Elevated hepatocyte paraffin 1 and neprilysin expression in hepatocellular carcinoma are correlated with longer survival

Résumé de l'article Le carcinome hépatocellulaire reste une tumeur maligne de mauvais pronostic. Le but de cette étude rétrospective est d'étudier l'expression immunohistochimique semi-quantitative d'Hep Par 1 (hepatocyte paraffin 1) et de CD 10 (CALLA ou neprilysin) et leur valeur pronostique sur un collectif de 97 patients avec un carcinome hépatocellulaire traité à visée curative. Hep Par 1 réagit avec un épitope spécifique de l'hépatocyte au niveau de la membrane mitochondriale et se présente sous forme d'un marquage cytoplasmique diffus d'intensité variable, le foie non tumoral exprimant un marquage granulaire servant de contrôle interne positif. Le CD 10 correspond ä une metallopeptidase de la membrane cellulaire participant au processus de sécrétion hormonale et l'immunoréaction colore spécifiquement la portion luminale des canalicules biliaires du foie non tumoral, qui sert ainsi de contrôle interne positif. Le foie tumoral exprime ou non un marquage canaliculaire (CD 10 can), similaire au foie non tumoral, ou cytoplasmique (CD 10 cyt). Le marquage immunohistochimique est quantifié pour les 3 différents marqueurs (Hep Par 1, CD10 can et CD10 cyt) en fonction du pourcentage de cellules tumorales positives (score de 0 à 3 établi pour chaque marqueur immunohistochimique). L'élaboration d'un score combiné immunohistochimique (CIS) est obtenu en additionnant les scores d'Hep Par 1 et de CD10 con et en soustrayant le score de CD10 cyt. Dans l'analyse univariée, la survie globale des patients est prolongée de manière significative en cas de forte expression tumorale par Hep Par 1 (p=0,0005) et CD10 can (p=0,02). Dans l'analyse multivariée, la combinaison du CIS avec les autres paramètres histopathologiques pronostiques classiques du carcinome hépatocellulaire comme la taille tumorale, l'invasion vasculaire, la multifocalité de la tumeur et le grade tumoral montre que le score immunohistochimique combiné (CIS) reste le facteur pronostique le plus important (p=0,001). Les patients avec un CIS bas (<4) avec une survie moyenne de 17 mois ont 3,5 fois plus de risque de décès comparés à ceux avec un CIS élevé (>4) avec une survie moyenne de plus de 80 mois. En conclusion, une expression immunohistochimique élevée d'Hep Par 1 et de CD10 can en l'absence d'expression de CD10 cyt sont des facteurs pronostiques favorables pour les patients présentant un carcinome hépatocellulaire. La combinaison des marqueurs immunohistochimiques dans un score combiné pourrait être utilisé dans la prise en charge des patients avec un hépatocarcinome àvisée curative. Toutefois des études prospectives restent nécessaires pour confirmer l'utilité pronostique du CIS.

Role of forkhead transcription factor FOXC2 in lymphatic vascular developement

Le système vasculaire lymphatique est le second réseau de vaisseaux du corps humain. Sa fonction principale est de retourner le fluide interstitiel excédentaire au système cardiovasculaire. Il est également impliqué dans la défense immunitaire de l'organisme, ainsi que dans le transport initial des graisses alimentaires. De multiples pathologies sont associées au dysfonctionnement du développement vasculaire lymphatique, dont les lymphoedèmes. Un des gènes clés dans le contrôle de l'étape de maturation du système lymphatique est le facteur de transcription FOXC2. De précédentes études utilisant des modèles génétiques mutins déficients en Foxc2 ont montré son rôle dans la régulation du processus de spécification des vaisseaux lymphatiques en capillaires versus vaisseaux collecteurs, ainsi que dans la formation des valves lymphatiques. Chez l'homme, les mutations dans le gène FOXC2 causent le syndrome lymphoedème- distichiasis. Dans ce travail, nous avons étudié les mécanismes moléculaires qui régulent l'expression et l'activité de FOXC2 dans les vaisseaux lymphatiques. Nous avons découvert que la fonction de FOXC2 est régulée par phosphorylation de la protéine, qui détermine son activité transcriptionnelle au niveau génomique, jouant ainsi un rôle important dans le développement vasculaire in vivo. Les vaisseaux lymphatiques sont soumis à des forces de stress générées par le flux de la lymphe (FSS). Nous avons donc testé l'hypothèse que ces forces contribuent à la morphogenèse et à l'organisation des vaisseaux lymphatiques. In vitro, les cellules endothéliales lymphatiques répondent aux forces mécaniques, qui induisent l'expression de FOXC2, activent la voie de signalisation Ca2+/calcineurin/NFATcl et régulent l'expression de la protéine de jonction gap connexin37. Nous avons également montré que le stress de flux mécanique, FOXC2, calcineurin/NFATcl et connexin37 coopèrent dans le contrôle de la maturation des vaisseaux lymphatiques in vivo. En dernier lieu, nous avons cherché à identifier les récepteurs de surface cellulaires permettant le transfert du signal de stress mécanique qui induit l'expression de FOXC2. Nous présentons ici des données préliminaires, qui suggèrent le rôle de la voie de signalisation TGFß ainsi que l'implication des jonctions adhérentes dans ce processus. En conclusion, la présente étude met en lumière les mécanismes de l'activité de FOXC2 dans les cellules endothéliales lymphatiques et l'importance du rôle des forces mécaniques de flux dans le contrôle de son l'expression, ainsi que dans le développement et la fonction du système vasculaire lymphatique. - The lymphatic vascular system is a second vascular system of human body. Its main fonction is to transfer excess interstitial fluid back to cardiovascular system. In addition, it is involved in immune defense and responsible for the uptake of dietary fat. A number of pathologies called lymphedemas are associated with lymphatic vascular system dysfunction. Hereditary lymphedemas are caused by mutations in genes controlling lymphatic vascular development. One of the key genes responsible for lymphatic vascular maturation is forkhead transcription factor FOXC2. Previous studies of Foxc2 knockout mice showed that Foxc2 controls the process of lymphatic capillary versus collecting vessel fate specification and formation of lymphatic valves. Importantly, mutations in FOXC2 cause human lymphedema-distichiasis syndrome. In this work we investigated the molecular mechanisms regulating the expression and activity of FOXC2 in lymphatic vasculature. We discovered that FOXC2 function is regulated by phosphorylation. We describe how phosphorylation controls FOXC2 transcriptional activity on a genome-wide level and show that FOXC2 phosphorylation plays an important role in vascular development in vivo. Lymphatic vessels are subjected to fluid shear stress (FSS). Therefore we investigated whether mechanical forces contribute to lymphatic vascular patterning and morphogenesis. We found that FSS induces the expression of FOXC2, activates Ca2+/calcineurin/NFATcl signaling and induces the expression of gap junction protein connexin37 in lymphatic endothelial cells in vitro. Importantly, we were able to show that shear stress, FOXC2, calcineurin/NFATcl and connexin37, control maturation of lymphatic vessels in vivo. Finally, we searched for cell surface receptors that mediate the induction of FOXC2 by shear stress, and we present some preliminary data, suggesting the role of TGF-beta signaling and adherens junctions in this process. In conclusion, the present study sheds light on the mechanisms of FOXC2 activity and suggests an important role of mechanical forces in controlling FOXC2 expression as well as lymphatic system development and function.

Studying the molecular causes of ageing in ants

RÉSUMÉ DE THÈSE Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux causes physiologiques du vieillissement en utilisant les fourmis comme modèle. Les trois castes de fourmis - les mâles, les ouvrières et les reines - présentent des longévités très différentes, tout en étant génétiquement identiques. Ceci implique que les différences de longévité sont dues à des variations entre castes dans le pattern d'expression de gènes. Mon travail chez la fourmi a consisté d'une part à mettre en place les outils pour identifier de tels gènes à grande échelle, de l'autre à étudier le rôle de gènes et de mécanismes qui affectent la longévité chez d'autres espèces. Pour identifier de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans le vieillissement, nous avons développé des puces à ADN. Cette technique permet la comparaison du niveau d'expression de milliers de gènes entre deux échantillons. L'application de cette méthode aux reines et ouvrières adultes nous a jusqu'à présent permis d'identifier neuf gènes surexprimés chez les reines. Trois d'entre eux sont potentiellement impliqués dans le maintien et la réparation du soma, deux processus qui sont supposés avoir un impact crucial sur la longévité. Parmi les mécanismes impliqués dans le vieillissement chez d'autres espèces, nous nous sommes principalement intéressés aux télomères, qui sont les extrémités des chromosomes. Chez les vertébrés, les télomères se raccourcissent à chaque division cellulaire, entre autres parce que l'ADN polymérase ne peut répliquer cette partie des chromosomes en entier. Or des télomères courts entravent la prolifération des cellules et peuvent même induire l'apoptose, ce qui pourrait se répercuter sur la capacité des organismes à régénérer des tissus. J'ai pu montrer que chez les fourmis mâles (la caste qui vit le moins longtemps) les télomères se raccourcissent beaucoup plus vite que chez les reines et les ouvrières. L'explication la plus plausible pour cette différence est que les mâles, étant adapté à une vie très éphémère, n'investissent qu'un minimum d'énergie dans la machinerie de maintenance qui assure le bon fonctionnement des cellules. Ces résultats sont intéressants car ils permettent pour la première fois de faire le lien entre les théories évolutives du vieillissement et la biologie des télomères. THESIS ABSTRACT During my thesis I used ants as a model to study the proximate (i.e., molecular) causes of ageing and lifespan determination. Ant queens, workers and males differ tremendously in lifespan, although all three castes are genetically identical. Importantly, this implies that genes and molecular pathways responsible for modulating lifespan are regulated in a caste-specific manner. To find new genes potentially involved in ageing, we first constructed 371-gene-cDNA microarrays for the ant L. niger. This molecular tool can be used to survey the relative gene expression levels of two samples for thousands of genes simultaneously. By applying this method to adult queens and workers we identified nine genes that are overexpressed in queens. Three of them are putatively involved in somatic maintenance and repair, two processes that have been previously suggested as important for ageing and lifespan determination. We expect to identify many more candidate genes in the near future by using the 9000-gene fire ant microarrays we have recently developed. We also investigated whether factors linked to ageing in other organisms could affect lifespan determination in ants. One project was on telomeres, the ends of linear chromosomes. For various reasons telomeres shorten with every cell division. Since short telomeres can lead to cellular defects such as impaired cell division, telomeres have been hypothesized as playing a role in ageing. We tested whether telomere length in ant somatic tissues correlates with caste-specific lifespan in young adults. The short-lived L. niger mates did indeed have significantly shorter telomeres than the longer-lived queens and workers, probably because telomere attrition is faster in males than in queens and workers. Queens did not, however, have longer telomeres than the shorter-lived workers. These findings are consistent with the idea that telomere length may play a role in ageing under some circumstances, but they also clearly demonstrate that other factors must be involved. We argue that sex-specific telomere length patterns in ants ultimately reflect adaptive differences in the level of somatic maintenance between males and females, and thus create a link between telomere biology and the evolutionary theory of ageing.

108

- Expliquer le cadre d'action du médecin du travail et ses relations avec les autres partenaires de santé. - A propos des risques liés aux solvants organiques, au plomb, à l'amiante, aux bruits, aux mouvements répétés ou à la manutention, savoir expliquer les possibilités d'action préventive du médecin du travail. - Evaluer l'impact du travail sur la santé et rapporter une pathologie aux contraintes professionnelles. - Mettre en relation pronostic médical et pronostic socioprofessionnel.

Molecular characterization of the Carma1-related protein card9

ABSTRACT : Fungal infections have become a major source of diseases in immuncompromised patients, but are quite benign in healthy individuals. As fungi are eukaryotes, and share many biological processes with humans, many antifungal drugs can cause toxicity in the patients. Therefore, the characterization of signaling pathways specific to the anti-fungal immune response is relevant for the better understanding of the disease and the development of new therapeutic approaches. Dectin-1 is the major mammalian pattern recognition receptor for the fungal component zymosan. Dectin-1 is an innate non-Toll-like receptor containing immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs). Card9, Bc110 and Maltl are proteins that have been shown to play a key role in the Dectin-l-induced signaliñg pathway by controlling Dectin-l-mediated cell activation, cytokine production and innate anti-fungal immunity in mice. Here we investigate the role of the Card9-Bc110-Maltl complex in humans using the monocytic cell line THP-1. We show that Card9 interacts with Bc110 through a CARD-CARD interaction and that interaction of Card9 with Bc110 is required for NF-xB activation. We further demonstrate that Card9 is phosphorylated in its C-terminal part on serine residues. The phosphorylation status of Card9 can influence its ability to active NF-xB, since mutation of the phosphorylation sites increases its ability to activate NF-xB. We find that Card9 is expressed in myeloid derived cells, such as the human monocytic cell lines THP1 and U937, and in human monocyte-enriched PBLs and monocyte-derived DCs. Our findings demonstrate that Card9 is implicated in anti-fungal responses, since silencing of Card9 as well as of Bc110 and Maltl diminishes the capacity of THP1 cells to produce TNF-a in response to zymosan. Interestingly, activation of the NF-xB and MAPK pathway remained normal and levels of TNF-a mRNA produced were also not affected in THP 1 cells silenced for the expression of Card9, Bc110 or Malt1. Using a Malt1 inhibitor, we provide evidence that the proteolytic activity of Malt1 is needed for zymosan-induced TNF-a production in THP 1 cells and bone marrow-derived macrophages of mice, but further experiments are required to confirm these findings and identify the substrate(s) of Malt1. In conclusion, our results reveal an important role for Card9 in the innate immune response of human macrophages to fungi. RÉSUMÉ : Les infections fongiques sont une source majeure de maladie chez les patients immunodéprimés, alors qu'elles sont plutôt bénignes chez les individus sains. Comme les champignons sont des eucaryotes et partagent beaucoup de processus biologiques avec les humains, les médicaments antifongiques peuvent être source de toxicité chez les patients. Il est donc important de mieux caractériser les voies de signalisation intracellulaire des réponses anti-fongiques pour pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques. La protéine Dectin-1 est le récepteur principal du composé fongique zymosan. Les protéines Card9, Bc110 et Maltl ont été décrites comme jouant un rôle primordial dans les signaux d'activation induits par Dectin-l, en contrôlant l'activité cellulaire, la production de cytokines et la défense anti-fongique dans les souris. Dans cette étude, nous investiguons le rôle du complexe Card9-Bc110-Maltl dans la lignée monocytaire humaine THP1. Nous montrons que Card9 interagit avec Bc110 par une interaction CARD-CARD et que cette interaction est requise pour activer le facteur de transcription NF-xB. Nous observons que Card9 est phosphorylé dans sa partie C-terminale sur des résidus serine et que l'état de phosphorylation de Card9 influence sa capacité à activer NF-xB. En effet, sa capacité à activer NF-xB est augmentée, après mutation des sites de phosphorylation. La génération d'un anticorps spécifique dirigé contre Card9 nous a permis de démontrer que Card9 est exprimé dans des cellules myéloïdes comme les lignées cellulaires monocytiques THP-1 et U-937, ainsi que dans les cellules dendritiques humaines. Nos résultats démontrent que Card9 est impliqué dans la réponse immunitaire antifongique puisque la réduction de l'expression de Card9 ainsi que de Bc110 et de Malt1 diminue la capacité des THP-1 à produire du TNF-a en réponse au zymosan. Par contre, les voies de signalisation NF-xB et MAPK ainsi que les niveaux de mRNA de TNF-a produits en réponse au zymosan ne sont pas affectés dans ces cellules. En utilisant un inhibiteur de Malt1, nous montrons que l'activité protéolytique de Malt1 est nécessaire pour la production de TNF-a induite par le zymosan dans les cellules THP-1 ainsi que dans les macrophages de souris, mais d'autres expériences seront nécessaires pour confirmer cette observation et identifier le(s) substrat(s) de Malt1 responsables de cet effet. En conclusion, nos résultats révèlent un rôle important de la protéine Card9 dans la réponse immunitaire innée antifongique dans les macrophages humains.

Modulation of pancreatic β-cell mass and insulin secretion by PPARβ/δ

SUMMARY : Peroxisome proliferator-activated receptor ß/δ protects against obesity by reducing dyslipidemia and insulin resistance via effects in various organs, including muscle, adipose tissue and liver. However, nothing is known about the function of PPARß in pancreas, a prime organ in the control of glucose homeostasis. To gain insight into so far hypothetical functions of this PPAR isotype in ß-cell function, we specifically ablated Pparß in the whole epithelial compartment of the pancreas. The mutated mice presented expanded ß-cell mass, possibly, this is due to increased burst of ß-cell proliferation at 2 weeks of age. These PPARß null pancreas mice exhibit hyperinsulinemia-hypoglycaemia starting at 4 weeks of age, due to hyperfunctionality of ß-cell. Gene expression profiling indicated a broad repressive function of PPARß impacting the vesicular and granular compartment, actin cytoskeleton, and metabolism of glucose and fatty acids. Analyses of insulin release from isolated islets revealed accelerated second-phase of glucose-stimulated insulin secretion. Higher levels of PKD and PKCS in mutated animals, in concert with F-actin disassembly, lead to an increased insulin secretion and its associated systemic effects. Enhanced palmitate potentiation of glucose-stimulated insulin secretion in PPARß mutant islets, suggests an important role of this receptor in lipid/glucose metabolism in ß-cell. Taken together, these results provide evidence for PPARß playing a repressive role on ß-cell growth and insulin exocytosis, and shed new light on its metabolic .action. RESUME : Le récepteur nucléaire PPARß (Peroxisome proliferator-activated receptor ß/δ) protège contre l'obésité en réduisant la dyslipidémie et la résistance à l'insuline dans différents organes, comme le muscle, le tissue adipeux et le foie. Cependant, il y a, à ce jour, très peu de connaissance par rapport au rôle de PPARß dans le pancréas, qui est un organe très important dans le contrôle homéostatique du glucose. Afin de comprendre le rôle de cet isotype de PPAR dans le fonctionnement des cellules beta du pancréas, nous avons invalidé le gène Pparß dans tout le compartiment pancréatique de la souris. Ces souris mutantes présentent une augmentation de la masse totale de cellules beta; Cela serait dû à une intense prolifération des cellules beta à 2 semaines après la naissance. Également, ces souris présentent une hyperinsulinémie et une hypoglycémie qui commencent à l'âge de 4 semaines; la raison de ce phénotype serait une hyperactivité des cellules beta. Le profil d'expression génique indique une fonction répressive globale de PPARß en se référant aux compartiments vésiculaire et granulaire, au cytosquelette d'actine, et au métabolisme du glucose et des acides gras. L'analyse de la sécrétion d'insuline par les cellules beta a démontré que la deuxième phase de sécrétion d'insuline après stimulation au glucose est augmentée. Les niveaux élevés de PKD et PKCS dans les îlots pancréatiques de souris mutantes, ainsi qu'une augmentation de la dépolymérisation des filaments d'active génèrent un surplus de sécrétion d'insuline après stimulation au glucose. Les îlots pancréatiques des souris mutantes secrètent plus d'insuline après stimulation au glucose et au palmitate que les îlots de souris contrôles. Ceci suggère un rôle important de PPARß dans le métabolisme des lipides et du glucose des cellules beta. En résumé, ces résultats mettent en évidence un rôle répressif de PPARß dans la croissance des cellules beta et dans l'exocytose d'insuline.

Immunological mechanisms underlying infectious and chronic lung diseases

Le système respiratoire permet l'échange de gaz entre un organisme et son environnement. Pour fonctionner efficacement, il doit lutter contre les infections tout en maintenant une tolérance aux particules inoffensives. Les cytokines sont des petites protéines qui permettent la communication entre les différentes cellules et jouent un rôle important dans la régulation de l'homéostasie et de l'immunité des surfaces pulmonaires. Une production altérée des cytokines sous-tend beaucoup de maladies du système pulmonaire. Ainsi, la compréhension de la biologie fondamentale des cytokines pourrait contribuer à la mise au point de nouveaux traitements. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié le rôle de deux cytokines, le TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) et l'IL-17 (Interleukin 17) dans les réponses immunitaires bénéfiques et nuisibles en utilisant des modèles précliniques de souris des maladies pulmonaires. L'asthme est une maladie qui est caractérisée par la bronchoconstriction réversible, l'inflammation des voies respiratoires inférieures, l'hyperréactivité bronchique et le remodelage tissulaire. Le type d'inflammation affectant les voies respiratoires et la présence ou non d'allergie permettent d'établir les différents types d'asthme. La TSLP est une cytokine qui est principalement exprimée à des niveaux élevés dans les poumons de patients souffrant d'asthme allergique. En conséquence, la majeure partie de la recherche sur la TSLP a mis l'accent sur le rôle joué par celle- ci dans les réponses négatives conduisant au développement de l'asthme allergique. Dans cette thèse, nous montrons que la TSLP joue aussi un rôle bénéfique dans les réponses immunitaires pulmonaires. Nous avons découvert que la TSLP atténue la grippe en augmentant les réponses des lymphocytes T cytotoxiques contre le virus. Nous avons également étudié la fonction de la TSLP dans l'asthme non allergique. Contrairement à l'asthme allergique, nous avons constaté que la TSLP diminue les réponses inflammatoires dans l'asthme non allergique en réglant la production de l'IL-17, une cytokine qui favorise la maladie. Ainsi, nous démontrons les fonctions pleiotropes de la TSLP dans des contextes spécifiques de la maladie. Nos résultats ont des implications importantes pour le développement de thérapies ciblant la TSLP dans l'asthme. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons étudié les mécanismes pathogéniques qui sous-tendent le développement de la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). La BPCO est une maladie chronique le plus largement associée aux fumeurs. Elle est caractérisée par une limitation progressive et irréversible du débit d'air et la destruction de la structure des poumons. L'augmentation globale de l'incidence de la maladie encourage grandement la compréhension des mécanismes pathogéniques et l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons découvert que les micro-organismes trouvés dans les voies respiratoires aggravent la maladie en augmentant la production de l'IL-17. L'IL-17 est une cytokine inflammatoire qui est impliquée dans plusieurs maladies pulmonaires chroniques, dont la BPCO. Dans notre modèle animal de la maladie, nous avons neutralisé 1ÌL-17A en utilisant un anticorps spécifique et observé une reprise de la fonction pulmonaire. Dans cette étude, nous avons identifié 2 axes potentiels pour l'intervention thérapeutique contre la BPCO. Cibler les bactéries dans les voies respiratoires soit par l'utilisation d'antibiotiques ou l'utilisation de thérapies à base immunitaire qui antagonisent l'activité spécifiques de l'IL-17. Dans l'avenir, notre laboratoire va collaborer avec des cliniciens pour acquérir des échantillons humains et tester la pertinence de nos résultats dans la maladie humaine. -- L'interaction avec l'environnement extérieur est vitale pour le fonctionnement du système respiratoire. Par conséquent, ce dernier a adopté une multitude de réseaux effecteurs et régulateurs qui permettent de distinguer les particules inhalées comme «dangereuses» ou «inoffensives» et de réagir en conséquence. L'équilibre entre ces réseaux est essentielle pour lutter contre le «danger» déclenché par une infection ou des dommages, et finalement pour le retour à l'homéostasie. Le milieu de cytokine local contribue de manière significative à la mise au point de ces réponses. Ainsi, la caractérisation du rôle des cytokines dans l'état d'équilibre et la maladie a des implications claires pour les interventions thérapeutiques dans les maladies respiratoires aiguës et chroniques. Cette thèse a porté sur le rôle des cytokines, la lymphopoïétine stromale thymique (TSLP) et TIL-17A dans l'élaboration de réponses immunitaires pulmonaires. La TSLP est principalement produite par les cellules épithéliales et peut cibler une myriade de cellules immunitaires. Bien qu'elle ait été montrée être un puissant inducteur des réponses de type Th2, son rôle dans d'autres contextes inflammatoires est relativement inexploré. Dans le premier projet de cette thèse, nous avons découvert une nouvelle fonction de la TSLP dans l'immunité antivirale contre la grippe, une infection virale. Nous avons constaté que la TSLP a réglementé la réponse neutrophile au début de l'infection, en amplifiant l'immunité adaptative spécifique du virus. Mécaniquement, la TSLP a augmenté l'expression de l'IL-15 et du CD70 sur les cellules dendritiques recrutées dans les poumons suite à l'infection et a renforcé leur capacité de stimuler localement les lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus. En outre, nous avons étudié la TSLP dans le cadre de divers phénotypes de l'asthme et également démontré l'impact pléiotropique qu'elle a sur les réponses immunitaires pulmonaires. En accord avec les rapports précédents, nous avons constaté que la TSLP a exacerbé l'inflammation atopique médiée par le Th2. En revanche la TSLP a réduit les réponses de l'IL-17A et l'inflammation neutrophile subséquente dans le modèle non atopique, ainsi que l'exacerbation du modèle atopique provoqué par une infection virale. Nos résultats démontrent une dichotomie dans le rôle de la TSLP dans la pathogenèse de l'asthme et soulignent la nécessité d'envisager plusieurs phénotypes d'asthme pour une évaluation approfondie de son potentiel thérapeutique dans cette maladie. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons caractérisé les mécanismes pathogènes qui sous-tendent la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). La BPCO est une maladie hétérogène définie par une diminution progressive de la fonction pulmonaire. Bien que des déclencheurs environnementaux puissent aggraver la maladie, chez les personnes sensibles une maladie établie peut progresser à travers un cercle inflammatoire auto-entretenu. Nous avons cherché à définir les mécanismes sous-jacents à l'aide d'un modèle murin d'inflammation chronique, qui reproduit les caractéristiques pathologiques de la maladie humaine. Puisqu'ont été associés à la BPCO sévère des changements dans le microbiome des voies respiratoires, nous avons supposé que les signaux dérivés de certains microbes pourraient favoriser des voies inflammatoires chroniques de progression de la maladie. Nous avons observé que, en l'absence d un microbiome, la maladie s'est améliorée tel que démontré par une réduction de l'inflammation des voies respiratoires et une amélioration de la fonction pulmonaire. Cela a été lié spécifiquement à une production réduite d'IL-17A, une cytokine qui a été impliquée dans la maladie humaine. De plus la cinétique de production de 1IL- 17A dépendant du microbiote est corrélé à la sévérité de la maladie. Sur la base de ces données, la neutralisation de l'IL-17A a également eu un effet bénéfique sur l'évolution de la maladie. Le rôle significatif de 1TL-17A dans l'aggravation de la maladie a été couplé à sa capacité à engager un dialogue entre les voies inflammatoires innées et adaptatives. Il a influencé le recrutement et le phénotype des neutrophiles et des macrophages, ce qui a eu un impact direct et indirect sur la formation et la fonction des tissus lymphoïdes tertiaires associée à des stades sévères de la maladie. -- The interaction with the external environment is vital for the functioning of the respiratory system. Consequently, it has adopted a multitude of effector and regulatory networks that enable it to distinguish inhaled particles as 'dangerous' or 'innocuous' and respond accordingly. The balance between these networks is crucial to counteract the 'danger' triggered by infection or damage, and ultimately return to homeostasis. The local cytokine milieu contributes significantly to the fine- tuning of these responses. Thus, characterizing the role of cytokines in steady state and disease has clear implications for therapeutic interventions in acute and chronic respiratory disorders. This thesis focused on the role of the cytokines, thymic stromal lymphopoietin (TSLP) and IL-17A in shaping pulmonary immune responses. TSLP is primarily produced by barrier epithelial cells and can target a myriad of immune cells. Although it has been shown to be potent inducer of Th2 type responses, its role in other inflammatory settings is relatively unexplored. In the first project of this thesis, we discovered a novel function of TSLP in antiviral immunity to Influenza A infection. We found that while TSLP regulated the early neutrophilic response to infection, it amplified virus specific adaptive immunity. Mechanistically, TSLP enhanced the expression of IL-15 and CD70 on the lung recruited inflammatory dendritic cells and strengthened their ability to stimulate virus specific CD8+ T cell responses locally. In addition we investigated TSLP in the context of diverse asthma phenotypes and further demonstrated the pleiotropic impact it has on pulmonary immune responses. In concurrence with previous reports we found that TSLP exacerbated Th2 mediated atopic inflammation. In contrast TSLP curtailed IL-17A responses and subsequent neutrophilic inflammation in the non-atopic model as well as virus induced exacerbation of the atopic model. Our findings demonstrate a dichotomy in the role of TSLP in asthma pathogenesis and emphasize the need to consider multiple asthma phenotypes for a thorough evaluation of its therapeutic potential in this disease. In the next part of this thesis we characterized the pathogenic mechanisms underlying chronic obstructive pulmonary disease. COPD is a heterogeneous disease defined by a progressive decline in lung function. Although environmental triggers exacerbate the disease, in susceptible individuals the established disease can progress through a self-sustained inflammatory circle. We sought to delineate the underlying mechanisms by using a murine model of chronic inflammation, which reproduced key pathological features of the human disease. As changes in the airway microbiome have been linked to severe COPD, we speculated that microbial derived signals could facilitate the establishment of chronic inflammatory pathways that favour disease progression. We found that the absence of a microbiota ameliorated disease, exhibited by a reduction in airway inflammation and an improvement in lung function. This was linked specifically to an impaired production of IL-17A, a cytokine that has been implicated in human disease. Moreover the kinetics of microbiota-dependent IL-17A production correlated with the disease severity. Based on these data targeted neutralization of IL-17A also had a beneficiai effect on the disease outcome. The prominent role played by IL-I7A in driving the disease was coupled to its ability in engaging and mediating cross talk between pathogenic innate and adaptive immune pathways. It influenced the recruitment and phenotype of neutrophils and macrophages, as well as impacted upon the formation and function of tertiary lymphoid tissue associated with severe disease. Thus, temporal and spatial changes in cytokine production, their cellular targets and interaction with the local milieu determine the balance between immunity and pathology in the lung. Collectively our findings provide novel mechanistic insights in the complex role played by cytokines in orchestrating pulmonary immune responses and have clear implications for human disease.

The DNA damage response to adeno-associated virus : centrosome overduplication and induction of cell death independently of the spindle checkpoint

Summary: Adeno-associated virus type 2 (AAV2) is a small virus containing single-stranded DNA of approximately 4.7kb in size. Both ends of the viral genome are flanked with inverted terminal repeat sequences (ITRs), which serve as primers for viral replication. Previous work in our laboratory has shown that AAV2 DNA with ultraviolet radiation-generated crosslinks (UV-AAV2) provokes a DNA damage response in the host cell by mimicking a stalled replication fork. Infection of cells with UV-AAV2 leads to a p53-and Chk1-mediated cell cycle arrest at the G2/M border of the cell cycle. However, tumour cells lacking the tumour suppressor protein p53 cannot sustain this arrest and enter a prolonged impaired mitosis, the outcome of which is cell death. The aim of my thesis was to investigate how UV-inactivated AAV2 kilts p53-deficient cancer cells. I found that the UV-AAV2-induced DNA damage signalling induces centriole overduplication in infected cells. The virus is able to uncouple the centriole duplication cycle from the cell cycle, leading to amplified centrosome numbers. Chk1 colocalises with centrosomes in the infected cells and the centrosome overduplication is dependent on the presence of Chk1, as well as on the activities of ATR and Cdk kinases and on the G2 arrest. The UV-AAV2-induced DNA damage signalling inhibits the degradation of cyclin B 1 and securin by the anaphase promoting complex, suggesting that the spindle checkpoint is activated in these mitotic cells. Interference with the spindle checkpoint components Mad2 and BubR1 revealed that the UV-AAV2-provoked mitotic catastrophe occurs independently of spindle checkpoint function, This work shows that, in the p53 deficient cells, UV-AAV2 triggers mitotic catastrophe associated with a dramatic Chk1-dependent overduplication of centrioles and the consequent formation of multiple spindle poles in mitosis. Résumé Le virus associé à l'adénovirus type 2 (AAV2) est un petit virus contenant un simple brin d'ADN d'environ 4.7kb. Des expériences antérieures dans notre laboratoire ont montré que les liens intramoléculaires sur l'ADN de AAV2 provoqués paz l'irradiation aux ultraviolets (UV) ressemblent à une fourche de réplication bloquée, ce qui provoque une réponse aux dommages à l'ADN dans la cellule hôte. L'infection des cellules avec UV-AAV2 résulte en un arrêt du cycle cellulaire à la transition G2/M entraîné par les protéines ATR et Chk1. Cependant, les cellules tumorales auxquelles il manque le suppresseur de tumeur p53 ne peuvent pas tenir cet arrêt et entrent dans une mitose anormale et prolongée qui se terminera par la mort cellulaire. Le but de ma thèse était d'étudier comment l'AAV2 inactivé par l'irradiation UV tue les cellules cancéreuses n'ayant pas p53. Je montre ici que le signal de dommages à l'ADN induit par UV-AAV2 génère une surduplication des centrioles dans les cellules infectées. Le virus est capable de dissocier le cycle de duplication du centriole du cycle cellulaire ce qui crée un nombre amplifié de centrosomes. Chk1 est co-localisé avec le centrosome dans les cellules infectées et la swduplication du centrosome est dépendante de la présence de Chk1, de l'activité des kinases ATR et Cdk et de l'arrêt en G2 de la cellule. Le signal d'ADN endommagé induit par UV-AAV2 réprime la dégradation des protéines cycline B1 et securine par le complexe promoteur de l'anaphase (APC), ce qui suggère que le point de contrôle du fuseau mitotique est activé dans ces cellules en mitose. L'étude d'interférence avec des éléments du point de contrôle du fuseau mitotique, Mad2 et BubR1, a révélé que la catastrophe mitotique provoquée paz UV-AAV2 survient indépendamment du point de contrôle du fuseau mitotique. Ce travail montre que dans les cellules déficientes en p53, UV-AAV2 induit une catastrophe mitotique associée à une surduplication des centrioles dépendant de Chk1 et ayant pour conséquence dramatique la formation de multiples fuseaux mitotiques dans la cellule en mitose.

The role of Receptor Activator of NFKB Ligand (RANKL) in mammary gland development

Abstract : The female reproductive hormones estrogen, progesterone and prolactin control postnatal breast development and are important to breast carcinogenesis. The mechanisms by which they elicit proliferation and morphogenesis remain poorly understood. Using the mouse as a model to study the molecular mechanisms through which hormones elicit morphogenetic changes in the mammary gland in vivo, we found the Receptor Activator of NFκB Ligand, a Tumor Necrosis Factor family member, to be strongly induced by progesterone. Recent publications suggested that hormone dependant RANKURANK signals are involved in the terminal differentiation of mammary gland alveolar buds into lobulo-alveolar structures competent for lactation. I show that in the absence of epithelial RANKL a distinct earlier stage of mammary gland development, side branch formation, is blocked. RANKL acts as a major mediator downstream of progesterone; it is required for progesterone-induced paracrine proliferation and completely rescues the mutant phenotype when ectopically expressed in progesterone receptor (PR) KO mammary epithelia. RANKL is not required for cell autonomous division of estrogen receptor alpha (ERa) /PR positive cells. Cyclin D1, previously implicated as a mediator of RANKL, is not affected by ablation of RANKL and is not required for RANKL-induced paracrine proliferation but for the cell autonomous proliferation. Gene expression arrays to find specific RANKL downstream targets have identified Id4, ElfS and one secreted metalloprotease (Adamtsl8) as potential candidates validated by Q-RT-PCR. Interestingly, Id4 and Adamtsl8 are expressed by the myoepithelial cells. Their expression additionally coincides with RANKL mRNA expression at mid pregnancy, possibly implying a functional contribution of both genes to RANKL mediated sidebranch formation. ElfS in contrast, is found to be strongly expressed by the end of pregnancy supporting recent findings of a prolactin mediated regulation. As for RANKL, this gene was in particular induced in luminal cells. Taken together, I report that progesterone is the major proliferative stimulus in the adult mammary gland eliciting proliferation of ERaJPR positive cells by a cell autonomous, cyclin D1-dependent and a paracrine RANKL-dependent mechanism. My work moreover suggests, that RANKL acts as a major orchestrator affecting different downstream mediators, through which progesterone exerts its effects concomitantly on different cellular compartments. Résumé : Les hormones sexuelles telles que l'oestrogène, la progestérone et la prolactine contrôlent le développement postnatal du sein et sont impliquées dans la cazcinogenèse. Les mécanismes par lesquels elles induisent la prolifération et la morphogénèse demeurent incompris. En utilisant la souris comme modèle, J'ai trouvé que le ligand activateur du récepteur de NFκB, une protéine de la famille du facteur de nécrose des tumeurs, peut être fortement induit par la progestérone. Les publications récentes ont suggéré que cette protéine est nécessaire à la fin de la grossesse, quand les cellules sécrétrices du lait apparaissent. Par des techniques de transplantation d'épithélium, je montre contrairement aux études précédentes, qu'en l'absence de RANKL dans l'épithélium une partie distincte du développement mammaire, la formation de branches latérales, est bloquée. La progestérone agit de manière pazacrine par l'intermédiaire de 12ANKL pour induire la prolifération tandis que la mort cellulaire n'est pas affectée. De plus, l'injection d'une protéine recombinante RANKL dans une souris mutante pour le récepteur à la progestérone induit la prolifération des cellules épithéliales en l'absence de grossesse ; la surexpression de RANKL dans ces mêmes mutants mène à une réversion complète du phénotype. Mes expériences démontrent que la progestérone induit deux types distincts de prolifération. Un premier type direct dans laquelle les cellules positives au récepteur à la progestérone prolifèrent. Cette division cellulaire est alors indépendante de RANKL mais dépendante de la cycline D1. Le second type de prolifération est induit par un mécanisme pazacrine et dépend de RANKL mais pas de la cycline D1. Ici, les cellules négatives au récepteur à la progestérone prolifèrent. Pour détecter des gènes cibles de la voie de signalisation du RANKL, un profil d'expression des gènes a été généré. Les facteurs de transcription Id4, EIf5 et une métalloprotéase sécrétée (Adamtsl8) ont été identifiés en tant que cibles potentielles. D'autres analyses de validation démontrent qu'Id4, Adamtsl8, RANKL mais pas E1f5 sont fortement exprimés au cours de la grossesse, coïncidant avec la formation de branchements latéraux induit par progestérone. EIf5 s'est avéré être exprimé vers la fin de la grossesse appuyant des résultats récents proposant une régulation par la prolactine. Le système canalaire mammaire se compose de couches cellulaires: une couche interne de cellules luminales et une externe de cellules myoépithéliale. Les expériences génétiques d'expression ont révélé que RANKL. et E1f5 sont exprimés dans la partie luminale tandis qu'Id4 et Adamtsl8 sont dans les cellules myoépithéliales. En conclusion, je prouve que la progestérone est le stimulus principal induisant la prolifération dans la glande mammaire d'adulte. Deux mécanismes de prolifération sont impliqués: l'un direct dépendant de la cycline Dl et l'autre paracrine dépendant de RANKI.. Mon travail suggère par ailleurs que RANKL agit en tant que médiateur important, par lequel la progestérone exerce ses effets sur différents compartiments cellulaires tels que la coordination de la prolifération des cellules épithéliales avec la réorganisation de la matrice extracellulaire et de la membrane basale exigées pour la morphogénèse du système canalaire latéral.

De novo T cell generation and cell cycle analysis of CD4 and CD8 T cells during HIV-disease

RESUME POUR UN LARGE PUBLIC Parmi les globules blancs, les lymphocytes T 004 jouent un rôle primordial dans la coordination de la réponse immunitaire contre les pathogènes et les lymphocytes T CD8 dans leur élimination. Lors d'une infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1), non seulement les cellules T CD4 sont les principales cibles d'infections, mais aussi elles disparaissent progressivement tout au long de la maladie. Ce phénomène, appelé aussi épuisement des lymphocytes T CD4, est la principale cause provoquant le Syndrome d'Immunodéficience Acquise (SIDA). Malgré de grands efforts de recherche, nous ne sommes toujours pas en mesure de dire si ce phénomène est dû à un défaut dans la production de nouvelles cellules ou à une destruction massive de cellules en circulation. Dans cette étude, nous nous proposions, dans un premier temps, de comparer la production de nouvelles cellules T CD4 et CD8 chez des individus VIH-négatifs et positifs. Les cellules nouvellement produites portent un marqueur commun que l'on appelle TREC et qui est facilement mesurable. En considérant des paramètres cliniques, nous étions en mesure de déterminer le niveau de TRECs de cellules T CD4 et CD8 dans différentes phases de la maladie. De là, nous avons pu déterminer que le niveau de TREC est toujours plus bas dans les cellules T CD8 de patients VIH-positifs comparativement à notre groupe contrôle. Nous avons pu déterminer par une analyse ultérieure que cette différence est due à une forte prolifération de ces cellules chez les patients VIH-positifs, ce qui a pour effet de diluer ce marqueur. En revanche, la production de nouvelles cellules T CD4 chez des patients VIH-positifs est accentuée lors de la phase précoce de la maladie et largement réprimée lors de la phase tardive. Dans un second temps, nous avons effectué une analyse à grande échelle de l'expression de gènes associés à la division cellulaire sur des lymphocytes T CD4 et CD8 d'individus VIH-¬positifs et négatifs, avec comme contrôle des cellules proliférant in vitro. De cette étude, nous avons pu conclure que les cellules T CD8 de patients VIH-positifs étaient en état de prolifération, alors que les lymphocytes T CD4 présentaient des défauts majeurs conduisant à un arrêt de la division cellulaire. Nos résultats montrent que la capacité à produire de nouvelles cellules chez des patients VIH¬positifs reste active longtemps pendant la maladie, mais que l'incapacité des cellules T CD4 à proliférer peut enrayer la reconstitution immunitaire chez ces individus. ABSTRACT The hallmark of HIV-1 infection is the depletion of CD4 T cells. Despite extensive investigation, the mechanisms responsible for the loss of CD4 T cells have been elucidated only partially. In particular, it remains controversial whether CD4 T cell depletion results from a defect in T cell production or from a massive peripheral destruction. In this study, de novo T cell generation has been investigated by measuring T cell receptor rearrangement excision circles (TRECs) on large cohorts of HIV-negative (N=120) and HIV-1 infected (N=298) individuals. Analysis of TREC levels was performed in HIV-infected subjects stratified by the stage of HIV disease based on CD4 T cell counts (early: >500 CD4 T cells/µl; intermediate: <500>200; late: <200) and by age (20 to 60 years, n = 259). Our data show that TREC levels in CD8 T cells were significantly lower in HIV-infected subjects at any stage of disease compared to the control group. In contrast, TREC levels in CD4 T cells were significantly higher in HIV-infected subjects at early stages disease while no significant differences were observed at intermediate stages of the disease and were severely reduced only at late stages of disease. To investigate further the status of cell cycle in peripheral CD4 and CD8 T cells in HIV-1 infections, we determined the pattern of gene expression with the microarray technology. In particular, CD4 and CD8 T cells of HIV-1 infected and HIV-negative subjects were analysed by Cell Cycle cDNA expression array. The patterns of gene expression were compared to in vitro stimulated CD4 and CD8 T cells and this analysis showed that CD8 T cells of HIV-1 infected subjects had a pattern of gene expression very similar to that of in vitro stimulated CD8 T cells thus indicating ongoing cell cycling. In contrast, CD4 T cells of HIV-1 infected subjects displayed a complex pattern of gene expression. In fact, CD4 T cells expressed high levels of genes typically associated with cell activation, but low levels of cell cycle genes. Therefore, these results indicated that activated CD4 T cells of HIV-1 infected subjects were in cell cycle arrest. Taking together these results indicate that thymus function is preserved for long time during HIV- 1 infection and the increase observed in early stage disease may represent a compensatory mechanism to the depletion of CD4 T cells. However, we provide evidence for a cell cycle arrest of peripheral CD4 T cells that may prevent potentially the replenishment of CD4 T cells. RESUME Les mécanismes responsables de la perte des lymphocytes T CD4 lors de l'infection pas VIH n'ont été élucidés que partiellement. Nous ne savons toujours pas si l'épuisement des lymphocytes T CD4 résulte d'un défaut dans la production de cellules ou d'une destruction périphérique massive. Dans cette étude, la production de cellules T a été étudiée en mesurant les cercles d'excision générés lors du réarrangement du récepteur au cellules T (TRECs) chez des individus VIH-négatifs (N=120) et VIH-1 positifs (N=298). L'analyse des niveaux de TREC a été faite chez sujets HIV-infectés en considérant les phases de la maladie sur la base des comptes CD4 (phase précoce: > 500 cellules CD4/µl; intermédiaire: < 500>200; tardive: < 200) et par âge. Nos données démontrent que les niveaux de TRECs des cellules T CD8 étaient significativement plus bas chez les sujets VIH-1 infectés, à tous les stades de la maladie comparativement au groupe contrôle. En revanche, les niveaux de TRECs des cellules T CD4 étaient significativement plus élevés chez les sujets VIH-1 infectés durant la phase précoce de la maladie, tandis qu'aucune différence significative n'était observée durant la phase intermédiaire et étaient très réduits dans la phase tardive. Dans une deuxième partie, nous avons utilisé la technique des biopuces à d'ADN complémentaire pour analyser la régulation du cycle cellulaire chez les lymphocytes T CD4 et CD8 périphériques lors d'une infection au VIH-1. Des profils d'expression ont été déterminés et comparés à ceux de cellules T CD4 et CD8 stimulées in vitro, démontrant que les cellules T CD8 des sujets VIH-positifs avaient un profil d'expression très semblable à celui des cellules stimulées in vitro en prolifération. En revanche, les lymphocytes T CD4 des sujets VIH-1 positifs avaient un profil d'expression de gène plus complexe. En fait, leur profil montrait une sur- expression de gènes associés à une activation cellulaire, mais une sous-expression de ceux induisant une division. Ainsi, ces résultats indiquent que les lymphocytes T CD4 d'individus VIH-positifs présentent des dérégulations qui conduisent à un arrêt du cycle cellulaire. Ces résultats montrent que la fonction thymique est préservée longtemps pendant l'infection au VIH-1 et que l'augmentation de la quantité de TRECs dans la phase précoce de la maladie peut représenter un mécanisme compensatoire à l'épuisement des cellules T CD4. Cependant, nous démontrons aussi un clair dysfonctionnement du cycle cellulaire chez les cellules T CD4 d'individus infectés par VIH-1 ce qui peut enrayer la reconstitution du système immunitaire.

Clic4, a novel protein that sensitizes ß-cells to apoptosis.

Introduction: La préservation et/ou l'expansion de la masse des cellules ß pourraient constituer des approches prometteuses dans le traitement du diabète. L'une des stratégies clés serait de réduire l'apoptose des cellules ß. Le chloride intracellular channel protein 4 (Clic4) est une protéine exprimée de manière ubiquitaire et supposée agir dans de nombreux processus cellulaires tels que le contrôle du cycle cellulaire, la différenciation cellulaire et l'apoptose. Ici, nous avons étudié le rôle de Clic4 dans l'apoptose des cellules ß pancréatiques en utilisant des cellules ßTC-tet et des îlots de Langerhans issus de souris knockout pour Clic4 (ßClic4KO). Résultats: L'expression de l'ARNm et de la protéine Clic4 était augmentée par un traitement aux cytokines dans les cellules ßTC-tet et encore plus fortement dans des îlots isolés de souris. De plus, la sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet diminuait leur sensibilité à l'apoptose induite par les cytokines. La sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet n'affectait pas l'expression des ARNm de Bcl-2 et Bad, mais augmentait leur expression protéique ainsi que la forme phosphorylée de Bad. Les mêmes résultats ont été obtenus sur des îlots isolés de souris contrôles et ßClic4KO. De plus, les îlots issus de souris ßClic4KO présentaient une augmentation de l'expression de la protéine Bcl-xL. Dans le but de déterminer si Clic4 augmentait l'expression de Bcl-2 et Bad via une interaction protéique directe, nous avons immunoprécipité Clic4 à partir de cellules ßTC-tet à l'aide d'anticorps dirigés contre la partie C- ou N-terminale de la protéine, puis nous avons soumis les immunoprécipités à une analyse de spectrométrie de masse. Aucune co- immunoprécipitation avec Bcl-2 ou d'autres protéines de la famille Bcl-2 n'a été détectée. Cependant, de manière intéressante, Clic4 était co-purifié avec plusieurs protéines du protéasome suggérant un rôle de Clic4 dans la dégradation des protéines. Par conséquent, nous avons étudié la demi-vie de Bcl-2 et Bad, et avons observé que la sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet augmentait la demi-vie de ces protéines. De plus, l'expression de l'ARNm et de la protéine Clic4 était également augmentée lors d'un stress du réticulum endoplasmique induit par la thapsigargine dans les cellules ßTC-tet. La sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet ou chez les KO diminuait la sensibilité des cellules ß à l'apoptose induite par la thapsigargine ou l'acide palmitique, respectivement. Conclusion: Ces résultats suggèrent que Clic4 sensibilise les cellules ß à l'apoptose induite par les cytokines ou l'acide palmitique/thapsigargine (stress du réticulum endoplasmique). De plus, la sous-expression de Clic4 améliore la survie des cellules ß en diminuant la dégradation de Bcl-2 et Bcl-xL, et en augmentant le niveau total de Bad phosphorylé, peut-être suite à une interaction de Clic4 avec le protéasome.

On the transcriptional role of NLRC5 and the function of NLRC5-driven MHC class I expression in the immune system

Major histocompatibility complex (MHC) molecules are of crucial importance for the immune system to recognize and defend the body against external attacks. Foreign antigens are presented by specialized cells, called antigen presenting cells, to T lymphocytes in the context of MHC molecules, thereby inducing T cell activation. In addition, MHC molecules are essential for Natural Killer (NK) cell biology, playing a role in NK cell education and activation. Recently, the NOD-like receptor (NLR) family member NLRC5 (NLR caspase recruitment domain containing protein 5) was found to act as transcriptional regulator of MHC class I, in particular in T and NK cells. Its role in MHC class I expression is however minor in dendritic cells (DCs). This raised the question of whether inflammatory conditions, which augment the levels of NLRC5 in DCs, could increase its contribution to MHC class I expression. Our work shows that MHC class I transcript and intracellular levels depend on NLRC5, while its role in MHC class I surface expression is instead negligible. We describe however a general salvage mechanism that enables cells with low intracellular MHC class I levels to nevertheless maintain relatively high MHC class I on the cell surface. In addition, we lack a thorough understanding of NLRC5 target gene specificity and mechanism of action. Our work delineates the unique consensus sequence in MHC class I promoters required for NLRC5 recruitment and pinpoints conserved features conferring its specificity. Furthermore, through genome-wide analyses, we confirm that NLRC5 regulates classical MHC class I genes and identify novel target genes all encoding non-classical MHC class I molecules exerting an array of functions in immunity and tolerance. We finally asked why a dedicated factor co-regulates MHC class I expression specifically in T and NK lymphocytes. We show that deregulated NLRC5 expression affects the education of NK cells and alters the crosstalk between T and NK cells, leading to NK cell-mediated killing of T lymphocytes. Altogether this thesis work brings insights into molecular and physiological aspects of NLRC5 function, which might help understand certain aspects of immune responses and disorders. -- Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) sont essentielles au système immunitaire pour l'initiation de la réponse immunitaire. En effet, l'activation des lymphocytes T nécessite la reconnaissance d'un antigène étranger présenté par les cellules présentatrices d'antigènes sur une molécule du CMH. Les molécules du CMH ont également un rôle fondamental pour la fonction des cellules Natural Killer (NK) puisqu'elles sont nécessaires à leur processus d'éducation et d'activation. Récemment, NLRC5 (NLR caspase recruitment domain containing protein 5), un membre de la famille des récepteurs de type NOD (NLRs), a été décrit comme un facteur de transactivation de l'expression des gènes du CMH de classe I. A l'état basai, cette fonction transcriptionnelle est essentielle dans les lymphocytes T et NK, alors que ce rôle reste mineur pour l'expression des molécules du CMH de classe I dans les cellules dendritiques (DCs). Dans des conditions inflammatoires, l'expression de NLRC5 augmente dans les DCs. Notre travail démontre que, dans ces conditions, les transcrits et les niveaux intracellulaires des molécules du CMH de classe I augmentent aussi d'une façon dépendante de NLRC5. A contrario, le rôle de NLRC5 sur les niveaux de molécules de surface reste minoritaire. Cette observation nous a conduits à l'identification d'un mécanisme général de compensation qui permet aux cellules de maintenir des niveaux relativement élevés de molécules de CMH de class I à leur surface malgré de faibles niveaux intracellulaires. De plus, il semblait nécessaire de s'orienter vers une approche plus globale afin de déterminer l'étendue de la fonction transcriptionnelle de NLRC5. Par une approche du génome entier, nous avons pu décrire une séquence consensus conservée présente dans les promoteurs des gènes du CMH de classe I, sur laquelle NLRC5 est spécifiquement recruté. Nous avons pu également identifier de nouveaux gènes cibles codant pour des molécules de CMH de classe I non classiques impliqués dans l'immunité et la tolérance. Finalement, nous nous sommes demandé quel est l'intérêt d'avoir un facteur transcriptionnel, en l'occurrence NLRC5, qui orchestre l'expression du CMH de classe I dans les lymphocytes T et NK. Nous montrons que la dérégulation de l'expression de NLRC5 affecte l'éducation des cellules NK et conduit à la mort cellulaire des lymphocytes T médiée par les cellules NK. Dans l'ensemble ce travail de thèse contribue à la caractérisation du rôle de NLRC5, tant au niveau moléculaire que physiologique, ce qui présente un intérêt dans le cadre de la compréhension de certains aspects physiopathologique de la réponse immunitaire.

Contributions of fat protein to the incretin effect of a mixed meal

La régulation de la glycémie est une fonction complexe de l'organisme faisant intervenir de multiples mécanismes. Lors de la prise alimentaire, l'un des mécanismes impliqués dans l'homéostasie glucidique, notamment dans la sécrétion d'insuline, est l'axe entéroinsulaire. En effet, le contact des nutriments avec des cellules spécialisées réparties le long du tractus digestif déclenche la sécrétion d'hormones, appelées incretines, telles que le GLP-1 ou le GIP. Ces hormones gastro-intestinales potentialisent la sécrétion d'insuline (effet incrétine) et sont responsables d'une grande partie de la réponse insulinique à la prise orale de glucose.¦L'importance de ces hormones est particulièrement mise en évidence par des observations faites chez les sujets obèses ayant bénéficié d'une chirurgie bariatrique. En effet, après l'opération, la sensibilité à l'insuline et sa sécrétion sont améliorées chez des patients obèses diabétiques ou intolérants au glucose, alors que le pattern de sécrétion des hormones GI est nettement modifié avec notamment une augmentation de la sécrétion de GLP-1. L'augmentation de la sécrétion de ces hormones pourrait contribuer à l'amélioration de la tolérance glucidique en augmentant la sécrétion d'insuline en réponse à l'apport de nutriments. Cette activation exagérée de l'axe entéro-insulaire pourrait aussi contribuer à la pathogenèse des hypoglycémies postprandiales survenant parfois après un bypass gastrique¦Néanmoins, si le rôle des hormones gastro-intestinales est indubitale, il y a peu de données nous indiquant le rôle respectif des divers macronutriments composant un repas standard dans I'activation de l'axe entéro-insulaire. Dans ce travail, nous avons cherché à préciser le rôle spécifique de la partie lipidique et protéique d'un repas standard.¦Après avoir confirmé l'existence d'un effet incrétine lors de la consommation d'un repas test sous forme d'un sandwich, les résultats que nous avons obtenus montrent que l'ingestion de lipides en quantité correspondant à celle d'un repas standard augmente la sécrétion d'insuline, contribuant ainsi à l'effet incrétine, alors qu'à contrario, l'ingestion de protéines ne provoque pas d'augmentation de l'insulinémie et ainsi ne contribue pas à l'effet incrétine.¦Ces observations pourraient revêtir un intérêt pratique. En effet, la démonstration du rôle prépondérant d'un macronutriment dans l'effet incrétine suivant la prise d'un repas standard pourrait mener à des prescriptions diététiques dans le but d'améliorer le contrôle glycémique chez des patients diabétiques ou de diminuer les hypoglycémies suivant la prise alimentaire chez certains patients ayant bénéficié d'un bypass gastrique. De même, une meilleure compréhension du rôle des hormones incrétines a déjà ouvert de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type 2 avec le développement de nouvelles classes de médicaments telles que les analogues du GLP-1 ou les inhibiteurs de sa dégradation.

Control of gene expression in melanocytes and RPE by conserved distal regulatory elements

Résumé Durant le développement embryonnaire, les cellules pigmentaires des mammifères se développent à partir de deux origines différentes : les melanocytes se développent à partir de la crête neurale alors que les cellules de la rétine pigmentaire (RP) ont une origine neuronale. Un grand nombre de gènes sont impliqués dans la pigmentation dont les gènes de la famille tyrosinase à savoir Tyr, Tyrp1 et Dct. Certaines études ont suggéré que les gènes de la pigmentation sont régulés de manière différentielle dans les mélanocytes et dans la RP. Dans ce travail, les gènes de la famille tyrosinase ont été étudiés comme modèle de la régulation des gènes de la pigmentation par des éléments régulateurs agissant à distance. II a été montré que le promoteur du gène Tyrp1pouvait induire l'expression d'un transgène uniquement dans la RP alors que ce gène est aussi exprimé dans les mélanocytes comme le montre le phénotype des souris mutantes pour Tyrp1. Ce résultat suggère que les éléments régulateurs du promoteur sont suffisants pour l'expression dans la RP mais pas pour l'expression dans les mélanocytes. J'ai donc cherché à identifier la séquence qui régule l'expression dans les mélanocytes. Un chromosome artificiel bactérien (CAB) contenant le gène Tyrp1 s'est avéré suffisant pour induire l'expression dans les mélanocytes, comme démontré par la correction du phénotype mutant. La séquence de ce CAB contient plusieurs régions très conservées qui pourraient représenter de nouveaux éléments régulateurs. Par la suite, j'ai focalisé mon analyse sur une séquence située à -I5 kb qui s'est révélée être un amplificateur spécifique aux mélanocytes comme démontré par des expériences de cultures cellulaire et de transgenèse. De plus, une analyse poussée de cet élément a révélé que le facteur de transcription Sox 10 représentait un transactivateur de cet amplificateur. Comme pour Tyrp1, la régulation du gène tyrosinase est contrôlée par différents éléments régulateurs dans les mélanocytes et la RP. Il a été montré que le promoteur de tyrosinase n'était pas suffisant pour une forte expression dans les mélanocytes et la RP. De plus, l'analyse de la région située en amont a révélé la présence d'un amplificateur nécessaire à l'expression dans les mélanocytes à la position -15 kb. Cet amplificateur n'est toutefois pas actif dans la RP mais agit comme un répresseur dans ces cellules. Ces résultats indiquent que certains éléments nécessaires à l'expression dans les deux types de cellules pigmentaires sont absents de ces constructions. Comme pour Tyrp1, j'ai en premier lieu démontré qu'un CAB était capable de corriger le phénotype albinique, puis ai inséré un gène reporter (lacZ) dans le CAB par recombinaison homologue et ai finalement analysé l'expression du reporter en transgenèse. Ces souris ont montré une expression forte du lacZ dans les mélanocytes et la RP, ce qui indique que le CAB contient les séquences régulatrices nécessaires à l'expression correcte de tyrosinase. Afin de localiser plus précisément les éléments régulateurs, j'ai ensuite généré des délétions dans le CAB et analysé l'expression du lacZ en transgenèse. La comparaison de séquences génomiques provenant de différentes espèces a permis par la suite d'identifier des régions représentant de nouveaux éléments régulateurs potentiels. En utilisant cette approche, j'ai identifié une région qui se comporte comme un amplificateur dans la RP et qui est nécessaire à l'expression de tyrosinase dans ce tissu. De plus, j'ai identifié les facteurs de transcription Mitf et Sox10 comme transactivateurs de l'amplificateur spécifique aux mélanocytes situé à -15 kb. L'identification et la caractérisation des ces éléments régulateurs des gènes tyrosinase et Tyrp1confirme donc que la régulation différentielle des gènes dans les mélanocytes et la RP est liée à des éléments régulateurs séparés. Summary Pigment cells of mammals originate from two different lineages: melanocytes arise from the neural crest, whereas cells of the retinal pigment epithelium (RPE) originate from the optic cup of the developing forebrain. A large set of genes are involved in pigmentation, including the members of the tyrosinase gene family, namely tyrosinase, Tyrp1 and Dct. Previous studies have suggested that pigmentation genes are differentially regulated in melanocytes and RPE. In this work, the tyrosinase gene family was used as a model for studying the involvement of distal regulatory elements in pigment cell-specific gene expression. The promoter of the Tyrp1 gene has been shown to drive detectable transgene expression only to the RPE, even though the gene is also expressed in melanocytes as evident from Tyrp1-mutant mice. This indicates that the regulatory elements responsible for Tyrp1 gene expression in the RPE are not sufficient for expression in melanocytes. I thus searched for a putative melanocyte-specific regulatory sequence and demonstrate that a bacterial artificial chromosome (BAC) containing the Tyrp1 gene and surrounding sequences is able to target transgenic expression to melanocytes and to rescue the Tyrp1 b (brown) phenotype. This BAC contains several highly conserved non-coding sequences that might represent novel regulatory elements. I further focused on a sequence located at -15 kb which I identified as amelanocyte-specific enhancer as shown by cell culture and transgenic mice. In addition, further functional analysis identified the transcription factor Sox10 as being able to bind and transactivate this enhancer. As for Tyrp1, tyrosinase gene regulation is mediated by different cis-regulatory elements in melanocytes and RPE. It was shown that the tyrosinase promoter was not sufficient to confer strong and specific expression in melanocytes and RPE. Moreover, analysis of tyrosinase upstream sequence, revealed the presence of a specific enhancer at position -15 kb which was necessary to confer strong expression in melanocytes. This enhancer element however failed to act as an enhancer in the RPE, but rather repressed expression. This indicates that some regulatory elements required for tyrosinase expression in both RPE and melanocytes are still missing from these constructs. As for Tyrp1, I first demonstrated that a BAC containing the Tyr gene is able to rescue the Tyr c (albino) phenotype in mice, then I inserted a lacZ reporter gene in the BAC by homologous recombination, and finally analysed the pattern of lacZ expression in transgenic mice. These mice showed strong lacZ expression in both RPE and melanocytes, indicating that the BAC contains the regulatory sequences required for proper tyrosinase expression. In order to localize more precisely these regulatory elements, I have then generated several deletions in the BAC and analysed lacZ expression in transgenic mice. Multi-species comparative genomic analysis then allowed identifying conserved sequences that potentially represent novel regulatory elements. Using this experimental approach, I identified a region that behaves as a RPE-specific enhancer and that is required for tyrosinase expression in the retina] pigment epithelium. In addition, I identified the transcription factors Mitf and Sox l0 as being transactivators of the melanocyte-specific enhancer located at -l5 kb. The identification and characterization of these tyrosinase and Tyrp1 distal regulatory element supports the idea that separate regulatory sequences mediate differential gene expression in melanocytes and RPE.

Role of amphiregulin in mammary gland development

Abstract Ovarian hormones are key regulators of postnatal mammary gland development and are linked to breast carcinogenesis. In particular, estrogens induce mammary epithelial cells to proliferate at the onset of puberty, leading to the elongation of the rudimental ductal tree into the fatty stromal tissue. Elucidating the molecular events underlying estrogen mitogenic activity in the mammary gland is of value in understanding how the deregulation of this signalling pathway can lead to breast tumorigenesis. Our lab has recently shown that estrogen induces mammary proliferation via epithelial estrogen receptor alpha (ERα) by a paracrine mechanism. Based on the finding that several EGF receptor (EGFR) ligands are able to substitute for estrogens and that amphiregulin (Areg), one of these ligands, is required during mammary development, we have hypothesized that Areg is a key mediator of estrogen induced paracrine signalling during ductal morphogenesis. Our analysis of the Areg -/- mice mammary phenotype reveals that epithelial Areg is required at the onset of puberty for epithelial proliferation, terminal end bud (TEB) formation and, subsequently, ductal elongation. Hormonal stimulation experiments show that among the EGFR ligands, only Arég is specifically controlled by estrogen at the transcriptional level, via ERα, in the mammary gland. Moreover, Areg is required for the estrogen-induced mammotrophic effects of epithelial proliferation and ductal elongation. We have shown that ectopic Areg expression in ERα -/- mammary epithelial cells is sufficient to induce ductal morphogenesis. Our transplantations experiment show that when Areg -/- cells are in the presence of wt cells they contribute to all aspects of ductal development, suggesting that this growth factor acts in a paracrine fashion. Moreover, this result shows that Areg -/- epithelial cells are not intrinsically impaired in proliferation. Our transplantation experiment carried out under physiological conditions confirmed previous reports showing that stromal EGFR is needed for ductal morphogenesis. This suggests that estrogen-driven Areg signalling involves an epithelium-stroma crosstalk. Thus, these data confirmed our hypothesis of Areg being an important estrogen mediator during ductal morphogenesis. Résumé Les hormones ovariennes, régulatrices clés du développement post-natal de la glande mammaire, sont également liées à la carcinogénèse du sein. En particulier, l'oestrogène induit la division des cellules épithéliales au début de la puberté. Cette prolifération amène à l'élongation du réseau canalaire rudimentaire et permet l'invasion du compartiment stromal. L'élucidation des mécanismes moléculaires responsables de l'activité mitogénique de l'oestrogène dans la glande mammaire est précieuse pour une meilleure compréhension du développement du cancer du sein. Notre laboratoire a récemment démontré que l'cestrogène induit la prolifération des cellules épithéliales par un signal paracrine, grâce au récepteur à l'oestrogène alpha (ERα). En se basant sur le fait que plusieurs ligands du récepteur à l'EGF (EGFR) sont capables de se substituer à l'cestrogène et d'induire la prolifération épithéliale et qu'amphiregulin (Areg), un de ces ligands, est essentielle au développement de la glande mammaire, nous avons émi l'hypothèse que Areg est un médiateur essentiel du signal paracrine induit par l'oestrogène pendant la croissance du système canalaire. Nos analyses phénotypiques des glandes mammaires issues de souris transgéniques Areg -/- démontrent que cette protéine est indispensable à la prolifération des cellules épithéliales mammaires au début de la puberté et à la formation des bourgeons terminaux qui conduisent à l'élongation des canaux. Nos expériences de stimulations hormonales démontrent que, parmi l'ensemble des ligands du EGFR, seule Areg est contrôlée au niveau transcriptionnel par l'cestrogène dans la glande mammaire, ceci via le récepteur ERα. De plus, Areg est essentielle pour le effets mammotrophique induit par l'cestrogène, à savoir la prolifération épithéliál et la croissance du système canalaire. Par ailleurs, l'expression ectopique d'Areg dans des cellules epithéliales mammaires de souris transgéniques ERα -/- est suffisante pour permettre la formation du réseau canalaire. En présence de cellules normales, les cellules dépourvues du gène d'Areg contribuent à la formation des canaux. Cette expérience suggère que ce facteur de croissance agit de manière paracrine. De plus, ce résultat montre que les cellules épithéliales Areg -/- conservent leur potentiel prolifératif. Nos expériences de transplantation, réalisées dans des conditions physiologiques, ont confirmé des précédentes études qui montraient que le récepteur stromal à l'EGF est nécessaire pour la morphogénèse du système canalaire. Ceci suggère que la voie de signalisation activée par l'oestrogène et dépendante d' implique une communication entre l'épithélium et le stroma. Ainsi, ces résultats valident notre hypothèse puisqu'ils confirment Areg en tant que médiateur majeur de l'oestrogène dans la morphogénèse du système canalaire.