909 resultados para Lymphocyte T CD8
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La prot��ine AID (d��aminase induite par l���activation) joue un r��le central dans la r��ponse immunitaire adaptative. En d��saminant des d��soxycytidines en d��soxyuridines au niveau des g��nes immunoglobulines, elle initie l���hypermutation somatique (SHM), la conversion g��nique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle �� une r��ponse humorale efficace en contribuant �� la maturation de l���affinit�� des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activit�� mutag��nique peut ��tre oncog��nique et causer une instabilit�� g��nomique propice au d��veloppement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de r��guler AID, en particulier ses niveaux prot��iques, pour g��n��rer une r��ponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d���autoimmunit��. Un ��l��ment de r��gulation est le fait qu���AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique �� l�����quilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue �� r��duire sa pr��sence �� proximit�� de l���ADN. Le but de cette th��se ��tait d���identifier de nouveaux partenaires et d��terminants d���AID r��gulant sa stabilit�� et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifi�� AID comme une nouvelle prot��ine cliente d���HSP90. Nous avons montr�� qu���HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui emp��che la poly-ubiquitination d���AID et sa d��gradation par le prot��asome. En cons��quence, l���inhibition d���HSP90 r��sulte en une diminution significative des niveaux endog��nes d���AID et corr��le avec une r��duction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l���introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montr�� que l�����tape initiale dans la stabilisation d���AID par la voie de chaperonnage d���HSP90 d��pend d���HSP40 et d���HSP70. En particulier, la prot��ine DnaJa1, qui fait partie de la famille des prot��ines HSP40s, limite la stabilisation d���AID dans le cytoplasme. La farn��sylation de DnaJa1 est importante pour l���interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son ��tat de farn��sylation impacte �� la fois les niveaux endog��nes d���AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- pr��sentent une r��ponse immunitaire compromise en cas d���immunisation, qui est d��e �� des niveaux r��duits d���AID et un d��faut de commutation de classe. Dans un troisi��me temps, nous avons montr�� que la prot��ine AID est intrins��quement plus instable que sesprot��ines paralogues APOBEC. Nous avons identifi�� l���acide aspartique en seconde position d���AID ainsi qu���un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilit�� d���AID. La modification de ces motifs augmente la stabilit�� d���AID et r��sulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l���instabilit�� intrins��que d���AID est un ��l��ment de r��gulation de la diversification des anticorps. Cette instabilit�� est en partie compens��e dans le cytoplasme par l���action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l���utilisation d���inhibiteurs d���HSP90 ou de farn��syltransf��rases pourrait ��tre un outil int��ressant pour la modulation indirecte des niveaux d���AID et le traitement de lymphomes/leuc��mies et de maladies auto-immunes caus��s par AID.
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Cryptococcus neoformans var. grubii est responsable de la majeure partie des infections au Cryptococcus chez les individus infect��s au VIH-1. Cryptococcus gattii infecte g��n��ralement les personnes immunocomp��tentes. Afin de comprendre les m��canismes responsables de la susceptibilit�� diff��rentielle de ces esp��ces lors de l���infection au VIH-1, nous avons ��tabli et caract��ris�� un mod��le novateur de la cryptococcose chez des souris transg��niques (Tg) CD4C/HIVMutA exprimant des g��nes du VIH-1, et qui d��veloppent une maladie similaire au SIDA. Les objectifs sont de d��montrer une diff��rence significative au niveau de la survie, de la r��ponse inflammatoire et du recrutement cellulaire pulmonaire en fonction de la pr��sence du transg��ne et de l���esp��ce de Cryptococcus inocul��e. Des analyses de survie, d���histopathologie et de cytom��trie en flux sur les populations cellulaires pulmonaires ont ��t�� effectu��es. Les souris Tg infect��es avec C. neoformans H99 ou C23 ont d��montr�� une survie r��duite et une augmentation de la diss��mination comparativement aux souris non-Tg, contrairement aux souris Tg infect��es au C. gattii R265 ou R272. L���examen histopathologique des poumons de souris Tg infect��es au H99 a montr�� une faible r��ponse inflammatoire, contrairement aux souris non-Tg. Pour la souche R265, il y avait une tr��s faible r��ponse inflammatoire chez les deux types de souris. Enfin, l�����tude des populations cellulaires du poumon a r��v��l�� chez les souris Tg une augmentation des pourcentages de macrophages interstitiels et de cellules polymorphonucl��aires, ainsi qu���une diminution des lymphocytes T CD4+ et CD8+, ind��pendamment de l���infection au Cryptococcus. Ce mod��le novateur repr��sente donc un outil tr��s pertinent pour l�����tude de l���immunopathogen��se de la cryptococcose dans le contexte du VIH.
Resumo:
M��moire num��ris�� par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit�� de Montr��al.
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M��moire num��ris�� par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit�� de Montr��al.
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Les premi��res cellules prog��nitrices lympho-my��lo��des (LMPP) entrent dans le thymus et commencent leur processus de diff��renciation au stade double n��gatif (DN, CD4-CD8-). Apr��s un r��arrangement fonctionnel de la chaine b��ta de leur r��cepteur des cellules T (RCT), les cellules re��oivent des signaux de diff��renciation, de prolif��ration, de survie et de s��lection et passent au stade double positif (DP, CD4+CD8+). Ensuite, la chaine alpha du RCT est r��arrang��e et test��e via les s��lections positive et n��gative. Si le RCT re��oit un signal ni trop fort, ni trop faible, les cellules passent au stade simple positif o�� elles exprimeront soit la mol��cule CD4 ou CD8. ERK3, une MAPK non-conventionnelle, joue un r��le important dans le d��veloppement thymique. Des ��tudes pr��c��dentes ont d��montr�� qu���une d��ficience en ERK3 diminue de 50 % la cellularit�� thymique et de 75% le nombre de cellules simples positives CD4 (CD4SP). Nous avons pos�� comme hypoth��ses qu���il y a une augmentation de l���apoptose chez les thymocytes DP de souris Erk3-/- et que cette d��ficience chez les thymocytes DP affecterait la s��lection positive des cellules DP, r��duisant ainsi le nombre de thymocytes CD4SP. Afin de v��rifier la premi��re hypoth��se, nous avons regard�� les niveaux d���apoptose gr��ce �� la cytom��trie en flux et par immunohistochimie. Dans les deux cas, nous ��tions incapables de d��tecter une diff��rence du niveau d���apoptose chez les thymocytes DP entre les souris Erk3+/+ et Erk3-/-. Ensuite, nous nous sommes pos��s la question suivante : La demi-vie des thymocytes DP Erk3-/- ��tait-elle plus courte que le type sauvage? La demi-vie des thymocytes DP a ��t�� mesur��e �� l���aide de l�����tude des r��arrangements secondaires de la chaine alpha du RCT par PCR semi-quantitatif et �� l���aide de cultures de thymus f��taux. En effet, ERK3 semble important pour prolonger la demi-vie des thymocytes DP. Ensuite, nous avons utilis�� des marqueurs cellulaires diff��rentiels (CD69, CD5 et RCT) pour regarder si les thymocytes DP sont capables de passer la s��lection positive. En effet, il y a moins de thymocytes DP Erk3-/- qui sont CD69fort, CD5fort et RCTfort. Finalement, nous voulons savoir si les fonctions de ERK3 passent par MK5, son seul partenaire d���interaction connu �� ce jour. Apr��s la caract��risation du thymus de la souris Mk5-/-, nous observons que seulement la r��duction du nombre de thymocytes CD4SP est identique �� celle des thymocytes CD4SP de la souris Erk3-/-. En conclusion, ces r��sultats r��v��lent des fonctions importantes pour la mol��cule ERK3 lors du processus de s��lection positive, le maintient de la demi-vie des thymocytes DP et lors de la r��gulation de d��veloppement thymique de mani��re MK5-d��pendante et -ind��pendante.
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MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DO�� that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO ��1 and ��1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed ��1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone���s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII �� chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.
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La scl��rose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire d��my��linisante et neurod��g��n��rative du syst��me nerveux central (SNC). Les cellules T activ��es qui expriment le PD-1 sont inhib��es via l���interaction avec l���un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des ��tudes effectu��es chez le mod��le murin de la SEP, l���enc��phalomy��lite auto-immune exp��rimentale (EAE), ont d��montr�� que l���interaction du PD-1 avec ses ligands contribue �� att��nuer la maladie. Toutefois, le r��le du PD-1 et de ses ligands dans la pathogen��se de la SEP chez l���humain et dans le mod��le murin n���a pas ��t�� compl��tement ��lucid��. Nous avons d��termin�� que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de fa��on significative cette expression en r��ponse �� des cytokines inflammatoires. Le blocage de l���expression du PD-L1 par les astrocytes �� l���aide de siRNA sp��cifiques m��ne �� l���augmentation significative des r��ponses des cellules T CD8+ (prolif��ration, cytokines, enzymes lytiques). Nos r��sultats ��tablissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les r��ponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus c��r��braux post-mortem par immunohistochimie d��montre que dans les l��sions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus ��lev��s que dans les tissus de t��moins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moiti�� des lymphocytes T CD8+ ayant infiltr�� des l��sions de SEP n���expriment pas le r��cepteur PD-1. Au cours du d��veloppement de l���EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprim�� par les cellules T d��s le d��but des sympt��mes, mais son intensit�� diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoy�� par le PD-L1. Nous avons observ�� que les cellules endoth��liales humaines formant la barri��re h��mato-enc��phalique (BHE) expriment de fa��on constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l���expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprim��s par les cellules endoth��liales ont la capacit�� de freiner l���activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration �� travers la BHE. L���endoth��lium du cerveau des tissus normaux et des l��sions SEP n���exprime pas des taux d��tectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moiti�� de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des l��sions SEP. Nos travaux d��montrent que l���entr��e des cellules T activ��es est contr��l��e dans des conditions physiologiques gr��ce �� la pr��sence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l���expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les l��sions SEP nuit au contr��le de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ ��tant d��pourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprim�� par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activ��es.
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La vaccination ADN �� l���aide de plasmides codant pour des autoantig��nes s���est av��r��e efficace dans la protection contre plusieurs maladies auto-immunes. Le but de ce m��moire ��tait dans un premier temps d�����tablir si un protocole de vaccination ADN compos�� de 3 injections de pCMV-CTLA-4-NP et de pVR-IL-12 �� deux semaines d���intervalle avait un effet protecteur contre le d��veloppement d���une h��patite auto-immune chez la souris TTR-NP, un mod��le murin transg��nique de la maladie et pr��c��demment d��velopp�� au laboratoire. Dans un deuxi��me temps, le but ��tait d�����lucider, le cas ��ch��ant, les m��canismes sous-tendant la protection conf��r��e par la vaccination ADN. Les hypoth��ses initiales ��taient qu���une protection allait effectivement ��tre conf��r��e par la vaccination ADN et que celle-ci pouvait ��tre attribuable �� une d��viation de la r��ponse typiquement Th1 de la maladie vers une r��ponse Th2, �� un ��puisement des cellules immunitaires et/ou �� l���activation et �� l���induction de prolif��ration de cellules r��gulatrices. Les r��sultats montrent que la vaccination ADN induit une protection transitoire contre le d��veloppement d���infiltrations lymphocytaires au foie. Cette protection se ferait via un ��puisement des cellules CD4+, CD8+ et CD19+ se retrouvant �� la rate et exprimant PD 1 dans une plus forte proportion �� 3 mois, et ne serait m��di��e ni par les lymphocytes T r��gulateurs CD4+CD25+FoxP3+, ni par les cellules CD8+FoxP3+. Une d��viation de la r��ponse Th1 vers une r��ponse Th2 demeure une explication suppl��mentaire plausible �� la protection conf��r��e mais n��cessiterait une caract��risation en situation plus physiologique avant de pouvoir inf��rer sur son implication r��elle. La vaccination ADN n���influe ni sur la pr��sence d���autoanticorps, ni sur les niveaux d���alanine aminotransf��rase, deux marqueurs de la maladie.
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Le microenvironnement tumoral et les cellules et mol��cules signal (cytokines et chimiokines) qu���ils contiennent sont reconnus comme jouant un r��le pr��pond��rant dans la progression des tumeurs. Il devient donc n��cessaire d�����tudier la relation entre les mol��cules signal, les cellules infiltrantes et les cellules tumorales. Le TGF-�� est une puissante cytokine immunosuppressive et suppressive de la croissance cellulaire, dont le r��le dans la formation du microenvironnement tumoral leuc��mique est mal connu. Dans cette ��tude, nous avons ��tudi�� le mod��le injectable de leuc��mie lympho��de T EL4 (cellules tumorales produisant du TGF-��) de souche C57BL/6. Nous avons caract��ris�� l���infiltration de cellules my��lo��des et lympho��des au niveau des tumeurs par cytom��trie en flux et par microscopie �� fluorescence. L���analyse des cellules infiltrant les tumeurs EL4 nous a permis de montrer la forte pr��sence de lymphocytes T et de cellules my��lo��des CD11b+. Nous avons donc poursuivi l�����tude afin de mieux caract��riser ces cellules. Nous avons montr�� que ces cellules se retrouvent en p��riph��rie de la tumeur et en p��riph��rie des vaisseaux sanguins de la tumeur. Ces cellules ont des ph��notypes nous laissant croire qu���elles appartiennent �� la famille des cellules dite my��lo��des suppressives. Ces cellules ont de forts niveaux de transcrits de VEGF et de MMP9 au niveau de la tumeur ainsi qu���au niveau syst��mique, mais ne semblent pas avoir une forte capacit�� inhibitrice in vitro. Afin de d��terminer si la production tumorale de TGF-�� influe le recrutement de ces cellules, nous avons transform�� des cellules EL4 �� l���aide d���un shRNA afin de diminuer la production de TGF-�� (shRNA-TGF-��) et, compar�� l���infiltration my��lo��de et lympho��de de tumeurs form��es avec des cellules EL4 contr��les (shRNA-Luc). Une diminution de 50% dans les niveaux de transcrits de TGF-�� n���affecte pas la croissance tumorale mais semble diminuer l���infiltration par des cellules my��lo��des. La pr��sente ��tude nous a permis de mieux comprendre le mod��le de leuc��mie EL4 et le r��le des populations cellulaires my��lo��des dans le microenvironnement tumoral leuc��mique. La diminution du TGF-�� produit par les cellules tumorales r��duit l���infiltration de ces populations my��lo��des dans la tumeur EL4. Le r��le pr��cis de ces cellules est encore �� d��terminer. Ces r��sultats sont en accord avec le fait qu���une th��rapie anti-TGF-�� n���est pas suffisante pour contrer la progression tumorale, mais pourrait influer sur le r��sultat post-chimioth��rapie et l���immunoth��rapie en alt��rant la composition du microenvironnement.
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Le syste��me ubiquitine-prote��asome est le principal me��canisme par lequel les prote��ines intracellulaires sont de��grade��es. Le prote��asome dit constitutif (PC) est donc essentiel a�� l���home��ostasie mais aussi a�� la re��gulation de la majorite�� des processus cellulaires importants. La de��couverte d���un deuxie��me type de prote��asome, appele�� immunoprote��asome (IP), soule��ve toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d���un type de prote��asome ? L���IP a-t-il des ro��les redondants ou comple��mentaires avec le PC ? L���IP e��tant pre��sent principalement dans les cellules immunitaires ou stimule��es par des cytokines, plusieurs groupes ont tente�� de de��finir son ro��le dans la re��ponse immunitaire. Or, l���implication de son homologue constitutif dans un e��ventail de processus non spe��cifiquement immunitaires nous laisse croire que l���IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L���objectif de cette the��se e��tait donc de caracte��riser certains ro��les cellulaires de l���IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d���abord e��tudie�� l���impact global de l���IP sur la pre��sentation antige��nique de classe I. Ce faisant, nous avons pu de��terminer ses deux contributions principales, soit l���augmentation drastique du nombre et de la diversite�� des peptides pre��sente��s sur les complexes majeurs d���histocompatibilite�� de classe I. Les diffe��rences de clivage entre le PC et l���IP pourraient expliquer en partie cette diversite�� du re��pertoire peptidique, notamment par l���affinite�� apparente de l���IP pour les re��gions prote��iques non structure��es. Dans un deuxie��me temps, nous avons de��voile�� un nouveau ro��le de l���IP sur un processus de��passant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons de��couvert que l���IP modifie l���abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthe��se. L���impact de l���IP sur le transcriptome est majeur et serait du�� en partie a�� une de��gradation diffe��rente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-de��ficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette de��faillance est cause��e (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoque��e par l���absence d���IP. Il importe donc de comprendre les diffe��rents ro��les mole��culaires de l���IP afin de mieux de��finir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l���avantage e��volutif, au niveau de l���organisme, procure�� par une telle plasticite�� du syste��me ubiquitine-prote��asome.
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La pr��sentation antig��nique par le complexe majeur d���histocompatibilit�� (MHC) I est un processus ubiquitaire permettant la pr��sentation de prot��ines endog��nes qui refl��tent l'��tat de la cellule �� la surface cellulaire aux lymphocytes T CD8+ dans le contexte de la surveillance et la r��ponse immunitaires. Ainsi, l'expression des mol��cules du MHC I classiques est induite en r��ponse aux stimuli inflammatoires afin de favoriser la reconnaissance immunitaire et l'��limination des pathog��nes. HFE est une mol��cule du MHC Ib non-classique qui sert de r��gulateur n��gatif de l'absorption du fer. HFE est associ�� au d��veloppement de l'h��mochromatose h��r��ditaire (HH), maladie associ��e au m��tabolisme du fer mais souvent accompagn��e de d��fauts immunitaires. Ainsi, nous avons en premier lieu ��tudi�� l'impact de HFE sur la pr��sentation antig��nique par MHC I, afin d'expliquer en partie les d��fauts immunitaires li��s �� l'HH associ��e �� HFEC282Y. Puis, compte tenu de l'impact de l'inflammation sur l'expression des mol��cules du MHC I classiques, nous avons ��tudi�� la r��gulation de l'expression de HFE en r��ponse aux stimuli inflammatoires induits par les cellules du sang p��riph��rique mononucl����es (PBMC). Nous avons mis au point un syst��me d���expression antig��nique dans lequel nous contr��lons l���expression de MHC I, de HFE et d���un antig��ne pour lequel nous avons g��n��r�� des lymphocytes T CD8+ sp��cifiques. Nos r��sultats d��montrent que la forme sauvage de HFE (HFEWT), contrairement �� sa forme mut��e (HFEC282Y), inhibe la reconnaissance de complexes MHC I/peptide (pMHC). Nous avons ��galement d��montr�� que l'inhibition de la reconnaissance est maintenue, ind��pendamment des niveaux d'expression de MHC I �� la surface, d'une comp��tition pour la ��2-microglobuline, de la capacit�� de HFE d'interagir avec le r��cepteur de la transferrine, de l'origine de l'antig��ne ou de l'affinit�� de celui-ci. Par ailleurs, nous avons identifi�� les domaines ��1-2 de HFEWT comme ��tant responsables de l'inhibition de la reconnaissance antig��nique. Par contre, la reconnaissance de peptides charg��s de mani��re externe sur les mol��cules du MHC I pr��sentes �� la surface n'a d��montr�� aucune inhibition en pr��sence de HFEWT, sugg��rant que HFEWT pourrait affecter la reconnaissance en interf��rant avec le processus d'appr��tement antig��nique intracellulaire. �� l���inverse, nous avons souhait�� d��terminer si les lymphocytes T activ��s pouvaient influencer les niveaux d'expression de HFE. En termes de r��gulation de l'expression de HFE, nous avons ��tabli que HFE est exprim�� dans les tissus sains chez l'humain et induit chez les lign��es de cancers du colon, du sein, du poumon, du rein et du m��lanome. Par ailleurs, en co-cultivant des lymphocytes T activ��s avec ces lign��es tumorales, nous avons d��montr�� que l'expression de HFE est fortement inhib��e dans toutes ces lign��es tumorales lorsqu'expos��es �� des lymphocytes T activ��s. Finalement, la modulation de l'expression de HFE est ind��pendante du contact cellulaire et semble m��di��e en partie par le GM-CSF, l'IFN-�� et le TNF. En somme, ces r��sultats sugg��rent que les lymphocytes T de l'h��te modulent l'expression de HFE dans le microenvironnement inflammatoire, ce qui pourrait promouvoir la reconnaissance des antig��nes pr��sent��s sur les mol��cules du MHC I pr��sent��es aux lymphocytes T CD8+ antig��ne-sp��cifiques. De plus, ces ��tudes soul��vent la possibilit�� d'un nouveau r��le physiologique de HFEWT dans la voie de pr��sentation antig��nique par MHC I, qui pourrait moduler l'immunog��nicit�� des antig��nes et la r��ponse immunitaire cellulaire chez l'h��te.
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Contexte : L���an��mie falciforme ou dr��panocytose est un probl��me de sant�� important, particuli��rement pour les patients d���origine africaine. La variation ph��notypique de l���an��mie falciforme est probl��matique pour le suivi et le traitement des patients. L���architecture g��nomique responsable de cette variabilit�� est peu connue. Principe : Mieux saisir la contribution g��n��tique de la variation clinique de cette maladie facilitera l���identification des patients �� risque de d��velopper des ph��notypes s��v��res, ainsi que l���adaptation des soins. Objectifs : L���objectif g��n��ral de cette th��se est de combler les lacunes relatives aux connaissances sur l�����pid��miologie g��nomique de l���an��mie falciforme �� l���aide d���une cohorte issue au B��nin. Les objectifs sp��cifiques sont les suivants : 1) caract��riser les profils d���expressions g��nomiques associ��s �� la s��v��rit�� de l���an��mie falciforme ; 2) identifier des biomarqueurs de la s��v��rit�� de l���an��mie falciforme ; 3) identifier la r��gulation g��n��tique des variations transcriptionelles ; 4) identifier des interactions statistiques entre le g��notype et le niveau de s��v��rit�� associ�� �� l���expression ; 5) identifier des cibles de m��dicaments pour am��liorer l�����tat des patients atteints d���an��mie falciforme. M��thode : Une ��tude cas-t��moins de 250 patients et 61 fr��res et soeurs non-atteints a ��t�� men��e au Centre de Prise en charge M��dical Int��gr�� du Nourrisson et de la Femme Enceinte atteints de Dr��panocytose, au B��nin entre f��vrier et d��cembre 2010. R��sultats : Notre analyse a montr�� que des profils d���expressions sont associ��s avec la s��v��rit�� de l���an��mie falciforme. Ces profils sont enrichis de g��nes des voies biologiques qui contribuent �� la progression de la maladie : l���activation plaquettaire, les lymphocytes B, le stress, l���inflammation et la prolif��ration cellulaire. Des biomarqueurs transcriptionnels ont permis de distinguer les patients ayant des niveaux de s��v��rit�� clinique diff��rents. La r��gulation g��n��tique de la variation de l���expression des g��nes a ��t�� d��montr��e et des interactions ont ��t�� identifi��es. Sur la base de ces r��sultats g��n��tiques, des cibles de m��dicaments sont propos��es. Conclusion: Ce travail de th��se permet de mieux comprendre l���impact de la g��nomique sur la s��v��rit�� de l���an��mie falciforme et ouvre des perspectives de d��veloppement de traitements cibl��s pour am��liorer les soins offerts aux patients.
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La candidose oro-pharyng��e (COP) est l���infection fongique opportuniste la plus commune chez les individus infect��s par le VIH-1. La production des cytokines Il-17 et Il-22 par les lymphocytes Th17 est importante lors de la r��solution de la COP, puisque ces cytokines induisent la production de peptides antifongiques et le recrutement des neutrophiles polymorphonucl��aires. Toutefois, les lymphocytes Th17 sont pr��f��rentiellement d��pl��t��s chez les individus infect��s par le VIH-1. Le mod��le de COP chez la souris transg��nique (Tg) CD4C/HIVMutA, exprimant les g��nes nef, env et rev du VIH-1, permettra de d��terminer si des alt��rations quantitatives et/ou fonctionnelles des sous-populations de lymphocytes T CD4+ causent la sensibilit�� �� la candidose. Les sous-populations Th1, Th2, Th1Th17, Th17 et Treg, ainsi que leurs pr��curseurs, les lymphocytes T CD4+ na��fs, sont s��v��rement d��pl��t��es dans les ganglions cervicaux de la souris Tg. Cependant, les lymphocytes T CD4+ na��fs conservent la capacit�� �� se diff��rencier in vitro en pr��sence de cytokines polarisantes et �� produire les cytokines typiques des diverses sous-populations. De plus, les cytokines requises pour la polarisation des lymphocytes T CD4+ na��fs n�����taient pas r��duites dans les ganglions cervicaux des souris Tg, 7 jours apr��s le d��but de l���infection. Les g��nes S100a8, Ccl20, Il17 et Il22 ��taient surexprim��s en r��ponse �� la COP chez la souris non-Tg, mais pas chez la souris Tg. Le traitement de souris Tg infect��es �� l���aide de la combinaison des cytokines Il-17 et Il-22 r��duit significativement la charge fongique buccale de C. albicans et le nombre d���hyphes dans l�����pith��lium de la langue et restaure la capacit�� �� surexprimer des g��nes S100a8, Ccl20 et Il22. Ces r��sultats d��montrent que la perturbation de l���induction de l���immunit�� inn��e par l���Il-17 et l���Il-22 augmente la susceptibilit�� �� la COP chez la souris Tg.
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Objectifs: Chez les patients atteints de scl��rose en plaques (SEP), des lymphocytes pro-inflammatoires utilisent des mol��cules d���adh��rence afin de parvenir �� traverser la barri��re h��mo-enc��phalique (BHE) et former des l��sions multifocales dans le syst��me nerveux central (SNC). Dans le contexte de la SEP, les lymphocytes CD4 auto-agressifs polaris��s en TH17 (s��cr��tant de l���IL-17) sont reconnus comme contribuant �� la formation des l��sions. Le r��le des lymphocytes CD8 TC17 est quant �� lui encore mal d��fini. L���identification de marqueurs de surface sp��cifiquement exprim��s par les lymphocytes TH17 et TC17 faciliterait la caract��risation de ces sous-populations pathog��niques et fournirait de nouvelles cibles th��rapeutiques pour traiter la SEP. M��thodologie: Nous avons identifi�� MCAM lors d���analyses prot��omiques de cellules endoth��liales de la BHE humaine et de lymphocytes T humains. Nous avons caract��ris�� le ph��notype et la fonction de ces cellules exprimant MCAM ex vivo, in vitro, in situ et in vivo, �� partir de mat��riel obtenu de t��moins (contr��les), de patients atteints de SEP et d���animaux atteints d���enc��phalomy��lite auto-immune exp��rimentale (EAE). R��sultats: MCAM est exprim�� �� la fois par les cellules endoth��liales de la BHE humaine et par une sous-population de lymphocytes T effecteurs m��moire CD161+ et CCR6+. Les lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ expriment plus d���IL-17, IL-22, GM-CSF et granzyme B (Gz B) que les lymphocytes MCAMneg. De plus, l���expression de MCAM est fortement augment��e �� la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ lors des pouss��es de SEP, alors que les traitements immunomodulateurs en diminuent l���expression. In situ, l���expression de MCAM par les cellules endoth��liales de la BHE est plus marqu��e au site des l��sions de SEP et d���EAE, et on retrouve des lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ au sein de ces infiltrats p��rivasculaires du SNC. In vitro, les lymphocytes CD8 MCAM+ causent plus de mort oligodendrocytaire et bloquer MCAM diminue la transmigration des CD8 TC17 et des CD4 TH17 �� travers les cellules endoth��liales de la BHE humaine. In vivo, d��pl��ter les lymphocytes CD4 ou CD8 MCAM+ am��liore les signes cliniques de l���EAE par transfert. Par ailleurs, l���expression de MCAM est r��gul��e �� la hausse �� la surface des lymphocytes CD4 et CD8 de la souris transg��nique TCR1640, un mod��le animal d���EAE spontan��e. Finalement, bloquer MCAM att��nue les d��ficits neurologiques chroniques aussi bien du mod��le d���EAE induite avec le MOG35-55 que du mod��le d���EAE spontan��e. Conclusion: Nos donn��es d��montrent que les lymphocytes enc��phalitog��niques produisant de l���IL-17 et pr��sentant une capacit�� effectrice et migratoire marqu��e expriment MCAM. MCAM pourrait servir de biomarqueur en SEP et constituer une cible th��rapeutique valable pour traiter les conditions neuroinflammatoires.
Resumo:
Les tumeurs solides sont infiltr��es par des cellules immunes (TIIC) dont la nature, la fonction et la composition varient d���un patient �� l'autre. Ces cellules inflammatoires influencent l'invasion tumorale en contr��lant la croissance et le potentiel m��tastatique d���une tumeur. Ainsi, il est propos�� d���utiliser cette infiltration comme outil diagnostic et pronostic de routine. Certaines cellules sont bien connues pour jouer un r��le important dans le contr��le de la progression tumorale, comme c���est le cas des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ alors que d���autres poss��dent un r��le contradictoire. ��tant donn�� la d��pendance des tumeurs sur l�����quilibre entre ces diff��rentes cellules, il est important d���identifier les fonctions pr��cises des cellules immunes au sein de la tumeur. De nombreuses ��tudes sont r��alis��es afin d���identifier des marqueurs descriptifs du ph��notype et la fonction des cellules immunes dans la tumeur. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- Identifier la m��thode de d��sagr��gation des tissus tumoraux alt��rant le moins la biologie des TIIC pour leur caract��risation. 2- Caract��riser l���expression de la mol��cule d���adh��rence CD146 dans les TIIC et en identifier l���origine. L���identification de marqueurs pour la caract��risation ph��notypique et fonctionnelle des TIIC a ��t�� r��alis��e, entre autres, par la d��tection de prot��ines exprim��es par la cellule. Dans la premi��re partie de ce projet, nous avons d��montr�� que les m��thodes utilis��es pour d��sagr��ger les tissus tumoraux dans le but d���isoler les TIIC induisent des changements dans la biologie de ces cellules ce qui peut fausser les conclusions qui en d��rivent. Nous avons donc compar�� l'impact de trois m��thodes de d��sagr��gation : une dissociation m��canique utilisant la M��dimachineTM et deux digestions enzymatiques utilisant une collag��nase de type I seule ou combin��e �� de la collag��nase de type IV et de la DNase I de type II. Nous nous sommes int��ress��s �� l'effet de ces m��thodes sur des param��tres tels que la viabilit�� cellulaire, l���alt��ration des prot��ines de surface et la capacit�� des cellules �� prolif��rer. Nous avons d��montr�� que ces m��thodes affectent la viabilit�� des cellules de mani��re comparable, alors que la d��tection de certaines prot��ines de surface et la capacit�� de prolif��rer est r��duite/inhib��e par les traitements enzymatiques. Nous concluons qu���une m��thode m��canique utilisant la M��dimachineTM est mieux adapt��e �� la caract��risation des TIIC afin de conserver leurs propri��t��s. Dans la deuxi��me partie de notre projet, nous avons adapt�� cette m��thode �� la caract��risation des TIIC. Nous avons port�� une attention particuli��re �� la mol��cule d���adh��rence CD146 dont l���implication dans la migration des cellules immunes �� travers l���endoth��lium vers les sites d���inflammation est de plus en plus ��tudi��e dans les maladies autoimmunes. Nous avons mis en ��vidence une augmentation des proportions de cellules immunes exprimant CD146 dans les tumeurs comparativement au sang de patients de cancers. Cette expression est induite par les cellules tumorales tout en ��tant accrue par la n��crose de celles-ci. Nous d��montrons que ces cellules sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ pr��sentant un profil immunosuppressif. En conclusion, nos r��sultats sugg��rent que CD146 participe �� la mise en place du contexte immunitaire dans la tumeur et augmente la capacit�� de migration des lymphocytes T CD4+. L���induction par les cellules tumorales de cette mol��cule d���adh��rence dans les cellules suppressives pourrait contribuer aux m��canismes immunor��gulateurs mis en place par la tumeur. CD146 pourrait ��tre un marqueur d���int��r��t pour l���identification des cellules immunosuppressives et pour le d��veloppement de nouvelles th��rapies.