Fusion of protoplasts with irradiated microprotoplasts as a tool for radiation hybrid panel in citrus

The objective of this work was to combine asymmetric somatic hybridization (donor-recipient fusion or gamma fusion) to microprotoplast-mediated chromosome transfer, as a tool to be used for chromosome mapping in Citrus. Swinglea glutinosa microprotoplasts were irradiated either with 50, 70, 100 or 200 gamma rays and fused to cv. Ruby Red grapefruit or Murcott tangor protoplasts. Cell colonies were successfully formed and AFLP analyses confirmed presence of S. glutinosa in both 'Murcott' tangor and 'Ruby Red' grapefruit genomes.

Population genetic structure in the native and introduced range of the Argentine ant/

SUMMARY : The evolution of animal societies, where some individuals forego their own reproductive opportunities to help others to reproduce, poses an evolutionary paradox that can be traced back to Darwin. Altruism may evolve through kin selection when the donor and recipient of altruistic acts are related to each other. In social insects, workers are generally highly related to the brood they rear when colonies are headed by a single queen. Yet some ants have an extraordinary social organization, called unicoloniality, whereby individuals from separate nests mix freely to form large supercolonies, which in some cases extend over hundreds of km. These supercolonies are characterised by a high number of queens (polygyny) and an absence of clear colony boundaries. This type of social organization represents an evolutionary paradox because relatedness between nestmates is effectively zero. In such conditions, kin selection cannot account for the evolution of reproductive altruism. Moreover, unicoloniality is thought to be unstable over time, because workers that can no longer aid close relatives may evolve more selfish strategies. The Argentine ant (Linepithema humile) is a highly invasive species listed among the hundred world's worst invaders by the UICN. Native from South America, L. humile has been accidentally introduced throughout the world. Native populations have been described as noninvasive with a family-based organization. In contrast, within its introduction range, they form unicolonial supercolonies that contain numerous nests without intraspecific aggression. The development of such unicolonial populations has been explained as a direct consequence of the ant's introduction into a new habitat, favouring a transition from family-based to open colonies. To determine if the social structure of the Argentine ant is fundamentally different between the native and the introduced range, we studied genetically and behaviourally native and introduced populations of L. humile over different geographic scales. Our results clearly indicated that there are no fundamental differences in the social organisation of the Argentine ant between the two ranges. Our investigations revealed that, contrary to previous claims, native populations have a unicolonial social organisation very similar to that observed in the introduced range. Consequently, the unicolonial social structure of the Argentine ant does not stem from a shift in social organization associated with introduction into new habitats but evolved in the native range and is likely a stable, evolutionarily ancient adaptation to the local environment. Our study on native populations of L. humile also gave important insight in the comprehension of the evolution of unicoloniality in the Argentine ant. Native supercolonies are relatively small compared to introduced ones and may co-habit in a same population. These supercolonies are genetically highly differentiated leading to a significant relatedness among nestmate workers when the different supercolonies of a population are taken as a reference population. This provides the necessary conditions for loin selection to operate. Furthermore, we examined a native population over time, which revealed a high supercolony extinction rate. If more competitive supercolonies are more likely to survive or replace other supercolonies, a subtle dynamical process between the spread of selfish traits within supercolony and the selective elimination of supercolonies with such traits may allow a stable equilibrium and the persistence of unicoloniality over time. Finally, a worldwide study of the Argentine ant showed that the introduced supercolonies originate from numerous independent introduction events. In conclusion, the success of the Argentine ant does not stem from a shift in social organization associated with its introduction into new habitats, but is most probably explained by the intrinsic characteristics developed in its native range. RESUME : L'altruisme de reproduction où certains individus renoncent à leur propre reproduction pour aider d'autres individus à se reproduire constitue l'un des plus grand paradoxe de l'évolution. En effet, comment expliquer l'évolution de comportements qui tendent à augmenter les chances de survie et le succès reproductif d'autres individus, alors que ces actes diminuent l'aptitude de leurs auteurs ? La théorie de la sélection de parentèle permet de résoudre ce problème. Cette théorie stipule qu'en aidant de proches parents à se reproduire, les individus peuvent promouvoir indirectement la transmission de copies de leurs propres gènes à la génération suivante. Chez les insectes sociaux, l'altruisme des ouvrières s'explique par la théorie de sélection de parentèle lorsque les colonies sont monogynes (constituées d'une seule reine) puisque les ouvrières sont fortement apparentées aux couvains dont elles s'occupent. Par contre, les espèces dites unicoloniales, dont les colonies forment des réseaux de nids appelés supercolonies, représentent toujours un paradoxe pour les théories de l'évolution puisque l'apparentement entre les différents individus d'un nid est nulle. De plus, l'unicolonialité ne devrait pas être stable sur le long terme parce que les ouvrières qui ne s'occupent plus de leur apparentés devraient développer des stratégies plus égoïstes au cours du temps. La fourmi d'Argentine (Linepithema humile) est une espèce invasive ayant un impact considérable sur son environnement. Originaire d'Amérique du Sud, elle a été introduite dans pratiquement toutes les régions du monde dont le climat est de type méditerranéen. Son incroyable succès invasif s'explique par sa structure sociale unicoloniale observée dans chacun des pays où elle a été introduite. Par contre, les rares études effectuées en Argentine ont suggéré que la fourmi d'Argentine n'était pas unicoloniale dans son aire native. L'unicolonialité chez la fourmi d'Argentine était donc considéré comme une conséquence de son introduction dans de nouveaux environnements. Durant cette thèse, nous avons vérifié si la structure sociale de cette espèce différait fondamentalement entre l'aire native et introduite. Pour cela, nous avons étudié, à différentes échelles géographiques, des populations introduites et argentines avec une approche génétique et comportementale. L'ensemble de nos résultats montrent que les différences entre les deux structure sociales ne sont pas aussi importantes que ce que l'on imaginait. Les populations natives sont aussi constituées de réseaux de nids coopérants. La taille de ses supercolonies est toutefois bien moins importante en Argentine et il n'est pas rare de trouver plusieurs supercolonies cohabitantes dans une même population. Nous avons démontré que ces réseaux de nids étaient constitués d'individus qui sont plus apparentés entre eux qu'ils ne le sont avec les individus d'autres supercolonies, ainsi l'unicolonialité dans son aire d'origine ne représente pas un réel paradoxe pour les théories de l'évolution. Finalement nous avons étudié la même population en Argentine à six ans d'intervalle et avons constaté que les supercolonies avaient un taux de survie très faible ce qui pourrait expliquer la stabilité de l'unicolonialité au cours du temps. Si les supercolonies les plus compétitives survivent mieux que les supercolonies dans lesquelles apparaissent des traits égoïstes, on devrait alors observer une dynamique entre l'apparition de traits égoïstes et l'élimination des supercolonies dans lesquelles ces traits égoïstes évolueraient. Finalement, une étude mondiale nous a montré que les supercolonies étaient originaires de nombreux événements d'introductions indépendants. En conclusion, le succès invasif de la fourmi d'Argentine n'est donc pas dû à un changement de comportement associé à son introduction mais est lié aux caractéristiques qu'elle a développées en Argentine.

Performance of 'Oneco' mandarin on six rootstocks in South Brazil

The objective of this work was to assess the effect of six rootstocks on yield, fruit quality, and growth of 'Oneco' mandarin during the first seven harvesting seasons, in Butiá, Rio Grande do Sul State, Brazil. The rootstocks evaluated were: 'Swingle' citrumelo (Citrus paradisi × Poncirus trifoliata), 'Caipira' orange (C. sinensis), 'Troyer' citrange (C. sinensis × P. trifoliata), 'Rangpur' lime (C. limonia), 'Volkamer' lemon (C. volkameriana), and 'Flying Dragon' trifoliata orange (P. trifoliata var. monstrosa). Plants budded onto 'Flying Dragon' had the lowest vegetative development, which indicates the dwarfing characteristics of this rootstock, and had the highest mean production efficiency, despite low yield. Plants grafted on 'Volkamer' lemon and 'Rangpur' lime had the highest alternate bearing. Under the experimental conditions evaluated, the most adequate rootstocks for mandarin 'Oneco' are 'Swingle' citrumelo and 'Troyer' citrange, regarding fruit yield and quality.

Surgical safety and hospital volume across a wide range of interventions

OBJECTIVES:: For certain major operations, inpatient mortality risk is lower in high-volume hospitals than those in low-volume hospitals. Extending the analysis to a broader range of interventions and outcomes is necessary before adopting policies based on minimum volume thresholds. METHODS:: Using the United States 2004 Nationwide Inpatient Sample, we assessed the effect of intervention-specific and overall hospital volume on surgical complications, potentially avoidable reoperations, and deaths across 1.4 million interventions in 353 hospitals. Outcome variations across hospitals were analyzed through a 3-level hierarchical logistic regression model (patients, surgical interventions, and hospitals), which took into account interventions on multiple organs, 144 intervention categories, and structural hospital characteristics. Discriminative performance and calibration were good. RESULTS:: Hospitals with more experience in a given intervention had similar reoperation rates but lower mortality and complication rates: odds ratio per volume deciles 0.93 and 0.97. However, the benefit was limited to heart surgery and a small number of other operations. Risks were higher for hospitals that performed more interventions overall: odds ratio per 1000 for each event was approximately 1.02. Even after adjustment for specific volume, mortality varied substantially across both high- and low-volume hospitals. CONCLUSION:: Although the link between specific volume and certain inpatient outcomes suggests that specialization might help improve surgical safety, the variable magnitude of this link and the heterogeneity of hospital effect do not support the systematic use of volume-based referrals. It may be more efficient to monitor risk-adjusted postoperative outcomes and to investigate facilities with worse than expected outcomes.

Importance of abiotic stress as a range-limit determinant for European plants: insights from species' responses to climatic gradients

Aim We examined whether species occurrences are primarily limited by physiological tolerance in the abiotically more stressful end of climatic gradients (the asymmetric abiotic stress limitation (AASL) hypothesis) and the geographical predictions of this hypothesis: abiotic stress mainly determines upper-latitudinal and upper-altitudinal species range limits, and the importance of abiotic stress for these range limits increases the further northwards and upwards a species occurs. Location Europe and the Swiss Alps. Methods The AASL hypothesis predicts that species have skewed responses to climatic gradients, with a steep decline towards the more stressful conditions. Based on presence-absence data we examined the shape of plant species responses (measured as probability of occurrence) along three climatic gradients across latitudes in Europe (1577 species) and altitudes in the Swiss Alps (284 species) using Huisman-Olff-Fresco, generalized linear and generalized additive models. Results We found that almost half of the species from Europe and one-third from the Swiss Alps showed responses consistent with the predictions of the AASL hypothesis. Cold temperatures and a short growing season seemed to determine the upper-latitudinal and upper-altitudinal range limits of up to one-third of the species, while drought provided an important constraint at lower-latitudinal range limits for up to one-fifth of the species. We found a biome-dependent influence of abiotic stress and no clear support for abiotic stress as a stronger upper range-limit determinant for species with higher latitudinal and altitudinal distributions. However, the overall influence of climate as a range-limit determinant increased with latitude. Main conclusions Our results support the AASL hypothesis for almost half of the studied species, and suggest that temperature-related stress controls the upper-latitudinal and upper-altitudinal range limits of a large proportion of these species, while other factors including drought stress may be important at the lower range limits.

Dynamic range extension of SiPM detectors with the time-gated operation

The silicon photomultiplier (SiPM) is a novel detector technology that has undergone a fast development in the last few years, owing to its single-photon resolution and ultra-fast response time. However, the typical high dark count rates of the sensor may prevent the detection of low intensity radiation fluxes. In this article, the time-gated operation with short active periods in the nanosecond range is proposed as a solution to reduce the number of cells fired due to noise and thus increase the dynamic range. The technique is aimed at application fields that function under a trigger command, such as gated fluorescence lifetime imaging microscopy.

Multiple introductions boosted genetic diversity in the invasive range of black cherry (Prunus serotina; Rosaceae).

BACKGROUND AND AIMS: Black cherry (Prunus serotina) is a North American tree that is rapidly invading European forests. This species was introduced first as an ornamental plant, then it was massively planted by foresters in many countries, but its origins and the process of invasion remain poorly documented. Based on a genetic survey of both native and invasive ranges, the invasion history of black cherry was investigated by identifying putative source populations and then assessing the importance of multiple introductions on the maintenance of gene diversity. METHODS: Genetic variability and structure of 23 populations from the invasive range and 22 populations from the native range were analysed using eight nuclear microsatellite loci and five chloroplast DNA regions. KEY RESULTS: Chloroplast DNA diversity suggests there were multiple introductions from a single geographic region (the north-eastern United States). A low reduction of genetic diversity was observed in the invasive range for both nuclear and plastid genomes. High propagule pressure including both the size and number of introductions shaped the genetic structure in Europe and boosted genetic diversity. Populations from Denmark, The Netherlands, Belgium and Germany showed high genetic diversity and low differentiation among populations, supporting the hypothesis that numerous introduction events, including multiple individuals and exchanges between sites, have taken place during two centuries of plantation. CONCLUSIONS: This study postulates that the invasive black cherry has originated from east of the Appalachian Mountains (mainly the Allegheny plateau) and its invasiveness in north-western Europe is mainly due to multiple introductions containing high numbers of individuals.

CALOGÊNESE EM ÓVULOS DE ESPÉCIES E VARIEDADES DE CITRUS

A Embrapa Mandioca e Fruticultura vem realizando ações de pesquisa visando à obtenção de híbridos somáticos de citros, particularmente porta-enxertos, melhor adaptados às condições tropicais de cultivo brasileiras que as variedades atualmente em uso. Como objetivo principal, busca-se a seleção de genótipos tolerantes à seca e ao alumínio, tolerantes/resistentes a gomose de Phytophthora e tristeza dos citros, além de adaptados a altas densidades populacionais. Como fontes de protoplastos, vêm sendo utilizadas as tangerinas-'Cleópatra', 'Sunki' e 'Swatow', limões-'Cravo Santa Cruz' e 'Santa Bárbara', 'Volkameriano' e 'Rugoso Mazoe', laranja 'Hamlin CNPMF 04' e 'CNPMF 20', laranjas-azedas 'Comum' e 'Narrow Leaf', citrange-'Troyer', Citrus amblycarpa e Microcitrus papuana. O estudo concentrou-se na etapa de obtenção e cultivo de calos embriogênicos. Foram utilizados óvulos extraídos de frutos imaturos, empregando-se como meio de cultura o MT, adicionando-se 50 g.L-1 de sacarose e 500 mg.L-1de extrato de malte e solidificando com 7 g.L-1 1de ágar. Em geral, a indução de calos nas variedades estudadas ocorreu entre a 6ª e a 8ª semana de cultivo, com maior precocidade na laranja-‘Hamlin’, sendo que, em limão-‘Cravo’, laranja-‘Hamlin’ , tangerinas-‘Cleópatra’ e ‘Swatow’ e citrange-‘Troyer’, a porcentagem de formação de calos foi igual ou superior a 50%, destacando-se a tangerina-‘Cleópatra’ com um porcentual próximo a 70% de calogênese.

ORGANOGÊNESE IN VITRO DE Citrus EM FUNÇÃO DE CONCENTRAÇÕES DE BAP E SECCIONAMENTO DO EXPLANTE

O sucesso de técnicas biotecnológicas no melhoramento in vitro de Citrus depende diretamente do desenvolvimento de protocolos eficientes para regeneração de plantas. Objetivou-se avaliar o efeito de concentrações de 6-benzilaminopuria (BAP) na organogênese in vitro de limão-'Cravo' e laranja-'Pêra', bem como o efeito do seccionamento do explante em laranja-'Valência'. Para o limão-'Cravo', foram utilizados como explante, segmentos internodais de plântulas germinadas in vitro, cultivados em meio MT e variando-se as concentrações de BAP em 0; 2,5; 5; 7,5 e 10 mg.L-1. Nas laranjas-'Pêra' e 'Valência' os explantes foram segmentos do epicótilo de plântulas germinadas in vitro. Os explantes de laranja-'Pêra' foram cultivados em meio MT variando-se as concentrações de BAP em 0; 1; 2; 3 e 4 mg.L-1. Para a laranja-'Valência', metade dos explantes foram seccionados e cultivados em meio MT acrescido de 1,0 mg.L-1 de BAP. Todas as brotações obtidas foram alongadas no meio de cultura MT + 25 g.L-1 de sacarose + 1 mg.L-1 de ácido giberélico (GA3) e enraizadas no meio MT + 25 g.L-1 de sacarose + 0,5 g.L-1 de carvão ativado + 1 mg.L-1 de ácido naftaleno acético (ANA). O melhor resultado para o número de brotações adventícias foi obtido na concentração 2,5 mg.L-1 de BAP para limão-'Cravo', e nas concentrações 1,0 e 2,0 mg.L-1 de BAP para laranja-'Pêra'. O seccionamento dos explantes favoreceu a organogênese in vitro da laranja-'Valência', porém as brotações apresentaram menor índice de enraizamento.

CARACTERÍSTICAS DO FRUTO DA VARIEDADE SPAN AMERICANA (Citrus reticulata Blanco): UMA TANGERINA DO TIPO 'PONCÃ' DE MATURAÇÃO PRECOCE

A tangerina-'Poncã' é bastante apreciada pelo consumidor brasileiro. No Estado de São Paulo, a maturação de seus frutos ocorre nos meses de abril a agosto. Com o mercado ávido por frutas de mesa e agravado pelo problema da ocorrência da clorose variegada dos citros (CVC), que afeta principalmente as variedades de laranjas-doces, tem havido um aumento considerável no plantio dessa variedade. Dessa forma, um excesso de produção, num mesmo período, faz com que os preços caiam, desestimulando assim os produtores. O Centro de Citricultura Sylvio Moreira (CCSM) vem buscando outras alternativas no sentido de obter, durante o ano todo, esse tipo de tangerina. Assim sendo, foram realizados estudos de caracterização de frutos, em diversas épocas do ano, com o acompanhamento dos níveis de maturação, envolvendo acessos do Banco de Germoplasma do CCSM. Dentre as variedades estudadas, quanto à precocidade e qualidade dos frutos, destacou-se a Span Americana. A tangerina-'Poncã' tem seu período de maturação para as condições edafoclimáticas do CCSM, nos meses de maio e junho. Já a variedade Span Americana, que apresenta frutos similares à 'Poncã' tradicional, tem maturação bastante precoce, podendo ser iniciada a sua colheita no mês de março.

Fortuitous infestation or wide host range? The case of Spinturnicidae and their bat hosts: Reply to Guiller and Deunff (2010)

Defining the degree of host specificity in host-parasite studies can greatly inform cophylogenetic history. In a recent paper, Guiller and Deunff (2010) cast doubt on some points and conclusions drawn from a cophylogenetic study between European bats and Spinturnicid mites (Bruyndonckx et al., 2009a). Here we answer their criticisms and discuss the notion of specificity in Spinturnicid mites.

MARCADORES RAPD PARA MAPEAMENTO GENÉTICO E SELEÇÃO DE HÍBRIDOS DE CITROS

Os marcadores moleculares apresentam várias aplicações no melhoramento de plantas, permitindo uma série de análises genéticas. Este trabalho foi realizado com o objetivo de estabelecer marcadores RAPD para serem utilizados em estudos de mapeamento genético e na seleção de híbridos entre tangerina-'Cravo' (Citrus reticulata Blanco) e laranja-'Pêra' (C. sinensis (L.) Osbeck). Extraiu-se DNA de folhas dos parentais e de seis híbridos F1. As reações de amplificação foram preparadas em 13 uL de solução, constituída por tampão 1x GIBCO BRL; soluções 1,54 mM de MgCl2 e 0,2 mM de cada dNTP; 15 ng de cada 'primer'; 1,5 unidade de 'Taq DNA Polymerase' e 15 ng de DNA genômico. As reações foram realizadas em termocicladores programados para 36 ciclos de 1 min a 92ºC, 1 min a 36ºC, 2 min a 72ºC e 10 min de extensão a 72ºC. Foram testados 'primers' decâmeros arbitrários dos 'kits' A, AB, AT, AV, B, C, D, E, G, H, M, N, P, Q, R e U da Operon, sendo selecionados 113 por apresentarem polimorfismo, com número de marcadores variando de 1 a 6 por 'primer'. Esses 'primers' amplificaram 201 (23,13%) bandas polimórficas, aplicáveis no mapeamento genético e seleção de híbridos. A freqüência de 'primers' com 1; 2; 3; 4; 5 e 6 bandas polimórficas foi de 49,5%, 33,6%, 9,7%, 4,4%, 1,8% e 1,0%, respectivamente.

EFEITO DO ÁCIDO GIBERÉLICO (AG3) NA FLORAÇÃO E PRODUÇÃO DA LIMA ÁCIDA 'TAHITI' (Citrus latifolia Tan.)

A floração nos citros, assim como em outras fruteiras, é um dos fatores determinantes para a produção. A possibilidade de inibição ou redução da florada normal e alteração da época de produção para a lima 'Tahiti' é fator primordial para determinar sua rentabilidade econômica. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do ácido giberélico sobre a florada, número de flores formadas, da lima ácida 'Tahiti', nas condições do Estado de São Paulo durante dois anos, buscando inibir a florada normal e observar o efeito desta inibição sobre produções temporãs. O delineamento experimental foi em blocos casualizados (5 blocos) com 3 plantas por tratamento. Foi utilizada uma planta como bordadura entre os tratamentos e uma linha de plantas entre os blocos. Os tratamentos foram: testemunha, 20, 40 e 80 mg/L de ácido giberélico (AG3) + 10 ml/L de espalhante adesivo, e o pH da água utilizada foi 6,2. As plantas foram tratadas com ácido giberélico durante o inverno (estação seca) após 50 dias sem irrigação no primeiro ano e 60 dias no segundo. O ácido giberélico reduziu o número de flores formadas (-81%) e aumentou a produção de frutos temporões (+59,77% ou +16,04 kg/pl).

Porta-enxertos para a lima-ácida-'Tahiti' na região de Bebedouro, SP

Foi instalado um experimento de seleção de porta-enxertos para a lima-ácida-'Tahiti' (Citrus latifolia Tanaka), em dezembro de 1988, na Estação Experimental de Citricultura de Bebedouro-SP, com o objetivo de conhecer seu comportamento e oferecer novas opções de plantio para as condições ecológicas semelhantes às daquela região. A variedade copa, originária do BAG-Citros do IAC, localizado no Centro de Citricultura Sylvio Moreira, Cordeirópolis-SP, é um clone nucelar de 'Tahiti', denominado IAC-5. Os porta-enxertos, que tiveram a mesma origem, foram: tangerinas-'Sunki' (Citrus sunki Hort. ex Tanaka); 'Cleópatra'(Citrus reshni Hort. ex Tan.); 'Batangas' e 'Oneco' (Citrus reticulata Blanco); trifoliata-EEL (Poncirus trifoliata Raf.); limão-'Cravo' (Citrus limonia Osbeck); limão-'Volkameriano Catania 2' (Citrus volkameriana Tan. & Pasq.); tangelo-'Orlando' (C. reticulata Blanco x Citrus paradisi Macf.); citrumelo-'Swingle' (P. trifoliata Raf. X C.paradisi Macf.); citrange-'Morton' (P. trifoliata Raf. X C. sinensis (L.) Osbeck) e laranja-'Caipira DAC' (C. sinensis (L.) Osbeck). Com relação à produção, avaliada no período de 1991 a 1998, os porta-enxertos de melhor comportamento foram o tangelo-'Orlando', citrange-'Morton' e citrumelo-'Swingle'. As mais baixas produções ocorreram nos porta-enxertos de tangerina e de laranja-'Caipira DAC'. O limão-'Cravo' apresentou produção intermediária e proporcionou curta vida útil às plantas.

Absorção e redistribuição de nitrogênio (15N) em Citrus mitis Bl

Com a avaliação da eficiência de uso do nitrogênio, tem-se melhor entendimento dos aspectos nutricionais e respostas à adubação. O presente ensaio teve por objetivo estudar a absorção e redistribuição de nitrogênio (15N) em Citrus mitis Bl.. As fontes de fertilizante utilizadas foram: sulfato de amônio, uréia, nitrato de cálcio e nitrato de potássio. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 4 tratamentos e 3 repetições. Foram realizadas duas amostragens, aos 10 e 20 dias após a aplicação do adubo marcado, a fim de determinar os teores de N nas diferentes partes da planta. Através dos resultados, verificou-se que não houve efeito dos tratamentos sobre o peso de matéria seca e conteúdo de N nas plantas. A eficiência de absorção de N variou com a natureza do fertilizante nitrogenado e com a época de amostragem, ao passo que a redistribuição do N não foi afetada. A eficiência máxima de absorção do N variou de 14% (uréia) e 31% (sulfato de amônio), respectivamente, aos 10 e 20 dias após a aplicação do 15N.