Stratified analysis reveals chemokine-like factor (CKLF) as a potential prognostic marker in the MSI-immune consensus molecular subtype CMS1 of colorectal cancer

The Colorectal Cancer (CRC) Subtyping Consortium (CRCSC) recently published four consensus molecular subtypes (CMS’s) representing the underlying biology in CRC. The Microsatellite Instable (MSI) immune group, CMS1, has a favorable prognosis in early stage disease, but paradoxically has the worst prognosis following relapse, suggesting the presence of factors enabling neoplastic cells to circumvent this immune response. To identify the genes influencing subsequent poor prognosis in CMS1, we analyzed this subtype, centered on risk of relapse.
In a cohort of early stage colon cancer (n=460), we examined, in silico, changes in gene expression within the CMS1 subtype and demonstrated for the first time the favorable prognostic value of chemokine-like factor (CKLF) gene expression in the adjuvant disease setting [HR=0.18, CI=0.04-0.89]. In addition, using transcription profiles originating from cell sorted CRC tumors, we delineated the source of CKLF transcription within the colorectal tumor microenvironment to the leukocyte component of these tumors. Further to this, we confirmed that CKLF gene expression is confined to distinct immune subsets in whole blood samples and primary cell lines, highlighting CKLF as a potential immune cell-derived factor promoting tumor immune-surveillance of nascent neoplastic cells, particularly in CMS1 tumors. Building on the recently reported CRCSC data, we provide compelling evidence that leukocyte-infiltrate derived CKLF expression is a candidate biomarker of favorable prognosis, specifically in MSI-immune stage II/III disease.

Immune-derived PD-L1 gene expression defines a subgroup of stage II/III colorectal cancer patients with favorable prognosis that may be harmed by adjuvant chemotherapy

A recent phase 2 study of metastatic colorectal carcinoma (CRC) patients showed that mismatch repair gene status was predictive of clinical response to PD-1-targeting immune checkpoint blockade. Further examination revealed strong correlation between PD-L1 protein expression and microsatellite instability (MSI) in stage IV CRC, suggesting that the amount of PD-L1 protein expression could identify late stage patients who may benefit from immunotherapy. To assess whether the clinical associations between PD-L1 gene expression and MSI identified in metastatic CRC are also present in stage II/III CRC, we used in silico analysis to elucidate the cell types expressing the PD-L1 gene. We found a significant association of PD-L1 gene expression with MSI in early stage CRC (P < 0.001) and show that unlike in non-CRC tumors, PD-L1 is derived predominantly from the immune infiltrate. We demonstrate that PD-L1 gene expression has positive prognostic value in the adjuvant disease setting (PD-L1low v PD-L1high HR = 9.09; CI, 2.11-39.10). PD-L1 gene expression had predictive value, as patients with high PD-L1 expression appear to be harmed by standard-of-care treatment (HR = 4.95; CI,1.10-22.35). Building on the promising results from the metastatic CRC PD-1-targeting trial, we provide compelling evidence that PD-L1high/MSI/immunehigh stage II/III CRC patients should not receive standard chemotherapy. This conclusion supports the rationale to clinically evaluate this patient subgroup for PD-1 blockade treatment.

Molecular Subtypes and Personalized Therapy in Metastatic Colorectal Cancer

Development of colorectal cancer occurs via a number of key pathways, with the clinicopathological features of specific subgroups being driven by underlying molecular changes. Mutations in key genes within the network of signalling pathways have been identified; however, therapeutic strategies to target these aberrations remain limited. As understanding of the biology of colorectal cancer has improved, this has led to a move toward broader genomic testing, collaborative research and innovative, adaptive clinical trial design. Recent developments in therapy include the routine adoption of wider mutational spectrum testing prior to use of targeted therapies and the first promise of effective immunotherapy for colorectal cancer patients. This review details current biomarkers in colorectal cancer for molecular stratification and for treatment allocation purposes, including open and planned precision medicine trials. Advances in our understanding, therapeutic strategy and technology will also be outlined.

Genetic structure, relationships and admixture with wild relatives in native pig breeds from Iberia and its islands

Background: Native pig breeds in the Iberian Peninsula are broadly classified as belonging to either the Celtic or the Mediterranean breed groups, but there are other local populations that do not fit into any of these groups. Most of the native pig breeds in Iberia are in danger of extinction, and the assessment of their genetic diversity and population structure, relationships and possible admixture between breeds, and the appraisal of conservation alternatives are crucial to adopt appropriate management strategies. Methods: A panel of 24 microsatellite markers was used to genotype 844 animals representing the 17 most important native swine breeds and wild populations existing in Portugal and Spain and various statistical tools were applied to analyze the results. Results: Genetic diversity was high in the breeds studied, with an overall mean of 13.6 alleles per locus and an average expected heterozygosity of 0.80. Signs of genetic bottlenecks were observed in breeds with a small census size, and population substructure was present in some of the breeds with larger census sizes. Variability among breeds accounted for about 20% of the total genetic diversity, and was explained mostly by differences among the Celtic, Mediterranean and Basque breed groups, rather than by differences between domestic and wild pigs. Breeds clustered closely according to group, and proximity was detected between wild pigs and the Mediterranean cluster of breeds. Most breeds had their own structure and identity, with very little evidence of admixture, except for the Retinto and Entrepelado varieties of the Mediterranean group, which are very similar. Genetic influence of the identified breed clusters extends beyond the specific geographical areas across borders throughout the Iberian Peninsula, with a very sharp transition from one breed group to another. Analysis of conservation priorities confirms that the ranking of a breed for conservation depends on the emphasis placed on its contribution to the betweenand within-breed components of genetic diversity. Conclusions: Native pig breeds in Iberia reveal high levels of genetic diversity, a solid breed structure and a clear organization in well-defined clusters.

Estratégias para a valorização do coberto vegetal da Ilha de Porto Santo

No presente trabalho desenvolveram-se estudos visando a valorização do coberto vegetal da Ilha de Porto Santo, através de duas metodologias de investigação complementares: a) preservação e reintrodução na Ilha de uma espécie endémica e em risco do Arquipélago da Madeira (Olea maderensis) e de uma espécie naturalizada (Olea europaea ssp. europaea var. sylvestris), recorrendo para o efeito a técnicas de biotecnologia (micropropagação); b) análise da percepção da comunidade local e visitante sobre o fenómeno da desertificação e a valorização do coberto vegetal bem como a sua aceitação relativamente à aplicação de técnicas de biotecnologia (para micropropagar e reintroduzir espécies de oliveira na Ilha) para minimização do processo de desertificação. A dissertação estrutura-se em quatro partes principais. A Parte I caracteriza a Ilha de Porto Santo em termos geográficos, geológicos, climáticos, sócio-economicos e do uso do solo. Enquadra, ainda, o problema da desertificação, através da caracterização/evolução do coberto vegetal ao longo dos anos. Finalmente apresentam-se os objectivos gerais deste estudo. A Parte II centra-se no desenvolvimento de metodologias no âmbito da biotecnologia vegetal para propagação de espécies de O. maderensis e O. europaea ssp. europaea var. sylvestris. em larga escala. Esta parte está dividida em seis capítulos. O Capítulo II.1 aborda a distribuição geográfica das espécies de oliveira e faz uma revisão bibliográfica dos aspectos mais importantes da micropropagação de oliveira (O. europaea L.), principalmente através da micropropagação por estimulação de gomos axilares. No final deste capítulo apresentam-se os objectivos específicos desta investigação. No Capítulo II.2 faz-se a caracterização genética de genótipos de O. maderensis do Arquipélago da Madeira através da análise da ploidia e do conteúdo em DNA por citometria de fluxo (FCM) e através da detecção de polimorfismos por análise de microssatélites (SSR). Nesta análise usaram-se ainda outros genótipos, nomeadamente: O. europaea ssp. europaea var. sylvestris, O. cerasiformes e O. europaea ssp. europaea var. europaea. Este estudo contribuiu para uma melhor caracterização desta espécie e permitiu a detecção de um nível de ploidia novo no género Olea (tetraploidia). O Capítulo II.3 descreve a optimização das condições de cultura in vitro (e.g. desinfecção, meio de cultura e enraizamento) para propagar e preservar a O. maderensis. Avalia-se ainda a “performance” dos rebentos in vitro (taxas de crescimento, avaliação da aparência das folhas e estudos fisiológicos), de modo a confirmar a optimização das condições de propagação. Neste capítulo define-se um meio novo (OMG) para propagação desta espécie endémica. O Capítulo II.4 descreve dois protocolos de micropropagação e aclimatização de ambas as espécies (O. maderensis e O. europaea ssp. europaea var. sylvestris) e a qualidade das plantas (“true-to-type”) é avaliada através da possível ocorrência de variabilidade genética através de FCM (ploidia) e SSRs. O Capítulo II.5 descreve um protocolo eficiente de aclimatização ao campo de O. maderensis e avalia a “performance” das plantas micropropagadas no campo através da análise de parâmetros fisiológicos durante o processo. O Capítulo II.6 apresenta os estudos em curso relativamente às plantas de O. maderensis em aclimatização no campo, bem como a introdução de plantas micropropagadas num outro local da Ilha com um maior grau de degradação dos solos. Estas estratégias estão a ser aplicadas juntamente com a DRFRAM, no âmbito de programas de florestação em curso. Finalmente é realçada a necessidade de estudos semelhantes com outras espécies nativas. Na Parte III, são apresentados os estudos sobre a percepção da comunidade local relativamente à valorização do coberto vegetal para a minimização dos processos de degradação dos solos/desertificação. A introdução faz o enquadramento teórico sobre o fenómeno da desertificação, particularmente na Ilha de Porto Santo e sobre a percepção social da desertificação. São ainda apresentados os objectivos específicos desta investigação. A metodologia adoptada recorreu à aplicação de inquéritos por questionário à população residente e aos visitantes da Ilha de Porto Santo e ainda a realização de inquéritos por entrevista a algumas entidades e especialistas. Estes estudos permitiram verificar que existe uma nítida consciência da situação de risco da ilha, das medidas tomadas e a tomar e da premência da resolução do problema. Face ao recurso de estratégias alternativas envolvendo biotecnologia, e apesar de existir algum desconhecimento, concluiu-se ainda que a população manifesta aceitação, desde que essas estratégias valorizem o coberto vegetal e, assim, ajudem a combater a degradação biofísica dos solos. Finalmente são apresentadas as conclusões e algumas recomendações. Na Parte IV apresentam-se as conclusões gerais e perspectivas futuras, onde o potencial ambiental destas oliveiras bravas micropropagadas é destacado, bem como é considerado o alargamento da aplicação destas estratégias a outras espécies indígenas em risco, nesta Ilha (e noutros locais). São ainda resumidas as principais visões da população e das entidades e dos especialistas que poderão contribuir para apoiar a elaboração de medidas de mitigação e prevenção no combate ao processo de degradação dos solos/desertificação em curso.

Cadmium phytotoxicity and trophic transfer to isopods

O cádmio (Cd) é um metal não essencial e é considerado um poluente prioritário pela comunidade europeia. Este metal atinge o ambiente no decurso de várias actividades antropogénicas e tende a concentrar-se nos solos e sedimentos, onde está potencialmente disponível para as plantas, sendo posteriormente transferido através da cadeia trófica. Neste contexto, o principal objectivo da presente dissertação foi o estudo dos efeitos da assimilação e da acumulação de Cd em plantas e as suas consequências para animais consumidores. Numa primeira fase, foram estudados os principais efeitos fisiológicos e genotóxicos do Cd em plantas. As plantas de alface (Lactuca sativa L.) expostas a Cd apresentaram um decréscimo na eficiência fotossintética, aumento de peroxidação lipídica e alterações significativas na actividade de enzimas de stress oxidativo. Estas alterações culminaram num decréscimo do crescimento da parte aérea no final da exposição. As respostas obtidas pelos parâmetros bioquímicos sugerem que estes poderão ser utilizados como eventuais biomarcadores em testes ecotoxicológicos com Cd em abordagens integrantes em conjunto com parâmetros clássicos. Os efeitos mutagénicos de Cd foram avaliados através da determinação da instabilidade de microsatélites (IM). Não foi observada IM, nem nas folhas nem nas raízes de plantas de alface com 5 semanas de idade expostas a 100 μM Cd durante 14 dias, no entanto observou-se IM em raízes de alface exposta a 10 μM Cd durante 28 dias desde a germinação. A idade da planta e a maior acumulação de Cd nas raízes poderão explicar os resultados obtidos. A clastogenicidade de Cd foi analisada em três espécies vegetais com diferentes capacidades de destoxificação e acumulação de metais através de citometria de fluxo. Foram detectadas alterações significativas nos parâmetros analisados em raízes alface, mas não nas espécies Thlaspi caerulescens J & C Presl e Thlaspi arvense L. Estes resultados sugerem que o stress provocado pelo Cd originou clastogenicidade como consequência da perda de porções de cromossomas, uma vez que o conteúdo de ADN nuclear diminuiu. A transferência trófica através da cadeia alimentar permanece muito pouco estudada em termos ecotoxicológicos. A distribuição subcellular de metais num organismo pode ser utilizada para compreender a transferência trófica de um metal na cadeia alimentar. Como tal, numa última parte é estudado de que modo a distribuição subcellular do Cd em plantas com perfis de acumulação de Cd distintos afecta a biodisponibilidade e transferência trófica de Cd para isópodes. A distribuição de Cd entre as 4 fracções subcelulares obtidas através de centrifugação diferencial revelou a existência de diferenças significativas entre as espécies de plantas. Estes resultados em conjunto com a avaliação directa da eficiência de assimilação (EA) de Cd individual de cada uma das quatro fracções subcelulares das plantas em estudo, resultou em informação de grande relevância para a explicação das diferenças observadas na EA de Cd por parte de isópodes alimentados com folhas de diferentes espécies de plantas. Com base nos resultados obtidos, o Cd ligado a proteínas estáveis à temperatura (e.g. metaloteoninas e fitoquelatinas) é o menos biodisponível, sendo assim o que menos contribuiu para a transferência trófica, enquanto que o Cd ligado a proteínas desnaturadas pela temperatura foi a fracção mais disponível para transferência trófica de Cd ao isópode. Estes resultados realçam a relevância ecológica da distribuição subcelular de Cd em plantas que tem influência directa na tranferência trófica deste metal para os consumidores e ainda o facto de que alterações na distribuição subcelular de Cd em plantas devido a diferentes mecanismos de destoxificação poderá ter um impacto directo na transferência trófica de Cd para o animal consumidor.

Population genetics of C. Maenas : oceanography and larval dispersal

Decifrar a complexa interacção entre os ciclos de vida de espécies marinhas e a oceanografia revela-se fundamental para a compreensão do fluxo genético e da conectividade no meio marinho. Nas espécies marinhas com desenvolvimento indirecto o fluxo de genes entre populações depende da distância que separa as populações, bem como da interacção entre a duração do desenvolvimento larvar, do comportamento das larvas e dos padrões de circulação oceânica. A conectividade larvar influencia uma variedade de processos como a dinâmica de stocks e de populações, a distribuição e limites geográficos das espécies, a estrutura genética das populações e a dispersão de espécies invasivas e reveste-se consequentemente de uma importância fundamental na identificação das unidades populacionais evolucionariamente relevantes e para a gestão e conservação marinhas. Os marcadores genéticos e os Modelos Individuais Acoplados a Modelos Físico-Biológicos (“ICPBMs”) são actualmente ferramentas fundamentais para o estudo dos padrões de dispersão larvar e para avaliar o nível de conectividade populacional. A presente tese respeita à avaliação das escalas espaciais de conectividade de populações de uma espécie costeira, o caranguejo Carcinus maenas, e utiliza conjuntamente informação de marcadores genéticos, análise de séries temporais de fornecimento de larvas e um modelo numérico de circulação oceânica. O primeiro capítulo introduz a temática da conectividade em espécies marinhas e inclui algumas referências aos métodos moleculares, analíticos e de modelação seguidos ao longo da tese. Através da utilização de múltiplas ferramentas – avaliação da estrutura genética geográfica de C. maenas na sua distribuição nativa com recurso a marcadores de DNA (microssatélites) (Capítulo 2), avaliação da estrutura genética temporal das larvas que formam os eventos de fornecimento larvar à Ria de Aveiro, NW Portugal (Capítulo 3), descrição da variabilidade inter-anual do fornecimento larvar à Ria de Aveiro, NW Portugal (Capítulo 4) e validação de um modelo ICPBM que descreve os padrões observados de fornecimento (Capítulo 5) – esta tese espera poder contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam o fluxo de genes e a conectividade entre populações de organismos marinhos. No Capítulo 6 são apresentadas as principais conclusões da investigação. A análise genética com recurso a microssatélites indicou que as populações de C. maenas são geneticamente homogéneas ao longo de várias centenas de km, dentro da distribuição nativa da espécie. Paralelamente, não foram encontrados indícios da existência de reprodução por “sweepstakes” em C. maenas de populações da costa oeste da Península Ibérica, visto que não se obtiveram diferenças genéticas significativas entre os eventos larvares. Também não se encontrou qualquer estrutura familiar entre as larvas que formam cada episódio de fornecimento, e não houve nenhuma redução significativa da variabilidade genética das larvas quando comparada com a de caranguejos adultos. A análise de séries temporais de suprimento de larvas na Ria de Aveiro em cinco anos estudados indica que este é um fenómeno episódico e variável, sendo os maiores episódios de fornecimento coincidentes com as marés vivas e acentuados por fortes ventos de sul. O modelo ICPBM foi validado com sucesso e parece fornecer uma estimativa realística das escalas espaciais e temporais de dispersão larvar, de acordo com as observações da estrutura genética e da ausência de reprodução por “sweepstake” em C. maenas da costa oeste da Península Ibérica

Avaliação do efeito de metais pesados na fertilidade do ratinho

A infertilidade é um problema actual que afecta cerca de 8 a 12% dos casais em idade fértil, sendo 50% dos casos atribuídos ao factor masculino. A exposição ocupacional e/ou ambiental a metais pesados representa uma das suas principais causas. O chumbo, o cádmio e o crómio são metais com elevada utilização industrial e muito persistentes no ambiente, sendo motivo de grande preocupação devido aos seus efeitos na saúde reprodutiva dos trabalhadores e da população em geral. Neste trabalho estudaram-se os efeitos do cloreto de chumbo (PbCl2), cloreto de cádmio (CdCl2) e cromato de potássio (K2CrO4) na fertilidade, usando como modelo ratinhos machos ICR-CD1. Os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 74 e 100 mg de PbCl2/kg pc ou com 5 e 10 mg de K2CrO4/kg pc, respectivamente, durante 4 dias consecutivos ou com 1, 2 e 3 mg de CdCl2/kg pc numa única injecção. Nos ensaios com PbCl2 e K2CrO4 os animais foram sacrificados 5 e 35 dias após o início da exposição, enquanto que nos ensaios com CdCl2 os animais foram sacrificados após 24 horas e 35 dias. O cloreto de chumbo não alterou a histologia do testículo nem do epidídimo, mas induziu um aumento da percentagem de células em fase S no testículo. O cloreto de chumbo alterou também alguns parâmetros dos espermatozóides, tais como a motilidade, morfologia e integridade do acrossoma. Contudo, não foram observados efeitos na integridade do DNA ou na estrutura da cromatina. O cloreto de cádmio induziu lesões severas e não reversíveis nos testículos que, após 35 dias, reverteram em necrose testicular. O cloreto de cádmio alterou ainda as subpopulações de células testiculares após 24 horas e induziu IMS no testículo após 35 dias. Em consequência das lesões no testículo, a densidade espermática foi severamente afectada após 35 dias. A exposição ao cloreto de cádmio afectou também a morfologia, a motilidade e a integridade acrossómica nos espermatozóides. O cloreto de cádmio induziu ainda fragmentação do DNA nestas células após 35 dias. O cromato de potássio alterou a morfologia dos espermatozóides e a integridade do acrossoma, sobretudo nos animais sacrificados após 35 dias. Verificou-se ainda uma redução da motilidade dos espermatozóides. Não foram detectados efeitos genotóxicos nos espermatozóides, devido à acção do K2CrO4 nas doses testadas. Dos parâmetros avaliados neste trabalho, destacam-se duas novas abordagens, nomeadamente o programa informático Snakes e a análise do conteúdo em DNA de células de testículo, a partir de material incluído em parafina. O Snakes permitiu fazer medições rigorosas do diâmetro dos tubos seminíferos, enquanto que a fixação de amostras de testículo de ratinhos em formol tamponado e inclusão em parafina resultou numa boa preservação do DNA, possibilitando assim a quantificação das subpopulações de células testiculares por citometria de fluxo. Os resultados obtidos para os diferentes parâmetros testados indicam que a motilidade dos espermatozóides e a integridade do acrossoma sejam parâmetros sensíveis à toxicidade de metais. O acrossoma aparenta ser um dos principais alvos da toxicidade dos metais e cuja reacção acrossómica prematura pode reduzir a capacidade do espermatozóide para fertilizar o oócito. Assim, este trabalho representa uma contribuição para uma melhor compreensão dos efeitos do chumbo, cádmio e crómio na fertilidade masculina.

Genotoxicity and cytotoxicity of Cr(VI) and Pb²+ in Pisum sativum

A toxicidade dos metais é uma problemática que envolve a saúde humana e o ambiente, sendo necessária uma vigilância constante e uma avaliação dos danos precisa e robusta. As plantas, como principal fonte alimentar e de produtos, são de vital importância à sociedade humana. Devido a serem seres sesseis, este grupo é um dos mais afectados por poluentes, tornandoos objectos de estudo extremamente interessantes. O objectivo desta tese foi avaliar os efeitos genotóxicos e citotóxicos do Cr(VI) e Pb2+ na espécie modelo Pisum sativum L. No capitulo I é introduzida a problemática da toxicidade de ambos os metais, com especial relevo nas plantas, bem como as abordagens mais actuais no estudo da geno e citotoxicidade. No capitulo II são apresentados os resultados dos estudos da genotoxicidade do Pb2+ (II-1) e Cr(VI) (II-2 e II-3), tendo sido realizados analises de dano ao DNA a vários níveis e alterações do ciclo celular (II-1 e II-2), bem como a detecção de instabilidade de microssatelites (II-1 e II-3), que é um indicador do estado funcional do mecanismo de reparação do DNA. O capítulo III aborda o efeito de stresses abióticos na capacidade fotossintética da espécie modelo. No capítulo III-1, realizou-se um estudo pioneiro de avaliação da aplicabilidade da citometria de fluxo no estudo da fotossíntese, mais concretamente no estado funcional e estrutural dos cloroplastos, quando expostos a um inibidor da fotossíntese (Paraquat). Os dados obtidos neste estudo encorajaram a aplicação da técnica nos capítulos III-2 e III-3, nos quais se analisaram os efeitos dos metais Pb2+ (III- 2) e Cr(VI) (III-3) na capacidade fotossintética de plantas expostas a este metal; em estudos que envolveram vários marcadores clássicos, para alem dos da citometria de fluxo. Finalmente, no capítulo IV são apresentadas as conclusões finais do trabalho, uma comparativa entre os efeitos e níveis de toxicidade dos dois metais em estudo e são apontadas algumas perspectivas para futuros estudos, levantadas pelos dados obtidos.

Micropropagation in elite corck oak trees: a tool for suber production improvement?

Dada a extrema importância económica e ambiental que o montado de sobro tem em Portugal, e dado o declínio deste devido a várias razões (e.g. doença, idade das plantas) é premente desenvolver estratégias de preservação de sobreiros elite e optimizar técnicas para a propagação destes genótipos. No primeiro Capítulo expõe-se uma breve introdução sobre o montado actual e as técnicas actuais de regeneração/propagação do sobreiro. Descreve-se ainda as principais técnicas de preservação e avaliação de estabilidade genética referidas na literatura para sobreiro e outras lenhosas. No Capítulo II é apresentado um estudo de melhoramento das condições actuais de maturação de embriões somáticos de sobreiro com vista a aperfeiçoar o processo de conversão em plantas. Neste capítulo é apresentado um protocolo melhorado em relação ao actual que permite um desenvolvimento dos embriões somáticos dum modo semelhante aos embriões zigóticos em termos de substâncias de reserva. O Capítulo III mostra um estudo efectuado com o objectivo principal de avaliar estabilidade genética durante todo o processo de embriogénese somática. Neste capítulo são apresentados resultados duma análise feita por RAPD em fases distintas da embriogénese somática de sobreiro. Neste estudo mostra-se que não existem diferenças significativas entre plantas de campo, embriões somáticos e plantas regeneradas. No Capítulo VI, pretende-se complementar o estudo anterior. Neste Capítulo descreve-se a dinâmica do ciclo celular durante as primeiras fases de embriogénese somática na presença de reguladores de crescimento. Este trabalho permitiu concluir a importância dos reguladores de crescimento na indução e perceber o peso do factor genótipo durante o processo. Considerando os resultados anteriores, a necessidade de um processo eficiente de preservação de genótipos elite torna-se fundamental. No Capítulo V descreve-se um protocolo de criopreservação eficiente sem recursos a substâncias tóxicas. Nesta secção é ainda feita uma análise de variabilidade genética após criopreservação através de FCM, AFLP e SSR. Todos os resultados obtidos anteriormente são postos a prova no Capítulo VI onde se faz uma monitorização extensiva de 10 genótipos elite, tendo em conta a sua capacidade de produção de cortiça, através do processo de embriogénese somática. Durante esta secção são utilizados os protocolos desenvolvidos anteriormente e avaliados na sua eficiência. Neste capítulo é descrita a integração de vários segmentos deste estudo num só protocolo eficiente de regeneração e preservação de sobreiros através de embriogénese somática. Finalmente, no Capítulo VI são apresentadas as conclusões da presente Tese de Doutoramento, com especial incidência para linhas de investigação futuras a serem tomadas. Discute-se a importância deste novo protocolo na optimização da produção da cortiça e traçam-se possíveis aplicações alternativas.

Estudo da variabilidade genética de marcadores moleculares ligados ao gene da MGP e sua aplicação para paternidades em Sparus aurata

Dissertação de Mestrado, Biologia Marinha, Especialização em Biotecnologia Marinha, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2008

Molecular genetic analysis of a cattle population to reconstitute the extinct Algarvia breed

Background: Decisions to initiate conservation programmes need to account for extant variability, diversity loss and cultural and economic aspects. Molecular markers were used to investigate if putative Algarvia animals could be identified for use as progenitors in a breeding programme to recover this nearly extinct breed. Methods: 46 individuals phenotypically representative of Algarvia cattle were genotyped for 27 microsatellite loci and compared with 11 Portuguese autochthonous and three imported breeds. Genetic distances and factorial correspondence analyses (FCA) were performed to investigate the relationship among Algarvia and related breeds. Assignment tests were done to identify representative individuals of the breed. Y chromosome and mtDNA analyses were used to further characterize Algarvia animals. Gene- and allelic-based conservation analyses were used to determine breed contributions to overall genetic diversity. Results: Genetic distance and FCA results confirmed the close relationship between Algarvia and southern Portuguese breeds. Assignment tests without breed information classified 17 Algarvia animals in this cluster with a high probability (q > 0.95). With breed information, 30 cows and three bulls were identified (q > 0.95) that could be used to reconstitute the Algarvia breed. Molecular and morphological results were concordant. These animals showed intermediate levels of genetic diversity (MNA = 6.0 ± 1.6, Rt = 5.7 ± 1.4, Ho = 0.63 ± 0.19 and He = 0.69 ± 0.10) relative to other Portuguese breeds. Evidence of inbreeding was also detected (Fis = 0.083, P < 0.001). The four Algarvia bulls had Y-haplotypes H6Y2 and H11Y2, common in Portuguese cattle. The mtDNA composition showed prevalence of T3 matrilines and presence of the African-derived T1a haplogroup. This analysis confirmed the genetic proximity of Algarvia and Garvonesa breeds (Fst = 0.028, P > 0.05). Algarvia cattle provide an intermediate contribution (CB = 6.18, CW = -0.06 and D1 = 0.50) to the overall gene diversity of Portuguese cattle. Algarvia and seven other autochthonous breeds made no contribution to the overall allelic diversity. Conclusions: Molecular analyses complemented previous morphological findings to identify 33 animals that can be considered remnants of the Algarvia breed. Results of genetic diversity and conservation analyses provide objective information to establish a management program to reconstitute the Algarvia breed.

Genetic structure at range edge: Low diversity and high inbreeding in Southeast Asian mangrove (Avicennia marina) populations

Understanding the genetic composition and mating systems of edge populations provides important insights into the environmental and demographic factors shaping species’ distribution ranges. We analysed samples of the mangrove Avicennia marina from Vietnam, northern Philippines and Australia, with microsatellite markers. We compared genetic diversity and structure in edge (Southeast Asia, and Southern Australia) and core (North and Eastern Australia) populations, and also compared our results with previously published data from core and southern edge populations. Comparisons highlighted significantly reduced gene diversity and higher genetic structure in both margins compared to core populations, which can be attributed to very low effective population size, pollinator scarcity and high environmental pressure at distribution margins. The estimated level of inbreeding was significantly higher in northeastern populations compared to core and southern populations. This suggests that despite the high genetic load usually associated with inbreeding, inbreeding or even selfing may be advantageous in margin habitats due to the possible advantages of reproductive assurance, or local adaptation. The very high level of genetic structure and inbreeding show that populations of A. marina are functioning as independent evolutionary units more than as components of a metapopulation system connected by gene flow. The combinations of those characteristics make these peripheral populations likely to develop local adaptations and therefore to be of particular interest for conservation strategies as well as for adaptation to possible future environmental changes.

The downy mildew resistance locus Pp523 is located on chromosome C8 of Brassica oleracea L.

We have previously constructed a genetic map of Brassica oleracea L. containing the Pp523 locus that confers downy mildew resistance to adult plants. In this work, 44 SSR markers of reference for the Brassica C genome chromosomes were added to the map, allowing the nine major linkage groups to be assigned to the nine chromosomes of B. oleracea. Locus Pp523 was located on chromosome C8, and a locus determining flower colour was mapped to chromosome C3. In comparison with the first version of the map, the new map is denser and more compact. The available genomic information on B. oleracea was enriched with the chromosome location of two phenotypic traits and 421 DNA markers (RAPD, ISSR, AFLP, SCAR, BAC-end derived STS, SSR and other PCR markers). Conversely, the genomic information on B. oleracea chromosome C8 is being used as an additional tool for the map-based cloning of Pp523, the first gene for adult plant resistance to downy mildew precisely located to a specific chromosome of this crop species.

Marine foundation species shifting ranges and genetic baselines

This thesis revealed the most importance factors shaping the distribution, abundance and genetic diversity of four marine foundation species. Environmental conditions, particularly sea temperatures, nutrient availability and ocean waves, played a primary role in shaping the spatial distribution and abundance of populations, acting on scales varying from tens of meters to hundreds of kilometres. Furthermore, the use of Species Distribution Models (SDMs) with biological records of occurrence and high-resolution oceanographic data, allowed predicting species distributions across time. This approach highlighted the role of climate change, particularly when extreme temperatures prevailed during glacial and interglacial periods. These results, when combined with mtDNA and microsatellite genetic variation of populations allowed inferring for the influence of past range dynamics in the genetic diversity and structure of populations. For instance, the Last Glacial Maximum produced important shifts in species ranges, leaving obvious signatures of higher genetic diversities in regions where populations persisted (i.e., refugia). However, it was found that a species’ genetic pool is shaped by regions of persistence, adjacent to others experiencing expansions and contractions. Contradicting expectations, refugia seem to play a minor role on the re(colonization) process of previously eroded populations. In addition, the available habitat area for expanding populations and the inherent mechanisms of species dispersal in occupying available habitats were also found to be fundamental in shaping the distributions of genetic diversity. However, results suggest that the high levels of genetic diversity in some populations do not rule out that they may have experienced strong genetic erosion in the past, a process here named shifting genetic baselines. Furthermore, this thesis predicted an ongoing retraction at the rear edges and extinctions of unique genetic lineages, which will impoverish the global gene pool, strongly shifting the genetic baselines in the future.