Étude du trafic du récepteur delta-opiacé suite à sa stimulation par différents agonistes

Les opiacés figurent parmi les analgésiques les plus puissants pour le traitement des douleurs sévères. Les agonistes du DOR (récepteur delta opiacé) induisent moins d'effets secondaires que ceux du mu, ce qui les rend une cible d'intérêt pour le traitement des douleurs chroniques. Cependant, ils induisent la tolérance à l'analgésie. Des hypothèses récentes proposent que le potentiel des drogues à induire la tolérance soit la conséquence de la stabilisation de différentes conformations du récepteur induites par la liaison avec différents ligands, chacune ayant différentes propriétés de trafic. Dans ce contexte, nous avons déterminé si différents ligands du DOR différaient dans leur capacité à induire la signalisation et le trafic du récepteur. Nos résultats indiquent que DPDPE et SNC-80 sont les drogues les plus efficaces à inhiber la production d’AMPc, suivis par UFP-512, morphine et TIPP. DPDPE et SNC-80 induisent à eux seuls l’internalisation du DOR dans les cellules HEK-293 de façon dépendante de la β-arrestine mais pas de la GRK2 ni PKC. Ces deux drogues induisent également l’internalisation du DOR dans les neurones corticaux et c’est seulement le DPDPE qui permet au DOR de regagner la membrane des cellules HEK-293 et des neurones après récupération. Cette capacité de recyclage était suggérée comme un mécanisme protégeant contre la survenue de la tolérance. Ces observations indiquent que le DOR peut subir différentes régulations en fonction du ligand lui étant associé. Cette propriété de sélectivité fonctionnelle des ligands pourrait être utile pour le développement de nouveaux opiacés ayant une activité analgésique plus durable.

Implication du CYP2D6 dans la pharmacodynamie et la pharmacogénomique de l’oxycodone

La variabilité interindividuelle dans la réponse aux médicaments constitue une problématique importante pouvant causer des effets indésirables ou l’échec d’un traitement. Ces variabilités peuvent être causées par une diminution de l’activité de l’enzyme responsable du métabolisme de certains médicaments, fréquemment les cytochromes P450, un système enzymatique majeur dans le métabolisme de ces derniers. Ces enzymes sont sujets à des mutations génétiques appelées polymorphismes, qui altèrent l’activité métabolique. Il est donc important d’évaluer le rôle de ces enzymes dans le métabolisme des médicaments afin d’identifier leur responsabilité dans la variabilité interindividuelle de la réponse au traitement. Parmi l’important système enzymatique que représentent les cytochromes P450, l’isoenzyme CYP2D6 est particulièrement étudiée, ses variations métaboliques revêtant une haute importance clinique. L’un des substrats du CYP2D6 est l’oxycodone, un analgésique narcotique largement prescrit en clinique. Une grande variabilité est observée dans la réponse analgésique à l’oxycodone, variabilité pouvant être causée par un polymorphisme génétique. Il est connu que des variations génétiques dans le CYP2D6 compromettent la réponse analgésique à la codéine en rendant moins importante la formation de son métabolite actif, la morphine. Par analogie, plusieurs études supportent l’hypothèse selon laquelle le métabolite oxymorphone, formée par l’isoenzyme CYP2D6, serait responsable de l’analgésie de l’oxycodone. Une déficience génétique de l’enzyme compromettrait la réponse analgésique au médicament. Les travaux effectués dans le cadre de ce mémoire ont démontré que l’inhibition du CYP2D6 chez des sujets volontaires réduit de moitié la production d’oxymorphone, confirmant l’importante implication de l’enzyme dans le métabolisme de l’oxycodone. Ces résultats démontrent une forte ressemblance avec le métabolisme de la codéine, suggérant que l’oxymorphone pourrait être responsable de l’analgésie. Cependant, les travaux effectués n’ont pu établir de relation entre la concentration plasmatique d’oxymorphone et le niveau d’analgésie ressenti par les sujets. La continuation des études sur le mécanisme d’action de l’oxycodone dans la réponse analgésique est essentielle afin d’établir la source des variabilités interindividuelles expérimentées par les patients et ainsi d’éviter des effets secondaires ou lacunes dans le traitement.

What’s so Special About Cyberspace Reflections on Elkin-Koren And Salzberger

Dans cet article, l’auteur Ejan Mackaay présente les caractéristiques fondamentales du cyberespace et analyse les relations économiques et juridiques entre les acteurs du marché virtuel de l’Internet. Cette analyse s'inscrit en marge des travaux de Niva Elkin-Koren et Eli Salzberger, dont elle suit le plan. D'une part, il y est précisé que le marché virtuel de l’Internet remet en question l’analyse classique des interactions entre les acteurs économiques. La nouvelle analyse néo-institutionnel présente un cadre analytique qui relève plus adéquatement les relations complexes entre les acteurs économiques du marché virtuel que les théories économiques classiques. Cette nouvelle approche se fonde sur le concept que les acteurs économiques utilisent les ressources afin d’être intégrés au sein des institutions les plus actives et efficaces. D'autre part, il est fait mention que le cyberespace présente plusieurs caractéristiques d’un marché économique. Toutefois, étant virtuel, le cyberespace ne présente pas les mêmes limites qu’un marché physique. En effet, dans ce dernier, certaines limites physiques imposent diverses règles de comportement. Le législateur doit donc prendre conscience de l’absence de telles limites et des normes qu’elles imposaient afin de légiférer adéquatement sur les échanges dans le cyberespace. Ensuite, afin d’illustrer les divergences entre les marchés physiques et virtuels, une analyse est faite au regard des principaux échecs de marchés, soit l’établissement d’un monopole, l’accès aux biens publics, les informations imparfaites et les externalités négatives. Un monopole est un échec de marché qui restreint considérablement la compétition, peut être accrut par l’effet boule de neige et, s’il n’est pas contrôlé, peut mener à un effet de blocage ou d’exclusion de certains acteurs. Le second échec analysé est l’accès aux biens publics. Dans le cyberespace, le principal bien public est l’information qui peut être échangée entre les utilisateurs. Toutefois, certaines règles de droits d’auteur et de propriété intellectuelle peuvent considérablement limiter l’accès à ce bien. L’information incomplète des acteurs économiques constitue un autre échec de marché, mais le cyberespace offre plusieurs moyens d’accéder à l’information pertinente aux transactions éclairées. Enfin, les externalités négatives peuvent généralement être considérées comme des effets secondaires des échanges commerciaux. Toutefois il est souligné que ces dernières ont un effet très limité dans le cyberespace, étant donné le plus grand nombre d’options de retrait et la facilité accrue de l’exercer. Enfin, il est rappelé que le commerce électronique et le cyberespace remettent en questions toutes les théories économiques et politiques traditionnelles et offrent une perspective nouvelle sur le phénomène de la formation des normes.

Le cas du chapitre 11 de l'ALÉNA : son impact sur la capacité de l'État d'agir pour le bien public et de gérer le risque

Cet article présente le chapitre 11 de l’ALÉNA à titre de question d’actualité non seulement juridique mais également sociale et politique. Après avoir retracé son origine historique et expliqué la controverse qui y est relative ainsi que ses implications, l’auteur analyse l’impact du chapitre en posant trois questions: le chapitre 11 de l’ALÉNA a-t-il l’effet recherché ?  A-t-il des effets secondaires ?  Quelle est leur importance relative ?  Afin de combler une lacune dans la doctrine existante, une analyse globale des poursuites et des jugements déjà rendus est effectuée, tableaux de travail à l’appui, État par État.  Ceci permet de constater notamment que les États-Unis n’ont jamais été condamnés à payer des dommages-intérêts en vertu de ce chapitre alors que les entreprises américaines ont raflé la quasi-totalité des dommages-intérêts payés par le Canada et le Mexique.  Les entreprises canadiennes n’ont jamais obtenu de dommages-intérêts en vertu de ce chapitre.  On constate aussi que le Canada est actuellement l’État poursuivi pour le montant le plus élevé en vertu de ce chapitre et que les poursuites intentées contre le Canada se sont multipliées par quatre, ce qui n’augure pas bien de l’avenir.

Étude Pharmacologique de la Douleur Neuropathique Centrale à la suite d'une Hémorragie Intrathalamique induite chez le Rat.

La douleur neuropathique centrale post accident vasculaire cérébral est une condition débilitante dont le traitement s’avère souvent délicat et infructueux. Le but de ce projet était de reproduire cette condition chez le rat en injectant par stéréotaxie une solution de collagènase produisant une hémorragie localisée dans le noyau ventropostérolatéral du thalamus. Des tests comportementaux évaluant la coordination motrice, la sensibilité mécanique, au chaud et au froid étaient réalisés régulièrement afin d’établir la présence de douleur neuropathique puis les effets de l’administration de kétamine, d’amitriptyline, de gabapentine, et de carbamazepine étaient évalués. L’induction d’une hémorragie intrathalamique conduit à l’apparition d’allodynie mécanique bilatérale persistante ainsi que d’allodynie au froid transitoire chez certains sujets et ce sans modification de la coordination motrice. L’administration de kétamine à forte dose renverse l’allodynie mécanique mais est associée à une altération de la motricité. L’administration de gabapentine renverse également cette allodynie mécanique sans effet notable sur la coordination motrice. Les autres médicaments n’ont pas démontré d’effet significatif. L’évaluation histopathologique des cerveaux montre une lésion bien localisée dans la zone d’intérêt. Ces résultats montrent que l’injection intrathalamique de collagénase peut être utilisée comme un modèle fiable de douleur neuropathique centrale. Si la kétamine semble capable de soulager ce type de douleur, elle est associée à des effets indésirables. En revanche, la gabapentine serait une molécule prometteuse pour le traitement de cette condition. Le rôle des récepteurs NMDA et des canaux calciques voltage dépendants, cibles respectives de la kétamine et de la gabapentine dans le maintien de cette douleur mérite d’être précisé.

Rôle et implication du système cannabinoïde dans la modulation périphérique de la douleur inflammatoire et neuropathique

Les dérivés de l’opium (opioïdes) et du cannabis (cannabinoïdes) présentent de nombreuses propriétés intéressantes. Suite à l’identification de leurs récepteurs respectifs, diverses stratégies pharmacologiques ont tenté d’exploiter leurs propriétés analgésiques. Le clonage des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 a favorisé la découverte de composés endogènes pour ces récepteurs, les endocannabinoïdes, dont les deux plus étudiés sont l’anandamide et le 2-arachidonyl glycérol (2-AG). Cette découverte a également mené à l’identification d’enzymes qui catalysent l’inactivation de ces cannabinoïdes endogènes : une amidohydrolase des acides gras ou FAAH ainsi qu’une monoacylglycérol lipase ou MAGL. Le système cannabinoïde endogène est régulé à la hausse dans une variété de processus pathologiques, tels que les douleurs inflammatoire et neuropathique. Cette augmentation est habituellement interprétée comme une réaction physiologique visant à rétablir l’homéostasie et elle a notamment été observée en périphérie. Les endocannabinoïdes semblent donc agir de façon spécifique à des moments clés dans certains tissus ciblés afin de minimiser les conséquences reliées au déclenchement de ces douleurs. Cette observation est très intéressante d’un point de vue thérapeutique puisqu’elle suggère la possibilité de cibler les enzymes de dégradation des endocannabinoïdes dans le but d’augmenter leurs concentrations locales et d’ainsi prolonger leur action neuromodulatrice. En périphérie, l’activation des récepteurs cannabinoïdes induit des effets antinociceptifs bénéfiques tout en minimisant les effets indésirables souvent associés à leur activation centrale. Nous avons orienté nos travaux vers la modulation périphérique de ce système endogène à l’aide d’inhibiteurs des enzymes de dégradation des endocannabinoïdes afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique et d’élucider les mécanismes d’action qui sous-tendent leurs effets dans des modèles animaux de douleurs inflammatoire et neuropathique. Nous avons démontré que cette approche permet de soulager les symptômes associés à ces deux types de douleurs, et ce via les récepteurs CB1 et CB2. Les systèmes cannabinoïde et opioïde présentent des similitudes, dont des localisations similaires le long des voies de la douleur, des mécanismes d’action relayés par des récepteurs couplés aux protéines G et des propriétés pharmacologiques communes telles que l’analgésie. Le système opioïde est impliqué dans les effets antinociceptifs induits par les cannabinoïdes. À l’inverse, le rôle joué par le système cannabinoïde dans ceux induits par la morphine demeure incertain. Nous avons démontré que les effets antinociceptifs périphériques et spinaux produits par la morphine sont diminués chez les souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’expression des récepteurs CB1 ou CB2 a été éliminée, laissant supposer un rôle pour ces récepteurs dans les effets de la morphine. Nous avons de plus démontré que la diminution de l'analgésie produite par la morphine dans ces souris n'est pas causée par un dysfonctionnement des récepteurs opioïdes mu (MOP) ni par une régulation à la baisse de ces récepteurs. Nos résultats confirment l'existence d'interactions fonctionnelles entre les systèmes cannabinoïde et opioïde au niveau périphérique et spinal. Ces observations sont prometteuses d’un point de vue thérapeutique puisqu’une modulation périphérique ciblée des niveaux d’endocannabinoïdes et d’opioïdes endogènes permettrait de produire des effets analgésiques bénéfiques potentiellement synergiques tout en minimisant les effets indésirables associés à l’activation centrale de ces systèmes.

Traitement de l'arthrose canine : étude d'efficacité d'une diète riche en moule verte (Perna canaliculus) et validité des méthodes cliniques d'évaluation de l'effet traitement

Introduction: L’arthrose est une maladie fréquente chez le chien. Même si des traitements palliatifs ont prouvé leur efficacité pour soulager les signes cliniques associés, aucun n’a permis de restaurer la structure des cartilages ou la fonction des patients. De nouvelles modalités de traitement sont proposées mais très peu d’évidences existent quant à leur efficacité. Un problème récurrent pour apporter plus d’évidence est le manque d’outils d’évaluation dûment validés. Objectif: Evaluer l’efficacité d’une diète contenant de la moule verte, ainsi que la validité de différentes méthodes pour évaluer les effets de ce traitement sur la condition arthrosique de chiens de propriétaire. Méthodes: Une étude prospective croisée contrôlée en aveugle a été conduite sur 30 chiens de propriétaires. Leur condition était stable et non traitée. Ils ont reçu une diète contrôle pendant 30 jours puis la diète thérapeutique pendant 60 jours. A J0 (inclusion), J30 (fin de la période contrôle) et J90 (fin du traitement), les concentrations plasmatiques en acides gras ω–3 (EPA et DHA), le pic de force verticale (PVF – critère de référence), un questionnaire multifactoriel standardisé (MFQ), et la conductance électrodermique (EDA) ont été mesurés. Deux fois par semaine, les propriétaires remplissaient un questionnaire sur la fonction spécifique à leur animal (CODI). L’activité locomotrice (actimétrie) a été enregistrée en continu sur 7 chiens. Résultats: Aucun effet secondaire n’a été documenté excepté une augmentation du poids des chiens durant la période traitement. La localisation -thoracique ou pelvienne- du membre étudié et le poids ont interagi avec PVF. Les taux d’EPA et DHA ont augmenté durant la période traitement (p=0.026 et p<0.001, respectivement), tout comme PVF corrigé pour l’effet du poids et de la localisation du membre (p=0.003). La validité technique de PVF a été vérifiée. La validité technique et selon-critère du CODI ont été vérifiées. MFQ n’a pas montré d’homogénéité suffisante entre ses différents composants, bien que les résultats du composite convergent partiellement avec PVF. L’EDA n’a pas montré de validité technique suffisante. L’actimétrie a montré une validité technique satisfaisante ainsi que des résultats convergeant avec ceux de PVF. Conclusions: La méthode choisie comme référence a montré un effet bénéfique de la diète testée et sa validité technique a été vérifiée. À la fois, CODI et l’actimétrie ont été validés. La validité d’EDA et de MFQ a été remise en question. L’actimétrie a donné des résultats prometteurs, probablement complémentaires de PVF.

Development of a multi-gene PCR assay for the prediction of the response to hormone therapy in breast cancer

Deux tiers des cancers du sein expriment des récepteurs hormonaux ostrogéniques (tumeur ER-positive) et la croissance de ces tumeurs est stimulée par l’estrogène. Des traitements adjuvant avec des anti-estrogènes, tel que le Tamoxifen et les Inhibiteurs de l’Aromatase peuvent améliorer la survie des patientes atteinte de cancer du sein. Toutefois la thérapie hormonale n’est pas efficace dans toutes les tumeurs mammaires ER-positives. Les tumeurs peuvent présenter avec une résistance intrinsèque ou acquise au Tamoxifen. Présentement, c’est impossible de prédire quelle patiente va bénéficier ou non du Tamoxifen. Des études préliminaires du laboratoire de Dr. Mader, ont identifié le niveau d’expression de 20 gènes, qui peuvent prédire la réponse thérapeutique au Tamoxifen (survie sans récidive). Ces marqueurs, identifié en utilisant une analyse bioinformatique de bases de données publiques de profils d’expression des gènes, sont capables de discriminer quelles patientes vont mieux répondre au Tamoxifen. Le but principal de cette étude est de développer un outil de PCR qui peut évaluer le niveau d’expression de ces 20 gènes prédictif et de tester cette signature de 20 gènes dans une étude rétrospective, en utilisant des tumeurs de cancer du sein en bloc de paraffine, de patients avec une histoire médicale connue. Cet outil aurait donc un impact direct dans la pratique clinique. Des traitements futiles pourraient être éviter et l’indentification de tumeurs ER+ avec peu de chance de répondre à un traitement anti-estrogène amélioré. En conséquence, de la recherche plus appropriée pour les tumeurs résistantes au Tamoxifen, pourront se faire.

Caractérisation pharmacologique et moléculaire des dyskinésies tardives chez un modèle de primate non humain

Les dyskinésies tardives (DT) sont des troubles moteurs associés à l’utilisation chronique des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le métoclopramide. Ces dyskinésies correspondent à une incoordination motrice portant préférentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est imposée comme défi de santé publique surtout en l’absence d’une alternative thérapeutique efficace et abordable. L’hypothèse classiquement avancée pour expliquer la physiopathologie des DT inhérente au traitement par les antipsychotiques s’articule autour de l’hypersensibilité des récepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molécules. Néanmoins, plusieurs données remettent la véracité de cette hypothèse en question. Hypothèse: nous proposons que le blocage chronique des récepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable d’un phénomène d’hypersensibilisation mais contrairement à l’hypothèse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramètres de la transmission dopaminergique autres que les récepteurs D2. De même nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altérations des cascades signalétiques au niveau des cellules du striatum. Ces altérations aboutissent à des changements portant sur le récepteur nucléaire (Nur77), qui est hautement associé au système dopaminergique; l’induction de ces récepteurs déclencherait des cascades associées à la compensation ou à la genèse des DT. Matériels et méthodes: 23 femelles Cebus apella, réparties en 3 groupes: groupe halopéridol, groupe clozapine, et groupe contrôle, ont été exposées aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Après l’analyse comportementale, les animaux ont été décapités et leurs cerveaux isolés pour fin d’analyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel à cette technique pour mesurer l’expression de l’ARNm de Nur77 et du neuropeptide enképhaline. Hybridation in situ double: nous avons exploités cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les récepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur éventuelle induction. Autoradiographies des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des récepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif d’évaluer l’expression de ces différents récepteurs. Mutagenèse dirigée et transfection cellulaire: nous faisons appel à ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifié au niveau de la région 3’UTR de l’ARNm Nur77 et évaluer l’impact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilité de l’ARNm Nur77 sinon sur l’expression de la protèine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier l’expression globale de ces kinases. Analyses statistiques: l’expression de l’ARNm Nur77 a été évaluée en utilisant l’analyse de la variance à un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procédé de la même façon pour mesurer l’expression des récepteurs D2, D3 et mGluR5. Résultats: le groupe des animaux traités par l’halopéridol montre une plus forte expression des récepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrèle positivement avec la sévérité des DT. L’expression des récepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchangée entre les différents groupes, alors qu’un gradient d’expression a été observé pour le récepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par l’halopéridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traités par la clozapine. L’induction de l’expression de Nur77 par l’halopéridol est plus accrue chez les animaux non dyskinétiques. Les animaux traités par la clozapine démontrent une expression amoindrie de l’ARNm de Nur77 qui tend à être plus faible que l’expression de base. D’autre part, la présence du polymorphisme au niveau de la région 3’UTR semble affecter l’expression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces résultats confortent notre hypothèse concernant l’existence d’un phénomène d’hypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phénomène s’est traduit par une augmentation de l’expression des récepteurs D3 sans porter sur les récepteurs D2 tel que prôné classiquement. Cette hypersensibilisation des récepteurs D3 implique également l’existence d’un débalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre l’apparition des DT. Ces résultats dévoilent ainsi un nouveau mécanisme qui pourrait contribuer à l’apparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous l’espérons, des DT à l’échelle clinique.

Detection of methotrexate using surface plasmon resonance biosensors for chemotherapy monitoring

Le méthotrexate (MTX), un agent anti-cancéreux fréquemment utilisé en chimiothérapie, requiert généralement un suivi thérapeutique de la médication (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) pour surveiller son niveau sanguin chez le patient afin de maximiser son efficacité tout en limitant ses effets secondaires. Malgré la fenêtre thérapeutique étroite entre l’efficacité et la toxicité, le MTX reste, à ce jour, un des agents anti-cancéreux les plus utilisés au monde. Les techniques analytiques existantes pour le TDM du MTX sont coûteuses, requièrent temps et efforts, sans nécessairement fournir promptement les résultats dans le délai requis. Afin d’accélérer le processus de dosage du MTX en TDM, une stratégie a été proposée basée sur un essai compétitif caractérisé principalement par le couplage plasmonique d’une surface métallique et de nanoparticules d’or. Plus précisément, l’essai quantitatif exploite la réaction de compétition entre le MTX et une nanoparticule d’or fonctionnalisée avec l’acide folique (FA-AuNP) ayant une affinité pour un récepteur moléculaire, la réductase humaine de dihydrofolate (hDHFR), une enzyme associée aux maladies prolifératives. Le MTX libre mixé avec les FA-AuNP, entre en compétition pour les sites de liaison de hDHFR immobilisés sur une surface active en SPR ou libres en solution. Par la suite, les FA-AuNP liées au hDHFR fournissent une amplification du signal qui est inversement proportionnelle à la concentration de MTX. La résonance des plasmons de surface (SPR) est généralement utilisée comme une technique spectroscopique pour l’interrogation des interactions biomoléculaires. Les instruments SPR commerciaux sont généralement retrouvés dans les grands laboratoires d’analyse. Ils sont également encombrants, coûteux et manquent de sélectivité dans les analyses en matrice complexe. De plus, ceux-ci n’ont pas encore démontré de l’adaptabilité en milieu clinique. Par ailleurs, les analyses SPR des petites molécules comme les médicaments n’ont pas été explorés de manière intensive dû au défi posé par le manque de la sensibilité de la technique pour cette classe de molécules. Les développements récents en science des matériaux et chimie de surfaces exploitant l’intégration des nanoparticules d’or pour l’amplification de la réponse SPR et la chimie de surface peptidique ont démontré le potentiel de franchir les limites posées par le manque de sensibilité et l’adsorption non-spécifique pour les analyses directes dans les milieux biologiques. Ces nouveaux concepts de la technologie SPR seront incorporés à un système SPR miniaturisé et compact pour exécuter des analyses rapides, fiables et sensibles pour le suivi du niveau du MTX dans le sérum de patients durant les traitements de chimiothérapie. L’objectif de cette thèse est d’explorer différentes stratégies pour améliorer l’analyse des médicaments dans les milieux complexes par les biocapteurs SPR et de mettre en perspective le potentiel des biocapteurs SPR comme un outil utile pour le TDM dans le laboratoire clinique ou au chevet du patient. Pour atteindre ces objectifs, un essai compétitif colorimétrique basé sur la résonance des plasmons de surface localisée (LSPR) pour le MTX fut établi avec des nanoparticules d’or marquées avec du FA. Ensuite, cet essai compétitif colorimétrique en solution fut adapté à une plateforme SPR. Pour les deux essais développés, la sensibilité, sélectivité, limite de détection, l’optimisation de la gamme dynamique et l’analyse du MTX dans les milieux complexes ont été inspectés. De plus, le prototype de la plateforme SPR miniaturisée fut validé par sa performance équivalente aux systèmes SPR existants ainsi que son utilité pour analyser les échantillons cliniques des patients sous chimiothérapie du MTX. Les concentrations de MTX obtenues par le prototype furent comparées avec des techniques standards, soit un essai immunologique basé sur la polarisation en fluorescence (FPIA) et la chromatographie liquide couplée avec de la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour valider l’utilité du prototype comme un outil clinique pour les tests rapides de quantification du MTX. En dernier lieu, le déploiement du prototype à un laboratoire de biochimie dans un hôpital démontre l’énorme potentiel des biocapteurs SPR pour utilisation en milieux clinique.

A systematic analysis of the detrimental effect of hormonotherapy on skeletal and non-skeletal morbidities in male with prostate cancer

Plusieurs patients atteints d’un cancer de la prostate (CaP) se verront prescrire l'hormonothérapie (HT) en raison du stade avancé ou en cas d’une récidive de la maladie, pour freiner la progression de la maladie et améliorer leur survie. Cependant, l’HT présente des effets pouvant nuire significativement à la santé du patient.

The specific in vivo role of PPARgamma and its downstream signaling pathway in the pathophysiology of Osteoarthritis

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative, avec une pathogenèse inconnue. Des études récentes suggèrent que l'activation du facteur de transcription du récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thérapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPARγ inhibent l'inflammation et réduisent la synthèse des produits de dégradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des études utilisant des agonistes du PPARγ n’élucident pas les effets exacts médiés par ce gène complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacité de régulariser d'autres voies de signalisation indépendantes de PPARγ, ainsi entraînant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacité thérapeutique avec potentiellement moins de problèmes de sécurité, il est donc essentiel d'élucider, in vivo, le rôle exact de PPARγ dans la physiopathologie OA. Mon projet de thèse permettra de déterminer, pour la première fois, le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle du gène PPARγ dans le cartilage. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Pour tester cette hypothèse, j'ai généré deux types de souris avec une délétion au PPARγ, (a) une suppression du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage germinale pour l'étude de l'arthrose liée au développement et à l'âge et (b) la suppression inductible du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les études OA. L’étude précédente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une délétion au gène PPARγ germinales, montre que ces souris présentent des anomalies du développement du cartilage. J'ai également exploré si ces souris qui présentent des défauts précoces du développement ont toutes les modifications phénotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes résultats ont montré que les souris adultes, ayant une délétion au gène PPARγ, ont présenter un phénotype de l'arthrose spontanée associée à une dégradation du cartilage, l’hypocellularité, la fibrose synoviale. Cette étude a montré que PPARγ est un régulateur essentiel pour le cartilage, et c’est le manque (l’absence) de ce dernier qui conduit à un phénotype de l'arthrose spontanée accélérée (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'étude, on n’a pas pu vérifier si ces souris présentaient l’OA spontanée en raison des défauts de développement ou à la suite de la délétion du gène PPARγ. Pour contourner les défauts de développement, j'ai généré des souris ayant une délétion du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage inductible avec le système Col2rTACre. Ces souris ont été soumises à modèle de la chirurgie OA (DMM: déstabilisation du ménisque médial) et les résultats révèlent que les souris PPARγ KO ont une dégradation accélérée du cartilage, une hypocellularité, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un évènement critique qui initie la dégradation de cartilage dans OA. Les études récentes suggèrent que le procès d’autophagie, une forme de survie cellulaire programmée, est altéré pendant l’OA et peut contribuer vers une protection diminuée des cellules, résultant la dégradation du cartilage. J’ai donc exploré le rôle de PPARγ dans la protection des cellules en déterminant l’effet de manque de PPARγ dans le cartilage par l’expression de mTOR (régulateur négatif principal d’autophagie) et les gènes d’autophagie durant OA. Mes résultats ont montré que les souris KO PPARγ présentent également une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur l’expression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isolés des souris contrôles OA. J'ai suggéré l'hypothèse que PPARγ contrôle la régulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et l’expression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothèse, j’ai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPARγ-KO avec le vecteur d’expression de PPARγ pour déterminer si la restauration de l'expression de PPARγ peut sauver le phénotype des cellules PPARγ-KO OA. J'ai observé que la restauration de l'expression de PPARγ dans les cellules PPARγ-KO en présence du vecteur d'expression PPARγ, a pu considérablement régulariser négativement l'expression de mTOR et mettre en règle positivement l'expression des gènes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagène de type II et l’aggrecan et de baisser de manière significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que l’augmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phénotype OA accélérée observée dans les souris PPARγ KO in vivo, j'ai généré les souris doubles KO PPARγ- mTOR inductible spécifique du cartilage en utilisant le système Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris à DMM modèle de l'arthrose. Mes résultants démontrent que les souris avec PPARγ- mTOR doubles KO ont été significativement protégés contre les OA DMM induites associées à une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protéoglycanes et la perte de chondro-cellularité par rapport aux souris témoins. Considérant que mTOR est un répresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouvé que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a été significativement plus élevée dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPARγ-mTOR par rapport aux souris témoins. En plus, les études de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les études in vivo utilisant les souris doubles KO PPARγ- mTOR montrent que PPARγ est impliqué dans la régulation de la protéine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces résultats contournent PPARγ et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose.

Fonctions antitumorales de la voie ERK/MAPK et développement rationnel de nouvelles stratégies thérapeutiques

Les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) régulent une multitude de processus cellulaires, incluant la prolifération, la survie et la différenciation. Ces kinases représentent l’élément terminal de la voie ERK/MAPK, laquelle est activée dans près de 30% de tous les cancers humains et donc généralement perçue comme étant un effecteur critique de la progression tumorale. Cependant, une accumulation d’observations suggèrent que les kinases ERK pourraient également induire la suppression tumorale. Le but premier de cette thèse est de démontrer comment la signalisation par ERK peut contribuer à la suppression tumorale et de concilier les mécanismes impliqués avec son rôle dans la progression du cancer. Puisque nos travaux ont une incidence sur les bénéfices attendus de certaines thérapies actuellement en développement, le deuxième objectif de la thèse est de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre le cancer. Nous avons démontré qu’une hyperactivation des kinases ERK induit la sénescence cellulaire. Le mécanisme implique la dégradation sélective et dépendante du protéasome de nombreuses protéines, ce que nous avons nommé le SAPD (Senescence-Associated Protein Degradation). Ce processus cible des protéines requises pour différentes fonctions cellulaires, incluant la progression du cycle cellulaire, les fonctions mitochondriales et la biogenèse des ribosomes. Ensuite, nos résultats montrent qu’en plus d’inhiber l’établissement de la sénescence, une diminution de la signalisation par les kinases ERK favorise la reprogrammation cellulaire, laquelle permet aux cellules précancéreuses de développer leur tumorigénicité et aux cellules cancéreuses d’acquérir des propriétés attribuables aux cellules souches. Ces observations suggèrent que les mécanismes qui inhibent la voie ERK/MAPK pourraient favoriser l’initiation du cancer, la formation de métastases et la résistance à diverses thérapies. Enfin, nous avons démontré que la metformine, utilisée pour le traitement du diabète, inhibe le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier joue un rôle central dans la reprogrammation cellulaire et dans la production de cytokines pro-inflammatoires nocives par les cellules sénescentes. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la metformine pourrait être utilisée en combinaison avec certaines thérapies afin d’éviter les effets secondaires tant d’une inhibition des kinases ERK que d’une hyperactivation. Globalement, les résultats présentés démontrent que l’effet de la voie ERK/MAPK dépend de la force de son activation. Alors qu’une activation modérée peut contribuer à la prolifération de la plupart des cellules, une forte activation induit la sénescence tandis qu’au contraire, une faible activation favorise la reprogrammation des cellules cancéreuses et donc une augmentation de l’agressivité de la tumeur. Cette polyvalence de la voie suggère une certaine prudence face à l’usage des inhibiteurs de la voie ERK/MAPK. Cependant, elle nous motive à travailler au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, lesquelles pourraient inclure la metformine.

The Independence of CXCR4’s Pathways, Gαi and β-Arrestin2, and Their Modulation by AMD3100 and TC14012

CXCR4, a chemokine receptor involved in metastasis and homing of hematopoietic stem cells, signals through two major pathways: Gαi and β-arrestin2. β-arrestin2 terminates G-protein signaling and targets the receptor to endocytosis. This project proposed to study the effect of a previously described set of CXCR4 mutants on both these signaling pathways, as well as their localization. These mutants were assayed by different Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) systems. Using these systems, we confirmed that N119S is a constitutively active mutant (CAM), spontaneously activating Gαi. As well, we found that R134A is a constitutively inactive mutant (CIM), devoided of G-protein signaling, but spontaneously recruiting β-arrestin2. In addition, we studied the dependency of β-arrestin2 recruitment on the Gαi activity. By targeting R134A and N119S with pertussis toxin, an inhibitor of the Gαi activation, we showed efficient blocking of the Gαi pathway, while maintaining the constitutive recruitment of β-arrestin2. This demonstrated that for CXCR4, β-arrestin2 recruitment is independent of the Gαi pathway. Finally, two synthetic ligands of CXCR4, AMD3100 and TC14012 were tested for their ability to recruit β-arrestin2. AMD3100 is a clinically approved drug used for stem cell transplantation, with considerable side effects. We found it to be an antagonist on both Gαi and β-arrestin2 recruitment. On the other hand, TC14012 was found to be an inverse agonist on Gαi and an antagonist on β-arrestin2 recruitment. Based on this finding, it would be preferable to use of TC14012 as it will further reduce any basal Gαi activity, without affecting β-arrestin2 recruitment. These results support the development of TC14012 for stem cell mobilization trials.

Genetic association study of plasma creatine kinase levels in the Montreal Heart Institute Hospital Cohort

Il a déjà été démontré que les statines (ou inhibiteurs de la HMG-CoA réductase) sont efficaces pour réduire le LDL-cholestérol et elles se sont depuis établies comme étant le pilier dans le traitement de la dyslipidémie. Toutefois, environ 10 pourcent des utilisateurs de statines souffrent d'effets indésirables, généralement sous forme de myopathie qui est souvent accompagnée d’un taux élevé de la créatine kinase (CK) plasmatique. Il est fréquent que les patients doivent arrêter les statines à cause d’un taux de CK dépassant un seuil de référence. Nous avons examiné le taux de CK de près de 6000 participants de la biobanque de l’ICM, qui ont récemment été génotypés à l'aide de la micropuce d'ADN ExomChip d'Illumina. Des études antérieures ont démontré une association significative entre le taux de CK plasmatique et des polymorphismes génétiques et nous avons cherché à répliquer ces résultats par association génétique et à l'aide du test SKAT pour les polymorphismes rares. Nous avons répliqué les résultats dans le gène CKM (rs11559024, p=1.59x10-23) et le gène LILRB5 (rs12975366, p=1.44x10-26) dans le chromosome 19. Nous espérons que ces résultats seront éventuellement utilisés en clinique pour la prédiction des taux de référence de CK personnalisés selon le profil génétique des patients utilisateurs de statines.