka aktivoituu IL-4-stimulaation seurauksena, on tarpeen Th2- vasteen syntymiselle ja kroonistumiselle antigeenin aiheuttamassa keuhkoputkien astmaattisessa tulehduksessa. Väitöskirjatyöni tarkoituksena oli käyttää kaksidimensionaaliseen elektroforeesiin (2- DE) perustuvaa proteomiikkaa ja massaspektrometriaa uusien Th2-solujen erilaistumista säätelevien proteiinien tunnistamiseksi. Erilaistumattomat Th-solut eristettiin vastasyntyneen napaverestä tai hiiren pernasta. Solut aktivoitiin Tsolureseptorin ja ns. ko-stimulatoristen reseptorien kautta ja erilaistettiin joko Th1- tai Th2-suuntaan vastaavasti erilaistavien IL-12- ja IL-4-sytokiinien avulla. Ensimmäisessä tutkimuksessa in vitro -erilaistettujen Th1- ja Th2-solujen proteomeja verrattiin keskenään proteiinien ilmenemisessä tai proteiinimodifikaatioissa olevien erojen tunnistamiseksi. Kaksi muuta päätutkimusta keskittyivät IL-4:n aiheuttamaan proteiinitason säätelyyn ensimmäisen vuorokauden aikana T-soluaktivaation jälkeen. Näistä ensimmäisessä IL-4:n aiheuttamia eroja tunnistettiin aktivoiduista ihmisen Thsoluista. IL-4:n todettiin säätelevän useita proteiineja kaspaasien välittämissä signalointiteissä sekä lisäävän T-solujen elävyyttä ja aktivoitumista. Toisessa tutkimuksessa STAT6-poistogeenisten hiirien lymfosyyttien proteomia verrattiin villityypin kontrollisoluihin T-soluaktivaation ja IL-4-stimulaation jälkeen. Näissä tutkimuksissa karakterisoitiin useita uusia IL-4:n ja STAT6:n kohdeproteiineja ja löydettiin uusia säätelyverkostoja. Tutkimustulokset ovat johtaneet uusiin Th2-erilaistumismekanismeja koskeviin hypoteeseihin.

The origins, evolution, and functional potential of alternative splicing in vertebrates.

Alternative splicing (AS) has the potential to greatly expand the functional repertoire of mammalian transcriptomes. However, few variant transcripts have been characterized functionally, making it difficult to assess the contribution of AS to the generation of phenotypic complexity and to study the evolution of splicing patterns. We have compared the AS of 309 protein-coding genes in the human ENCODE pilot regions against their mouse orthologs in unprecedented detail, utilizing traditional transcriptomic and RNAseq data. The conservation status of every transcript has been investigated, and each functionally categorized as coding (separated into coding sequence [CDS] or nonsense-mediated decay [NMD] linked) or noncoding. In total, 36.7% of human and 19.3% of mouse coding transcripts are species specific, and we observe a 3.6 times excess of human NMD transcripts compared with mouse; in contrast to previous studies, the majority of species-specific AS is unlinked to transposable elements. We observe one conserved CDS variant and one conserved NMD variant per 2.3 and 11.4 genes, respectively. Subsequently, we identify and characterize equivalent AS patterns for 22.9% of these CDS or NMD-linked events in nonmammalian vertebrate genomes, and our data indicate that functional NMD-linked AS is more widespread and ancient than previously thought. Furthermore, although we observe an association between conserved AS and elevated sequence conservation, as previously reported, we emphasize that 30% of conserved AS exons display sequence conservation below the average score for constitutive exons. In conclusion, we demonstrate the value of detailed comparative annotation in generating a comprehensive set of AS transcripts, increasing our understanding of AS evolution in vertebrates. Our data supports a model whereby the acquisition of functional AS has occurred throughout vertebrate evolution and is considered alongside amino acid change as a key mechanism in gene evolution.