Only subtle protein conformational adaptations are required for ligand binding to thyroid hormone receptors: Simulations using a novel multipoint steered molecular dynamics approach

Thyroid hormone receptors (TR) are hormone-dependent transcription regulators that play a major role in human health, development, and metabolic functions. The thyroid hormone resistance syndrome, diabetes, obesity, and some types of cancer are just a few examples of important diseases that are related to TR malfunctioning, particularly impaired hormone binding. Ligand binding to and dissociation from the receptor ultimately control gene transcription and, thus, detailed knowledge of binding and release mechanisms are fundamental for the comprehension of the receptor`s biological function and development of pharmaceuticals. In this work, we present the first computational study of ligand entry into the ligand binding domain (LBD) of a nuclear receptor. We report molecular dynamics simulations of ligand binding to TRs using a generalization of the steered molecular dynamics technique designed to perform single-molecule pulling simulations along arbitrarily nonlinear driving pathways. We show that only gentle protein movements and conformational adaptations are required for ligand entry into the LBDs and that the magnitude of the forces applied to assist ligand binding are of the order of the forces involved in ligand dissociation. Our simulations suggest an alternative view for the mechanisms ligand binding and dissociation of ligands from nuclear receptors in which ligands can simply diffuse through the protein surface to reach proper positioning within the binding pocket. The proposed picture indicates that the large-amplitude protein motions suggested by the apo- and holo-RXR alpha crystallographic structures are not required, reconciling conformational changes of LBDs required for ligand entry with other nuclear receptors apo-structures that resemble the ligand-bound LBDs.

Molecular characterization of Arabidopsis thaliana PUF proteins - binding specificity and target candidates

PUF proteins regulate both stability and translation through sequence-specific binding to the 3` UTR of target mRNA transcripts. Binding is mediated by a conserved PUF domain, which contains eight repeats of approximately 36 amino acids each. Found in all eukaryotes, they have been related to several developmental processes. Analysis of the 25 Arabidopsis Pumilio (APUM) proteins presenting PUF repeats reveals that 12 (APUM-1 to APUM-12) have a PUF domain with 50-75% similarity to the Drosophila PUF domain. Through three-hybrid assays, we show that APUM-1 to APUM-6 can bind specifically to the Nanos response element sequence recognized by Drosophila Pumilio. Using an Arabidopsis RNA library in a three-hybrid screening, we were able to identify an APUM-binding consensus sequence. Computational analysis allowed us to identify the APUM-binding element within the 3` UTR in many Arabidopsis transcripts, even in important mRNAs related to shoot stem cell maintenance. We demonstrate that APUM-1 to APUM-6 are able to bind specifically to APUM-binding elements in the 3` UTR of WUSCHEL, CLAVATA-1, PINHEAD/ZWILLE and FASCIATA-2 transcripts. The results obtained in the present study indicate that the APUM proteins may act as regulators in Arabidopsis through an evolutionarily conserved mechanism, which may open up a new approach for investigating mRNA regulation in plants.

A two-component system, an anti-sigma factor and two paralogous ECF sigma factors are involved in the control of general stress response in Caulobacter crescentus

The extracytoplasmic function sigma factor sigma(T) is the master regulator of general stress response in Caulobacter crescentus and controls the expression of its paralogue sigma(U). In this work we showed that PhyR and NepR act, respectively, as positive and negative regulators of sigma(T) expression and function. Biochemical data also demonstrated that NepR directly binds sigma(T) and the phosphorylated form of PhyR. We also described the essential role of the histidine kinase gene CC3474, here denominated phyK, for expression of sigma(T)-dependent genes and for resistance to stress conditions. Additionally, in vivo evidence of PhyK-dependent phosphorylation of PhyR is presented. This study also identified a conserved cysteine residue (C95) located in the periplasmic portion of PhyK that is crucial for the function of the protein. Furthermore, we showed that PhyK, PhyR and sigma(T) regulate the same set of genes and that sigma(T) apparently directly controls most of its regulon. In contrast, sigma(U) seems to have a very modest contribution to the expression of a subset of sigma(T)-dependent genes. In conclusion, this report describes the molecular mechanism involved in the control of general stress response in C. crescentus.

The GATA-type transcriptional activator Gat1 regulates nitrogen uptake and metabolism in the human pathogen Cryptococcus neoformans

Nitrogen uptake and metabolism are essential to microbial growth. Gat1 belongs to a conserved family of zinc finger containing transcriptional regulators known as GATA-factors. These factors activate the transcription of Nitrogen Catabolite Repression (NCR) sensitive genes when preferred nitrogen sources are absent or limiting. Cryptococcus neoformans GAT1 is an ortholog to the Aspergillus nidulans AreA and Candida albicans GAD genes. In an attempt to define the function of this transcriptional regulator in C. neoformans, we generated null mutants (gat1 Delta) of this gene. The gat 1 mutant exhibited impaired growth on all amino acids tested as sole nitrogen sources, with the exception of arginine and proline. Furthermore, the gat1 mutant did not display resistance to rapamycin, an immunosuppressant drug that transiently mimics a low-quality nitrogen source. Gal is not required for C. neoformans survival during macrophage infection or for virulence in a mouse model of cryptococcosis. Microarray analysis allowed the identification of target genes that are regulated by Gat1 in the presence of proline, a poor and non-repressing nitrogen source. Genes involved in ergosterol biosynthesis, iron uptake, cell wall organization and capsule biosynthesis, in addition to NCR-sensitive genes, are Gat1-regulated in C. neoformans. (C) 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.

Cell-cell signal-dependent dynamic interactions between HD-GYP and GGDEF domain proteins mediate virulence in Xanthomonas campestris

RpfG is a paradigm for a class of widespread bacterial two-component regulators with a CheY-like receiver domain attached to a histidine-aspartic acid-glycine-tyrosine-proline (HD-GYP) cyclic di-GMP phosphodiesterase domain. In the plant pathogen Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), a two-component system comprising RpfG and the complex sensor kinase RpfC is implicated in sensing and responding to the diffusible signaling factor (DSF), which is essential for cell-cell signaling. RpfF is involved in synthesizing DSF, and mutations of rpfF, rpfG, or rpfC lead to a coordinate reduction in the synthesis of virulence factors such as extracellular enzymes, biofilm structure, and motility. Using yeast two-hybrid analysis and fluorescence resonance energy transfer experiments in Xcc, we show that the physical interaction of RpfG with two proteins with diguanylate cyclase (GGDEF) domains controls a subset of RpfG-regulated virulence functions. RpfG interactions were abolished by alanine substitutions of the three residues of the conserved GYP motif in the HD-GYP domain. Changing the GYP motif or deletion of the two GGDEF-domain proteins reduced Xcc motility but not the synthesis of extracellular enzymes or biofilm formation. RpfG-GGDEF interactions are dynamic and depend on DSF signaling, being reduced in the rpfF mutant but restored by DSF addition. The results are consistent with a model in which DSF signal transduction controlling motility depends on a highly regulated, dynamic interaction of proteins that influence the localized expression of cyclic di-GMP.

In vitro morphogenesis and cell suspension culture establishment in Piper solmsianum C. DC. (Piperaceae)

In vitro morphogenesis and cell suspension culture establishment in Piper solmsianum C. DC. (Piperaceae)). Piper solmsianum is a shrub from Southeast Brazil in which many biologically active compounds were identified. The aim of this work was to establish a cell suspension culture system for this species. With this in mind, petiole and leaf explants obtained from in vitro plantlets were cultured in the presence of different plant growth regulator combinations (IAA, NAA, 2,4-D and BA). Root and indirect shoot adventitious formation, detected by histological analysis, was observed. Besides the different combinations of plant growth regulators, light regime and the supplement of activated charcoal (1.5 mg.l(-1)) were tested for callus induction and growth. Cultures maintained in light, on a 0.2 mg.l(-1) 2,4-D and 2 mg.l(-1) BA supplemented medium, and in the absence of activated charcoal, showed the highest calli fresh matter increment. From a callus culture, cell suspension cultures were established and their growth and metabolite accumulation studied. The achieved results may be useful for further characterization of the activated secondary metabolites pathways in in vitro systems of P. solmsianum.

Functional Expression of Chemoreceptors with the Help of a Guanine Nucleotide Exchange Factor

Odorant receptors and other chemoreceptors are usually poorly expressed in the plasma membrane of heterologous cells. A key point of regulation in G protein-mediated signaling is the interconversion between the active GTP-bound and inactive GDP-bound states of the G alpha subunit, which regulatory proteins, such as guanine nucleotide exchange factors (GEFs), can control. GEFs stimulate formation of the GTP-bound state of G alpha and therefore are considered to work as positive regulators of G protein-coupled receptor signaling. Ric-8B, a GEF that is specifically expressed in olfactory sensory neurons, promotes functional expression of odorant receptors in HEK293T cells because it amplifies the initially low receptor signaling through G alpha olf. This same strategy could be used to functionally express other types of chemoreceptors.

Sistemas inteligentes no transporte público coletivo por ônibus

Desenvolvimentos recentes na tecnologia de informação têm proporcionado grandes avanços no gerenciamento dos sistemas de transportes. No mundo já existem várias tecnologias testadas e em funcionamento que estão auxiliando na tarefa de controle da operação do transporte público por ônibus. Esses sistemas geram informações úteis para o planejamento e operação dos sistemas de transportes. No Brasil, os investimentos em tecnologias avançadas ainda são muito modestos e estão focados em equipamentos que auxiliam no controle da evasão da receita. No entanto, percebe-se um crescente interesse, por parte dos órgão gestores e operadores, em implementar sistemas automatizados para auxiliar na melhoria da qualidade dos sistemas de transportes e como forma de aumentar a produtividade do setor. Esse trabalho traz à discussão os sistemas avançados desenvolvidos para o transporte público coletivo, com o objetivo de definir o perfil da tecnologia avançada que está de acordo com as necessidades dos gestores e operadores brasileiros. Na realização do trabalho foi empregada uma ferramenta de planejamento denominada Desdobramento da Função Qualidade – QFD (Quality Function Deployment), bastante utilizada para direcionar os processos de manufatura e produto, e para hierarquizar os atributos considerados importantes para o gerenciamento do transporte público urbano no Brasil. O resultado do trabalho indica um grande interesse em implantar tecnologia avançada para auxiliar no monitoramento dos tempos de viagem e tempos perdidos durante a operação do transporte público. Essa tecnologia também é tida como capaz de melhorar o desempenho das linhas, através da manutenção da regularidade e pontualidade. Ainda, sistemas inteligentes que propiciam informações precisas aos usuários contribuem para melhorar a imagem do modal ônibus.

Um estudo sobre o valor e a reatância nas reações dos consumidores brasileiros frente ao recall de produtos

Neste projeto busca-se identificar as reações dos consumidores brasileiros ao recall de produtos. No exterior recall é prática mais antiga enquanto que no Brasil é um procedimento recente, mas que vem ganhando crescente importância nos últimos anos. De fato, esse alerta, que um determinado lote da produção não saiu de fábrica como o planejado, feito pelos fabricantes a um grupo de compradores de seus produtos, vem ocorrendo com mais freqüência e particularmente no setor automobilístico. Todavia, é bem possível que muitos consumidores ainda não conheçam esse procedimento e nem saibam que estão sujeitos a imprevistos como o de adquirir um produto que, mesmo tendo passado pelos testes de qualidade do fabricante, possa estar sendo objeto de um chamado desse tipo, pois algo diferente do que era esperado foi encontrado no produto: ele não passou por alguma sabatina posterior de testes do fabricante ou até mesmo de sua matriz no exterior! O objetivo do estudo é o de identificar as reações do consumidor frente ao recall de produtos e os impactos que possa estar criando para ele.

Regulação e defesa da concorrência: bases conceituais e aplicações do sistema de competências compartilhadas

Esta pesquisa discute configurações institucionais ótimas e sugere, nas atuais circunstâncias brasileiras, mecanismos de cooperação inter-institucional, de sorte a maximizar a eficiência de ações conjuntas entre agências regulatórias e de defesa da concorrência, minimizando os custos de coordenação. A pesquisa contém três partes. A primeira discute aspectos teóricos de um sistema de competências complementares entre a autoridade de defesa da concorrência e a agência regulatória, destacando suas eventuais vantagens comparativamente às possíveis configurações institucionais alternativas. A segunda contém breve sumário da experiência histórico-concreta nos planos mundial e nacional, procurando situar, na medida do possível, diferentes países e setores em tipologia sugerida na primeira parte. A terceira apresenta algumas recomendações de política.

A estrutura de regulação dos mercados futuros no Brasil e o uso de modelos estatísticos de precificação na atividade de supervisão dos órgãos reguladores

Esta dissertação procurou identificar as diretrizes de supervisão dos mercados futuros no Brasil frente às práticas de regulação utilizadas em outros países do mundo, basicamente aqueles cujas economias e mercados são maiores do que o brasileiro, em volume de contratos negociados. O desenvolvimento do tema se deu de maneira a estimular o uso de tais práticas na estrutura local de supervisão, com vistas a uma melhoria da atividade dos órgãos reguladores e ao crescimento do mercado de capitais brasileiro. Dentre as referidas práticas, destacou-se a utilização de modelos estatísticos de precificação dos contratos negociados no sentido de balizar a atuação dos departamentos de fiscalização na investigação de condições artificiais de mercado. A abordagem desses modelos abrangeu desde a definição de conceitos fundamentais até a apresentação de um estudo de caso com opções sobre ações, passando pela caracterização dos principais modelos e formas de calcular a volatilidade no preço desses títulos. Os resultados de pesquisa foram relacionados às origens legais e ao desenvolvimento econômico recente do Brasil, que levaram à sofisticação dos mecanismos de financiamento do mercado de capitais nacional, não se limitando ao simples apontamento dos pontos fracos da estrutura local de supervisão. Finalmente, a pesquisa evoluiu para as necessidades práticas da atividade de supervisão a serem atendidas pelo regulador, segundo as características operacionais dos principais mercados, a fim de que a bolsa de futuros brasileira reforce sua posição competitiva no cenário mundial.

A estrutura de regulação dos mercados futuros no Brasil e o uso de modelos estatísticos de precificação, na atividade de supervisão dos órgãos reguladores.

Esta dissertação procurou identificar as diretrizes de supervisão dos mercados futuros no Brasil frente às práticas de regulação utilizadas em outros países do mundo, basicamente aqueles cujas economias e mercados são maiores do que o brasileiro, em volume de contratos negociados. O desenvolvimento do tema se deu de maneira a estimular o uso de tais práticas na estrutura local de supervisão, com vistas a uma melhoria da atividade dos órgãos reguladores e ao crescimento do mercado de capitais brasileiro. Dentre as referidas práticas, destacou-se a utilização de modelos estatísticos de precificação dos contratos negociados no sentido de balizar a atuação dos departamentos de fiscalização na investigação de condições artificiais de mercado. A abordagem desses modelos abrangeu desde a definição de conceitos fundamentais até a apresentação de um estudo de caso com opções sobre ações, passando pela caracterização dos principais modelos e formas de calcular a volatilidade no preço desses títulos. Os resultados de pesquisa foram relacionados às origens legais e ao desenvolvimento econômico recente do Brasil, que levaram à sofisticação dos mecanismos de financiamento do mercado de capitais nacional, não se limitando ao simples apontamento dos pontos fracos da estrutura local de supervisão. Finalmente, a pesquisa evoluiu para as necessidades práticas da atividade de supervisão a serem atendidas pelo regulador, segundo as características operacionais dos principais mercados, a fim de que a bolsa de futuros brasileira reforce sua posição competitiva no cenário mundial.

Regendo a atividade regulatória: a nova legislação das agências reguladoras federais no Brasil

Os processos e as instituições regulatórias são assuntos prioritários da agenda governamental, por tratarem-se de assunto dinâmico que envolve uma mudança na cultura administrativa do país. Um dos grandes desafios das agências reguladoras brasileiras tem sido desempenhar suas funções de forma autônoma e imparcial com o objetivo de promover confiança e transparência ao mercado e à sociedade. Este estudo buscou realizar uma análise do conteúdo e das repercussões das mudanças ora em curso no Brasil, em especial daquelas contidas na proposta enviada pelo governo federal brasileiro ao Congresso Nacional dispondo sobre a nova Lei Geral das Agências reguladoras (Projeto de Lei 3337/2004), com o fito de promover mudanças no modelo de organização institucional e funcionamento desses entes regulatórios. Com esse fim, de início, foram descritos os fundamentos teóricos da regulação, com a apresentação do processo de criação das agências reguladoras federais brasileiras e suas características determinantes. Após a fundamentação, foram detalhados os pontos principais do Projeto de Lei 3337/2004, e seu substitutivo, elaborado pelo Deputado Leonardo Picciani. O próximo capítulo, Governança Regulatória, apresentou as políticas de reforma regulatória, seus desafios no Brasil, e delineou o Programa de Fortalecimento da Capacidade Institucional para Gestão em Regulação (PRO-REG). O estudo deu prosseguimento à análise por meio da apresentação das boas práticas à qualidade regulatória, enfatizando a importância da participação social no processo regulatório, e também da abordagem da experiência internacional. Item complementar para a compreensão e visão geral do estudo, a supervisão regulatória foi também conceituada e justificada, seguida pela abordagem da criação da Unidade de Supervisão Central e da experiência internacional. Por último, em análise final do tema, apoiada por grande pesquisa bibliográfica e documental, e por entrevistas concedidas pelos ocupantes dos dois maiores cargos da Superintendência de Abastecimento da Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis, procurou-se mostrar a imprescindibilidade do desenvolvimento e implementação de uma estratégia de qualidade regulatória que permita uma abordagem consistente.

O controle externo sobre as agências reguladoras de Estado : limites e (im)possibilidades

Com a criação das primeiras entidades reguladoras de infraestrutura, década de 90, surgiu uma nova maneira estratégica de o Estado atuar com intuito de melhorar a governança pública. O Estado brasileiro, que era responsável direto pelo desenvolvimento econômico e social, buscou se redefinir frente ao modelo de entidades reguladoras que emergia. Em decorrência dessa nova fisionomia estatal, a descentralização funcional ganhou ênfase resultando no aparecimento de estruturas mais flexíveis e autônomas sob a natureza de direito público com a finalidade de atuar em setores típicos de Estado. Assim, foram criadas as primeiras agências reguladoras brasileiras com objetivo de normatizar, incentivar e regular setores essenciais à sociedade. Por consequência de tais inovações, diversas áreas administrativas tiveram de serem adaptadas, sobretudo as relacionadas à atividade de controle no âmbito administrativo. Para tanto, tornou-se necessário conciliar, dentro de um escopo sistematizado, mecanismos capazes de atender as demandas oriundas do recente Estado regulador brasileiro. Com efeito, a função controle adquire relevo no sentido de evitar que tais agências reguladoras apartem-se de limites impostos por lei ou de que divirjam de suas missões institucionais. Assim, o presente trabalho investiga a atuação do controle externo exercido pelo Tribunal de Contas da União (TCU) no desempenho das agências reguladoras de Estado. Diante de o assunto permear várias áreas epistemológicas, entende-se que abordá-lo sob o enfoque interdisciplinar pode estender em contribuições sobre o objeto investigado. Nesse contexto, esta dissertação visa incorporar, também, outras áreas de conhecimento. Longe de defender um isomorfismo para o arranjo regulatório brasileiro ou de promover uma saída paradigmática, esta pesquisa busca, com amparo na metodologia qualitativa e sob os enfoques exploratórios e descritivos, reunir conhecimentos e constatações no sentido de propiciar maior aproximação acerca do assunto e concorrer para o delineamento de diretrizes futuras do controle externo sobre a regulação brasileira. Destaca-se que tanto a regulação como o controle sobre o ambiente regulatório são assuntos que se encontram em desenvolvimento no contexto brasileiro, o que enseja a pertinência desta pesquisa. Em face do exposto, esta dissertação visa investigar o estado atual do controle exercido pelo TCU sobre o desempenho nas agências reguladoras de Estado – infraestrutura - com intuito de analisar e promover um debate sobre limites e (im)possibilidades dessa atuação.

A enciclopédia do integralismo: lugar de memória e apropriação do passado (1957-1961)

O ano de 1957 se tornou paradigmático para o integralismo, pois a partir das celebrações dos 25 anos de sua criação a intelectualidade vinculada ao movimento debruçou-se sobre sua história o que incentivou a retomada de sua ritualidade e discurso pregressos. Isto se deu graças à insatisfação da base militante que se viu sem identidade própria em finais dos anos 1950. Com o intuito de promover atividades que ensejassem a partilha de sua cultura política, calcada em uma rede de sociabilidade, o integralismo avançou nas suas investidas, projetando estratégias e eventos que viabilizassem uma reviravolta na sua atuação político-partidária. A publicação da Enciclopédia do Integralismo e a celebração dos 25 anos de sua existência política (marcos reguladores/ lugares de memória e de construção de sua cosmogonia) serão aqui tratadas como pontos fundamentais para entendermos a atuação que o integralismo teve no período. Pesquisar o que propunham, qual discurso utilizavam e qual era a finalidade destas celebrações e da própria Enciclopédia do Integralismo poderá indicar quais as propostas e respostas integralistas a uma série de questões incômodas que a contemporaneidade fazia.