A biocomposite of collagen nanofibers and nanohydroxyapatite for bone regeneration

This work aims to design a synthetic construct that mimics the natural bone extracellular matrix through innovative approaches based on simultaneous type I collagen electrospinning and nanophased hydroxyapatite (nanoHA) electrospraying using non-denaturating conditions and non-toxic reagents. The morphological results, assessed using scanning electron microscopy and atomic force microscopy (AFM), showed a mesh of collagen nanofibers embedded with crystals of HA with fiber diameters within the nanometer range (30 nm), thus significantly lower than those reported in the literature, over 200 nm. The mechanical properties, assessed by nanoindentation using AFM, exhibited elastic moduli between 0.3 and 2 GPa. Fourier transformed infrared spectrometry confirmed the collagenous integrity as well as the presence of nanoHA in the composite. The network architecture allows cell access to both collagen nanofibers and HA crystals as in the natural bone environment. The inclusion of nanoHA agglomerates by electrospraying in type I collagen nanofibers improved the adhesion and metabolic activity of MC3T3-E1 osteoblasts. This new nanostructured collagen–nanoHA composite holds great potential for healing bone defects or as a functional membrane for guided bone tissue regeneration and in treating bone diseases.

Basel III new capital requirements, impacts and bank behavior

For some years, researchers could not find a clear effect of capital adequacy on the risk profile of banks, as shareholders could increase the riskiness of the assets (qualitative effect), crowding-out the effect of reduced leverage (volume effect). Some shareholders might have the will to increase the riskiness of the assets, but they may lack the power to do so. Considering only ”powerful” shareholders, definitive conclusions were drawn but with constant ownership profile. In this paper I investigate whether there is a significant change in the type of shareholders in response to regulatory capital shocks and, if so, will the banking system be in the hands of more “desired” shareholders. I find that ownership profile responds to a regulatory shock, changing the risk appetite of the ruling power at the bank. I find more banks and the government in the ownership of undercapitalised banks and much less institutional shareholders and free float. I claim that these new shareholders may not the desired ones, given the objective of the regulatory change, as they are associated with a preference for more leverage. One possible explanation for this crowding-out effect is that regulators are trying to contain idiosyncratic risk (more linked to the riskiness of the assets) with a rule that contains systematic risk (capital adequacy). This has a distorting effect on ownership. Another insight can be drawn from the tests: supervisors should be aware of significant ownership movements that cause the crowding-out.

Statut des transporteurs du cholestérol au niveau de l'intestin et du foie dans le diabète de type 2

La résistance à l’insuline et le diabète de type 2 (DT2) sont caractérisés par une hyperlipidémie. Le but de cette étude est de déterminer si le DT2 contribue au dérèglement du métabolisme du cholestérol au niveau du petit intestin et du foie du Psammomys obesus, un modèle animal nutritionnel d’induction de la résistance à l’insuline et du DT2. L’absorption intestinale du cholestérol est diminuée chez les animaux diabétiques. Cette diminution est associée à une baisse (i) de l’expression génique et protéique de NPC1-L1 qui joue un rôle primordial dans l’absorption du cholestérol au niveau des entérocytes; et (ii) de l’ARNm de l’ABCA1 responsable de l’efflux de cholestérol des cellules intestinales à l’apolipoprotéine A-I et aux HDLs. En ce qui a trait aux transporteurs SR-B1 et Annexin II, aucune différence n’a été observée au niveau intestinal. Toutefois, une diminution significative de l’expression génique de l’ABCG5, un intervenant majeur dans la sécrétion du cholestérol des entérocytes vers la lumière intestinale, est mesurée chez les animaux diabétiques. De plus, l’expression protéique est diminuée pour le PCSK9 et augmentée pour le LDLr au niveau du jéjunum, tandis que la quantité de protéine de l’enzyme HMG-CoA réductase est régulée à la baisse chez les Psammomys obesus diabétiques. Finalement, de tous les facteurs de transcription testés seule une augmentation de LXR et une diminution de PPAR/δ sont détectées au niveau de l’intestin. Au niveau hépatique, il y a (i) une augmentation de la masse protéique de NPC1-L1, SR-BI et Annexin II; (ii) une élévation l’ARNm de SR-BI; (iii) une diminution du contenu protéique de ABCG8 et de l’expression génique de l’ABCG5 et de l’ABCA1; et (iv) une élévation de l’ARNm de LXR et de PPAR/δ, tout comme une baisse de l’expression protéique de SREBP-2. Somme toute, nos résultats montrent que le développement du diabète de type 2 chez le Psammomys obesus entraîne un changement dans la machinerie intra-entérocytaire et hépatocytaire, qui mène à un dérèglement de l’homéostasie du cholestérol.

Rôle de la phospholipase A2 de type V dans le recrutement de leucocytes au foyer inflammatoire

Les phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) font partie d’une grande famille d’enzymes impliquées dans la synthèse d’écosanoïdes, de chimiokines et dans l’expression de molécules d’adhérence. Ce groupe comprend dix isoformes différentes (sPLA2-IB, -IIA, -IIC, -IID, -IIE, -IIF, -III, -V, -X et XII) dont la majorité sont surexprimées en présence de molécules pro-inflammatoires telles que l’interleukine-1β (IL-1 β) et le lipopolysaccharide bactérien (LPS). La sPLA2-IIA fut longtemps considérée comme la principale sPLA2 associée à l’inflammation. Toutefois, un nombre grandissant d’études suggère l’implication d’autres isoformes dans la réponse inflammatoire. Étant donné la similarité structurelle des différentes isoformes de sPLA2, la majorité des inhibiteurs présentement disponibles sont non spécifiques et bloquent simultanément plus d’une sPLA2. De ce fait, encore peu de choses sont connues quant au rôle précis de chacune des sPLA2 dans la réponse inflammatoire. Ayant accès à des souris génétiquement modifiées n’exprimant pas la sPLA2-V (sPLA2-V-/-), nous avons donc investigué le rôle spécifique de la sPLA2-V dans le recrutement leucocytaire induit par le LPS, ainsi que sa capacité à moduler l’expression de certaines molécules d’adhérence. Pour ce faire, nous avons utilisé le modèle inflammatoire de la poche d’air sous-cutanée. L’administration de LPS dans la poche d’air de souris contrôles (WT) entraîne un recrutement leucocytaire important. Cet appel de cellules inflammatoires est cependant significativement diminué chez les souris sPLA2-V-/-. De plus, l’expression des molécules d’adhérence VCAM-1 et ICAM-1 est également diminuée chez les souris sPLA2-V-/- comparativement aux souris WT. Nos résultats démontrent donc le rôle important de la sPLA2-V dans le recrutement leucocytaire et l’expression de molécules d’adhérence induits par le LPS, confirmant ainsi l’implication de cette enzyme dans le processus inflammatoire.

L’influence du réseau de chimiokines sur les lymphocytes T dans le contexte de l’infection à virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)

Les chimiokines et leurs récepteurs respectifs jouent un rôle important dans l’immunité innée et adaptative. Les récepteurs de chimiokines identifient des cellules T CD4+ avec potentiel de migration dans des tissus spécifiques et à fonctionnalité distincte du point de vue de la spécificité antigénique et de la production de cytokines. L’identité de la population des cellules T CD4+ susceptibles versus résistantes à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste mal définie. Le recrutement dans les muqueuses intestinales d’un excès de cellules T effectrices (CD8+) comparé aux cellules cibles (CD4+) représente un bon pronostic de l’infection par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS), tandis que la déplétion des cellules Th17 dans les tissus lymphoïdes associés au tractus gastro-intestinal (GALT) est un marqueur de la progression de l’infection à VIH. L’effet régulateur des chimiokines sur l’activation de la réplication virale dans différentes sous-populations cellulaires T CD4+ reste peu étudié. Ce projet de maîtrise est divisé en 3 parties: (1) l’identification des récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 comme marqueurs de surfaces des sous populations T CD4+ avec susceptibilité distincte à l’infection par le VIH; (2) la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ et T CD8+ spécifiques au VIH de sujets à progression lente vers le stade sida (LTNP); et (3) les effets des chimiokines ligands de CCR4, CXCR3 et CCR6 sur l’activation cellulaire et la réplication virale in vitro. Nos résultats démontrent que les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ (profile cytokinique Th17) et CXCR3+CCR6+ (profile cytokinique Th1/Th17) sont hautement permissives à l’infection par le VIH. Nous proposons également de nouveaux corrélats de protection immunitaire contre le VIH chez les sujets LTNP: (i) le potentiel de co-localisation dans les muqueuses intestinales des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH via l’intégrine β7, (ii) le ratio élevé entre les cellules T effectrices (CD8+) versus les cellules cibles (CD4+) spécifiques au VIH, (iii) le profil cytokinique Th17 et (iv) la capacité des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH à produire des ligands de CCR5 bloquant l’entrée virale. Finalement, nos résultats sur l’effet co-stimulateur des chimiokines sur les cellules T et leurs effets opposés sur la réplication virale démontrent l’implication du réseau des chimiokines dans la régulation de la pathogenèse de l’infection à VIH.

Régulation de protéine C-réactive vasculaire dans le diabète de type 2

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans les pays occidentaux et représentent une complication majeure du syndrome métabolique. Il est maintenant largement admis que l’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique et que l’inflammation joue un rôle pathogénique majeur dans l’initiation et la progression de la maladie athéromateuse. Il a été démontré qu’une augmentation des niveaux sériques de la protéine c-réactive (CRP), une protéine de la phase aigüe et un important constituant de la réponse immunitaire de type inné, est associée à un risque cardiovasculaire accru. Ainsi, il a été documenté qu’une augmentation de CRP, tant chez les sujets sains que chez les sujets diabétiques, était associée à une augmentation du risque de morbidité et de mortalité cardiovasculaires. De multiples évidences suggèrent que la CRP puisse non seulement constituer un marqueur de risque des maladies cardiovasculaires mais aussi représenter un facteur pro-athérogénique direct. La dysfonction endothéliale représente un des stades les plus précoces du processus athérosclérotique et un rôle de la CRP dans la pathogenèse de la dysfonction endothéliale est postulé. Outre son origine systémique, la CRP est produite dans la lésion athérosclérotique et par diverses cellules vasculaires, dont les cellules endothéliales. Afin d’élucider le rôle de la CRP vasculaire dans l’altération de la fonction endothéliale associée au syndrome métabolique, nous avons étudié la régulation de l’expression endothéliale de la CRP par les acides gras libres (AGL) et le rôle de la CRP endothéliale dans l’inhibition de la synthèse d’oxyde nitrique (NO) par les AGL. Nos résultats démontrent que :1) l’acide palmitique (PA) induit l’expression génique de CRP au niveau de cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs) en culture et, augmente, de manière dose-dépendante, l’expression protéique de la CRP; 2) La pré-incubation des HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la i) protéine kinase C (PKC), ii) du facteur nucléaire-kappa B, iii) des Janus kinases et des protéines de transduction et de régulation de la transcription et iv) des protéines kinases activées par les mitogènes prévient l’effet stimulant du PA sur l’expression protéique et génique de la CRP; 3) Le traitement des HAECs par le PA induit une augmentation de la production des espèces réactives oxygénées, un effet prévenu par les inhibiteurs de la PKC et par l’AICAR(5-amino-4-imidazole carboxamide 1-β-D-ribofuranoside), un activateur de la protéine kinase activée par l’AMP; 4) L’incubation des HAECs en présence de PA résulte enfin en une diminution de la production basale endothéliale de NO, un effet abrogé par la préincubation de ces cellules avec un anticorps anti-CRP. Dans l’ensemble, ces données démontrent un effet stimulant du PA sur l’expression de la CRP endothéliale via l’activation de kinases et de facteurs de transcription sensibles au stress oxydatif. Ils suggèrent en outre un rôle de la CRP dans la dysfonction endothéliale induite par les AGL.

POCN-type Pincer Complexes of NiII and NiIII : synthesis, reactivities, catalytic activities and physical properties

Cette thèse décrit la synthèse, la caractérisation, les réactivités, et les propriétés physiques de complexes divalents et trivalents de Ni formés à partir de nouveaux ligands «pincer» de type POCN. Les ligands POCN de type amine sont préparés d’une façon simple et efficace via l’amination réductrice de 3-hydroxybenzaldéhyde avec NaBH4 et plusieurs amines, suivie par la phosphination de l’amino alcool résultant pour installer la fonction phosphinite (OPR2); le ligand POCN de type imine 1,3-(i-Pr)2PC6H4C(H)=N(CH2Ph) est préparé de façon similaire en faisant usage de PhCH2NH2 en l’absence de NaBH4. La réaction de ces ligands «pincer» de type POCN avec NiBr2(CH3CN)x en présence d’une base résulte en un bon rendement de la cyclométalation du lien C-H situé en ortho aux fonctions amine et phosphinite. Il fut découvert que la base est essentielle pour la propreté et le haut rendement de la formation des complexes «pincer» désirés. Nous avons préparé des complexes «pincer» plan- carrés de type POCN, (POCNRR΄)NiBr, possédant des fonctions amines secondaires et tertiaires qui démontrent des réactivités différentes selon les substituants R et R΄. Par exemple, les complexes possédant des fonctions amines tertiaires ArCH2NR2 (NR2= NMe2, NEt2, and morpholinyl) démontrent des propriétés rédox intéressantes et pourraient être convertis en leurs analogues trivalents (POCNR2)NiBr2 lorsque réagis avec Br2 ou N-bromosuccinimide (NBS). Les complexes trivalents paramagnétiques à 17 électrons adoptent une géométrie de type plan-carré déformée, les atomes de Br occupant les positions axiale et équatoriale. Les analyses «DSC» et «TGA» des ces composés ont démontré qu’ils sont thermiquement stables jusqu’à ~170 °C; tandis que la spectroscopie d’absorption en solution a démontré qu’ils se décomposent thermiquement à beaucoup plus basse température pour regénérer les complexes divalents ne possédant qu’un seul Br; l’encombrement stérique des substitutants amines accélère cette route de décomposition de façon significative. Les analogues NMe2 et N(morpholinyl) de ces espèces de NiIII sont actifs pour catalyser la réaction d’addition de Kharasch, de CX4 à des oléfines telles que le styrène, tandis qu’il fut découvert que l’analogue le moins thermiquement stable (POCNEt2)Ni est complètement inerte pour catalyser cette réaction. Les complexes (POCNRH)NiBr possédant des fonctions amines secondaires permettent l’accès à des fonctions amines substituées de façon non symétrique via leur réaction avec des halogénures d’alkyle. Un autre avantage important de ces complexes réside dans la possibilité de déprotonation pour préparer des complexes POCN de type amide. De telles tentatives pour déprotoner les fonctions NRH nous ont permis de préparer des espèces dimériques possédant des ligands amides pontants. La nature dimérique des ces complexes [P,C,N,N-(2,6-(i-Pr)2PC6H3CH2NR)Ni]2 (R= PhCH2 et Ph) fut établie par des études de diffraction des rayons-X qui ont démontré différentes géométries pour les cœurs Ni2N2 selon le substituant N : l’analogue (PhCH2)N possède une orientation syn des substitutants benzyles et un arrangement ressemblant à celui du cyclobutane du Ni et des atomes d’azote, tandis que l’analogue PhN adopte un arrangement de type diamant quasi-planaire des atomes du Ni et des atomes d’azote et une orientation anti des substituants phényles. Les espèces dimériques ne se dissocient pas en présence d’alcools, mais elles promouvoient l’alcoolyse catalytique de l’acrylonitrile. De façon intéressante, les rendements de ces réactions sont plus élevés avec les alcools possédant des fonctions O-H plus acides, avec un nombre de «turnover» catalytique pouvant atteindre 2000 dans le cas de m-cresol. Nous croyons que ces réactions d’alcoolyse procèdent par activation hétérolytique de l’alcool par l’espèce dimérique via des liaisons hydrogènes avec une ou deux des fonctions amides du dimère. Les espèces dimériques de Ni (II) s’oxydent facilement électrochimiquement et par reaction avec NBS ou Br2. De façon surprenante, l’oxydation chimique mène à l’isolation de nouveaux produits monomériques dans lesquels le centre métallique et le ligand sont oxydés. Le mécanisme d’oxydation fut aussi investigué par RMN, «UV-vis-NIR», «DFT» et spectroélectrochimie.

Rôle des topoisomérases de type IA dans la ségrégation des chromosomes chez Escherichia coli

Les topoisomérases I (topA) et III (topB) sont les deux topoisomérases (topos) de type IA d’Escherichia coli. La fonction principale de la topo I est la relaxation de l’excès de surenroulement négatif, tandis que peu d’information est disponible sur le rôle de la topo III. Les cellules pour lesquelles les deux topoisomérases de type IA sont manquantes souffrent d’une croissance difficile ainsi que de défauts de ségrégation sévères. Nous démontrons que ces problèmes sont majoritairement attribuables à des mutations dans la gyrase qui empêchent l’accumulation d’excès de surenroulement négatif chez les mutants sans topA. L’augmentation de l’activité de la gyrase réalisée par le remplacement de l’allèle gyrB(Ts) par le gène de type sauvage ou par l’exposition des souches gyrB(Ts) à une température permissive, permet la correction significative de la croissance et de la ségrégation des cellules topos de type IA. Nous démontrons également que les mutants topB sont hypersensibles à l’inhibition de la gyrase par la novobiocine. La réplication non-régulée en l’absence de topA et de rnhA (RNase HI) augmente la nécessité de l’activité de la topoisomérase III. De plus, en l’absence de topA et de rnhA, la surproduction de la topoisomérase III permet de réduire la dégradation importante d’ADN qui est observée en l’absence de recA (RecA). Nous proposons un rôle pour la topoisomérase III dans la ségrégation des chromosomes lorsque l’activité de la gyrase n’est pas optimale, par la réduction des collisions fourches de réplication s’observant particulièrement en l’absence de la topo I et de la RNase HI.

Revêtement anti-apoptotique à base de chondroïtine sulfate : vers un stent-graft bioactif

La réparation endovasculaire (EVAR) est une technique minimalement invasive permettant de traiter l’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) par l’entremise d’un stent- graft (SG). L’utilisation d’EVAR est actuellement limitée par de fréquentes complications liées à une guérison inadéquate autour de l’implant. Ce manque de guérison est principalement dû au type de recouvrement polymérique des SG, au milieu pro-apoptotique des AAA et à l’accès réduit aux nutriments et à l’oxygène après EVAR. L’objectif de cette thèse consistait à concevoir un revêtement bioactif permettant d’inhiber l’apoptose et stimuler la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), pour ainsi favoriser la guérison des tissus vasculaires autour des SG. La chondroïtine-4-sulfate (CS) a d’abord été choisie, car elle a été identifiée comme un médiateur important de la réparation vasculaire. Il a été démontré que la CS en solution influence directement la résistance à l’apoptose des CMLV, en plus de favoriser la différenciation myofibroblastique chez les fibroblastes. Dans le cadre de ce projet, un premier revêtement à base de CS et de collagène a été créé. Bien que le revêtement permettait d’induire une résistance à l’apoptose chez les CMLV, il se désintégrait trop rapidement dans des conditions aqueuses. Une nouvelle méthodologie a donc été adaptée afin de greffer la CS directement sur des surfaces aminées, à l’aide d’un système utilisant un carbodiimide. Dans le but d’accroître la croissance des CMLV à la surface des revêtements, le facteur de croissance de l’épiderme (EGF) a ensuite été sélectionné. En plus de ses propriétés mitogéniques et chimiotactiques, l’EGF stimule la production d’éléments de la matrice extracellulaire, comme le collagène et la fibronectine. De plus, l’activation du récepteur de l’EGF inhibe également l’apoptose des CMLV. L’EGF a donc été greffé sur la CS. Le revêtement de CS+EGF a démontré une bonne uniformité et bioactivité sur des surfaces de verre aminé. iii iv Dans une 3ème étape, afin de permettre de transposer ce revêtement bioactif sur des implants, plusieurs méthodes permettant de créer des groupements d’amines primaires sur les biomatériaux polymériques comme le PET ou le ePTFE ont été étudiées. La polymérisation par plasma a été choisie pour créer le revêtement CS+EGF à la surface de PET. Une fois de plus, celui-ci a permis d’inhiber l’apoptose des CMLV, dans des conditions pro-apoptotiques, et de favoriser la croissance des cellules. Le revêtement de CS et d’EGF, déposé sur des surfaces aminées, possède des caractéristiques biologiques intéressantes et semble donc prometteur pour favoriser une meilleure guérison autour des SG.

Therapeutic potential of endothelin receptor type A and bradykinin receptor B1 dual antagonism in osteoarthritis treatment

Nous avons préalablement démontré que l'endothéline-1 (ET-1), un peptide vasoconstricteur de 21 acides aminés, joue un rôle central dans le métabolisme des tissus articulaires et a des fonctions cataboliques sur le cartilage articulaire dans l'ostéoarthrose, en liant son récepteur de type A (ETA). Suite à la relâche du nonapeptide vasodilatateur bradykinine (BK), et l'augmentation d'expression du récepteur B1 des kinines (BKB1), ces médiateurs engendrent un cycle d'inflammation, une destruction du cartilage, et une douleur articulaire. Lors de cette étude, l'efficacité thérapeutique des antagonistes spécifiques du ETA et/ou BKB1 dans un modèle animal d'ostéoarthrose a été testée. Notre hypothèse est que l'antagonisme va diminuer la progression de la pathologie et de la douleur articulaire. L'ostéoarthrose a été induite chez des rats par rupture chirurgicale du ligament croisé antérieur. Les animaux ont été traités par injections intra articulaire hebdomadaires des antagonistes peptidiques spécifiques du ETA et/ou BKB1. La douleur articulaire a été évaluée par le test d'incapacitance statique durant les deux mois postopératoires ; la morphologie articulaire a été examinée post mortem par radiologie et histologie. On constate que le traitement a diminué la douleur et a préservé la morphologie articulaire ; la double inhibition a été plus efficace que la simple inhibition. En conclusion, l'antagonisme double d'ETA et BKB1 améliore la douleur chronique et prévient la dégradation articulaire dans l'ostéoarthrose, ce qui suggère que ces récepteurs peuvent être des cibles thérapeutiques potentiels pour le traitement de cette pathologie.

Spectroscopie Raman de complexes de fer(II) et fer(III) à transition de spin

Les transitions de spin provoquent des changements de propriétés physiques des complexes de métaux du bloc d les subissant, notamment de leur structure et propriétés spectroscopiques. Ce mémoire porte sur la spectroscopie Raman de composés du fer(II) et du fer(III), pour lesquels on induit une transition de spin par variation de la température ou de la pression. Trois complexes de fer(II) de type FeN4(NCS)2 avec des comportements de transition de spin différents ont été étudiés : Fe(Phen)2(NCS)2 (Phen : 1,10-Phénanthroline), Fe(Btz)2(NCS)2 (Btz : 2,2’-bi-4,5-dihydrothiazine) et Fe(pyridine)4(NCS)2. Un décalage de l’ordre de 50 cm-1 est observable pour la fréquence d’étirement C-N du ligand thiocyanate des complexes FeN4(NCS)2, lors de la transition de spin induite par variation de la température ou de la pression. Il est possible d’utiliser cette variation de fréquence afin de tracer un profil de transition. Quatre complexes isomères de type FeL222(CN)2 (L222 : 2,13- diméthyl-6,9-dioxa-3,12,18-triazabicyclo[12.3.1]-octadéca-1(18),2,12,14,16-pentaène) ont également été étudiés. Un taux de décalage de l’ordre d’environ 0,03 cm-1/K est observé pour plusieurs bandes du complexe FeL222(CN)2. La bande à 1415 cm-1 disparaît à plus haute température au profit d’une bande à 1400 cm-1. Pour le complexe de chiralité R,R’, les bandes à 1008 cm-1 et 1140 cm-1 se déplacent vers des fréquences plus élevées à partir de 223 K. Les transitions de spin sont observées dans certains complexes de fer(III). Dans cette famille de composés, le complexe Fe(EtDTC)3 (EtDTC : N,N-diéthyldithiocarbamate) a été étudié . Aucun changement n’a été observé dans l’intensité des bandes d’étirement fer-soufre sur les spectres à température variable. Cependant, la bande Fe-S associée à la forme bas-spin à 530 cm-1 augmente en intensité au profit de la bande associée à la forme haut-spin à 350 cm-1 lors des mesures à haute pression, passant d’un rapport d’amplitude de 50% à pression ambiante à 80% à 21 kbar. Un dédoublement de la bande d’étirement C-N du ligand dithiocarbamate à 1495 cm-1 est également observé à des pressions supérieures à 5 kbar. Une comparaison des changements des fréquences de vibration de tous les complexes est effectuée.

Étude de la variabilité spectroscopique d’un échantillon d’étoiles Wolf-Rayet de type WC9

Nous savons que la grande majorité des étoiles WC9 produit de la poussière à base de carbone. Cette dernière doit se former dans des zones de très haute densité afin de survivre à l’environnement hostile qu’est celui du vent d’une étoile WR. Les étoiles WC appartenant à un système binaire WR + O produisent de la poussière quand les vents des deux étoiles entrent en collision et forment une zone de choc pouvant augmenter la densité du gaz d’un facteur 1000. Par contre, plusieurs étoiles WC9 n’ont, à ce jour, montré aucun signe de la présence d’un compagnon. Le but du projet est de tenter d’identifier un mécanisme alternatif responsable de la formation de poussière dans les étoiles WC9 n’appartenant pas à un système binaire. Nous présentons les résultats d’une campagne d’observation visant à caractériser la variabilité spectroscopique d’un échantillon de huit étoiles WC9 et une étoile WC8d. Nos résultats indiquent que la majorité des étoiles montrent des variations à grande échelle dans la raie d’émission C III 5696, soit à un niveau d’au moins 5% du flux de la raie et que les structures dans le vent ont une dispersion de vitesses de l’ordre de 150-300 km/s. De manière générale, les variations de vitesse radiales sont anti-corrélées avec le coefficient d’asymétrie de la raie, ce qui semble infirmer la présence d’un compagnon. Des observations en photométrie de l’étoile WR103 montrent une période de 9.1 ± 0.6 jours qui s’accorde avec les variations spectroscopiques et qui ne semble pas, de manière évidente, d’origine binaire.

The roles of TL1A and Pno1 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique. Elle est caractérisée par une inflammation persistante touchant de multiples petites articulations, causant douleurs, rougeurs, gonflements et déformations. Des études menées auprès de patients et d’animaux ont démontré que certains auto-anticorps, cytokines et enzymes tissue-déstructives sont des médiateurs importants dans le développement de la PR. Au cours des deux dernières décennies, les traitements de fond (DMARDs en anglais) ont été démontrés très efficaces pour traiter la PR. D'autre part, des effets secondaires ont été rapportés pour ces traitements, par exemple l'augmentation du risque d'infections opportunistes. L’objectif de ce travail est d’acquérir des connaissances sur le rôle du TL1A (TNF-like molécule 1 A; TNFSF15) et son partenaire Nob1 (Pno1 ; YOR145c) dans la pathogenèse de la PR afin de découvrir de nouveaux médicaments contre ces molécules dans l'avenir. TL1A est un membre de la famille du TNF. Il déclenche des signaux co-stimulateurs via le récepteur de mort 3 (DR3) et induit la prolifération ainsi que la production des cytokines pro inflammatoires par les lymphocytes. Des données multiples suggèrent l'implication de la cascade TL1A-DR3 dans plusieurs maladies auto-immunes. Donc, nous avons proposé les hypothèses suivantes:1) la production locale de TL1A dans les articulations est un composant d’un cercle vicieux qui aggrave la PR; 2) dans la PR, la production de TL1A dans les organes lymphoïde augmente la production d’auto-anticorps pathogénique. Au cours de ce travail, nous avons démontré que la TL1A aggrave la maladie chez les souris où l’arthrite a été induite par le collagène (AIC). Par ailleurs, nous avons constaté que l’expression de TL1A est élevée dans les tissus atteints de PR ainsi que dans les ganglions lymphatiques drainant de la souris AIC. Mécaniquement, nous avons découvert que la TL1A est induite par le TNF-α et IL-17 produits par les cellules T in vitro. Ces résultats montrent directement que les TL1A-DR3 jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la PR. De plus, afin de poursuivre notre étude, la TL1A a été génétiquement supprimée dans les souris (TL1A KO). Nous avons montré que les souris TL1A KO n’ont aucune anomalie apparente et aucun dysfonctionnement du système immunitaire dans des conditions normales. Cependant, ces souris manifestent des AIC améliorées et une réduction significative des niveaux d'anticorps, anti-collagène du type II i dans le sérum. Nous avons trouvé que les ganglions lymphatiques de drainage (dLNs) de souris KO étaient plus petites avec une cellularité inférieure comparativement aux souris WT de 14 jours après l’immunisation. De plus, nous avons découvert que le DR3 a été exprimé par les cellules plasmatiques dans l’étape de la différenciation terminale et ces cellules surviennent mieux en présence de TL1A. La conclusion de cette étude apporte des nouvelles connaissances sur le rôle de TL1A qui amplifie les réponses humorales d’AIC. Nous avons suggéré que TL1A pourrait augmenter la réponse d’initiation d'anticorps contre collagène II (CII) ainsi que prolonger la survie des cellules plasmatiques. Une autre molécule qui nous intéresse est Pno1. Des études antérieures menées chez la levure ont suggéré que Pno1 est essentielle pour la néogénèse du protéasome et du ribosome Le protéasome étant crucial pour la différenciation terminale des cellules plasmatiques pendant les réponses humorales chez les mammifères, nous avons donc supposé que Pno1 joue un rôle dans la production d'anticorps pathogenique dans la PR via la voie du protéasome. Nous avons donc généré des souris génétiquement modifiées pour Pno1 afin d’étudier la fonction de Pno1 in vivo. Cependant, une mutation non-sens dans le Pno1 provoque une létalité embryonnaire à un stade très précoce chez les souris. D'autre part, une réduction de 50% de Pno1 ou une surexpression de Pno1 n’ont aucun effet ni sur le fonctionnent des cellules T et B, ni sur les activités du protéasome ainsi que sur la réponse humorale dans l’AIC. Ces résultats suggèrent que Pno1 est une molécule essentielle sans redondance. Par conséquent, il n’est pas une cible appropriée pour le développement de médicaments thérapeutiques. En conclusion, nos études ont révélé que la TL1A n’est pas essentielle pour maintenir les fonctions du système immunitaire dans des conditions normales. En revanche, il joue un rôle critique dans la pathogenèse de la PR en favorisant l'inflammation locale et la réponse humorale contre des auto-antigènes. Par conséquent, une inhibition de la TL1A pourrait être une stratégie thérapeutique pour le traitement de la PR. Au contraire, Pno1 est essentiel pour la fonction normale des cellules. Une délétion totale pourrait entraîner des conséquences graves. Il n’est pas une cible appropriée pour développer des médicaments de la PR.

Identification et caractérisation des principaux fragments du collagène de type II du cartilage équin, produit in vitro par l'enzyme cathepsine K

La dégradation protéolytique du collagène de type II est considérée comme étant un facteur majeur dans le processus irréversible de dégradation de la matrice cartilagineuse lors d’ostéoarthrose. Outre les collagénases de la famille des métaloprotéinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dégrader la triple hélice intacte du collagène de type II, devenant ainsi un élément pertinent pour les recherches sur l’ostéoarthrose. L’objectif à court terme de notre étude consiste en l’identification et la caractérisation de sites de clivage spécifiques de la cathepsine K sur le collagène de type II équin. La technique d’électrophorèse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des résultats de la caractérisation moléculaire des fragments protéolytiques. La caractérisation est réalisée en combinant la digestion trypsique précédant l’analyse HPLC-ESI/MS. Les résultats ont permis d’établir les sites, présents sur la carte peptidique de la molécule de collagène de type II équin, des 48 résidus prolines (P) et 5 résidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, différents de ceux produits par les MMPs, sont observés par SDS-PAGE 1D puis confirmés par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifié suggère un site de clivage différent de l’étude antérieure sur le collagène de type II bovin et humain. L’objectif à long terme serait le développement d’anticorps spécifiques au site identifié, permettant de suivre l’activité protéolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et ÉLISA, dans le cadre du diagnostic de l’ostéoarthrose.

Genetic studies on the role of type IA DNA topoisomerases in DNA metabolism and genome maintenance in Escherichia coli

Le surenroulement de l’ADN est important pour tous les processus cellulaires qui requièrent la séparation des brins de l’ADN. Il est régulé par l’activité enzymatique des topoisomérases. La gyrase (gyrA et gyrB) utilise l’ATP pour introduire des supertours négatifs dans l’ADN, alors que la topoisomérase I (topA) et la topoisomérase IV (parC et parE) les éliminent. Les cellules déficientes pour la topoisomérase I sont viables si elles ont des mutations compensatoires dans un des gènes codant pour une sous-unité de la gyrase. Ces mutations réduisent le niveau de surenroulement négatif du chromosome et permettent la croissance bactérienne. Une de ces mutations engendre la production d'une gyrase thermosensible. L’activité de surenroulement de la gyrase en absence de la topoisomérase I cause l’accumulation d’ADN hyper-surenroulé négativement à cause de la formation de R-loops. La surproduction de la RNase HI (rnhA), une enzyme qui dégrade l’ARN des R-loops, permet de prévenir l’accumulation d’un excès de surenroulement négatif. En absence de RNase HI, des R-loops sont aussi formés et peuvent être utilisés pour déclencher la réplication de l’ADN indépendamment du système normal oriC/DnaA, un phénomène connu sous le nom de « constitutive stable DNA replication » (cSDR). Pour mieux comprendre le lien entre la formation de R-loops et l’excès de surenroulement négatif, nous avons construit un mutant conditionnel topA rnhA gyrB(Ts) avec l’expression inductible de la RNase HI à partir d’un plasmide. Nous avons trouvé que l’ADN des cellules de ce mutant était excessivement relâché au lieu d'être hypersurenroulé négativement en conditions de pénurie de RNase HI. La relaxation de l’ADN a été montrée comme étant indépendante de l'activité de la topoisomérase IV. Les cellules du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) forment de très longs filaments remplis d’ADN, montrant ainsi un défaut de ségrégation des chromosomes. La surproduction de la topoisomérase III (topB), une enzyme qui peut effectuer la décaténation de l’ADN, a corrigé les problèmes de ségrégation sans toutefois restaurer le niveau de surenroulement de l’ADN. Nous avons constaté que des extraits protéiques du mutant topA rnhA gyrB(Ts) pouvaient inhiber l’activité de surenroulement négatif de la gyrase dans des extraits d’une souche sauvage, suggérant ainsi que la pénurie de RNase HI avait déclenché une réponse cellulaire d’inhibition de cette activité de la gyrase. De plus, des expériences in vivo et in vitro ont montré qu’en absence de RNase HI, l’activité ATP-dépendante de surenroulement négatif de la gyrase était inhibée, alors que l’activité ATP-indépendante de cette enzyme demeurait intacte. Des suppresseurs extragéniques du défaut de croissance du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) qui corrigent également les problèmes de surenroulement et de ségrégation des chromosomes ont pour la plupart été cartographiés dans des gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des R-loops, ou la formation de fimbriae. La deuxième partie de ce projet avait pour but de comprendre les rôles des topoisomérases de type IA (topoisomérase I et topoisomérase III) dans la ségrégation et la stabilité du génome de Escherichia coli. Pour étudier ces rôles, nous avons utilisé des approches de génétique combinées avec la cytométrie en flux, l’analyse de type Western blot et la microscopie. Nous avons constaté que le phénotype Par- et les défauts de ségrégation des chromosomes d’un mutant gyrB(Ts) avaient été corrigés en inactivant topA, mais uniquement en présence du gène topB. En outre, nous avons démontré que la surproduction de la topoisomérase III pouvait corriger le phénotype Par- du mutant gyrB(Ts) sans toutefois corriger les défauts de croissance de ce dernier. La surproduction de topoisomérase IV, enzyme responsable de la décaténation des chromosomes chez E. coli, ne pouvait pas remplacer la topoisomérase III. Nos résultats suggèrent que les topoisomérases de type IA jouent un rôle important dans la ségrégation des chromosomes lorsque la gyrase est inefficace. Pour étudier le rôle des topoisomérases de type IA dans la stabilité du génome, la troisième partie du projet, nous avons utilisé des approches génétiques combinées avec des tests de « spot » et la microscopie. Nous avons constaté que les cellules déficientes en topoisomérase I avaient des défauts de ségrégation de chromosomes et de croissance liés à un excès de surenroulement négatif, et que ces défauts pouvaient être corrigés en inactivant recQ, recA ou par la surproduction de la topoisomérase III. Le suppresseur extragénique oriC15::aph isolé dans la première partie du projet pouvait également corriger ces problèmes. Les cellules déficientes en topoisomérases de type IA formaient des très longs filaments remplis d’ADN d’apparence diffuse et réparti inégalement dans la cellule. Ces phénotypes pouvaient être partiellement corrigés par la surproduction de la RNase HI ou en inactivant recA, ou encore par des suppresseurs isolés dans la première partie du projet et impliques dans le cSDR (dnaT18::aph et rne59::aph). Donc, dans E. coli, les topoisomérases de type IA jouent un rôle dans la stabilité du génome en inhibant la réplication inappropriée à partir de oriC et de R-loops, et en empêchant les défauts de ségrégation liés à la recombinaison RecA-dépendante, par leur action avec RecQ. Les travaux rapportés ici révèlent que la réplication inappropriée et dérégulée est une source majeure de l’instabilité génomique. Empêcher la réplication inappropriée permet la ségrégation des chromosomes et le maintien d’un génome stable. La RNase HI et les topoisomérases de type IA jouent un rôle majeur dans la prévention de la réplication inappropriée. La RNase HI réalise cette tâche en modulant l’activité de surenroulement ATP-dependante de la gyrase, et en empêchant la réplication à partir des R-loops. Les topoisomérases de type IA assurent le maintien de la stabilité du génome en empêchant la réplication inappropriée à partir de oriC et des R-loops et en agissant avec RecQ pour résoudre des intermédiaires de recombinaison RecA-dépendants afin de permettre la ségrégation des chromosomes.