Identification des peptides du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I par spectrométrie de masse

L’immunité adaptive et la discrimination entre le soi et le non-soi chez les vertébrés à mâchoire reposent sur la présentation de peptides par les récepteurs d’histocompatibilité majeur de classe I. Les peptides antigéniques, présentés par les molécules du complexe d’histocompatibilité (CMH), sont scrutés par les lymphocytes T CD8 pour une réponse immunitaire appropriée. Le répertoire des peptides du CMH de classe I, aussi appelé immunopeptidome, est généré par la dégradation protéosomale des protéines endogènes, et a un rôle essentiel dans la régulation de l’immunité cellulaire. La composition de l’immunopeptidome dépend du type de cellule et peut présenter des caractéristiques liées à des maladies comme le cancer. Les peptides antigéniques peuvent être utilisés à des fins immunothérapeutiques notamment dans le traitement voire la prévention de certains cancers. La spectrométrie de masse est un outil de choix pour l’identification, le séquençage et la caractérisation de ces peptides. Cependant, la composition en acides aminés, la faible abondance et la diversité de ces peptides compliquent leur détection et leur séquençage. Nous avons développé un programme appelé StatPeaks qui permet de calculer un certains nombres de statistiques relatives à la fragmentation des peptides. À l’aide de ce programme, nous montrons sans équivoque que les peptides du CMH classe I, en mode de fragmentation par dissociation induite par collision (CID), fragmentent très différemment des peptides trypsiques communément utilisés en protéomique. Néanmoins, la fragmentation par décomposition induite par collision à plus haute énergie (HCD) proposée par le spectromètre LTQ-Orbitrap Velos améliore la fragmentation et fournit une haute résolution qui permet d’obtenir une meilleure confiance dans l’identification des peptides du CMH de classe I. Cet avantage permet d’effectuer le séquençage de novo pour identifier les variants polymorphes qui ne sont normalement pas identifiés par les recherches utilisant des bases de données. La comparaison des programmes de séquençage Lutefisk, pepNovo, pNovo, Vonode et Peaks met en évidence que le dernier permet d’identifier un plus grand nombre de peptides du CMH de classe I. Ce programme est intégré dans une chaîne de traitement de recherche d’antigènes mineurs d’histocompatibilité. Enfin, une base de données contenant les informations spectrales de plusieurs centaines de peptides du CMH de classe I accessible par Internet a été développée.

Inhibition du pathogène des salmonidés Saprolegnia parasitica par des bactéries aquatiques

Les maladies constituent présentement la cause la plus importante de perte économique en aquaculture moderne. Chez certaines espèces, notamment les salmonidés (Oncorhynchus sp. et Salmo sp.), on rapporte des pertes annuelles atteignant cinquante pour cent de la production. À l’heure actuelle, les infections fongiques occupent le second rang derrière les maladies bactériennes en fonction de leur importance économique. Ces poissons sont particulièrement vulnérables à une infection fongique causée par Saprolegnia sp. qui infecte habituellement les oeufs morts. Le saprophyte ubiquitaire se propage ensuite aux oeufs sains et aux individus matures. Malheureusement, le traitement efficace de cette infection, souvent primaire et parfois secondaire, est de plus en plus difficile en raison de nouvelles réglementations restrictives entourant le vert de malachite. Jadis, ce colorant constituait le fongicide le plus efficace dans la lutte contre la saprolégniose, mais son potentiel cancérigène en limite maintenant l’utilisation. Jusqu'à présent, aucun traitement disponible n’est aussi efficace que le vert de malachite pour le contrôle de la saprolégniose. Récemment, nous sommes parvenus à isoler trois bactéries capables d’inhiber la croissance de Saprolegnia sp. in vitro. Ces trois Pseudomonas fluorescens proviennent d’une pisciculture dans laquelle survenaient des cas d’infections à Saprolegnia parasitica. En poussant la caractérisation de l’activité grâce à des analyses de chromatographie liquide haute performance et de spectrométrie de masse, nous avons réussi à isoler et à identifier la molécule responsable. L’acide phénazine-1-carboxylique (PCA), sécrété par deux de nos trois souches, cause l’inhibition de la croissance de Saprolegnia.

Systems biology of the human MHC class I immunopeptidome

Le système de différenciation entre le « soi » et le « non-soi » des vertébrés permet la détection et le rejet de pathogènes et de cellules allogéniques. Il requiert la surveillance de petits peptides présentés à la surface cellulaire par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I). Les molécules du CMH I sont des hétérodimères composés par une chaîne lourde encodée par des gènes du CMH et une chaîne légère encodée par le gène β2-microglobuline. L’ensemble des peptides est appelé l’immunopeptidome du CMH I. Nous avons utilisé des approches en biologie de systèmes pour définir la composition et l’origine cellulaire de l’immunopeptidome du CMH I présenté par des cellules B lymphoblastoïdes dérivés de deux pairs de fratries avec un CMH I identique. Nous avons découvert que l’immunopeptidome du CMH I est spécifique à l’individu et au type cellulaire, qu’il dérive préférentiellement de transcrits abondants, est enrichi en transcrits possédant d’éléments de reconnaissance par les petits ARNs, mais qu’il ne montre aucun biais ni vers les régions génétiques invariables ni vers les régions polymorphiques. Nous avons également développé une nouvelle méthode qui combine la spectrométrie de masse, le séquençage de nouvelle génération et la bioinformatique pour l’identification à grand échelle de peptides du CMH I, dont ceux résultants de polymorphismes nucléotidiques simples non-synonymes (PNS-ns), appelés antigènes mineurs d’histocompatibilité (AMHs), qui sont les cibles de réponses allo-immunitaires. La comparaison de l’origine génomique de l’immunopeptidome de soeurs avec un CMH I identique a révélé que 0,5% des PNS-ns étaient représentés dans l’immunopeptidome et que 0,3% des peptides du CMH I seraient immunogéniques envers une des deux soeurs. En résumé, nous avons découvert des nouveaux facteurs qui modèlent l’immunopeptidome du CMH I et nous présentons une nouvelle stratégie pour l’indentification de ces peptides, laquelle pourrait accélérer énormément le développement d’immunothérapies ciblant les AMHs.

Étude de la cinétique de biomarqueurs d’exposition à la perméthrine dans des conditions d’exposition réelles chez les travailleurs agricoles au Québec

La perméthrine fait partie de la famille des pyréthrinoïdes qui sont abondamment utilisés en agriculture. Le but de cette étude était d'obtenir des données sur la cinétique des biomarqueurs d'exposition à la perméthrine en condition réelle d'exposition chez les travailleurs agricoles. Douze travailleurs (un applicateur, un superviseur et dix cueilleurs) exposés à la perméthrine dans le cadre de leur emploi ont été recrutés dans une ferme maraichère de la Montérégie (Québec). Ils ont fourni toutes leurs urines sur une période de trois jours suivant le début des travaux dans un champ traité. Les trois principaux métabolites de la perméthrine, l'acide cis-/trans-3-(2,2-dichlorovinyle)-2,2-diméthylecyclopropane carboxylique (cis-/trans-DCCA) et l'acide 3-phénoxybenzoïque (3-PBA) ont été analysés par chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse à temps de vol. Pour l'applicateur, une augmentation progressive des valeurs d'excrétion a été observée avec un pic unique atteint environ 30 h après le début de l'exposition d'une durée de 3,5 h suivi d'une élimination avec une demi-vie de 8 h. Pour le superviseur et l'un des cueilleurs, les profils d'excrétion de trans-DCCA et de 3-PBA étaient compatibles avec de multiples entrées dans la zone traitée pendant la période d'échantillonnage accompagné d'une élimination rapide entre les épisodes d'exposition.L'applicateur aurait été exposé indirectement par contact main-bouche, alors que les autres travailleurs auraient été exposés par la voie cutanée. Pour une surveillance biologique adéquate, nous recommandons de mesurer deux biomarqueurs de la perméthrine, soit le trans-DCCA et le 3-PBA et de prendre un minimum de trois échantillons urinaires, un avant et deux pendant ou suivant la période d'exposition.

Evaluation of multiple reaction monitoring cubed for the analysis of tachykinin related peptides in rat spinal cord using a hybrid triple quadrupole–linear ion trap mass spectrometer

Targeted peptide methods generally use HPLC-MS/MRM approaches. Although dependent on the instrumental resolution, interferences may occur while performing analysis of complex biological matrices. HPLC-MS/MRM3 is a technique, which provides a significantly better selectivity, compared with HPLC-MS/MRM assay. HPLC-MS/MRM3 allows the detection and quantitation by enriching standard MRM with secondary product ions that are generated within the linear ion trap. Substance P (SP) and neurokinin A (NKA) are tachykinin peptides playing a central role in pain transmission. The objective of this study was to verify whether HPLC-HPLCMS/ MRM3 could provide significant advantages over a more traditional HPLC-MS/MRM assay for the quantification of SP and NKA in rat spinal cord. The results suggest that reconstructed MRM3 chromatograms display significant improvements with the nearly complete elimination of interfering peaks but the sensitivity (i.e. signal-to-noise ratio) was severely reduced. The precision (%CV) observed was between 3.5% - 24.1% using HPLC-MS/MRM and in the range of 4.3% - 13.1% with HPLC-MS/MRM3, for SP and NKA. The observed accuracy was within 10% of the theoretical concentrations tested. HPLC-MS/MRM3 may improve the assay sensitivity to detect difference between samples by reducing significantly the potential of interferences and therefore reduce instrumental errors.

Nouvelles stratégies pour l’analyse des cyanotoxines par spectrométrie de masse

Les cyanobactéries ont une place très importante dans les écosystèmes aquatiques et un nombre important d’espèces considéré comme nuisible de par leur production de métabolites toxiques. Ces cyanotoxines possèdent des propriétés très variées et ont souvent été associées à des épisodes d’empoisonnement. L’augmentation des épisodes d’efflorescence d’origine cyanobactériennes et le potentiel qu’ils augmentent avec les changements climatiques a renchéri l’intérêt de l’étude des cyanobactéries et de leurs toxines. Considérant la complexité chimique des cyanotoxines, le développement de méthodes de détection simples, sensibles et rapides est toujours considéré comme étant un défi analytique. Considérant ces défis, le développement de nouvelles approches analytiques pour la détection de cyanotoxines dans l’eau et les poissons ayant été contaminés par des efflorescences cyanobactériennes nuisibles a été proposé. Une première approche consiste en l’utilisation d’une extraction sur phase solide en ligne couplée à une chromatographie liquide et à une détection en spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS) permettant l’analyse de six analogues de microcystines (MC), de l’anatoxine (ANA-a) et de la cylindrospermopsine (CYN). La méthode permet une analyse simple et rapide et ainsi que la séparation chromatographique d’ANA-a et de son interférence isobare, la phénylalanine. Les limites de détection obtenues se trouvaient entre 0,01 et 0,02 μg L-1 et des concentrations retrouvées dans des eaux de lacs du Québec se trouvaient entre 0,024 et 36 μg L-1. Une deuxième méthode a permis l’analyse du b-N-méthylamino-L-alanine (BMAA), d’ANA-a, de CYN et de la saxitoxine (STX) dans les eaux de lac contaminés. L’analyse de deux isomères de conformation du BMAA a été effectuée afin d’améliorer la sélectivité de la détection. L’utilisation d’une SPE manuelle permet la purification et préconcentration des échantillons et une dérivatisation à base de chlorure de dansyle permet une chromatographie simplifiée. L’analyse effectuée par LC couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et des limites de détections ont été obtenues entre 0,007 et 0,01 µg L-1. Des échantillons réels ont été analysés avec des concentrations entre 0,01 et 0,3 µg L-1 permettant ainsi la confirmation de la présence du BMAA dans les efflorescences de cyanobactéries au Québec. Un deuxième volet du projet consiste en l’utilisation d’une technologie d’introduction d’échantillon permettant des analyses ultra-rapides (< 15 secondes/échantillons) sans étape chromatographique, la désorption thermique à diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et à la spectrométrie de masse (MS). Un premier projet consiste en l’analyse des MC totales par l’intermédiaire d’une oxydation de Lemieux permettant un bris de la molécule et obtenant une fraction commune aux multiples congénères existants des MC. Cette fraction, le MMPB, est analysée, après une extraction liquide-liquide, par LDTD-APCI-MS/MS. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et des concentrations entre 1 et 425 µg L-1 ont été trouvées dans des échantillons d’eau de lac contaminés du Québec. De plus, une analyse en parallèle avec des étalons pour divers congénères des MC a permis de suggérer la possible présence de congénères ou d’isomères non détectés. Un deuxième projet consiste en l’analyse directe d’ANA-a par LDTD-APCI-HRMS pour résoudre son interférence isobare, la phénylalanine, grâce à la détection à haute résolution. La LDTD n’offre pas de séparation chromatographique et l’utilisation de la HRMS permet de distinguer les signaux d’ANA-a de ceux de la phénylalanine. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et la méthode a été appliquée sur des échantillons réels d’eau avec un échantillon positif en ANA-a avec une concentration de 0,21 µg L-1. Finalement, à l’aide de la LDTD-APCI-HRMS, l’analyse des MC totales a été adaptée pour la chair de poisson afin de déterminer la fraction libre et liée des MC et comparer les résultats avec des analyses conventionnelles. L’utilisation d’une digestion par hydroxyde de sodium précédant l’oxydation de Lemieux suivi d’une purification par SPE a permis d’obtenir une limite de détection de 2,7 µg kg-1. Des échantillons de poissons contaminés ont été analysés, on a retrouvé des concentrations en MC totales de 2,9 et 13,2 µg kg-1 comparativement aux analyses usuelles qui avaient démontré un seul échantillon positif à 2 µg kg-1, indiquant la possible présence de MC non détectés en utilisant les méthodes conventionnelles.

L’étude des stratégies de séparations préparatrices de protéines par électrophorèse capillaire

La protéomique est un sujet d'intérêt puisque l'étude des fonctions et des structures de protéines est essentiel à la compréhension du fonctionnement d'un organisme donné. Ce projet se situe dans la catégorie des études structurales, ou plus précisément, la séquence primaire en acides aminés pour l’identification d’une protéine. La détermination des protéines commence par l'extraction d'un mélange protéique issu d'un tissu ou d'un fluide biologique pouvant contenir plus de 1000 protéines différentes. Ensuite, des techniques analytiques comme l’électrophorèse en gel polyacrylamide en deux dimensions (2D-SDS-PAGE), qui visent à séparer ce mélange en fonction du point isoélectrique et de la masse molaire des protéines, sont utilisées pour isoler les protéines et pour permettre leur identification par chromatographie liquide and spectrométrie de masse (MS), typiquement. Ce projet s'inspire de ce processus et propose que l'étape de fractionnement de l'extrait protéique avec la 2D-SDS-PAGE soit remplacé ou supporté par de multiples fractionnements en parallèle par électrophorèse capillaire (CE) quasi-multidimensionnelle. Les fractions obtenues, contenant une protéine seule ou un mélange de protéines moins complexe que l’extrait du départ, pourraient ensuite être soumises à des identifications de protéines par cartographie peptidique et cartographie protéique à l’aide des techniques de séparations analytiques et de la MS. Pour obtenir la carte peptidique d'un échantillon, il est nécessaire de procéder à la protéolyse enzymatique ou chimique des protéines purifiées et de séparer les fragments peptidiques issus de cette digestion. Les cartes peptidiques ainsi générées peuvent ensuite être comparées à des échantillons témoins ou les masses exactes des peptides enzymatiques sont soumises à des moteurs de recherche comme MASCOT™, ce qui permet l’identification des protéines en interrogeant les bases de données génomiques. Les avantages exploitables de la CE, par rapport à la 2D-SDS-PAGE, sont sa haute efficacité de séparation, sa rapidité d'analyse et sa facilité d'automatisation. L’un des défis à surmonter est la faible quantité de masse de protéines disponible après analyses en CE, due partiellement à l'adsorption des protéines sur la paroi du capillaire, mais due majoritairement au faible volume d'échantillon en CE. Pour augmenter ce volume, un capillaire de 75 µm était utilisé. Aussi, le volume de la fraction collectée était diminué de 1000 à 100 µL et les fractions étaient accumulées 10 fois; c’est-à-dire que 10 produits de séparations étaient contenu dans chaque fraction. D'un autre côté, l'adsorption de protéines se traduit par la variation de l'aire d'un pic et du temps de migration d'une protéine donnée ce qui influence la reproductibilité de la séparation, un aspect très important puisque 10 séparations cumulatives sont nécessaires pour la collecte de fractions. De nombreuses approches existent pour diminuer ce problème (e.g. les extrêmes de pH de l’électrolyte de fond, les revêtements dynamique ou permanent du capillaire, etc.), mais dans ce mémoire, les études de revêtement portaient sur le bromure de N,N-didodecyl-N,N-dimethylammonium (DDAB), un surfactant qui forme un revêtement semi-permanent sur la paroi du capillaire. La grande majorité du mémoire visait à obtenir une séparation reproductible d'un mélange protéique standard préparé en laboratoire (contenant l’albumine de sérum de bovin, l'anhydrase carbonique, l’α-lactalbumine et la β-lactoglobulin) par CE avec le revêtement DDAB. Les études portées sur le revêtement montraient qu'il était nécessaire de régénérer le revêtement entre chaque injection du mélange de protéines dans les conditions étudiées : la collecte de 5 fractions de 6 min chacune à travers une séparation de 30 min, suivant le processus de régénération du DDAB, et tout ça répété 10 fois. Cependant, l’analyse en CE-UV et en HPLC-MS des fractions collectées ne montraient pas les protéines attendues puisqu'elles semblaient être en-dessous de la limite de détection. De plus, une analyse en MS montrait que le DDAB s’accumule dans les fractions collectées dû à sa désorption de la paroi du capillaire. Pour confirmer que les efforts pour recueillir une quantité de masse de protéine étaient suffisants, la méthode de CE avec détection par fluorescence induite par laser (CE-LIF) était utilisée pour séparer et collecter la protéine, albumine marquée de fluorescéine isothiocyanate (FITC), sans l'utilisation du revêtement DDAB. Ces analyses montraient que l'albumine-FITC était, en fait, présente dans la fraction collecté. La cartographie peptidique a été ensuite réalisée avec succès en employant l’enzyme chymotrypsine pour la digestion et CE-LIF pour obtenir la carte peptidique.

Développement d’une méthode SPRi-MALDI-IMS pour la quantification et l’identification des protéines dans des empreintes de tissus biologiques

Plusieurs tests médicaux, comme celui du dépistage du cancer du sein, se basent sur l’observation de section tissulaire sous un microscope. Ces tests se basent sur l’interprétation d’un spécialiste et les résultats peuvent varier d’un expert à un autre dû la subjectivité des observations. L’utilisation d’une technique analytique offrant une quantification et une identification de cibles moléculaires dans une section tissulaire permettrait aux experts de produire des diagnostics plus objectifs et diminuerait possiblement le nombre de faux diagnostics. Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur le développement d’une technique SPRi-MALDI-IMS permettant l’imagerie en deux dimensions de protéines contenues dans une section tissulaire. La MALDI-IMS est la technique de choix pour l’imagerie de biomolécules dans les sections tissulaires. Par contre, elle ne parvient pas à elle seule à quantifier de façon absolue le matériel adsorbé à la surface. Donc, le couplage de la MALDI-IMS avec la SPRi permet la quantification absolue de protéines en deux dimensions et crée une technique répondant aux besoins des experts médicaux. Pour ce faire, nous avons étudié, l’effet de la chimie de surface sur la nature et la quantité de matériel adsorbé à la surface du capteur. De plus, la cinétique de transfert des protéines du tissu vers le capteur a dû être optimisée afin de produire des empreintes correspondant au tissu d’origine, afin d’atteindre la gamme dynamique des instruments SPRi et MALDI-IMS. La technique résultante de ces optimisations permet d’obtenir les premières images quantitatives et qualitatives de protéines en deux dimensions d’une seule section tissulaire.

Développement d’outils analytiques pour la détection de biomolécules directement dans des fluides sanguins

Cette thèse porte sur le développement de biocapteurs basés sur la technique de résonance des plasmons de surface (SPR) pour effectuer des analyses directement dans un fluide sanguin n’ayant subi aucune purification ou dilution. L’ensemble des biocapteurs discutés exploiteront un instrument SPR portable développé dans le groupe du professeur Masson. Le premier volet de la thèse portera sur le processus d’interférence lié à l’adsorption non spécifique du sérum à la surface du capteur. L’analyse des biomolécules adsorbées sera effectuée en combinant la SPR à la spectrométrie de masse. Les informations obtenues seront exploitées pour la construction de biocapteurs adaptés à l’analyse en milieu sanguin. Un premier biocapteur développé ciblera la protéine antigène prostatique spécifique (APS) contenue dans le sérum servant de biomarqueur pour dépister le cancer de la prostate. Pour détecter les faibles concentrations de cette protéine directement dans le sérum, un matériel plasmonique microstructuré sera utilisé pour amplifier les signaux obtenus et sera recouvert d’une monocouche peptidique minimisant l’adsorption non spécifique du sérum. L’instrument SPR aura été adapté pour permettre également la détection simultanée de fluorescence. Un test ELISA sera ainsi effectué en parallèle du test SPR. Chacune des techniques fournira un contrôle pour la deuxième, tout en permettant de détecter le biomarqueur au niveau requis pour dépister la maladie. La combinaison des deux méthodes permettra aussi d’élargir la gamme dynamique du test de dépistage. Pour terminer, l’instrument SPR portable sera utilisé dans le cadre de détection de petites biomolécules ayant un potentiel thérapeutique directement dans un échantillon de sang. Des peptides ayant une activité anti-athérosclérotique pourront ainsi être détectés à même un échantillon de sang ni purifié ni dilué, et ce à des concentrations de l’ordre du micromolaire. Une modification de la microfluidique via l’introduction d’une membrane poreuse au cœur de celle-ci sera la clé permettant d’effectuer de telles analyses. La présente thèse met de l’avant de nouvelles stratégies et des modifications instrumentales permettant d’analyser des protéines et des petites molécules directement dans un échantillon non purifié de sérum ou de sang. Les modifications apportées au système fluidique, à l’instrument SPR et au niveau du biocapteur employé permettront d’effectuer des biodétections dans des matrices aussi complexes que les fluides sanguins. Les présents travaux mettent en lumière la capacité d’un instrument SPR/fluorescence portable à faire en 12 minutes la biodétection d’un marqueur du cancer de la prostate directement dans un échantillon de sérum. Finalement, on rapporte ici un des premiers articles où un biocapteur SPR est utilisé à même un échantillon de sang non-purifié pour faire des biodétections.

Quantitative proteomics methods for the analysis of histone post-translational modifications

Les histones sont des protéines nucléaires hautement conservées chez les cellules des eucaryotes. Elles permettent d’organiser et de compacter l’ADN sous la forme de nucléosomes, ceux-ci representant les sous unités de base de la chromatine. Les histones peuvent être modifiées par de nombreuses modifications post-traductionnelles (PTMs) telles que l’acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Ces modifications jouent un rôle essentiel dans la réplication de l’ADN, la transcription et l’assemblage de la chromatine. L’abondance de ces modifications peut varier de facon significative lors du developpement des maladies incluant plusieurs types de cancer. Par exemple, la perte totale de la triméthylation sur H4K20 ainsi que l’acétylation sur H4K16 sont des marqueurs tumoraux spécifiques a certains types de cancer chez l’humain. Par conséquent, l’étude de ces modifications et des événements determinant la dynamique des leurs changements d’abondance sont des atouts importants pour mieux comprendre les fonctions cellulaires et moléculaires lors du développement de la maladie. De manière générale, les modifications des histones sont étudiées par des approches biochimiques telles que les immuno-buvardage de type Western ou les méthodes d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Cependant, ces approches présentent plusieurs inconvénients telles que le manque de spécificité ou la disponibilité des anticorps, leur coût ou encore la difficulté de les produire et de les valider. Au cours des dernières décennies, la spectrométrie de masse (MS) s’est avérée être une méthode performante pour la caractérisation et la quantification des modifications d’histones. La MS offre de nombreux avantages par rapport aux techniques traditionnelles. Entre autre, elle permet d’effectuer des analyses reproductibles, spécifiques et facilite l’etude d’un large spectre de PTMs en une seule analyse. Dans cette thèse, nous présenterons le développement et l’application de nouveaux outils analytiques pour l’identification et à la quantification des PTMs modifiant les histones. Dans un premier temps, une méthode a été développée pour mesurer les changements d’acétylation spécifiques à certains sites des histones. Cette méthode combine l’analyse des histones intactes et les méthodes de séquençage peptidique afin de déterminer les changements d’acétylation suite à la réaction in vitro par l’histone acétyltransférase (HAT) de levure Rtt109 en présence de ses chaperonnes (Asf1 ou Vps75). Dans un second temps, nous avons développé une méthode d’analyse des peptides isomériques des histones. Cette méthode combine la LC-MS/MS à haute résolution et un nouvel outil informatique appelé Iso-PeptidAce qui permet de déconvoluer les spectres mixtes de peptides isomériques. Nous avons évalué Iso-PeptidAce avec un mélange de peptides synthétiques isomériques. Nous avons également validé les performances de cette approche avec des histones isolées de cellules humaines érythroleucémiques (K562) traitées avec des inhibiteurs d’histones désacétylases (HDACi) utilisés en clinique, et des histones de Saccharomyces cerevisiae liées au facteur d’assemblage de la chromatine (CAF-1) purifiées par chromatographie d’affinité. Enfin, en utilisant la méthode présentée précédemment, nous avons fait une analyse approfondie de la spécificité de plusieurs HATs et HDACs chez Schizosaccharomyces pombe. Nous avons donc déterminé les niveaux d’acétylation d’histones purifiées à partir de cellules contrôles ou de souches mutantes auxquelles il manque une HAT ou HDAC. Notre analyse nous a permis de valider plusieurs cibles connues des HATs et HDACs et d’en identifier de nouvelles. Nos données ont également permis de définir le rôle des différentes HATs et HDACs dans le maintien de l’équilibre d’acétylation des histones. Dans l’ensemble, nous anticipons que les méthodes décrites dans cette thèse permettront de résoudre certains défis rencontrés dans l’étude de la chromatine. De plus, ces données apportent de nouvelles connaissances pour l’élaboration d’études génétiques et biochimiques utilisant S. pombe.

The role of protein convertases in bigdynorphin and dynorphin A metabolic pathway

Les dynorphines sont des neuropeptides importants avec un rôle central dans la nociception et l’atténuation de la douleur. De nombreux mécanismes régulent les concentrations de dynorphine endogènes, y compris la protéolyse. Les Proprotéines convertases (PC) sont largement exprimées dans le système nerveux central et clivent spécifiquement le C-terminale de couple acides aminés basiques, ou un résidu basique unique. Le contrôle protéolytique des concentrations endogènes de Big Dynorphine (BDyn) et dynorphine A (Dyn A) a un effet important sur la perception de la douleur et le rôle de PC reste à être déterminée. L'objectif de cette étude était de décrypter le rôle de PC1 et PC2 dans le contrôle protéolytique de BDyn et Dyn A avec l'aide de fractions cellulaires de la moelle épinière de type sauvage (WT), PC1 -/+ et PC2 -/+ de souris et par la spectrométrie de masse. Nos résultats démontrent clairement que PC1 et PC2 sont impliquées dans la protéolyse de BDyn et Dyn A avec un rôle plus significatif pour PC1. Le traitement en C-terminal de BDyn génère des fragments peptidiques spécifiques incluant dynorphine 1-19, dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7 et Dyn A génère les fragments dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7. Ils sont tous des fragments de peptides associés à PC1 ou PC2. En plus, la protéolyse de BDyn conduit à la formation de Dyn A et Leu-Enk, deux peptides opioïdes importants. La vitesse de formation des deux est réduite de manière significative dans les fractions cellulaires de la moelle épinière de souris mutantes. En conséquence, l'inhibition même partielle de PC1 ou PC2 peut altérer le système opioïde endogène.

Quasilocal density functional theory and its application within the extended Thomas-Fermi approximation

In this paper we propose a generalization of the density functional theory. The theory leads to single-particle equations of motion with a quasilocal mean-field operator, which contains a quasiparticle position-dependent effective mass and a spin-orbit potential. The energy density functional is constructed using the extended Thomas-Fermi approximation and the ground-state properties of doubly magic nuclei are considered within the framework of this approach. Calculations were performed using the finite-range Gogny D1S forces and the results are compared with the exact Hartree-Fock calculations

Untersuchung zum Phosphorylierungsstatus der katalytischen Untereinheit der PKA mittels proteomischer Techniken

ZUSAMMENFASSUNG: Das Phosphorylierungsmuster eines Proteins ist kein statischer Zustand, sondern vielmehr ein dynamischer Status, den es in der modernen funktionellen (Phospho-) Proteomik und Analytik abzubilden gilt. Klassischerweise erfolgt der Nachweis der Proteinphosphorylierung auf Peptid-Ebene mittels MS/MS Sequenzierung. Diese Standardmethode der shotgun Phosphoproteomanalytik vernachlässigt jedoch wegen den in LC MS/MS Analysen oftmals schwer detektierbaren Phosphopeptiden gerade den variablen und oftmals nur geringen Phosphorylierungsgrad vieler Phosphorylierungsstellen (P-Stellen). Mittels phosphospezifischer Anreicherungsstrategien und MS/MS Sequenzierung konnten an der Modellkinase PKA-Cα nach rekombinanter Expression in E. coli insgesamt acht P-Stellen identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad wurde in Kooperation mit Dr. J. Seidler über quantitative Signalintensitätsmessungen bestimmt und zeigte eine nahezu vollständige Phosphorylierung von pS10, pS139, pT197 und pS338, während der Phosphorylierungsgrad für pS34, pS53, pS65 und pS259 zwischen <5 und 45 % variierte. Neben der Quantifizierung der P-Stellen wurde auch das Auftreten und die Verteilung definierter Phosphoformen der PKA-Cα untersucht und deren Abhängigkeit von der primären Aminosäureabfolge, dem Auftreten von zusätzlichen Modifikationen sowie den gewählten Expressions- und Reinigungsbedingungen aufgezeigt. Endogene, aus Säugergewebe isolierte PKA-Cα wies nur eine einzige Phosphoform mit den P-Stellen pT197 und pS338 auf. Auch in vitro autophosphorylierte rekombinante PKA-Cα, die zuvor dephosphoryliert worden war, wies eine zweifach modifizierte Phosphoform auf. Im Vergleich zum endogenen Protein ließ sich dieses Protein an S10 und S338 exzessiv phosphorylieren, wohingegen an T197 keine Autophosphorylierung nachzuweisen war. Das Ausbleiben weiterer Phosphorylierungen stellt in Frage, ob die Hyperphosphorylierung in E. coli ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozessen beruht, was anhand einer nicht phosphorylierten, katalytisch inaktiven Variante von PKA-Cα (PKA-Cα K72H) vermutet wurde. Im Hinblick auf die funktionellen P-Stellen pT197 und pS338 erfordert diese Entdeckung sowie der unabhängige Nachweis, dass zellfrei exprimierte PKA-Cα nur an S338 phosphoryliert ist, eine Modifizierung des sequenziellen Vorhersagemodells, wonach die Phosphorylierung an T197 eine zwingende Voraussetzung für die nachfolgende Phosphorylierung an S338 ist. Ferner konnte über phosphomimetische Mutagenese die Funktionalität der Phosphorylierung an S53 innerhalb der glycinreichen Schleife der PKA-Cα und somit ein potenzieller Weg zur Regulation der enzymatischen Aktivität gezeigt werden. Ein weiterer möglicher upstream Regulator von PKA-Cα ist die Proteinphosphatase 5, die in der Lage war, die bislang als phosphatasestabil beschriebene P Stelle pT197 in vitro zu dephosphorylieren. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der Phosphorylierungszustand eines Proteins von zahlreichen internen und externen Faktoren abhängt – eine Tatsache, die gerade für rekombinante Proteine, insbesondere enzymatisch aktive Kinasen, oft vernachlässigt wurde. Daher müssen auch in der shotgun Phosphoproteomanalytik P-Stellen nicht mehr nur identifiziert und quantifiziert werden, sondern die resultierenden Proteinphosphoformen differenziert auch in ihrem physiologischen Kontext beschrieben werden.

Selbstassemblierte Monolagen und magnetisch strukturierte Submonolagen mit dia- und paramagnetischen Molekülen sowie Einzelmolekülmagneten auf Phthalocyanin- und Subphthalocyanin-Basis

Mit dieser Arbeit wurde die Selbstassemblierung von dia- und paramagnetischen Molekülen sowie Einzelmolekülmagneten auf Goldsubstraten und magnetisch strukturierten Substraten untersucht. Dazu wurden drei verschiedene Klassen an Phthalocyaninderivaten verwendet: Diamagnetische Subphthalocyanine, paramagnetische Phthalocyaninatometalle und Diphthalocyaninatolanthanidkomplexe. Alle synthetisierten Verbindungen sind peripher thioethersubstituiert. Die Alkylketten (a: n-C8H17, b: n-C12H25) vermitteln die Löslichkeit in vielen organischen Solventien und sorgen für eine geordnete Assemblierung auf einer Oberfläche, wobei die Bindung auf Gold hauptsächlich über die Schwefelatome stattfindet. Die aus Lösung abgeschiedenen selbstassemblierten Monolagen wurden mit XPS, NEXAFS-Spektroskopie und ToF-SIMS untersucht. Bei der Selbstassemblierung auf magnetisch strukturierten Substraten stehen die Moleküle unter dem Einfluss magnetischer Streufelder und binden bevorzugt nur in bestimmten Bereichen. Die gebildeten Submonolagen wurden zusätzlich mit X-PEEM untersucht. Die erstmals dargestellten Manganphthalocyanine [MnClPc(SR)8] 1 wurden ausgehend von MnCl2 erhalten. Hier fand bei der Aufarbeitung an Luft eine Oxidation zu Mangan(III) statt; +III ist die stabilste Oxidationsstufe von Mangan in Phthalocyaninen. Der Nachweis des axialen Chloridoliganden erfolgte mit Massenspektrometrie und FIR- sowie Raman-Spektroskopie. SQUID-Messungen haben gezeigt, dass die Komplexe 1 vier ungepaarte Elektronen haben. Bei den Subphthalocyaninen [BClSubpc(SR)6] 2 wurde der axiale Chloridoligand mit dem stäbchenförmigen Phenolderivat 29-H substituiert und die erfolgreiche Ligandensubstitution durch NMR- und IR-Spektroskopie sowie Massenspektrometrie an den Produkten [BSubpc(SR)6(29)] 30 belegt. Der Radikalcharakter der synthetisierten Terbiumkomplexe [Tb{Pc(SR)8}2] 3 wurde spektroskopisch nachgewiesen; SQUID-Messungen ergaben, dass es sich um Einzelmolekülmagnete mit einer Energiebarriere U des Doppelpotentialtopfs von 880 K oder 610 cm-1 bei 3a handelt. Zunächst wurden die SAMs der Komplexverbindungen 1, 2, 30 und 3 auf nicht magnetisch strukturierten Goldsubstraten untersucht. Die Manganphthalocyanine 1 bilden geordnete SAMs mit größtenteils flach liegenden Molekülen, wie die XPS-, NEXAFS- und ToF-SIMS-Analyse zeigte. Die Mehrzahl der Thioether-Einheiten ist auf Gold koordiniert und die Alkylketten zeigen ungeordnet von der Oberfläche weg. Bei der Adsorption findet eine Reduktion zu Mangan(II) statt und der axiale Chloridoligand wird abgespalten. Das beruht auf dem sog. Oberflächen-trans-Effekt. Im vorliegenden Fall übt die Metalloberfläche einen stärkeren trans-Effekt als der axiale Ligand aus, was bisher experimentell noch nicht beobachtet wurde. Die thioethersubstituierten Subphthalocyanine 2 und 30 sowie die Diphthalocyaninatoterbium-Komplexe 3 sind ebenfalls für SAMs geeignet. Ihre Monolagen wurden mit XPS und NEXAFS-Spektroskopie untersucht, und trotz einer gewissen Unordnung in den Filmen liegen die Moleküle jeweils im Wesentlichen flach auf der Goldoberfläche. Vermutlich sind bei diesen Systemen auch die Alkylketten größtenteils parallel zur Oberfläche orientiert. Im Gegensatz zu den Manganphthalocyaninen 1 tritt bei 2b, 30a, 30b und 3b neben der koordinativen Bindung der Schwefelatome auf Gold auch eine für Thioether nicht erwartete kovalente Au–S-Bindung auf, die durch C–S-Bindungsbruch unter Abspaltung der Alkylketten ermöglicht wird. Der Anteil, zu dem dieser Prozess stattfindet, scheint nicht mit der Molekülstruktur zu korrelieren. Selbstassemblierte Submonolagen auf magnetisch strukturierten Substraten wurden mit dem diamagnetischen Subphthalocyanin 2b hergestellt. Der Nachweis der Submonolagen war schwierig und gelang schließlich durch eine Kombination von ToF-SIMS, NEXAFS Imaging und X-PEEM. Die Analyse der ToF-SIMS-Daten zeigte, dass tatsächlich eine Modulation der Verteilung der Moleküle auf einem unterwärts magnetisch strukturierten Substrat eintritt. Mit X-PEEM konnte die magnetische Struktur der ferromagnetischen Schicht des Substrats direkt der Verteilung der adsorbierten Moleküle zugeordnet werden. Die Subphthalocyanine 2b adsorbieren nicht an den Domänengrenzen, sondern vermehrt dazwischen. Auf Substraten mit abwechselnd 6.5 und 3.5 µm breiten magnetischen Domänen binden die Moleküle bevorzugt in den Bereichen geringster magnetischer Streufeldgradienten, also den größeren Domänen. Solche Substrate wurden für die ToF-SIMS- und X-PEEM-Messungen verwendet. Bei größeren magnetischen Strukturen mit ca. 400 µm breiten Domänen, wie sie aufgrund der geringeren Ortsauflösung dieser Methode für NEXAFS Imaging eingesetzt wurden, binden die Moleküle dann in allen Domänen. Die diamagnetischen Moleküle werden nach dieser Interpretation aus dem inhomogenen Magnetfeld über der Probenoberfläche heraus gedrängt und verhalten sich analog makroskopischer Diamagnete. Die eindeutige Detektion der Moleküle auf den magnetisch strukturierten Substraten konnte bisher nur für die diamagnetischen Subphthalocyanine 2b erfolgen. Um die Interpretation ihres Verhaltens bei der Selbstassemblierung in einem inhomogenen Magnetfeld weiter voranzutreiben, wurde das Subphthalocyanin 37b dargestellt, welches ein stabiles organisches TEMPO-Radikal in seinem axialen Liganden enthält. Das paramagnetische Subphthalocyanin 37b sollte auf den magnetisch strukturierten Substraten in Regionen starker magnetischer Streufelder binden und damit das entgegengesetzte Verhalten zu den diamagnetischen Subphthalocyaninen 2b zeigen. Aus Zeitgründen konnte dieser Nachweis im Rahmen dieser Arbeit noch nicht erbracht werden.

Characterization of Lipid Droplets and Functional Analysis of Lipid Droplet-Associated Proteins in Dictyostelium discoideum

Lipid droplets (LDs) are the universal storage form of fat as a reservoir of metabolic energy in animals, plants, bacteria and single celled eukaryotes. Dictyostelium LD formation was investigated in response to the addition of different nutrients to the growth medium. LDs were induced by adding exogenous cholesterol, palmitic acid (PA) as well as growth in bacterial suspension, while glucose addition fails to form LDs. Among these nutrients, PA addition is most effective to stimulate LD formation, and depletion of PA from the medium caused LD degradation. The neutral lipids incorporated into the LD-core are composed of triacylglycerol (TAG), steryl esters, and an unknown neutral lipid (UKL) species when the cells were loaded simultaneously with cholesterol and PA. In order to avoid the contamination with other cellular organelles, the LD-purification method was modified. The isolated LD fraction was analysed by mass spectrometry and 100 proteins were identified. Nineteen of these appear to be directly involved in lipid metabolism or function in regulating LD morphology. Together with a previous study, a total of 13 proteins from the LD-proteome were confirmed to localize to LDs after the induction with PA. Among the identified LD-proteins, the localization of Ldp (lipid droplet membrane protein), GPAT3 (glycerol-3-phosphate acyltransferase 3) and AGPAT3 (1-acylglycerol-3-phosphate-acyltransferase 3) were further verified by GFP-tagging at the N-termini or C-termini of the respective proteins. Fluorescence microscopy demonstrated that PA-treatment stimulated the translocation of the three proteins from the ER to LDs. In order to clarify DGAT (diacylglycerol acyltransferase) function in Dictyostelium, the localization of DGAT1, that is not present in LD-proteome, was also investigated. GFP-tagged DGAT1 localized to the ER both, in the presence and absence of PA, which is different from the previously observed localization of GFP-tagged DGAT2, which almost exclusively binds to LDs. The investigation of the cellular neutral lipid level helps to elucidate the mechanism responsible for LD-formation in Dictyostelium cells. Ldp and two short-chain dehydrogenases, ADH (alcohol dehydrogenase) and Ali (ADH-like protein), are not involved in neutral lipid biosynthesis. GPAT, AGPAT and DGAT are three transferases responsible for the three acylation steps of de novo TAG synthesis. Knock-out (KO) of AGPAT3 and DGAT2 did not affect storage-fat formation significantly, whereas cells lacking GPAT3 or DGAT1 decreased TAG and LD accumulation dramatically. Furthermore, DGAT1 is responsible for the accumulation of the unknown lipid UKL. Overexpression of DGAT2 can rescue the reduced TAG content of the DGAT1-KO mutant, but fails to restore UKL content in these cells, indicating that of DGAT1 and DGAT2 have overlapping functions in TAG synthesis, but the role in UKL formation is unique to DGAT1. Both GPAT3 and DGAT1 affect phagocytic activity. Mutation of GPAT3 increases it but a DGAT1-KO decreases phagocytosis. The double knockout of DGAT1 and 2 also impairs the ability to grow on a bacterial lawn, which again can be rescued by overexpression of DGAT2. These and other results are incorporated into a new model, which proposes that up-regulation of phagocytosis serves to replenish precursor molecules of membrane lipid synthesis, whereas phagocytosis is down-regulated when excess fatty acids are used for storage-fat formation.