Bioremediation of PAHs - Limitations and soultions

Introduction 1.1 Occurrence of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in the environment Worldwide industrial and agricultural developments have released a large number of natural and synthetic hazardous compounds into the environment due to careless waste disposal, illegal waste dumping and accidental spills. As a result, there are numerous sites in the world that require cleanup of soils and groundwater. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are one of the major groups of these contaminants (Da Silva et al., 2003). PAHs constitute a diverse class of organic compounds consisting of two or more aromatic rings with various structural configurations (Prabhu and Phale, 2003). Being a derivative of benzene, PAHs are thermodynamically stable. In addition, these chemicals tend to adhere to particle surfaces, such as soils, because of their low water solubility and strong hydrophobicity, and this results in greater persistence under natural conditions. This persistence coupled with their potential carcinogenicity makes PAHs problematic environmental contaminants (Cerniglia, 1992; Sutherland, 1992). PAHs are widely found in high concentrations at many industrial sites, particularly those associated with petroleum, gas production and wood preserving industries (Wilson and Jones, 1993). 1.2 Remediation technologies Conventional techniques used for the remediation of soil polluted with organic contaminants include excavation of the contaminated soil and disposal to a landfill or capping - containment - of the contaminated areas of a site. These methods have some drawbacks. The first method simply moves the contamination elsewhere and may create significant risks in the excavation, handling and transport of hazardous material. Additionally, it is very difficult and increasingly expensive to find new landfill sites for the final disposal of the material. The cap and containment method is only an interim solution since the contamination remains on site, requiring monitoring and maintenance of the isolation barriers long into the future, with all the associated costs and potential liability. A better approach than these traditional methods is to completely destroy the pollutants, if possible, or transform them into harmless substances. Some technologies that have been used are high-temperature incineration and various types of chemical decomposition (for example, base-catalyzed dechlorination, UV oxidation). However, these methods have significant disadvantages, principally their technological complexity, high cost , and the lack of public acceptance. Bioremediation, on the contrast, is a promising option for the complete removal and destruction of contaminants. 1.3 Bioremediation of PAH contaminated soil & groundwater Bioremediation is the use of living organisms, primarily microorganisms, to degrade or detoxify hazardous wastes into harmless substances such as carbon dioxide, water and cell biomass Most PAHs are biodegradable unter natural conditions (Da Silva et al., 2003; Meysami and Baheri, 2003) and bioremediation for cleanup of PAH wastes has been extensively studied at both laboratory and commercial levels- It has been implemented at a number of contaminated sites, including the cleanup of the Exxon Valdez oil spill in Prince William Sound, Alaska in 1989, the Mega Borg spill off the Texas coast in 1990 and the Burgan Oil Field, Kuwait in 1994 (Purwaningsih, 2002). Different strategies for PAH bioremediation, such as in situ , ex situ or on site bioremediation were developed in recent years. In situ bioremediation is a technique that is applied to soil and groundwater at the site without removing the contaminated soil or groundwater, based on the provision of optimum conditions for microbiological contaminant breakdown.. Ex situ bioremediation of PAHs, on the other hand, is a technique applied to soil and groundwater which has been removed from the site via excavation (soil) or pumping (water). Hazardous contaminants are converted in controlled bioreactors into harmless compounds in an efficient manner. 1.4 Bioavailability of PAH in the subsurface Frequently, PAH contamination in the environment is occurs as contaminants that are sorbed onto soilparticles rather than in phase (NAPL, non aqueous phase liquids). It is known that the biodegradation rate of most PAHs sorbed onto soil is far lower than rates measured in solution cultures of microorganisms with pure solid pollutants (Alexander and Scow, 1989; Hamaker, 1972). It is generally believed that only that fraction of PAHs dissolved in the solution can be metabolized by microorganisms in soil. The amount of contaminant that can be readily taken up and degraded by microorganisms is defined as bioavailability (Bosma et al., 1997; Maier, 2000). Two phenomena have been suggested to cause the low bioavailability of PAHs in soil (Danielsson, 2000). The first one is strong adsorption of the contaminants to the soil constituents which then leads to very slow release rates of contaminants to the aqueous phase. Sorption is often well correlated with soil organic matter content (Means, 1980) and significantly reduces biodegradation (Manilal and Alexander, 1991). The second phenomenon is slow mass transfer of pollutants, such as pore diffusion in the soil aggregates or diffusion in the organic matter in the soil. The complex set of these physical, chemical and biological processes is schematically illustrated in Figure 1. As shown in Figure 1, biodegradation processes are taking place in the soil solution while diffusion processes occur in the narrow pores in and between soil aggregates (Danielsson, 2000). Seemingly contradictory studies can be found in the literature that indicate the rate and final extent of metabolism may be either lower or higher for sorbed PAHs by soil than those for pure PAHs (Van Loosdrecht et al., 1990). These contrasting results demonstrate that the bioavailability of organic contaminants sorbed onto soil is far from being well understood. Besides bioavailability, there are several other factors influencing the rate and extent of biodegradation of PAHs in soil including microbial population characteristics, physical and chemical properties of PAHs and environmental factors (temperature, moisture, pH, degree of contamination). Figure 1: Schematic diagram showing possible rate-limiting processes during bioremediation of hydrophobic organic contaminants in a contaminated soil-water system (not to scale) (Danielsson, 2000). 1.5 Increasing the bioavailability of PAH in soil Attempts to improve the biodegradation of PAHs in soil by increasing their bioavailability include the use of surfactants , solvents or solubility enhancers.. However, introduction of synthetic surfactant may result in the addition of one more pollutant. (Wang and Brusseau, 1993).A study conducted by Mulder et al. showed that the introduction of hydropropyl-��-cyclodextrin (HPCD), a well-known PAH solubility enhancer, significantly increased the solubilization of PAHs although it did not improve the biodegradation rate of PAHs (Mulder et al., 1998), indicating that further research is required in order to develop a feasible and efficient remediation method. Enhancing the extent of PAHs mass transfer from the soil phase to the liquid might prove an efficient and environmentally low-risk alternative way of addressing the problem of slow PAH biodegradation in soil.

Mio-pliocene crustaceans from the Canary Islands, Spain

[EN] There are few previous references to fossil crustaceans for the Neogene marine layers of the Canary Islands (Spain). The Mio-Pliocene marine sedimentary layers in the eastern islands (Gran Canaria, Fuerteventura and Lanzarote) were previously characterised by the presence of numerous fossil fauna, mainly anthozoans and molluscs, which correspond to an equatorial-typepalaeoclimate, warmer than the present climate. This Mio-Pliocene transition dated between 9.3 and 4.1 Ma. In this paper, 12 fossil crustacean taxa are identified and classified, including decapods and barnacles: Balanus concavus Bronn, 1831, Balanus spongicola Brown, 1827, Balanus perforatus Brugui��re, 1789, Chenolobia testudinaria Linn��, 1767, Tetraclita cf. rubescens Darwin, 1854, Callianassa matsoni Rathbun, 1935, Callianassa sp., Upogebia sp, Eriphia aff. verrucosa (Forskal, 1775) , Maja sp., Scylla michelini Milne-Edwards, 1861 and Ocypode sp. [...]

Ricerca, mediante tecniche di proteomica, di biomarcatori proteici utili nella valutazione della qualit�� degli alimenti di origine animale

In the last decades, the increase of industrial activities and of the request for the world food requirement, the intensification of natural resources exploitation, directly connected to pollution, have aroused an increasing interest of the public opinion towards initiatives linked to the regulation of food production, as well to the institution of a modern legislation for the consumer guardianship. This work was planned taking into account some important thematics related to marine environment, collecting and showing the data obtained from the studies made on different marine species of commercial interest (Chamelea gallina, Mytilus edulis, Ostrea edulis, Crassostrea gigas, Salmo salar, Gadus morhua). These studies have evaluated the effects of important physic and chemical parameters variations (temperature, xenobiotics like drugs, hydrocarbons and pesticides) on cells involved in the immune defence (haemocytes) and on some important enzymatic systems involved in xenobiotic biotransformation processes (cytochrome P450 complex) and in the related antioxidant defence processes (Superoxide dismutase, Catalase, Heat Shock Protein), from a biochemical and bimolecular point of view. Oxygen is essential in the biological answer of a living organism. Its consume in the normal cellular breathing physiological processes and foreign substances biotransformation, leads to reactive oxygen species (ROS) formation, potentially toxic and responsible of biological macromolecules damages with consequent pathologies worsening. Such processes can bring to a qualitative alteration of the derived products, but also to a general state of suffering that in the most serious cases can provoke the death of the organism, with important repercussions in economic field, in the output of the breedings, of fishing and of aquaculture. In this study it seemed interesting to apply also alternative methodologies currently in use in the medical field (cytofluorimetry) and in proteomic studies (bidimensional electrophoresis, mass spectrometry) with the aim of identify new biomarkers to place beside the traditional methods for the control of the animal origin food quality. From the results it���s possible to point out some relevant aspects from each experiment: 1. The cytofluorimetric techniques applied to O. edulis and C. gigas could bring to important developments in the search of alternative methods that quickly allows to identify with precision the origin of a specific sample, contributing to oppose possible alimentary frauds, in this case for example related to presence of a different species, also under a qualitative profile, but morpholgically similar. A concrete perspective for the application in the inspective field of this method has to be confirmed by further laboratory tests that take also in account in vivo experiments to evaluate the effect in the whole organism of the factors evaluated only on haemocytes in vitro. These elements suggest therefore the possibility to suit the cytofluorimetric methods for the study of animal organisms of food interest, still before these enter the phase of industrial working processes, giving useful information about the possible presence of contaminants sources that can induce an increase of the immune defence and an alteration of normal cellular parameter values. 2. C. gallina immune system has shown an interesting answer to benzo[a]pyrene (B[a]P) exposure, dose and time dependent, with a significant decrease of the expression and of the activity of one of the most important enzymes involved in the antioxidant defence in haemocytes and haemolymph. The data obtained are confirmed by several measurements of physiological parameters, that together with the decrease of the activity of 7-etossi-resourifine-O-deetilase (EROD linked to xenobiotic biotransformation processes) during exposure, underline the major effects of B[a]P action. The identification of basal levels of EROD supports the possible presence of CYP1A subfamily in the invertebrates, still today controversial, never identified previously in C. gallina and never isolated in the immune cells, as confirmed instead in this study with the identification of CYP1A-immunopositive protein (CYP1A-IPP). This protein could reveal a good biomarker at the base of a simple and quick method that could give clear information about specific pollutants presence, even at low concentrations in the environment where usually these organisms are fished before being commercialized. 3. In this experiment it has been evaluated the effect of the antibiotic chloramphenicol (CA) in an important species of commercial interest, Chamelea gallina. Chloramphenicol is a drug still used in some developing countries, also in veterinary field. Controls to evaluate its presence in the alimentary products of animal origin, can reveal ineffective whereas the concentration results to be below the limit of sensitivity of the instruments usually used in this type of analysis. Negative effects of CA towards the CYP1A- IPP proteins, underlined in this work, seem to be due to the attack of free radicals resultant from the action of the antibiotic. This brings to a meaningful alteration of the biotransformation mechanisms through the free radicals. It seems particularly interesting to pay attention to the narrow relationships in C. gallina, between SOD/CAT and CYP450 system, actively involved in detoxification mechanism, especially if compared with the few similar works today present about mollusc, a group that is composed by numerous species that enter in the food field and on which constant controls are necessary to evaluate in a rapid and effective way the presence of possible contaminations. 4. The investigations on fishes (Gadus morhua, and Salmo salar) and on a bivalve mollusc (Mytilus edulis) have allowed to evaluate different aspects related to the possibility to identify a biomarker for the evaluation of the health of organisms of food interest and consequently for the quality of the final product through 2DE methodologies. In the seafood field these techniques are currently used with a discreet success only for vertebrates (fishes), while in the study of the invertebrates (molluscs) there are a lot of difficulties. The results obtained in this work have underline several problems in the correct identification of the isolated proteins in animal organisms of which doesn���t currently exist a complete genomic sequence. This brings to attribute some identities on the base of the comparison with similar proteins in other animal groups, incurring in the possibility to obtain inaccurate data and above all discordant with those obtained on the same animals by other authors. Nevertheless the data obtained in this work after MALDI-ToF analysis, result however objective and the spectra collected could be again analyzed in the future after the update of genomic database related to the species studied. 4-A. The investigation about the presence of HSP70 isoforms directly induced by different phenomena of stress like B[a]P presence, has used bidimensional electrophoresis methods in C. gallina, that have allowed to isolate numerous protein on 2DE gels, allowing the collection of several spots currently in phase of analysis with MALDI-ToF-MS. The present preliminary work has allowed therefore to acquire and to improve important methodologies in the study of cellular parameters and in the proteomic field, that is not only revealed of great potentiality in the application in medical and veterinary field, but also in the field of the inspection of the foods with connections to the toxicology and the environmental pollution. Such study contributes therefore to the search of rapid and new methodologies, that can increase the inspective strategies, integrating themselves with those existing, but improving at the same time the general background of information related to the state of health of the considered animal organism, with the possibility, still hypothetical, to replace in particular cases the employment of the traditional techniques in the alimentary field.

Evidenze micropaleontologiche e sedimentologiche di cicli deposizionali e climatici circa millenari nei Depositi Tardoquaternari della Piana dell'Arno e del Delta del Po

A multidisciplinary study was carried out on the Late Quaternary-Holocene subsurface deposits of two Mediterranean coastal areas: Arno coastal plain (Northern Tyrrhenian Sea) and Modern Po Delta (Northern Adriatic Sea). Detailed facies analyses, including sedimentological and micropalaeontological (benthic foraminifers and ostracods) investigations, were performed on nine continuously-cored boreholes of variable depth (ca. from 30 meters to100 meters). Six cores were located in the Arno coastal plain and three cores in the Modern Po Delta. To provide an accurate chronological framework, twenty-four organic-rich samples were collected along the fossil successions for radiocarbon dating (AMS 14C). In order to reconstruct the depositional and palaeoenvironmental evolution of the study areas, core data were combined with selected well logs, provided by local companies, along several stratigraphic sections. These sections revealed the presence of a transgressive-regressive (T-R) sequence, composing of continental, coastal and shallow-marine deposits dated to the Late Pleistocene-Holocene period, beneath the Arno coastal plain and the Modern Po Delta. Above the alluvial deposits attributed to the last glacial period, the post-glacial transgressive succession (TST) consists of back-barrier, transgressive barrier and inner shelf deposits. Peak of transgression (MFS) took place around the Late-Middle Holocene transition and was identified by subtle micropalaeontological indicators within undifferentiated fine-grained deposits. Upward a thick prograding succession (HST) records the turnaround to regressive conditions that led to a rapid delta progradation in both study areas. Particularly, the outbuilding of modern-age Po Delta coincides with mud-belt formation during the late HST (ca. 600 cal yr BP), as evidenced by a fossil microfauna similar to the foraminiferal assemblage observed in the present Northern Adriatic mud-belt. A complex interaction between allocyclic and autocyclic factors controlled facies evolution during the highstand period. The presence of local parameters and the absence of a predominant factor prevent from discerning or quantifying consequences of the complex relationships between climate and deltaic evolution. On the contrary transgressive sedimentation seems to be mainly controlled by two allocyclic key factors, sea-level rise and climate variability, that minimized the effects of local parameters on coastal palaeoenvironments. TST depositional architecture recorded in both study areas reflects a well-known millennial-scale variability of sea-level rising trend and climate during the Late glacial-Holocene period. Repeated phases of backswamp development and infilling by crevasse processes (parasequences) were recorded in the subsurface of Modern Po Delta during the early stages of transgression (ca. 11,000-9,500 cal yr BP). In the Arno coastal plain the presence of a deep-incised valley system, probably formed at OSI 3/2 transition, led to the development of a thick (ca. 35-40 m) transgressive succession composed of coastal plain, bay-head delta and estuarine deposits dated to the Last glacial-Early Holocene period. Within the transgressive valley fill sequence, high-resolution facies analyses allowed the identification and lateral tracing of three parasequences of millennial duration. The parasequences, ca. 8-12 meters thick, are bounded by flooding surfaces and show a typical internal shallowing-upward trend evidenced by subtle micropalaeontological investigations. The vertical stacking pattern of parasequences shows a close affinity with the step-like sea-level rising trend occurred between 14,000-8,000 cal years BP. Episodes of rapid sea-level rise and subsequent stillstand phases were paralleled by changes in climatic conditions, as suggested by pollen analyses performed on a core drilled in the proximal section of the Arno palaeovalley (pollen analyses performed by Dr. Marianna Ricci Lucchi). Rapid shifts to warmer climate conditions accompanied episodes of rapid sea-level rise, in contrast stillstand phases occurred during temporary colder climate conditions. For the first time the palaeoclimatic signature of high frequency depositional cycles is clearly documented. Moreover, two of the three "regressive" pulsations, recorded at the top of parasequences by episodes of partial estuary infilling in the proximal and central portions of Arno palaeovalley, may be correlated with the most important cold events of the post-glacial period: Younger Dryas and 8,200 cal yr BP event. The stratigraphic and palaeoclimatic data of Arno coastal plain and Po Delta were compared with those reported for the most important deltaic and coastal systems in the worldwide literature. The depositional architecture of transgressive successions reflects the strong influence of millennial-scale eustatic and climatic variability on worldwide coastal sedimentation during the Late glacial-Holocene period (ca. 14,000-7,000 cal yr BP). The most complete and accurate record of high-frequency eustatic and climatic events are usually found within the transgressive succession of very high accommodation settings, such as incised-valley systems where exceptionally thick packages of Late glacial-Early Holocene deposits are preserved.

Charakterisierung und Stabilit��t von Arthropoden-H��mocyanin

H��mocyanine sind gro��e, multimere Sauerstofftransport- proteine, die frei gel��st in der H��molymphe von Arthropoden und Mollusken vorkommen.Zur Charakterisierung verschiedener Arthropoden-h��mocyanine wurden deren molare Massen bestimmt. Die mit einer Vielwinkel-Laser-Lichtstreuapparatur ermittelten Molekulargewichte zeigten eine grosse Schwankungsbreite. Dies konnte auf Ungenauigkeiten der zur Berechnung der Molekulargewichte verwendeten spezifischen Extinktions- koeffizienten und Brechungsindex-Inkremente zur��ckgef��hrt werden.Mit der Methode der Massenspektrometrie (MALDI-TOF) bestimmte Molekulargewichte einzelner Untereinheiten des H��mocyanins der Vogelspinne <i style='mso-bidi-font-style: normal'>Eurypelma californicum</i> zeigten eine sehr gute ��bereinstimmung mit aus der Sequenz errechneten Werten.F��r das 24-mere Spinnenh��mocyanin von <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Eurypelma californicum</i> wurde die Stabilit��t gegen��ber GdnHCl und der Temperatur auf den verschiedenen strukturellen Ebenen des Proteins untersucht.Viele Stabilit��tsuntersuchungen werden an kleinen Proteinen durchgef��hrt, deren Entfaltung kooperativerfolgt. Bei gr����eren Proteinen mit unterschiedlichen strukturellen Bereichen (Dom��nen) ist der Entfaltungs-prozess weitaus komplexer. Ziel war es, durch die Denaturierung des Spinnen-H��mocyanins Erkenntnisse ��ber die Stabilit��t und Entfaltung der verschiedenen strukturellen Ebenen eines so gro��en Proteinkomplexes zu gewinnen.Ein wichtiges Charakteristikum f��r die Interpretation der Entfaltungsexperimente ist die starke L��schung der Tryptophanfluoreszenz im oxygenierten Spinnen-H��mocyanin. Die L��schung kann vollst��ndig durch F��rster-Transfer erkl��rt werden kann. Sie bleibt auf die einzelnen Untereinheiten beschr��nkt und stellt somit ein reines O₂-Beladungssignal dar.Unter Einwirkung von GdnHCl dissoziiert das native, 24-mere Spinnen-H��mocyanin ohne die Entstehung langlebiger Inter- mediate. Die Untereinheiten werden durch das Oligomer stabilisiert. Die Entfaltung eines Monomers, der Unter- einheit <u>e</u>, folgt einer Hierarchie der verschiedenen strukturellen Ebenen des Molek��ls. Die Entfaltung beginnt zun��chst von au��en mit der Auflockerung der Terti��rstruktur. Der Kern von Dom��ne II mit dem aktiven Zentrum weist hingegen eine besondere Stabilit��t auf.Die ausgepr��gte Hitzestabilit��t des <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Eurypelma</i>-H��mocyanins h��ngt vom Oligomerisierungsgrad, dem verwendeten Puffer und dessen Ausgangs-pH-Wert ab und spiegelt offensichtlich die extremen Lebensbedingungen im Habitat wider.

3D-Cryo-Elektronenmikroskopie des 4x6-H��mocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum unter Oxy- und Deoxybedingungen

Arthropodenh��mocyanine und Molluskenh��mocyanine, die extrazellul��ren Atmungsproteine der Arthropoden und Mollusken, unterscheiden sich grunds��tzlich im Aufbau, besitzen aber ��hnliche aktive Zentren, welche in ihrer oxydierten Form f��r die Blauf��rbung der H��mocyanine verantwortlich sind. Sauerstoff wird im Bindungszentrum zwischen zwei, von sechs Histidinen ligandierten, Kupfer(I)Ionen gebunden. Arthropodenh��mocyanine bauen sich artspezifisch aus 1, 2, 4, 6, oder 8 Hexameren mit D3-Symmetrie auf. Die Untereinheiten von je ca. 75 kDa falten sich in drei Dom��nen unterschiedlicher Funktionen. Der komplexe, hierarchische Zusammenbau der Arthropodenh��mocyanine h��ngt von der Heterogenit��t der Untereinheiten ab. Die 7 verschieden Sequenzen des 4x6-H��mocyanins von Eurypelma californicum (EcHc) sind biochemisch in der Quart��rstruktur lokalisiert. Bislang fehlte noch ein unabh��ngig erstelltes 3D-Modell der geometrischen Gesamtstruktur welche die hexamere und monomere Topographie eindeutig zeigt. Dessen Erstellung war Gegenstand dieser Arbeit, in Verbindung mit der Zielsetzung, die 3D-Rekonstruktion in den beiden extremen physiologischen Zust��nden, mit und ohne gebundenen Sauerstoff, zu erzeugen. Dazu wurden in einer eigens entwickelten Atmosph��ren-Pr��parationskammer die Proteine in L��sung schockgefrorenen und mittels Cryo-3D-Elektronenmikroskopie gemessen. Aus den daraus gewonnen Projektionsbildern lie��en sich mit der ���Single Particle Analyse��� die 3D-Informationen zur��ckberechnen. Die 3D-Rekonstruktionen wurden mit der publizierten R��ntgenkristallstruktur des hexameren Referenz-H��mocyanins der Languste Panulirus interruptus verifiziert. Die Rekonstruktionen erlaubten die eindeutige Messung diverser in der Literatur diskutierter Parameter der Architektur des 4x6-EcHc und dar��ber hinaus weiterer geometrischer Parameter, welche hier erstmals ver��ffentlicht werden. SAXS-Daten sagen extreme Translationen und Rotationen von Teilquart��rstrukturen zwischen oxy- und deoxy-EcHc voraus, was von den 3D-Rekonstruktionen der beiden Zust��nde nicht best��tigt werden konnte: Die 16 �� Rekonstruktion der Deoxyform weicht geometrisch nicht von der 21 �� Rekonstruktion der Oxyform ab. Die Einpassung der publizierten R��ntgenstruktur der Untereinheit II des H��mocyanin des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus in die Rekonstruktionen unterst��tzt eine auf der hexameren Hierarchieebene lokalisierte Dynamik der Oxygenierung. Mittels Einpassung modellierter molekularer Strukturen der EcHc-Sequenzen konnte eine erste Vermutung zur Lokalisation der beiden zentralen Linker-Untereinheiten b und c des 4x6-Molek��ls gemacht werden: Demnach w��rde Untereinheit b in den exponierten Hexameren des Molek��ls liegen. Aussagen ��ber die Quart��rstrukturbindungen auf molekularer Ebene aufgrund der Einpassung modellierter molekularer Daten in die Rekonstruktionen sind als spekulativ einzustufen: a) Die Aufl��sung der Rekonstruktion ist verbesserungsw��rdig. b) Es gibt keine ad��quate Vorlage f��r eine verl��ssliche Strukturvorhersage; die verschiedenen EcHc-Sequenzen liegen nur als Modellierung vor. c) Es w��re eine flexible Einpassung notwendig, um Ungenauigkeiten in den modellierten Strukturen durch Sekund��rstrukturanpassung zu minimieren.

Effects of artificial defences and flooding on coastal habitats and assemblages

Since large stretches of European coasts are already retreating and projected scenarios are worsening, many artificial structures, such as breakwaters and seawalls, are built as tool against coastal erosion. However artificial structures produce widespread changes that alter the coastal zones and affect the biological communities. My doctoral thesis analyses the consequences of different options for coastal protection, namely hard engineering ���artificial defences��� (i.e. impact of human-made structures) and ���no-defence��� (i.e. impact of seawater inundation). I investigated two new aspects of the potential impact of coastal defences. The first was the effect of artificial hard substrates on the fish communities structure. In particular I was interested to test if the differences among breakwaters and natural rocky reef would change depending on the nature of the surrounding habitat of the artificial structure (prevalent sandy rather than rocky). The second was the effect on the native natural sandy habitats of the organic detritus derived from hard-bottom species (green algae and mussels) detached from breakwaters. Furthermore, I investigated the ecological implication of the ���no-defend��� option, which allow the inundation of coastal habitats. The focus of this study was the potential effect of seawater intrusion on the degradation process of marine, salt-marsh and terrestrial detritus, including changes on the breakdown rates and the associated macrofauna. The PhD research was conducted in three areas along European coasts: North Adriatic sea, Sicilian coast and South-West England where different habitats (coastal, estuarine), biological communities (soft-bottom macro-benthos; rocky-coastal fishes; estuarine macro-invertebrates) and processes (organic enrichment; assemblage structure; leaf-litter breakdown) were analyzed. The research was carried out through manipulative and descriptive field-experiments in which specific hypothesis were tested by univariate and multivariate analyses.

Molecular phylogenetic inferences on the position of the Mollusca within the Lophotrochozoa

Die phylogenetische Position der Mollusken innerhalb der Trochozoa sowie die interne Evolution der Klassen der Mollusca sind weitgehend unbekannt und wurden in meiner Arbeit anhand molekularer Merkmale untersucht. Phylogenomische Analysen zeigten in der Vergangenheit eine gute Aufl��sung f��r urspr��ngliche Speziationsereignisse. Daher wurden hier drei neue EST Datens��tze generiert: f��r Sipunculus nudus (Sipuncula), Barentsia elongata (Kamptozoa) und Lepidochitona cinerea, (Polyplacophora, Mollusca). Zus��tzlich wurden gezielt Gene verschiedener Mollusken mittels RT-PCR amplifiziert. rnSowohl Kamptozoen als auch Sipunculiden wurden aufgrund morphologischer Kriterien bisher als m��gliche Schwestergruppe der Mollusken gehandelt, aber die hier erzielten Ergebnisse zur Evolution der H��merythrine, Gen-Anordnungen der mitochondrialen Genome und phylogenetische Analysen der ribosomalen und der mitochondriellen Proteine st��tzen diese Hypothese nicht. Die Position der Kamptozoa erwies sich hier generell als unbest��ndig; phylogenomische Analysen deuten eine N��he zu den Bryozoen an, aber diese Position wird stark durch die Auswahl der Taxa beeinflusst. Dagegen weisen meine Analysen klar auf eine n��here Beziehung zwischen Annelida und Sipuncula hin. Die ribosomalen Proteine zeigen Sipuncula (und Echiura) sogar als Subtaxa der Anneliden. Wie den Mollusken fehlt den Sipunculiden jegliche Segmentierung und meine Ergebnisse legen hier die M��glichkeit des Verlusts dieses Merkmals innerhalb der Anneliden bei den Sipunculiden nahe. Innerhalb der Mollusken wurden die Solenogastren bereits als Schwestergruppe aller rezenten Mollusken vorgeschlagen. Im Rahmen meiner Arbeit wurden von drei verschiedenen Solenogastren-Arten die ersten zuverl��ssigen 18S rRNA-Sequenzen ermittelt, und es zeigte sich, dass alle bisher ver��ffentlichten 18S-Sequenzen dieser Molluskenklasse h��chst unvollst��ndig oder fehlerhaft sind. rnRibosomale Proteine sind gute phylogenetische Marker und hier wurden die Auswahl und Anzahl dieser Gene f��r phylogenetische Analysen optimiert. ��ber Sonden-basierte Detektion wurde eine sampling-Strategie getestet, die im Vergleich mit standard-phylogenomischen Ans��tzen zuk��nftige molekulare Stammbaumrekonstruktionen mit gr����erem Taxonsampling erm��glicht.rn

3D-Strukturanalyse von Molluskenh��mocyaninen aus elektronenmikroskopischen Bildern

Diese Arbeit pr��sentiert die bislang h��chst aufgel��sten KryoEM-Strukturen f��r ein Cephalopoden h��mocyanin Dekamer (Nautilus pompilus H��mocyanin, NpH) und ein Gastropoden H��mocyanin Didekamer (keyhole limpet hemocyanin isoform 1). Durch die Methoden des ���molecular modelling��� und ���rigid-body-fiting��� wurde auch eine detaillierte Beschreibung beider Strukturen auf atomarem Niveau erstmalig m��glich. H��mocyanine sind kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine die frei gel��st in Blut zahlreicher Arthropoden und Mollusken vorkommen. Allgemein sind Molluskenh��mocyanine als Dekamere (Hohlzylinder aus 5 Untereinheiten-dimere) oder Didecamere (Zusammenlagerung von zwei Dekameren) zu finden. Durch Anlagerung weiterer Dekamere bilden sich teilweise tubul��re Multidekamere. H��mocyanine der Cephalopoden bestehen ausschlie��lich aus solit��ren Decameren. In Octopus und Nautilus bestehen die 10 Untereinheiten aus 7 funktionellen Einheiten(FU-a bis FU-g), wobei jede FU ein Sauerstoffmolek��l binden kann. FUs a-f bilden die Wand des ringf��rmigen Molek��ls und 10 Kopien der FU-g bilden einen sogenannten ���inneren Kragenkomplex���. Das im Rahmen dieser Arbeit erstelltes molekulares Modell von NpH kl��rt die Struktur des Dekamers vollst��ndig auf. Wir waren zum ersten Mal in der Lage das Untereinheiten-dimer, den Verlauf der Polypeptidkette und 15 unterschiedliche Kontaktstellen zwischen FUs zu identifizieren. Viele der inter-FU-Kontakte weisen Aminos��urenkonstellationen auf, die die Basis f��r die ��bertragung allosterischer Wechselwirkungen zwischen FUs darstellen k��nnten und Hinweise f��r den Aufbau der allosterische Einheit geben. Potentielle Bindungsstellen f��r N-glykosidische Zucker und bivalente Kationen wurden auch identifiziert. Im Gegensatz zu NpH, kommen Gastropoden H��mocyanine (inkl. KLH) haupts��chlich als Didekamere vor und der Kragenkomplex wird in diesem Fall aus 2 FUs gebildet (Fu-g und FU-h). Die zus��tzliche C'-terminale FU-h zeichnet sich durch eine spezielle Verl��ngerung von ~ 100 Aminos��uren aus. KLH stammt aus der kalifornische Schnecke Megathura crenulata und kommt seit mehreren Jahrzehnten als Immunostimulator in der immunologischen Grundlagenforschung und klinischen Anwendung zum Einsatz. KLH weist zwei Isoformen auf, KLH1 und KLH2. Das vorliegende Modell von KLH1 erlaubt die komplexe Architektur dieses riesigen Proteins in allen Details zu verstehen, sowie einen Vergleich zum dem NpH Dekamer auf atomare Ebene. Es wurde gefunden, dass das Untereinheitensegment a-b-c-d-e-f-g, sowie die equivalenten Kontaktstellen zwichen FUs stark konserviert sind. Dies deutet darauf hin, dass in Bezug auf die ��bertragung allosterische Signale zwischen benachbarten FUs, grundlegende Mechanismen in beiden Molek��len beibehalten wurden. Weiterhin, konnten die Verbindungen zwischen den zwei Dekameren ertsmalig identifiziert werden. Schlie��lich, wurde die Topologie der N-glycosidischen Zucker, welche f��r die immunologische Eigenschaften von KLH1 von gro��er Bedeutung sind, auch aufgekl��rt. Somit leistet die vorliegende Arbeit einen wesentlichen Schritt zum Verst��ndnis der Quart��rstruktur und Funktion der Molluskenh��mocyanine.rn

Entwicklung eines immunologischen Testsystems zur Detektion des marinen Biotoxins Domoins��ure

Domoins��ure ist ein von mehreren Arten mariner Kieselalgen der Gattung Pseudonitzschia produziertes Toxin, welches w��hrend einer Algenbl��te in Molluscen wie z.B. der Miesmuschel Mytilus sp. akkumuliert werden kann. Beim Verzehr solch kontaminierter Muscheln k��nnen sowohl beim Menschen als auch bei Tieren erhebliche Vergiftungserscheinungen auftreten, die von ��belkeit, Kopfschmerzen und Orientierungsst��rungen bis hin zum Verlust des Kurzzeitged��chtnisses (daher auch als amnesic shellfish poisoning bekannt) reichen und in einigen F��llen t��dlich enden. rnDie heute g��ngigen Methoden zur Detektion von Domoins��ure in Muschelgewebe wie Fl��ssigkeitschromatographie und Maus-Bioassay sind zeit- und kostenintensiv bzw. in Anbetracht einer Verbesserung des Tierschutzes aus ethischer Sicht nicht zu vertreten. Immunologische Testsysteme stellen eine erstrebenswerte Alternative dar, da sie sich durch eine vergleichsweise einfache Handhabung, hohe Selektivit��t und Reproduzierbarkeit auszeichnen.rnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein solches immunologisches Testsystem zur Detektion von Domoins��ure zu entwickeln. Hierf��r wurden zun��chst Antik��rper gegen Domoins��ure gewonnen, wof��r das Toxin wiederum als erstes ��ber die Carbodiimid-Methode an das Tr��gerprotein keyhole limpet hemocyanin (KLH) gekoppelt wurde, um eine Immunantwort ausl��sen zu k��nnen. Kaninchen und M��use wurden mit KLH-DO-Konjugaten nach vorgegebenen Immunisierungsschemata immunisiert. Nach vier Blutabnahmen zeigte das polyklonale Kaninchenantiserum eine ausreichend hohe Sensitivit��t zum Antigen; das nachfolgende Detektionssystem wurde mit Hilfe dieses polyklonalen Antik��rpers aufgebaut. Zwar ist es gegen Ende der Arbeit auch gelungen, einen spezifischen monoklonalen Antik��rper aus der Maus zu gewinnen, jedoch konnte dieser aus zeitlichen Gr��nden nicht mehr im Detektionssystem etabliert werden, was durchaus w��nschenswert gewesen w��re. rnWeiterhin wurde Domoins��ure im Zuge der Entwicklung eines neuartigen Testsystems an die Tr��gerproteine Ovalbumin, Trypsininhibitor und Casein sowie an Biotin konjugiert. Die Kopplungserfolge wurden im ELISA, Western Blot bzw. Dot Blot nachgewiesen. Die Ovalbumin-gekoppelte sowie die biotinylierte Domoins��ure dienten im Folgenden als die zu messenden Gr����en in den Detektionsassays- die in einer zu untersuchenden Probe vorhandende, kompetitierende Domoins��ure wurde somit indirekt nachgewiesen. rnDer zul��ssige H��chstwert f��r Domoins��ure liegt bei 20 ��g/g Muschelgewebe. Sowohl mit Biotin-DO als auch mit OVA-DO als den zu messenden Gr����en waren Domoins��urekonzentrationen unterhalb dieses Grenzwertes nachweisbar; allerdings erwies sich der Aufbau mit Biotin-DO um das ca. 20-fache empfindlicher als jener mit OVA-DO. rnDie in dieser Arbeit pr��sentierten Ergebnisse k��nnten als Grundlage zur Etablierung eines kommerzialisierbaren immunologischen Testsystems zur Detektion von Domoins��ure und anderen Biotoxinen dienen. Nach erfolgreicher Validierung w��re ein solches Testsystem in seiner Handhabung einfacher als die g��ngige Fl��ssigkeitschromatographie und besser reproduzierbar als der Maus-Bioassay.rn

Molekularbiologische Charakterisierung der beiden Untereinheiten des Mega-H��mocyanins der Schnecke Melanoides tuberculata

Bei dem 2010 von unserer Arbeitsgruppe entdeckten Mega-H��mocyanin handelt es sich um einen stark abgewandelten Typ des respiratorischen Proteins H��mocyanin, bestehend aus zwei flankierenden regul��ren Dekameren und einem zentralen Mega-Dekamer. Diese sind aus zwei immunologisch verschiedenen Untereinheiten mit ~400 bzw. ~550 kDa aufgebaut, die in unserer Arbeitsgruppe bereits proteinbiochemisch charakterisiert wurden. Im Zuge dieser Untersuchungen konnte zudem eine 3D-Rekonstruktion des Oligomers (13,5 MDa) mit einer Aufl��sung von 13�� erstellt werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufkl��rung der Prim��rstruktur beider Polypeptide bei der Schnecke Melanoides tuberculata (MtH). Es gelang, die cDNAs der beiden Untereinheiten vollst��ndig zu sequenzieren. Die zu typischen Dekameren assemblierende MtH400-Untereinheit umfasst 3445 Aminos��uren und besitzt eine theoretische Molekularmasse von 390 kDa. Nach dem Signalpeptid von 23 Aminos��uren L��nge folgen die f��r Gastropoden-H��mocyanine typischen funktionellen Einheiten FU-a bis FU-h. Insgesamt verf��gt die MtH400-Untereinheit ��ber sechs potentielle N-Glykosylierungsstellen. Die MtH550-Untereinheit, welche mit 10 Kopien das Mega-Dekamer bildet, umfasst 4999 Aminos��uren und besitzt eine theoretische Molekularmasse von 567 kDa. Damit handelt es sich bei dieser Untereinheit um die zweitgr����te jemals bei einem Protein detektierte Polypeptidkette. Die MtH550-Untereinheit besteht aus einem Signalpeptid von 20 Aminos��uren L��nge und den typischen Wand-FUs (FU-a bis FU-f). Daran anschlie��end folgen sechs weitere Varianten der FU-f (FU-f1 bis FU-f6). Die MtH550-Untereinheit verf��gt ��ber insgesamt zw��lf potentielle N-Glykosylierungsstellen. Anhand der ermittelten Prim��rstrukturdaten wird klar, dass der auff��llig vergr����erte Kragenbereich des Mega-Dekamers aus je 10 Kopien der FU-f1 bis FU-f6 besteht. Die ermittelten Sequenzdaten der beiden MtH-Untereinheiten weisen im Vergleich zu anderen H��mocyanin Sequenzen einige sehr charakteristische Indels sowie un��bliche N-Glykosylierungsstellen auf. Es war zudem m��glich, anhand einer molekularen Uhr den Entstehungszeitpunkt des Mega-H��mocyanins zu datieren (145 �� 35 MYA). Sowohl die Topologie als auch die berechneten Trennungszeitpunkte des an allen Verzweigungen gut unterst��tzten Stammbaums stimmen mit den bisher publizierten und auf H��mocyanindaten basierenden molekularen Uhren ��berein.

Charakterisierung und Expression zweier multimerer H��molympheproteine der Schnecke Biomphalaria glabrata

Die tropische S��sswasserschnecke Biomphalaria glabrata geh��rt zu der Familie der Planorbidae, welche als einziges Taxon der Gastropoden H��moglobin als Sauerstofftransportprotein verwenden. Als Zwischenwirt des Bilharzioseerregers Schistosoma mansoni ist B. glabrata von tropenmedizinischer Interesse. Das extrazellul��re BgHb zeigt sich mit einem Anteil von 95% als Hauptprotein in der H��molymphe. Dieses setzt sich aus Polypeptidketten mit je 240kDa zusammen. Diese wiederrum lassen sich in 13-H��m-Dom��nen und eine deutlich kleinere N-terminalen nicht H��m-Dom��ne untergliedern. Die Sequenzierung von zwei der drei Untereinheiten des BgHb (BgHb1, BgHb2) erm��glichte die rekombinante Expression ganzer Untereinheiten in Insektenzellen, und die Expression einiger BgHb2-Konstrukte in E. coli Zellen. Im Rahmen meiner Arbeit gelang es, BgHb1 in biologisch aktiver Form in Insektenzellen zu exprimieren. Das aus dem ��berstand der Insektenzellen aufgereinigte rekombinante BgHb1 zeigte eine immunologische Identit��t mit nativen BgHb. Strukturelle Analysen belegten zudem die Assemblierung des rekombinanten BgHb1 zu einer dem nativen Protein gleichenden Quart��rstruktur. Demnach konnte in meiner Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass eine einzelne Isoform in der Lage ist, zur Quart��rstruktur zu assemblieren. Zus��tzlich ergaben Sauerstoffbindungsanalysen, dass das rekombinante BgHb1 reversibel Sauerstoff binden kann.rnIn den restlichen 5% der B. glabrata H��molymphe zeigt sich ein rudiment��res H��mocyanin, welches f��r den Sauerstofftransport keine Rolle zu spielen scheint, und ein rosettenf��rmiges Protein, das es aufzukl��ren galt. Durch massenspektrometrische Analysen erhaltene Peptidfragmente zeigten eine hohe Sequenz��hnlichkeit zu den l��slichen Acetylcholin -Bindeproteinen anderer Mollusken. Diese AChBP zeigen eine hohe Sequenz��hnlichkeit zur Ligandenbindedom��ne von Rezeptoren der Cys-Loop-Proteinfamilie.rnDatenbankrecherchen deckten die Existenz zweier Isoformen auf

3D-ultrastructure, functions and stress responses of rhogocytes from the freshwater gastropods Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis

Rhogocytes, also termed ���pore cells���, exist free in the hemolymph or embedded in the connective tissue of different body parts of molluscs, notably gastropods. These unique cells can be round, elongated or irregularly shaped, and up to 30 ��m in diameter. Their hallmark is the so-called slit apparatus: i.e. pocket-like invaginations of the plasma membrane creating extracellular lacunae, bridged by cytoplasmic bars. These bars form distinctive slits of ca. 20 nm width. A slit diaphragm composed of proteins establishes a molecular sieve with holes of 20 x 20 nm. Different functions have been assigned to this special molluscan cell type, notably biosynthesis of the hemolymph respiratory protein hemocyanin. It has further been proposed, but not proven, that in the case of red-blooded snail species rhogocytes might synthesize the hemoglobin. However, the secretion pathway of these hemolymph proteins, and the functional role of the enigmatic slit apparatus remained unclear. Additionally proposed functions of rhogocytes, such as heavy metal detoxification or hemolymph protein degradation, are also not well studied. This work provides more detailed electron microscopical, histological and immunobiochemical information on the structure and function of rhogocytes of the freshwater snails Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis. By in situ hybridization on mantle tissues, it proves that B. glabrata rhogocytes synthesize hemoglobin and L. stagnalis rhogocytes synthesize hemocyanin. Hemocyanin is present, in endoplasmic reticulum lacunae and in vesicles, as individual molecules or pseudo-crystalline arrays. The first 3D reconstructions of rhogocytes are provided by means of electron tomography and show unprecedented details of the slit apparatus. A highly dense material in the cytoplasmic bars close to the diaphragmatic slits was shown, by immunogold labeling, to contain actin. By immunofluorescence microscopy, the protein nephrin was localized at the periphery of rhogocytes. The presence of both proteins in the slit apparatus supports the previous hypothesis, hitherto solely based on similarities of the ultrastructure, that the molluscan rhogocytes are phylogenetically related to mammalian podocytes and insect nephrocytes. A possible secretion pathway of respiratory proteins that includes a transfer mechanism of vesicles through the diaphragmatic slits is proposed and discussed. We also studied, by electron microscopy, the reaction of rhogocytes in situ to two forms of animal stress: deprivation of food and cadmium contamination of the tank water. Significant cellular reactions to both stressors were observed and documented. Notably, the slit apparatus surface and the number of electron-dense cytoplasmic vesicles increased in response to cadmium stress. Food deprivation led to an increase in hemocyanin production. These observations are also discussed in the framework of using such animals as potential environmental biomarkers.

Zur Karbonatsedimentologie, Biofazies und sequenzstratigraphischen Architektur eines fossilen Hochenergie-Schelfs aus dem Neogen der Algarve (Mioz��n, S��dportugal)

Die neogene Lagos-Portim��o Formation (Unter- bis Mittelmioz��n) bildet einen Teil der Steilk��ste der Algarve (S-Portugal) und besteht aus einer zyklischen Wechsellagerung von Karbonaten und Sand-steinen. Die vorliegende Arbeit bietet ein Modell zur sedimentologischen, faziellen und stratigraphischen Entwicklung dieser Einheit an. Basierend auf Profilen entlang der gesamten lateralen Erstreckung der Einheit wurden verschiedene Gel��nde- und Labormethoden angewandt, um ein Modell entwickeln zu k��nnen. Messungen des Sr87/86-Isotopenverh��ltnisses sollten Klarheit bez��glich der stratigraphischen Position bringen. Die laterale Korrelation der Profile erfolgte ��ber lithologische und fazielle Ansprachen. Unterst��tzend wurden einzelne Profile mit einem tragbaren Gammaray-Spektrometer gemessen. Es wurden vier Leithorizonte etabliert, die sich durch fazielle Merkmale und spezielle Fossilf��hrung defi-nieren lassen. Die Mikrofazies wurde qualitativ und quantitativ analysiert. Als statistisches Verfahren wurde unter anderem eine hierarchische Clusteranalyse durchgef��hrt, ��ber welche f��nf Biofaziestypen des warm-temperierten Klimabereichs unterschieden werden. Die Fossilf��hrung wird von Mollusken, Bryozoen und Rotalgen dominiert. Ausnahmen bilden stratigraphisch isolierte Vorkommen von kolo-nialen Korallen, die jedoch keine Riffk��rper aufbauen. Die Ergebnisse aller zuvor erw��hnten Untersuchungen deuten auf Ablagerungen eines nicht-tropischen Hochenergie-Schelfs hin. Sediment��re Zyklen sind oftmals unvollst��ndig, es treten Hartgr��nde und Auf-arbeitungs- bzw- Kondesationshorizonte auf. Die geochemische Altersdatierung weist Altersspr��nge und -inversionen auf. Ein Vergleich mit dem SW-australischen Schelf und dem von James et al. (1994) eingef��hrten Modell des shaved shelf bietet sich aufgrund der ��hnlichkeit der Sedimentgesteine und des ozeanographischen Settings an. Weiterhin werden zeitgleiche bzw. faziell ��hnliche Becken vergleichend diskutiert. Das Sedimentationsgeschehen der Lagos-Portim��o Formation wird ma��geblich durch eine halokinetisch bedingte unregelm����ige Subsidenz und Hebung beeinflu��t. Der Salzdom von Albufeira war w��hrend der Sedimentation der Einheit mehrfach in Bewegung. Rutschungspakete, Entlastungsspalten und Sanddikes zeugen davon. Die sequenzstratigraphische Interpretation bietet einen neuen Ansatz, in dem sie von Hochstand-Sandsteinen und Tiefstand-Karbonaten ausgeht.

Recent environmental change and trace metal pollution in World Heritage Bathurst Harbour, southwest Tasmania, Australia

Bathurst Harbour in World Heritage southwest Tasmania, Australia, is one of the world���s most pristine estuarine systems. At present there is a lack of data on pollution impacts or long-term natural variability in the harbor. A ca. 350-year-old 210Pb-dated sediment core was analysed for trace metals to track pollution impacts from local and long-range sources. Lead and antimony increased from AD 1870 onwards, which likely reflects remote (i.e. mainland Australian and global) atmospheric pollution sources. Variability in the concentrations of copper and zinc closely followed the history of mining activities in western Tasmania, which began in the AD 1880s. Tin was generally low throughout the core, except for a large peak in AD 1989 �� 0.5 years, which may be a consequence of input from a local small-scale alluvial tin mine. Changes in diatom assemblages were also investigated. The diatom flora was composed mostly of planktonic freshwater and benthic brackish-marine species, consistent with stratified estuarine conditions. Since mining began, however, an overall decrease in the proportion of planktonic to benthic taxa occurred, with the exception of two distinct peaks in the twentieth century that coincided with periods of high rainfall. Despite the region���s remoteness, trace metal analyses revealed evidence of atmospheric pollution from Tasmanian and possibly longer-range mining activities. This, together with recent low rainfall, appears to have contributed to altering the diatom assemblages in one of the most pristine temperate estuaries in the world.