Caracterización molecular del mutante riso 1508 de cebada : modificaciones transcripcionales y posttranscripcionales en el desarrollo de la semilla

La semilla es el principal órgano reproductivo de las plantas espermatofitas, permitiendo la dispersión de las poblaciones y asegurando su supervivencia gracias a su tolerancia a la desecación y a su capacidad para germinar bajo condiciones ambientales óptimas. El rendimiento y valor económico de los cereales, que constituyen la primera cosecha mundial, depende, en buena medida, de la eficacia con que se acumulan en la semilla sustancias de reserva: proteínas, carbohidratos y lípidos. El principal carbohidrato acumulado en la semilla de cebada es el almidón y la fracción mayoritaria de proteínas es la de las prolaminas (solubles en etanol al 70%); estas proteínas tienen muy bajo contenido en lisina, un aminoácido esencial en la dieta de animales monogástricos. Con el fin de mejorar el valor nutricional de la semilla de cebada, se han obtenido diferentes mutantes con un mayor contenido en este aminoácido. Riso 1508 es un mutante de cebada rico en lisina cuya mutación lys3a, de efectos pleiotrópicos, segrega como un único gen mendeliano. Entre otros, presenta una reducción drástica de la expresión de algunos genes que codifican proteínas de reserva de tipo prolamina, en concreto, presenta reducida la expresión de los genes que codifican B-, C- y ϒ-Hordeínas y del inhibidor de tripsina CMe, pero no tiene alterada la expresión del gen que codifica las D-Hordeínas. Este último gen carece en su promotor del motivo GLM (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), que es reconocido por factores transcripcionales bZIP. En este trabajo, el mutante de cebada Riso 1508 se ha utilizado como herramienta para profundizar en el conocimiento de la regulación génica en semillas durante las fases de la maduración y la germinación. Para ello, en una primera aproximación, se llevó a cabo un análisis transcriptómico comparando el genotipo mutante con el silvestre durante la maduración de la semilla. Además de confirmar variaciones en los genes que codifican proteínas de reserva, este análisis indicó que también estaban afectados los genes relacionados con metabolismo de carbohidratos. Por ello se decidió caracterizar la familia multigénica de sacarosas sintasa (SUSy) en cebada. Se anotaron dos nuevos genes, HvSs3 y HvSs4, cuya expresión se comparó con la de los genes HvSs1 y HvSs2, previamente descritos en el laboratorio. La expresión de los cuatro genes en tejidos diferentes y su respuesta a estreses abióticos se analizó mediante RT-qPCR. HvSs1 y HvSs2 se expresaron preferencialmente durante el desarrollo del endospermo, y HvSs1 también fue un tránscrito abundante durante la germinación. HvSs1 se indujo en hojas en condiciones de anoxia y HvSs3 por estrés hídrico, y ambos genes se indujeron por tratamientos de frío. La localización subcelular de las cuatro isoformas no fue sólo citoplásmica, sino que también se localizaron en zonas próximas a retículo endoplásmico y en la cara interna de la membrana plasmática; además, se observó una co-localización de HvSS1 con el marcador de mitocondrias. Estos datos sugieren un papel distinto aunque parcialmente solapante de las cuatro Sacarosa Sintasas de cebada, descritas hasta la fecha. Las cinéticas de expresión de los genes que codifican los TFs más importantes implicados en la regulación génica durante el desarrollo del endospermo de cebada, se analizaron por RT-qPCR en ambos genotipos, demostrando que los TFs de la clase DOF aparecieron desregulados durante todo el proceso en Riso 1508 comparado con el cv. Bomi, aunque también se observaron diferencias significativas en algunos de los que codifican bZIPs. Estudios previos indicaban que el ortólogo de BLZ2 en maíz, O2, se regula post-traduccionalmente mediante un mecanismo de fosforilación/defosforilación reversible, y que la forma defosforilada es la fisiológicamente activa. En este trabajo se demostró que BLZ2 está sujeto a este tipo de regulación y que la proteín-fosfatasa HvPP2C2 está implicada en el proceso. La interacción de HvPP2C2 y BLZ2 tiene lugar en el núcleo celular únicamente en presencia de 100 μM ABA. En el mutante Riso 1508, BLZ2 se encuentra en un estado hiperfosforilado tanto durante la maduración como durante la germinación de la semilla, lo que dificultaría la unión de BLZ2 a las secuencias GLM en los promotores de los genes que codifican B-, C-,y ϒ- Hordeínas y CMe. Summary The seed is the main reproductive organ of spermatophyte plants allowing the spread of populations and ensuring their survival through its desiccation tolerance and because of their ability to germinate under optimum environmental conditions. Yield and economic value of cereal crops, that constitute the first world crop, depend largely on the efficiency with which they accumulate in the seed reserve substances: proteins, carbohydrates and lipids. The main carbohydrate accumulated in the barley seed is starch and the major protein fraction is that of prolamins (soluble in 70% ethanol); these proteins have a very low lysine content, an essential amino-acid for the diet of monogastric animals. In order to improve the nutritional value of the barley seed, different mutants have been obtained with a higher content of this amino-acid. Riso 1508 is one lysine-rich mutant whose mutation (lys3a) segregates as a single Mendelian gene with pleiotropic effects, such as a drastic reduction of genes encoding the trypsin inhibitor CMe and the B-, C-and ϒ-hordeins, but has not altered the expression of the gene encoding the D-hordeins. This latter gene lacks in its promotor the GLM motif (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), that is recognised by bZIP transcription factors In this work we have used the barley mutant Riso 1508 as a tool for better understanding gene regulation in seeds during the maturation and germination phases. To this aim, a transcriptomic analysis was performed comparing wild and mutant genotypes during seed maturation. Besides confirming variations in the expression of genes encoding reserve proteins, this analysis indicated that some genes related with carbohydrate metabolism were also affected. It was therefore decided to characterize the multigene family of sucrose synthases (SUSy) in barley. Two new genes were annotated, HvSs3 and HvSs4, and its expression was compared with that of genes HvSs1 and HvSs2, previously described in our laboratory. The expression of the four genes in different tissues and in response to abiotic stresses was analyzed by RTqPCR. HvSs1 and HvSs2 were preferentially expressed during the development of the endosperm, and the HvSs1 transcript was also abundant upon germination. HvSs1 was induced in leaves by anoxic conditions, HvSs3 by water stress, and both genes were induced by cold treatments. The subcellular localization of all four isoforms was not only cytoplasmic, but they could be found along the endoplasmic reticulum and at the inner side of the cell membrane; HvSS1, was also associated with the mitochondrial marker. These data suggest a distinct but partially overlapping roles for the barley sucrose synthases, described so far. The expression kinetics of the genes encoding the most important TFs involved in gene regulation during barley endosperm development was analyzed by RT-qPCR in both genotypes. These data show that the genes encoding DOF TFs were mis-regulated throughout the process in Riso 1508, although significant differences were also found among some of those encoding bZIPs. Previous studies indicated that the BLZ2 orthologue in maize, O2, was post-translationally regulated by reversible phosphorylation/dephosphorylation and that the dephosphorylated protein is the physiologically active form. In this work we demostrate that BLZ2 is under a similar regulation and that the proteinphosphatase HvPP2C2 is implicated in the process. The interaction between HvPP2C2 and BLZ2 takes place in the cell nucleus only in the presence of 100 μM ABA. In the Riso 1508 mutant, BLZ2 is found in a hyperphosphorylated state in the maturation phase and upon seed germination; because of this, the BLZ2 binding to the GLM promoter sequences of genes encoding B-, C- y ϒ- Hordeins and CMe would be decreased in the mutant.

Computational methods to create and analyze a digital gene expression atlas of embryo development from microscopy images

Abstract The creation of atlases, or digital models where information from different subjects can be combined, is a field of increasing interest in biomedical imaging. When a single image does not contain enough information to appropriately describe the organism under study, it is then necessary to acquire images of several individuals, each of them containing complementary data with respect to the rest of the components in the cohort. This approach allows creating digital prototypes, ranging from anatomical atlases of human patients and organs, obtained for instance from Magnetic Resonance Imaging, to gene expression cartographies of embryo development, typically achieved from Light Microscopy. Within such context, in this PhD Thesis we propose, develop and validate new dedicated image processing methodologies that, based on image registration techniques, bring information from multiple individuals into alignment within a single digital atlas model. We also elaborate a dedicated software visualization platform to explore the resulting wealth of multi-dimensional data and novel analysis algo-rithms to automatically mine the generated resource in search of bio¬logical insights. In particular, this work focuses on gene expression data from developing zebrafish embryos imaged at the cellular resolution level with Two-Photon Laser Scanning Microscopy. Disposing of quantitative measurements relating multiple gene expressions to cell position and their evolution in time is a fundamental prerequisite to understand embryogenesis multi-scale processes. However, the number of gene expressions that can be simultaneously stained in one acquisition is limited due to optical and labeling constraints. These limitations motivate the implementation of atlasing strategies that can recreate a virtual gene expression multiplex. The developed computational tools have been tested in two different scenarios. The first one is the early zebrafish embryogenesis where the resulting atlas constitutes a link between the phenotype and the genotype at the cellular level. The second one is the late zebrafish brain where the resulting atlas allows studies relating gene expression to brain regionalization and neurogenesis. The proposed computational frameworks have been adapted to the requirements of both scenarios, such as the integration of partial views of the embryo into a whole embryo model with cellular resolution or the registration of anatom¬ical traits with deformable transformation models non-dependent on any specific labeling. The software implementation of the atlas generation tool (Match-IT) and the visualization platform (Atlas-IT) together with the gene expression atlas resources developed in this Thesis are to be made freely available to the scientific community. Lastly, a novel proof-of-concept experiment integrates for the first time 3D gene expression atlas resources with cell lineages extracted from live embryos, opening up the door to correlate genetic and cellular spatio-temporal dynamics. La creación de atlas, o modelos digitales, donde la información de distintos sujetos puede ser combinada, es un campo de creciente interés en imagen biomédica. Cuando una sola imagen no contiene suficientes datos como para describir apropiadamente el organismo objeto de estudio, se hace necesario adquirir imágenes de varios individuos, cada una de las cuales contiene información complementaria respecto al resto de componentes del grupo. De este modo, es posible crear prototipos digitales, que pueden ir desde atlas anatómicos de órganos y pacientes humanos, adquiridos por ejemplo mediante Resonancia Magnética, hasta cartografías de la expresión genética del desarrollo de embrionario, típicamente adquiridas mediante Microscopía Optica. Dentro de este contexto, en esta Tesis Doctoral se introducen, desarrollan y validan nuevos métodos de procesado de imagen que, basándose en técnicas de registro de imagen, son capaces de alinear imágenes y datos provenientes de múltiples individuos en un solo atlas digital. Además, se ha elaborado una plataforma de visualization específicamente diseñada para explorar la gran cantidad de datos, caracterizados por su multi-dimensionalidad, que resulta de estos métodos. Asimismo, se han propuesto novedosos algoritmos de análisis y minería de datos que permiten inspeccionar automáticamente los atlas generados en busca de conclusiones biológicas significativas. En particular, este trabajo se centra en datos de expresión genética del desarrollo embrionario del pez cebra, adquiridos mediante Microscopía dos fotones con resolución celular. Disponer de medidas cuantitativas que relacionen estas expresiones genéticas con las posiciones celulares y su evolución en el tiempo es un prerrequisito fundamental para comprender los procesos multi-escala característicos de la morfogénesis. Sin embargo, el número de expresiones genéticos que pueden ser simultáneamente etiquetados en una sola adquisición es reducido debido a limitaciones tanto ópticas como del etiquetado. Estas limitaciones requieren la implementación de estrategias de creación de atlas que puedan recrear un multiplexado virtual de expresiones genéticas. Las herramientas computacionales desarrolladas han sido validadas en dos escenarios distintos. El primer escenario es el desarrollo embrionario temprano del pez cebra, donde el atlas resultante permite constituir un vínculo, a nivel celular, entre el fenotipo y el genotipo de este organismo modelo. El segundo escenario corresponde a estadios tardíos del desarrollo del cerebro del pez cebra, donde el atlas resultante permite relacionar expresiones genéticas con la regionalización del cerebro y la formación de neuronas. La plataforma computacional desarrollada ha sido adaptada a los requisitos y retos planteados en ambos escenarios, como la integración, a resolución celular, de vistas parciales dentro de un modelo consistente en un embrión completo, o el alineamiento entre estructuras de referencia anatómica equivalentes, logrado mediante el uso de modelos de transformación deformables que no requieren ningún marcador específico. Está previsto poner a disposición de la comunidad científica tanto la herramienta de generación de atlas (Match-IT), como su plataforma de visualización (Atlas-IT), así como las bases de datos de expresión genética creadas a partir de estas herramientas. Por último, dentro de la presente Tesis Doctoral, se ha incluido una prueba conceptual innovadora que permite integrar los mencionados atlas de expresión genética tridimensionales dentro del linaje celular extraído de una adquisición in vivo de un embrión. Esta prueba conceptual abre la puerta a la posibilidad de correlar, por primera vez, las dinámicas espacio-temporales de genes y células.

Molecular basis of salt tolerance in Physcomitrella Patens model plant: potassium homeostasis and physiological roles of chx transporters

El suelo salino impone un estrés abiótico importante que causa graves problemas en la agricultura ya que la mayoría de los cultivos se ven afectados por la salinidad debido a efectos osmóticos y tóxicos. Por ello, la contaminación y la escasez de agua dulce, la salinización progresiva de tierras y el aumento exponencial de la población humana representan un grave problema que amenaza la seguridad alimentaria mundial para las generaciones futuras. Por lo tanto, aumentar la tolerancia a la salinidad de los cultivos es un objetivo estratégico e ineludible para garantizar el suministro de alimentos en el futuro. Mantener una óptima homeostasis de K+ en plantas que sufren estrés salino es un objetivo importante en el proceso de obtención de plantas tolerantes a la salinidad. Aunque el modelo de la homeostasis de K+ en las plantas está razonablemente bien descrito en términos de entrada de K+, muy poco se sabe acerca de los genes implicados en la salida de K+ o de su liberación desde la vacuola. En este trabajo se pretende aclarar algunos de los mecanismos implicados en la homeostasis de K+ en plantas. Para ello se eligió la briofita Physcomitrella patens, una planta no vascular de estructura simple y de fase haploide dominante que, entre muchas otras cualidades, hacen que sea un modelo ideal. Lo más importante es que no sólo P. patens es muy tolerante a altas concentraciones de Na+, sino que también su posición filogenética en la evolución de las plantas abre la posibilidad de estudiar los cambios claves que, durante el curso de la evolución, se produjeron en las diversas familias de los transportadores de K+. Se han propuesto varios transportadores de cationes como candidatos que podrían tener un papel en la salida de K+ o su liberación desde la vacuola, especialmente miembros de la familia CPA2 que contienen las familias de transportadores KEA y CHX. En este estudio se intenta aumentar nuestra comprensión de las funciones de los transportadores de CHX en las células de las plantas usando P. patens, como ya se ha dicho. En esta especie, se han identificado cuatro genes CHX, PpCHX1-4. Dos de estos genes, PpCHX1 y PpCHX2, se expresan aproximadamente al mismo nivel que el gen PpACT5, y los otros dos genes muestran una expresión muy baja. La expresión de PpCHX1 y PpCHX2 en mutantes de Escherichia coli defectivos en el transporte de K+ restauraron el crecimiento de esta cepa en medios con bajo contenido de K+, lo que viii sugiere que la entrada de K+ es energizada por un mecanismo de simporte con H+. Por otra parte, estos transportadores suprimieron el defecto asociado a la mutación kha1 en Saccharomyces cerevisiae, lo que sugiere que podrían mediar un antiporte en K+/H+. La proteína PpCHX1-GFP expresada transitoriamente en protoplastos de P. patens co-localizó con un marcador de Golgi. En experimentos similares, la proteína PpCHX2-GFP localizó aparentemente en la membrana plasmática y tonoplasto. Se construyeron las líneas mutantes simples de P. patens ΔPpchx1 y ΔPpchx2, y también el mutante doble ΔPpchx2 ΔPphak1. Los mutantes simples crecieron normalmente en todas las condiciones ensayadas y mostraron flujos de entrada normales de K+ y Rb+; la mutación ΔPpchx2 no aumentó el defecto de las plantas ΔPphak1. En experimentos a largo plazo, las plantas ΔPpchx2 mostraron una retención de Rb+ ligeramente superior que las plantas silvestres, lo que sugiere que PpCHX2 promueve la transferencia de Rb+ desde la vacuola al citosol o desde el citosol al medio externo, actuando en paralelo con otros transportadores. Sugerimos que transportadores de K+ de varias familias están involucrados en la homeostasis de pH de orgánulos ya sea mediante antiporte K+/H+ o simporte K+-H+.ix ABSTRACT Soil salinity is a major abiotic stress causing serious problems in agriculture as most crops are affected by it. Moreover, the contamination and shortage of freshwater, progressive land salinization and exponential increase of human population aggravates the problem implying that world food security may not be ensured for the next generations. Thus, a strategic and an unavoidable goal would be increasing salinity tolerance of plant crops to secure future food supply. Maintaining an optimum K+ homeostasis in plants under salinity stress is an important trait to pursue in the process of engineering salt tolerant plants. Although the model of K+ homeostasis in plants is reasonably well described in terms of K+ influx, very little is known about the genes implicated in K+ efflux or release from the vacuole. In this work, we aim to clarify some of the mechanisms involved in K+ homeostasis in plants. For this purpose, we chose the bryophyte plant Physcomitrella patens, a nonvascular plant of simple structure and dominant haploid phase that, among many other characteristics, makes it an ideal model. Most importantly, not only P. patens is very tolerant to high concentrations of Na+, but also its phylogenetic position in land plant evolution opens the possibility to study the key changes that occurred in K+ transporter families during the course of evolution. Several cation transporter candidates have been proposed to have a role in K+ efflux or release from the vacuole especially members of the CPA2 family which contains the KEA and CHX transporter families. We intended in this study to increase our understanding of the functions of CHX transporters in plant cells using P. patens, in which four CHX genes have been identified, PpCHX1-4. Two of these genes, PpCHX1 and PpCHX2, are expressed at approximately the same level as the PpACT5 gene, but the other two genes show an extremely low expression. PpCHX1 and PpCHX2 restored growth of Escherichia coli mutants on low K+-containing media, suggesting they mediated K+ uptake that may be energized by symport with H+. In contrast, these genes suppressed the defect associated to the kha1 mutation in Saccharomyces cerevisiae, which suggest that they might mediate K+/H+ antiport. PpCHX1-GFP protein transiently expressed in P. patens protoplasts co-localized with a Golgi marker. In similar experiments, the PpCHX2-GFP protein appeared to localize to tonoplast and plasma x membrane. We constructed the ΔPpchx1 and ΔPpchx2 single mutant lines, and the ΔPpchx2 ΔPphak1 double mutant. Single mutant plants grew normally under all the conditions tested and exhibited normal K+ and Rb+ influxes; the ΔPpchx2 mutation did not increase the defect of ΔPphak1 plants. In long-term experiments, ΔPpchx2 plants showed a slightly higher Rb+ retention than wild type plants, which suggests that PpCHX2 mediates the transfer of Rb+ from either the vacuole to the cytosol or from the cytosol to the external medium in parallel with other transporters. We suggest that K+ transporters of several families are involved in the pH homeostasis of organelles by mediating either K+/H+ antiport or K+-H+ symport.

Estudio molecular de gluteninas de alto y bajo peso molecular en Triticum aestivum ssp. vulgare L. y su relación con la calidad panadera

El trigo blando (Triticum aestivum ssp vulgare L., AABBDD, 2n=6x=42) presenta propiedades viscoélasticas únicas debidas a la presencia en la harina de las prolaminas: gluteninas y gliadinas. Ambos tipos de proteínas forman parte de la red de gluten. Basándose en la movilidad en SDS-PAGE, las gluteninas se clasifican en dos grupos: gluteninas de alto peso molecular (HMW-GS) y gluteninas de bajo peso molecular (LMW-GS). Los genes que codifican para las HMW-GS se encuentran en tres loci del grupo 1 de cromosomas: Glu-A1, Glu-B1 y Glu-D1. Cada locus codifica para uno o dos polipéptidos o subunidades. La variación alélica de las HMW-GS es el principal determinante de de la calidad harino-panadera y ha sido ampliamente estudiado tanto a nivel de proteína como de ADN. El conocimiento de estas proteínas ha contribuido sustancialmente al progreso de los programas de mejora para la calidad del trigo. Comparadas con las HMW-GS, las LMW-GS forman una familia proteica mucho más compleja. La mayoría de los genes LMW se localizan en el grupo 1 de cromosomas en tres loci: Glu-A3, Glu-B3 y Glu-D3 que se encuentran estrechamente ligados a los loci que codifican para gliadinas. El número de copias de estos genes ha sido estimado entre 10-40 en trigo hexaploide, pero el número exacto aún se desconoce debido a la ausencia de un método eficiente para diferenciar los miembros de esta familia multigénica. La nomenclatura de los alelos LMW-GS por electroforesis convencional es complicada, y diferentes autores asignan distintos alelos a la misma variedad lo que dificulta aún más el estudio de esta compleja familia. El uso de marcadores moleculares para la discriminación de genes LMW, aunque es una tarea dificil, puede ser muy útil para los programas de mejora. El objetivo de este trabajo ha sido profundizar en la relación entre las gluteninas y la calidad panadera y desarrollar marcadores moleculares que permitan ayudar en la correcta clasificación de HMW-GS y LMW-GS. Se han obtenido dos poblaciones de líneas avanzadas F4:6 a partir de los cruzamientos entre las variedades ‘Tigre’ x ‘Gazul’ y ‘Fiel’ x ‘Taber’, seleccionándose para los análisis de calidad las líneas homogéneas para HMW-GS, LMW-GS y gliadinas. La determinación alélica de HMW-GS se llevó a cabo por SDS-PAGE, y se complementó con análisis moleculares, desarrollándose un nuevo marcador de PCR para diferenciar entre las subunidades Bx7 y Bx7*del locus Glu-B1. Resumen 2 La determinación alélica para LMW-GS se llevó a cabo mediante SDS-PAGE siguiendo distintas nomenclaturas y utilizando variedades testigo para cada alelo. El resultado no fue concluyente para el locus Glu-B3, así que se recurrió a marcadores moleculares. El ADN de los parentales y de los testigos se amplificó usando cebadores diseñados en regiones conservadas de los genes LMW y fue posteriormente analizado mediante electroforesis capilar. Los patrones de amplificación obtenidos fueron comparados entre las distintas muestras y permitieron establecer una relación con los alelos de LMW-GS. Con este método se pudo aclarar la determinación alélica de este locus para los cuatro parentales La calidad de la harina fue testada mediante porcentaje de contenido en proteína, prueba de sedimentación (SDSS) y alveógrafo de Chopin (parámetros P, L, P/L y W). Los valores fueron analizados en relación a la composición en gluteninas. Las líneas del cruzamiento ‘Fiel’ x ‘Taber’ mostraron una clara influencia del locus Glu-A3 en la variación de los valores de SDSS. Las líneas que llevaban el nuevo alelo Glu-A3b’ presentaron valores significativamente mayores que los de las líneas con el alelo Glu-A3f. En las líneas procedentes del cruzamiento ‘Tigre ’x ‘Gazul’, los loci Glu-B1 y Glu-B3 loci mostraron ambos influencia en los parámetros de calidad. Los resultados indicaron que: para los valores de SDSS y P, las líneas con las HMW-GS Bx7OE+By8 fueron significativamente mejores que las líneas con Bx17+By18; y las líneas que llevaban el alelo Glu-B3ac presentaban valores de P significativamente superiores que las líneas con el alelo Glu-B3ad y significativamente menores para los valores de L . El análisis de los valores de calidad en relación a los fragmentos LMW amplificados, reveló un efecto significativo entre dos fragmentos (2-616 y 2-636) con los valores de P. La presencia del fragmento 2-636 estaba asociada a valores de P mayores. Estos fragmentos fueron clonados y secuenciados, confirmándose que correspondían a genes del locus Glu-B3. El estudio de la secuencia reveló que la diferencia entre ambos se hallaba en algunos SNPs y en una deleción de 21 nucleótidos que en la proteína correspondería a un InDel de un heptapéptido en la región repetida de la proteína. En este trabajo, la utilización de líneas que difieren en el locus Glu-B3 ha permitido el análisis de la influencia de este locus (el peor caracterizado hasta la fecha) en la calidad panadera. Además, se ha validado el uso de marcadores moleculares en la determinación alélica de las LMW-GS y su relación con la calidad panadera. Summary 3 Bread wheat (Triticum aestivum ssp vulgare L., AABBDD, 2n=6x=42) flour has unique dough viscoelastic properties conferred by prolamins: glutenins and gliadins. Both types of proteins are cross-linked to form gluten polymers. On the basis of their mobility in SDS-PAGE, glutenins can be classified in two groups: high molecular weight glutenins (HMW-GS) and low molecular weight glutenins (LMW-GS). Genes encoding HMW-GS are located on group 1 chromosomes in three loci: Glu-A1, Glu-B1 and Glu-D1, each one encoding two polypeptides, named subunits. Allelic variation of HMW-GS is the most important determinant for bread making quality, and has been exhaustively studied at protein and DNA level. The knowledge of these proteins has substantially contributed to genetic improvement of bread quality in breeding programs. Compared to HMW-GS, LMW-GS are a much more complex family. Most genes encoded LMW-GS are located on group 1 chromosomes. Glu-A3, Glu-B3 and Glu-D3 loci are closely linked to the gliadin loci. The total gene copy number has been estimated to vary from 10–40 in hexaploid wheat. However, the exact copy number of LMW-GS genes is still unknown, mostly due to lack of efficient methods to distinguish members of this multigene family. Nomenclature of LMW-GS alleles is also unclear, and different authors can assign different alleles to the same variety increasing confusion in the study of this complex family. The use of molecular markers for the discrimination of LMW-GS genes might be very useful in breeding programs, but their wide application is not easy. The objective of this work is to gain insight into the relationship between glutenins and bread quality, and the developing of molecular markers that help in the allele classification of HMW-GS and LMW-GS. Two populations of advanced lines F4:6 were obtained from the cross ‘Tigre’ x ‘Gazul’ and ‘Fiel’ x ‘Taber’. Lines homogeneous for HMW-GS, LMW-GS and gliadins pattern were selected for quality analysis. The allele classification of HMW-GS was performed by SDS-PAGE, and then complemented by PCR analysis. A new PCR marker was developed to undoubtedly differentiate between two similar subunits from Glu-B1 locus, Bx7 and Bx7*. The allele classification of LMW-GS was initially performed by SDS-PAGE following different established nomenclatures and using standard varieties. The results were not completely concluding for Glu-B3 locus, so a molecular marker system was applied. DNA from parental lines and standard varieties was amplified using primers designed in conserved domains of LMW genes and analyzed by capillary electrophoresis. The pattern of amplification products obtained was compared among samples and related to the protein allele classification. It was possible to establish a correspondence between specific amplification products and almost all LMW alleles analyzed. With this method, the allele classification of the four parental lines was clarified. Flour quality of F4:6 advanced lines were tested by protein content, sedimentation test (SDSS) and alveograph (P, L, P/L and W). The values were analyzed in relation to the lines prolamin composition. In the ‘Fiel’ x ‘Taber’ population, Glu-A3 locus showed an influence in SDSS values. Lines carrying new allele Glu-A3b’, presented a significantly higher SDSS value than lines with Glu-A3f allele. In the ‘Tigre ’x ‘Gazul’ population, the Glu-B1 and Glu-B3 loci also showed an effect in quality parameters, in SDSS, and P and L values. Results indicated that: for SDSS and P, lines with Bx7OE+By8 were significantly better than lines with Bx17+By18; lines carrying Glu-B3ac allele had a significantly higher P values than Glu-B3ad allele values. lines with and lower L The analysis of quality parameters and amplified LMW fragments revealed a significant influence of two peaks (2-616 y 2-636) in P values. The presence of 2-636 peak gave higher P values than 2-616. These fragments had been cloned and sequenced and identified as Glu-B3 genes. The sequence analysis revealed that the molecular difference between them was some SNPs and a small deletion of 21 nucleotides that in the protein would produce an InDel of a heptapeptide in the repetitive region. In this work, the analysis of two crosses with differences in Glu-3 composition has made possible to study the influence of LMG-GS in quality parameters. Specifically, the influence of Glu-B3, the most interesting and less studied loci has been possible. The results have shown that Glu-B3 allele composition influences the alveograph parameter P (tenacity). The existence of different molecular variants of Glu-B3 alleles have been assessed by using a molecular marker method. This work supports the use of molecular approaches in the study of the very complex LMW-GS family, and validates their application in the analysis of advanced recombinant lines for quality studies.

System supporting public transport based on geolocation

El propósito de este proyecto de fin de Grado es el estudio y desarrollo de una aplicación basada en Android que proporcionará soporte y atención a los servicios de transporte público existentes en Cracovia, Polonia. La principal funcionalidad del sistema será consultar la posición de un determinado autobús o tranvía y mostrar su ubicación con exactitud. Para lograr esto, necesitaremos tres fases de desarrollo. En primer lugar, deberemos implementar un sistema que obtenga las coordenadas geográficas de los vehículos de transporte público en cada instante. A continuación, tendremos que registrar todos estos datos y almacenarlos en una base de datos en un servidor web. Por último, desarrollaremos un sistema cliente que realice consultas a tiempo real sobre estos datos almacenados, obteniendo la posición para una línea determinada y mostrando su ubicación con un marcador en el mapa. Para hacer el seguimiento de los vehículos, sería necesario tener acceso a una API pública que nos proporcionase la posición registrada por los GPS que integran cada uno de ellos. Como esta API no existe actualmente para los servicios de autobús, y para los tranvías es de uso meramente privado, desarrollaremos una segunda aplicación en Android que hará las funciones del lado servidor. En ella podremos elegir mediante una simple interfaz el número de línea y un código específico que identificará a cada vehículo en particular (e.g. podemos tener 6 tranvías recorriendo la red al mismo tiempo para la línea 24). Esta aplicación obtendrá las coordenadas geográficas del teléfono móvil, lo cual incluye latitud, longitud y orientación a través del proveedor GPS. De este modo, podremos realizar una simulación de como el sistema funcionará a tiempo real utilizando la aplicación servidora desde dentro de un tranvía o autobús y, al mismo tiempo, utilizando la aplicación cliente haciendo peticiones para mostrar la información de dicho tranvía. El cliente, además, podrá consultar la ruta de cualquier línea sin necesidad de tener acceso a Internet. Almacenaremos las rutas y paradas de cada línea en la memoria del teléfono móvil utilizando ficheros XML debido al poco espacio que ocupan y a lo útil que resulta poder consultar un trayecto en cualquier momento, independientemente del acceso a la red. El usuario también podrá consultar las tablas de horarios oficiales para cada línea. Aunque en este caso si será necesaria una conexión a Internet debido a que se realizará a través de la web oficial de MPK. Para almacenar todas las coordenadas de cada vehículo en cada instante necesitaremos crear una base de datos en un servidor. Esto se resolverá mediante el uso de MYSQL y PHP. Se enviarán peticiones de tipo GET y POST a los servicios PHP que se encargarán de traducir y realizar la consulta correspondiente a la base de datos MYSQL. Por último, gracias a todos los datos recogidos relativos a la posición de los vehículos de transporte público, podremos realizar algunas tareas de análisis. Comparando la hora exacta a la que los vehículos pasaron por cada parada y la hora a la que deberían haber pasado según los horarios oficiales, podremos descubrir fallos en estos. Seremos capaces de determinar si es un error puntual debido a factores externos (atascos, averías,…) o si por el contrario, es algo que ocurre muy a menudo y se debería corregir el horario oficial. ABSTRACT The aim of this final Project (for University) is to develop an Android application thatwill provide support and feedback to the public transport services in Krakow. The main functionality of the system will be to track the position of a desired bus or tram line, and display its position on the map. To achieve this, we will need 3 stages: the first one will be to implement a system that sends the geographical position of the public transport vehicles, the second one will be to collect this data in a web server, and the last one will be to get the last location registered for the desired line and display it on the map. For tracking the vehicles, we would need to have access to a public API that should be connected with each bus/tram GPS. As this doesn’t exist in Krakow or at least is not available for public use, we will develop a second android application that will do the server side job. We will be able to choose in a simple interface the line number and a code letter to identify each vehicle (e.g. we can have 6 trams that belong to the line number 24 working at the same time). It will take the current mobile geolocation; this includes getting latitude, longitude and bearing from the GPS provider. Thus, we will be able to make a simulation of how the system works in real time by using the server app inside a tram and at the same time, using the client app and making requests to display the information of that tram. The client will also be able to check the path of the desired line without internet access. We will store the path and stops for each line locally in the phone memory using xml files due to the few requirements of available space it needs and the usefulness of checking a path when needed. This app will also offer the functionality of checking the timetable for the line, but in this case, it will link to the official Mpk website, so Internet access will be required. For storing all the coordinates for each vehicle at every moment we will need to create a database on a server. We have decided that the easiest way is to use Mysql and PHP for the deployment of the service. We will send GET and POST requests to the php files and those files will make the according queries to our database. Finally, based on all the collected data, we will be able to get some information about errors in the system of public transport timetables. We will check at what time a line was in each specific stop and compare it with the official timetable to find mistakes of time. We will determine if it is something that happens occasionally and related to external factors (e.g. traffic jams, breakdowns…) or if on the other hand, it is something that happens very often and the public transport timetables should be looked over and corrected.

Desarrollo de un procedimiento para la observación y caracterización mecánica de células sobre sustratos opacos mediante microscopía de fuerzas atómicas : aplicación al estudio de linfocitos

Las células en los tejidos biológicos están continuamente sometidas a estímulos físicos tales como la presión hidrostática y esfuerzos de tracción, compresión o cortante, entre otros. La importancia de los estímulos mecánicos en el comportamiento de las células se ha reconocido recientemente al comprobarse cómo la naturaleza de estas fuerzas puede cambiar en patologías tales como las enfermedades vasculares o el cáncer. En respuesta a estos cambios, las células reaccionan modificando desde su forma o aspecto hasta su ciclo celular. Consecuentemente, el interés por el comportamiento mecánico de las células ha experimentado un auge creciente que ha requerido el desarrollo de varias técnicas de caracterización. En este contexto, se puede afirmar que una de las técnicas que ha irrumpido con más fuerza en esta nueva área, situada entre el mundo biológico y el físico, es la microscopía de fuerza atómica. En esta Tesis se ha abordado el estudio mediante microscopía de fuerza atómica de linfocitos de ratón que constituyen un linaje celular especialmente difícil de caracterizar mediante esta técnica por su tamaño y naturaleza no adherente. Los linfocitos, como actores fundamentales del sistema inmune, tienen gran importancia en la determinación de la respuesta que un organismo desencadena ante la presencia de un biomaterial. Bajo esta premisa, y como condición previa a la caracterización de los linfocitos, ha sido necesario el desarrollo de una metodología robusta y de amplia aplicabilidad que permita el estudio de células sobre biomateriales. Finalmente y con el objetivo de correlacionar el comportamiento mecánico de los linfocitos con alguna característica fisiológica relevante, se ha analizado la hipótesis de que el comportamiento mecánico pueda ser utilizado como marcador de la edad biológica. Consecuentemente se ha abordado el estudio del comportamiento mecánico de los linfocitos clasificados por grupos de edad, de manera que se han obtenido los primeros resultados que indican cómo puede manifestarse el proceso de inmunosenescencia -depresión del sistema inmune relacionada con el envejecimiento- en el comportamiento mecánico de las células del sistema inmune. Cells within tissues are continuously exposed to physical forces including hydrostatic pressure, shear stress, and compression and tension forces. The relevance of these mechanical stimuli has recently been recognised by different works in which significant changes were observed in these forces when they were measued in individuals affected by cardiovasvular diseases or cancer. Cells may alter their orientation, shape, internal constitution, contract, migrate, adhere, modify the synthesis and degradation of extracellular constituents, or even their life cycle in response to perturbations in their mechanical environment. As a consequence of this, the attention in cell mechanical behavior has undergone a significant thrust and novel techniques have been developed. In this context, atomic force microscopy has become a basic tool for the progress of this field. In this Thesis, the mechanical behavior of living murine T-lymphocytes was assessed by atomic force microscopy. Lymphocytes play a main role in the immune system of the individual and, consequently, in the immune response triggered by the presence of a biomaterial. The observation and characterization of the lymphocytes required the development of a robust experimental procedure that allowed overcoming the difficulties related to the analysis of this cell lineage, in particular their relatively large size and non-adherent character. These procedures could be easily transferred to other non-adherent cell lineages. Finally, to check the viability of developed method, we study the lymphocyte mechanical behavior as a function of the murine ageing. The obtained data represent a first step in the knowledge about how mechanical stimuli can affect the age-dependent decrease in immunological competence, i.e., the immunosenescence.

Evaluación de la fuerza en niños de educación infantil (3-5 años) proyecto PREFIT

Introducción: El proyecto de investigación PREFIT (field – based FITness testing in PREschool children) ha diseñado una batería de tests de campo fiables y válidos para evaluar la condición física en niños preescolares (3 a 5 años), siendo la fuerza uno de los componentes más importantes de la condición física. La fuerza muscular se considera un importante marcador de salud cardiovascular y osteoarticular en niños, además de contribuir a su salud mental. Por tanto, la evaluación y mejora de esta cualidad desde etapas tempranas es crucial para el desarrollo saludable de los niños.

Análisis de sistemas dinámicos y complejos en la Liga Profesional de Balonmano de España = Complex and dynamical systems analysis in Spanish Professional Handball League

El propósito de esta tesis fue estudiar el rendimiento ofensivo de los equipos de balonmano de élite cuando se considera el balonmano como un sistema dinámico complejo no lineal. La perspectiva de análisis dinámica dependiente del tiempo fue adoptada para evaluar el rendimiento de los equipos durante el partido. La muestra general comprendió los 240 partidos jugados en la temporada 2011-2012 de la liga profesional masculina de balonmano de España (Liga ASOBAL). En el análisis posterior solo se consideraron los partidos ajustados (diferencia final de goles ≤ 5; n = 142). El estado del marcador, la localización del partido, el nivel de los oponentes y el periodo de juego fueron incorporados al análisis como variables situacionales. Tres estudios compusieron el núcleo de la tesis. En el primer estudio, analizamos la coordinación entre las series temporales que representan el proceso goleador a lo largo del partido de cada uno de los dos equipos que se enfrentan. Autocorrelaciones, correlaciones cruzadas, doble media móvil y transformada de Hilbert fueron usadas para el análisis. El proceso goleador de los equipos presentó una alta consistencia a lo largo de todos los partidos, así como fuertes modos de coordinación en fase en todos los contextos de juego. Las únicas diferencias se encontraron en relación al periodo de juego. La coordinación en los procesos goleadores de los equipos fue significativamente menor en el 1er y 2º periodo (0–10 min y 10–20 min), mostrando una clara coordinación creciente a medida que el partido avanzaba. Esto sugiere que son los 20 primeros minutos aquellos que rompen los partidos. En el segundo estudio, analizamos los efectos temporales (efecto inmediato, a corto y a medio plazo) de los tiempos muertos en el rendimiento goleador de los equipos. Modelos de regresión lineal múltiple fueron empleados para el análisis. Los resultados mostraron incrementos de 0.59, 1.40 y 1.85 goles para los periodos que comprenden la primera, tercera y quinta posesión de los equipos que pidieron el tiempo muerto. Inversamente, se encontraron efectos significativamente negativos para los equipos rivales, con decrementos de 0.50, 1.43 y 2.05 goles en los mismos periodos respectivamente. La influencia de las variables situacionales solo se registró en ciertos periodos de juego. Finalmente, en el tercer estudio, analizamos los efectos temporales de las exclusiones de los jugadores sobre el rendimiento goleador de los equipos, tanto para los equipos que sufren la exclusión (inferioridad numérica) como para los rivales (superioridad numérica). Se emplearon modelos de regresión lineal múltiple para el análisis. Los resultados mostraron efectos negativos significativos en el número de goles marcados por los equipos con un jugador menos, con decrementos de 0.25, 0.40, 0.61, 0.62 y 0.57 goles para los periodos que comprenden el primer, segundo, tercer, cuarto y quinto minutos previos y posteriores a la exclusión. Para los rivales, los resultados mostraron efectos positivos significativos, con incrementos de la misma magnitud en los mismos periodos. Esta tendencia no se vio afectada por el estado del marcador, localización del partido, nivel de los oponentes o periodo de juego. Los incrementos goleadores fueron menores de lo que se podría esperar de una superioridad numérica de 2 minutos. Diferentes teorías psicológicas como la paralización ante situaciones de presión donde se espera un gran rendimiento pueden ayudar a explicar este hecho. Los últimos capítulos de la tesis enumeran las conclusiones principales y presentan diferentes aplicaciones prácticas que surgen de los tres estudios. Por último, se presentan las limitaciones y futuras líneas de investigación. ABSTRACT The purpose of this thesis was to investigate the offensive performance of elite handball teams when considering handball as a complex non-linear dynamical system. The time-dependent dynamic approach was adopted to assess teams’ performance during the game. The overall sample comprised the 240 games played in the season 2011-2012 of men’s Spanish Professional Handball League (ASOBAL League). In the subsequent analyses, only close games (final goal-difference ≤ 5; n = 142) were considered. Match status, game location, quality of opposition, and game period situational variables were incorporated into the analysis. Three studies composed the core of the thesis. In the first study, we analyzed the game-scoring coordination between the time series representing the scoring processes of the two opposing teams throughout the game. Autocorrelation, cross-correlation, double moving average, and Hilbert transform were used for analysis. The scoring processes of the teams presented a high consistency across all the games as well as strong in-phase modes of coordination in all the game contexts. The only differences were found when controlling for the game period. The coordination in the scoring processes of the teams was significantly lower for the 1st and 2nd period (0–10 min and 10–20 min), showing a clear increasing coordination behavior as the game progressed. This suggests that the first 20 minutes are those that break the game-scoring. In the second study, we analyzed the temporal effects (immediate effect, short-term effect, and medium-term effect) of team timeouts on teams’ scoring performance. Multiple linear regression models were used for the analysis. The results showed increments of 0.59, 1.40 and 1.85 goals for the periods within the first, third and fifth timeout ball possessions for the teams that requested the timeout. Conversely, significant negative effects on goals scored were found for the opponent teams, with decrements of 0.59, 1.43 and 2.04 goals for the same periods, respectively. The influence of situational variables on the scoring performance was only registered in certain game periods. Finally, in the third study, we analyzed the players’ exclusions temporal effects on teams’ scoring performance, for the teams that suffer the exclusion (numerical inferiority) and for the opponents (numerical superiority). Multiple linear regression models were used for the analysis. The results showed significant negative effects on the number of goals scored for the teams with one less player, with decrements of 0.25, 0.40, 0.61, 0.62, and 0.57 goals for the periods within the previous and post one, two, three, four and five minutes of play. For the opponent teams, the results showed positive effects, with increments of the same magnitude in the same game periods. This trend was not affected by match status, game location, quality of opposition, or game period. The scoring increments were smaller than might be expected from a 2-minute numerical playing superiority. Psychological theories such as choking under pressure situations where good performance is expected could contribute to explain this finding. The final chapters of the thesis enumerate the main conclusions and underline the main practical applications that arise from the three studies. Lastly, limitations and future research directions are described.

Development of somatic embryogenesis for cloning and conservation of mature holm oak trees (Quercus ilex L.)

La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.

Development of somatic embryogenesis for cloning and conservation of mature holm oak trees (Quercus ilex L.)

La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.

Potenciación de la respuesta productiva en rumiantes mediante el empleo de proteínas protegidas

El principal objetivo de esta tesis fue incrementar la eficiencia proteica en las dietas de rumiantes mediante el uso de proteínas protegidas (harina de girasol y guisante de primavera), así como mejorar la predicción de los aportes de proteína microbiana. Una partida de harinas comerciales de girasol (HG) y de guisante de primavera (GP) fueron tratadas con soluciones 4 N de ácido málico (268,2 g/L) o ácido ortofosfórico (130,6 g/L). Para cada harina, ácido y día de tratamiento, dos fracciones de 12,5 kg fueron pulverizadas sucesivamente en una hormigonera con la solución de ácido correspondiente mediante un pulverizador de campo. Las dos fracciones fueron mezcladas posteriormente y se dejaron reposar durante 1 h a temperatura ambiente. La mezcla fue luego secada en una estufa de aire forzado a 120 ºC durante 1 h. La estufa fue apagada inmediatamente después y el material tratado se mantuvo dentro de ésta hasta la mañana siguiente. El material fue removido durante el proceso de secado cada 30 min durante las primeras 2 h y cada 60 min durante las 5 h posteriores. Este proceso se repitió hasta conseguir las cantidades de harinas tratadas necesarias en los distintos ensayos. En el primer experimento (capitulo 3) se llevaron a cabo estudios de digestión ruminal e intestinal para evaluar los efectos de la aplicación de las soluciones ácidas indicadas y calor a fin de proteger las proteínas de HG y GP contra la degradación ruminal. Estos estudios se realizaron con tres corderos canulados en el rumen y en el duodeno. El estudio de digestión ruminal fue realizado en tres periodos experimentales en los que los corderos fueron alimentados sucesivamente con tres dietas isoproteicas que incluían HG y GP, sin tratar o tratadas con ácidos málico u ortofosfórico. Cada periodo experimental de 21 días incluyó sucesivamente: 10 días de adaptación a las dietas, un estudio del tránsito ruminal de las partículas de HG y GP (días 11 a 14), y la incubación de las muestras de ambos alimentos en bolsas de nailon (días 15–21). Las harinas incubadas en cada periodo experimental correspondieron a las que fueron incluidas en las dietas. Las bacterias ruminales fueron marcadas desde el día 11 hasta el día 21 del periodo experimental mediante infusión intra-ruminal continua con una fuente de 15N. Tras finalizar las incubaciones in situ el día 21 el rumen fue vaciado en cada periodo para aislar las bacterias asociadas a la fase sólida y liquida del rumen. El estudio de digestión intestinal fue realizado veinte días después del final del estudio ruminal a fin de eliminar el enriquecimiento en 15N de la digesta. En este estudio se incubaron muestras compuestas obtenidas mediante la combinación de los diferentes residuos no degradados en el rumen de forma que fuesen representativas de la composición química de la fracción no degradada en el rumen (RU). En esta fase los corderos fueron alimentados con la dieta sin tratar para determinar la digestibilidad de las harinas tanto tratadas como sin tratar mediante la técnica de las bolsas móviles. Además, las proteínas contenidas en las harinas tratadas y sin tratar, así como en las muestras correspondientes a los residuos a 0 h, las muestras compuestas anteriormente indicadas y las muestras no digeridas intestinalmente fueron extraídas y sometidas a electroforesis para determinar el sitio de digestión de las diferentes fracciones proteicas. Las estimaciones de la RU y la digestibilidad intestinal de la materia seca, la materia orgánica (solamente para RU), la proteína bruta (PB) y el almidón (solamente en GP) fueron obtenidos considerando la contaminación microbiana y las tasas de conminución y salida de partículas. Las estimaciones de RU y de la digestibilidad intestinal disminuyeron en todas las fracciones evaluadas de ambos alimentos al corregir por la contaminación microbiana acaecida en el rumen. Todas las estimaciones de RU aumentaron con los tratamientos de protección, incrementándose también la digestibilidad intestinal de la materia seca en la HG. Los bajos valores de la digestibilidad de la proteína de GP tratado y sin tratar sugieren la presencia de algún factor antitripsico no termolábil es esta harina. Los tratamientos de protección incrementaron consistentemente la fracción de materia seca y PB digerida intestinalmente en los dos alimentos, mientras que la fracción de almidón en la muestra de GP solamente aumentó numéricamente (60,5% de media). Sin embargo, los tratamientos también redujeron la fermentación de la materia orgánica, lo cual podría disminuir la síntesis de proteína microbiana. Los estudios de electroforesis muestran la práctica desaparición de la albumina por la degradación ruminal en ambos alimentos, así como que los cambios en otras proteínas de la muestra RU fueron más pronunciados en GP que en HG. La composición de las bacterias asociadas con las fases de digesta ruminal sólida (BAS) y líquida (BAL) fue estudiada para revisar la precisión de un sistema de predicción previo que determinaba la infravaloración del aporte de nutrientes correspondiente a las BAS cuando de usa 15N como marcador y las BAL como referencia microbiana (capitulo 4). Al comparar con BAS, BAL mostraron menores contenidos en materia orgánica, polisacáridos de glucosa y lípidos totales y un mayor contenido en PB, así como un mayor enriquecimiento en 15N. Los datos obtenidos en el estudio actual se ajustan bien a la ecuación previa que predice el enriquecimiento en 15N de las BAS a partir del mismo valor en BAL. Esta nueva ecuación permite establecer que se produce una infravaloración de un 22% en el aporte de PB al animal a partir de las BAS sintetizadas si las BAL son usadas como muestras de referencia. Una segunda relación calculada utilizando los valores medios por dieta expuestos en numerosos trabajos encontrados en la literatura confirma la magnitud de este error. Esta infravaloración asociada al uso de BAL como referencia fue mayor para el aporte de glucosa (43,1%) y todavía mayor para el aporte de lípidos (59,9%), como consecuencia de los menores contenidos de ambas fracciones en BAL frente a SAB. Estos errores deberían ser considerados para obtener mayor precisión en la estimación del aporte de nutrientes microbianos y mejorar la nutrición de los rumiantes. En el experimento 2 se realizó un estudio de producción (capitulo 5) para evaluar los efectos del tratamiento de las harinas HG y GP con soluciones de ácido málico o ácido ortofosfórico sobre el crecimiento, el consumo de concentrado y el rendimiento y engrasamiento de las canales de corderos de engorde. Noventa corderos machos de cruce entrefino procedentes de tres granjas comerciales (peso inicial medio = 14,6, 15,3 y 13,3 kg, respectivamente) fueron asignados aleatoriamente a cinco dietas con diferentes niveles de proteína y diferentes tratamientos con ácidos y engordados hasta un peso medio al sacrificio de 25 kg. Las fuentes de proteína en el pienso control (C; PB=18,0%) fueron harina de soja, HG y GP sin tratar. En tres de los piensos experimentales, las harinas tratadas con ácido ortofosfórico sustituyeron a las de HG y GP sin tratar (Control Ortofosfórico, PC; PB=18,0% sobre materia seca), sustituyéndose, además, la harina de soja parcialmente (Sustitución Media Ortofosfórico, MSP; PB=16,7%) o totalmente (Sustitución Total Ortofosfórico, TSP; PB=15,6%). Finalmente, en uno de los piensos el ácido ortofosfórico fue reemplazo por acido málico para proteger ambas harinas (Sustitución Media Málico, MSM; PB= 16,7%). La paja de trigo (fuente de forraje) y el concentrado fueron ofrecidos ad libitum. Dieciocho corderos fueron distribuidos en seis cubículos con tres animales para cada dieta. Los datos fueron analizados según un análisis factorial considerando el peso inicial como covariable y la granja de procedencia como bloque. Los datos de consumo de concentrado y eficiencia de conversión fueron analizados usando el cubículo como unidad experimental, mientras que los datos sobre ganancia media diaria, rendimiento a la canal, grasa dorsal y grasa pélvico renal fueron analizados usando el cordero como unidad experimental. No se encontró ningún efecto asociado con el nivel de PB sobre ninguna variable estudiada. Esto sugiere que usando proteínas protegidas es posible utilizar concentrados con 15,6% de PB (sobre materia seca) disminuyendo así la cantidad de concentrados de proteína vegetal a incluir en los piensos y la calidad de los concentrados proteicos. Los corderos alimentados con la dieta MSM tuvieron mayores ganancias medias diarias (15,2%; P= 0,042), y mejores rendimiento a la canal en caliente (1,3 unidades porcentuales; P= 0,037) que los corderos alimentados con el concentrado MSP. Esto podría ser explicado por los efectos benéficos ruminales del malato o por el mayor efecto de protección conseguido con el ácido málico. ABSTRACT The main objective of this thesis project was to increase the protein efficiency in ruminant diets by using protected protein (sunflower meal and spring pea), and improving the prediction of microbial protein supply. Commercial sunflower meal (SFM) and spring pea (SP) were treated with 4 N solutions (200 mL/kg) of malic acid (268.2 g/L) or orthophosphoric acid (130.6 g/L). Daily, two fractions of 12.5 kg of one of these meals were successively sprayed with the tested acid solution in a concrete mixer using a sprayer. Both fractions were then mixed and allowed to rest for 1 h at room temperature. The blend was then dried in a forced air oven at 120 ºC for 1 h. Then the oven was turned off and the treated material was left in the oven overnight. During the drying process, the material was stirred every 30 min during the first 2 h and then every 60 min for the subsequent 5 h. This process was repeated until the amounts of treated flour needed for the different trials performed. In the first experiment (chapter 3), ruminal and intestinal digestion trials were conducted to study the effects of the application of these acid solutions and heat to protect proteins of SFM and SP against ruminal degradation using three wethers fitted with rumen and duodenum cannulae. The ruminal digestion study was carried out in three experimental periods in which the wethers were successively fed three isoproteic diets including SFM and SP, untreated or treated with malic or orthophosphoric acids. The experimental periods of 21 days included successively: 10 days of diet adaptation, SFM and SP particle ruminal transit study (days 11–14) and ruminal nylon-bag incubations (days 15–21). The meals incubated in each experimental period were those corresponding to the associated diet. Rumen bacteria were labelled from days 11 to 21 by continuous intra-ruminal infusion of a 15N source and the rumen was emptied at the end of in situ incubations in each period to isolate solid adherent bacteria and liquid associate bacteria. The intestinal digestion trial was conducted twenty days after the end of the ruminal studies to eliminate the 15N enrichment in the digesta. The tested samples were composite samples obtained pooling the different ruminally undegraded residues to be representative of the chemical composition of the ruminally undegraded fraction (RU). Wethers were fed the untreated diet to determine the intestinal digestibility of untreated and treated meals using the mobile nylon bag technique. In addition, protein in untreated and treated meals and their 0 h, composite and intestinally undigested samples were extracted and subjected to electrophoresis to determine the digestion site of the different protein fractions. Estimates of the RU and its intestinal digestibility of dry matter, organic matter (only for RU), crude protein (CP) and starch (only in SP) were obtained considering ruminal microbial contamination and particle comminution and outflow rates. When corrected for the microbial contamination taking place in the rumen, estimates of RU and intestinal digestibility decreased in all tested fractions for both feeds. All RU estimates increased with the protective treatments, whereas intestinal digestibility-dry matter also increased in SFM. Low intestinal digestibility-CP values in untreated and treated samples suggested the presence of non-heat labile antitrypsin factors in SP. Protective treatments of both feeds led to consistent increases in the intestinal digested fraction of dry matter and CP, being only numerically different for SP-starch (60.5% as average). However, treatments also reduced the organic matter fermentation, which may decrease ruminal microbial protein synthesis. Electrophoretic studies showed albumin disappearance in both SFM and SP, whereas changes in other RU proteins were more pronounced in SP than SFM. The chemical composition of bacteria associated with solid (SAB) and liquid (LAB) rumen-digesta phases was studied to examine the accuracy of a previous regression system determining the underevaluation of SAB-nutrient supply using 15N as marker and LAB as microbial reference (chapter 4). Compared with SAB, LAB showed lower contents of organic matter, polysaccharide-glucose and total lipids and the opposite for the CP content and the 15N enrichment. Present data fitted well to the previous relationship predicting the 15N enrichment of SAB from the same value in LAB. This new equation allows establishing an underevaluation in the supply of CP from the synthesized SAB in 22.0% if LAB is used as reference. Another relationship calculated using mean diet values from the literature confirmed the magnitude of this error. This underevaluation was higher for the supply of glucose (43.1%) and still higher for the lipid supply (59.9%) as a consequence of the lower contents of these both fractions in LAB than in SAB. These errors should be considered to obtain more accurate estimates of the microbial nutrient supply and to improve ruminant nutrition. A production study was performed in experiment 2 (chapter 5) to examine the effects of treating SFM and SP meals with orthophosphoric or malic acid solutions on growth performance, concentrate intake, and carcass yield and fatness of growing-fattening lambs. Ninety "Entrefino" cross male lambs from three commercial farms (average initial body weights (BW) = 14.6, 15.3 and 13.3 kg) were randomly assigned to five diets with different acid treatment and protein levels, and fattened to an average slaughter weight of 25 kg. Protein sources in the control concentrate (C; CP=18%) were soybean meal and untreated SFM and SP. In three of the experimental concentrates, orthophosphoric acid-treated meals substituted untreated SFM and SP (Orthophosphoric Control, PC; CP=18% dry matter basis), and soybean meal was partially (Medium Substitution Orthophosphoric, MSP; CP=16.7%) or totally removed (Total Substitution Orthophosphoric, TSP; CP=15.6%). In addition, in one concentrate orthophosphoric acid was replaced by malic acid to protect these meals (Medium Substitution Malic, MSM; CP= 16.7%). Wheat straw (roughage source) and concentrate were offered ad libitum. Eighteen lambs were allocated to six pens of three animals on each diet. Data were analyzed using a factorial analysis with initial body weight BW as covariate and farm of origin as block. Data on concentrate intake and feed conversion efficiency were analyzed using pen as experimental unit, while data on average daily gain, carcass yield, dorsal fat, and kidney-pelvic-fat were analyzed with lamb as experimental unit. No effect associated with the CP level was observed on any parameter. This suggests that with protected proteins it is possible to feed concentrates with 15.6% CP (dry matter basis) reducing the quantity of vegetable protein meals to include in the concentrate as well as the quality of the protein concentrates. Lambs feed MSM had higher average daily gains (15.2%; P= 0.042), and better hot carcass yields (1.3 percentage points; P= 0.037) than lambs feed MSP. This probably can be explained by ruminal malate actions and by greater protection effects obtained with malic acid.

Localización y mapeo visual monocular para robot móvil terrestre aplicado a la inspección ultrasónica aeronáutica

En el ámbito de la robótica de servicio, actualmente no existe una solución automatizada para la inspección ultrasónica de las partes de material compuesto de una aeronave durante las operaciones de mantenimiento que realiza la aerolínea. El desarrollo de las nuevas técnicas de acoplamiento acústico en seco en el método de inspección no destructiva por ultrasonidos, está conduciendo a posibilitar su uso con soluciones de menor coste respecto a las técnicas tradicionales, sin perder eficacia para detectar las deficiencias en las estructuras de material compuesto. Aunque existen aplicaciones de esta técnica con soluciones manuales, utilizadas en las fases de desarrollo y fabricación del material compuesto, o con soluciones por control remoto en sectores diferentes al aeronáutico para componentes metálicos, sin embargo, no existen con soluciones automatizadas para la inspección no destructiva por ultrasonidos de las zonas del avión fabricadas en material compuesto una vez la aeronave ha sido entregada a la aerolínea. El objetivo de este trabajo fin de master es evaluar el sistema de localización, basado en visión por ordenador, de una solución robotizada aplicada la inspección ultrasónica estructural de aeronaves en servicio por parte de las propias aerolíneas, utilizando las nuevas técnicas de acoplamiento acústico en seco, buscando la ventaja de reducir los tiempos y los costes en las operaciones de mantenimiento. Se propone como solución un robot móvil autónomo de pequeño tamaño, con control de posición global basado en técnicas de SLAM Visual Monocular, utilizando marcadores visuales externos para delimitar el área de inspección. Se ha supuesto la inspección de elementos de la aeronave cuya superficie se pueda considerar plana y horizontal, como son las superficies del estabilizador horizontal o del ala. Este supuesto es completamente aceptable en zonas acotadas de estos componentes, y de cara al objetivo del proyecto, no le resta generalidad. El robot móvil propuesto es un vehículo terrestre triciclo, de dos grados de libertad, con un sistema de visión monocular completo embarcado, incluyendo el hardware de procesamiento de visión y control de trayectoria. Las dos ruedas delanteras son motrices y la tercera rueda, loca, sirve únicamente de apoyo. La dirección, de tipo diferencial, permite al robot girar sin necesidad de desplazamiento, al conseguirse por diferencia de velocidad entre la rueda motriz derecha e izquierda. El sistema de inspección ultrasónica embarcado está compuesto por el hardware de procesamiento y registro de señal, y una rueda-sensor situada coaxialmente al eje de las ruedas motrices, y centrada entre estas, de modo que la medida de inspección se realiza en el centro de rotación del robot. El control visual propuesto se realiza mediante una estrategia “ver y mover” basada en posición, ejecutándose de forma secuencial la extracción de características visuales de la imagen, el cálculo de la localización global del robot mediante SLAM visual y el movimiento de éste mediante un algoritmo de control de posición-orientación respecto a referencias de paso de la trayectoria. La trayectoria se planifica a partir del mapa de marcas visuales que delimitan el área de inspección, proporcionado también por SLAM visual. Para validar la solución propuesta se ha optado por desarrollar un prototipo físico tanto del robot como de los marcadores visuales externos, a los que se someterán a una prueba de validación como alternativa a utilizar un entorno simulado por software, consistente en el reconocimiento del área de trabajo, planeamiento de la trayectoria y recorrido de la misma, de forma autónoma, registrando el posicionamiento real del robot móvil junto con el posicionamiento proporcionado por el sistema de localización SLAM. El motivo de optar por un prototipo es validar la solución ante efectos físicos que son muy complicados de modelar en un entorno de simulación, derivados de las limitaciones constructivas de los sistemas de visión, como distorsiones ópticas o saturación de los sensores, y de las limitaciones constructivas de la mecánica del robot móvil que afectan al modelo cinemático, como son el deslizamiento de las ruedas o la fluctuación de potencia de los motores eléctricos. El prototipo de marcador visual externo utilizado para la prueba de validación, ha sido un símbolo plano vertical, en blanco y negro, que consta de un borde negro rectangular dentro del cual se incluye una serie de marcas cuadradas de color negro, cuya disposición es diferente para cada marcador, lo que permite su identificación. El prototipo de robot móvil utilizado para la prueba de validación, ha sido denominado VINDUSTOR: “VIsual controlled Non-Destructive UltraSonic inspecTOR”. Su estructura mecánica ha sido desarrollada a partir de la plataforma comercial de robótica educacional LEGO© MINDSTORMS NXT 2.0, que incluye los dos servomotores utilizados para accionar las dos ruedas motrices, su controlador, las ruedas delanteras y la rueda loca trasera. La estructura mecánica ha sido especialmente diseñada con piezas LEGO© para embarcar un ordenador PC portátil de tamaño pequeño, utilizado para el procesamiento visual y el control de movimiento, y el sistema de captación visual compuesto por dos cámaras web de bajo coste, colocadas una en posición delantera y otra en posición trasera, con el fin de aumentar el ángulo de visión. El peso total del prototipo no alcanza los 2 Kg, siendo sus dimensiones máximas 20 cm de largo, 25 cm de ancho y 26 cm de alto. El prototipo de robot móvil dispone de un control de tipo visual. La estrategia de control es de tipo “ver y mover” dinámico, en la que se realiza un bucle externo, de forma secuencial, la extracción de características en la imagen, la estimación de la localización del robot y el cálculo del control, y en un bucle interno, el control de los servomotores. La estrategia de adquisición de imágenes está basada en un sistema monocular de cámaras embarcadas. La estrategia de interpretación de imágenes está basada en posición tridimensional, en la que los objetivos de control se definen en el espacio de trabajo y no en la imagen. La ley de control está basada en postura, relacionando la velocidad del robot con el error en la posición respecto a las referencias de paso de una trayectoria. La trayectoria es generada a partir del mapa de marcadores visuales externo. En todo momento, la localización del robot respecto a un sistema de referencia externo y el mapa de marcadores, es realizado mediante técnicas de SLAM visual. La auto-localización de un robot móvil dentro de un entorno desconocido a priori constituye uno de los desafíos más importantes en la robótica, habiéndose conseguido su solución en las últimas décadas, con una formulación como un problema numérico y con implementaciones en casos que van desde robots aéreos a robots en entornos cerrados, existiendo numerosos estudios y publicaciones al respecto. La primera técnica de localización y mapeo simultáneo SLAM fue desarrollada en 1989, más como un concepto que como un algoritmo único, ya que su objetivo es gestionar un mapa del entorno constituido por posiciones de puntos de interés, obtenidos únicamente a partir de los datos de localización recogidos por los sensores, y obtener la pose del robot respecto al entorno, en un proceso limitado por el ruido de los sensores, tanto en la detección del entorno como en la odometría del robot, empleándose técnicas probabilísticas aumentar la precisión en la estimación. Atendiendo al algoritmo probabilístico utilizado, las técnicas SLAM pueden clasificarse en las basadas en Filtros de Kalman, en Filtros de Partículas y en su combinación. Los Filtros de Kalman consideran distribuciones de probabilidad gaussiana tanto en las medidas de los sensores como en las medidas indirectas obtenidas a partir de ellos, de modo que utilizan un conjunto de ecuaciones para estimar el estado de un proceso, minimizando la media del error cuadrático, incluso cuando el modelo del sistema no se conoce con precisión, siendo el más utilizado el Filtro de Kalman Extendido a modelos nolineales. Los Filtros de Partículas consideran distribuciones de probabilidad en las medidas de los sensores sin modelo, representándose mediante un conjunto de muestras aleatorias o partículas, de modo que utilizan el método Montecarlo secuencial para estimar la pose del robot y el mapa a partir de ellas de forma iterativa, siendo el más utilizado el Rao-Backwell, que permite obtener un estimador optimizado mediante el criterio del error cuadrático medio. Entre las técnicas que combinan ambos tipos de filtros probabilísticos destaca el FastSLAM, un algoritmo que estima la localización del robot con un Filtro de Partículas y la posición de los puntos de interés mediante el Filtro de Kalman Extendido. Las técnicas SLAM puede utilizar cualquier tipo de sensor que proporcionen información de localización, como Laser, Sonar, Ultrasonidos o Visión. Los sensores basados en visión pueden obtener las medidas de distancia mediante técnicas de visión estereoscópica o mediante técnica de visión monocular. La utilización de sensores basados en visión tiene como ventajas, proporcionar información global a través de las imágenes, no sólo medida de distancia, sino también información adicional como texturas o patrones, y la asequibilidad del hardware frente a otros sensores. Sin embargo, su principal inconveniente es el alto coste computacional necesario para los complejos algoritmos de detección, descripción, correspondencia y reconstrucción tridimensional, requeridos para la obtención de la medida de distancia a los múltiples puntos de interés procesados. Los principales inconvenientes del SLAM son el alto coste computacional, cuando se utiliza un número elevado de características visuales, y su consistencia ante errores, derivados del ruido en los sensores, del modelado y del tratamiento de las distribuciones de probabilidad, que pueden producir el fallo del filtro. Dado que el SLAM basado en el Filtro de Kalman Extendido es una las técnicas más utilizadas, se ha seleccionado en primer lugar cómo solución para el sistema de localización del robot, realizando una implementación en la que las medidas de los sensores y el movimiento del robot son simulados por software, antes de materializarla en el prototipo. La simulación se ha realizado considerando una disposición de ocho marcadores visuales que en todo momento proporcionan ocho medidas de distancia con ruido aleatorio equivalente al error del sensor visual real, y un modelo cinemático del robot que considera deslizamiento de las ruedas mediante ruido aleatorio. Durante la simulación, los resultados han mostrado que la localización estimada por el algoritmo SLAM-EKF presenta tendencia a corregir la localización obtenida mediante la odometría, pero no en suficiente cuantía para dar un resultado aceptable, sin conseguir una convergencia a una solución suficientemente cercana a la localización simulada del robot y los marcadores. La conclusión obtenida tras la simulación ha sido que el algoritmo SLAMEKF proporciona inadecuada convergencia de precisión, debido a la alta incertidumbre en la odometría y a la alta incertidumbre en las medidas de posición de los marcadores proporcionadas por el sensor visual. Tras estos resultados, se ha buscado una solución alternativa. Partiendo de la idea subyacente en los Filtros de Partículas, se ha planteado sustituir las distribuciones de probabilidad gaussianas consideradas por el Filtro de Kalman Extendido, por distribuciones equi-probables que derivan en funciones binarias que representan intervalos de probabilidad no-nula. La aplicación de Filtro supone la superposición de todas las funciones de probabilidad no-nula disponibles, de modo que el resultado es el intervalo donde existe alguna probabilidad de la medida. Cómo la efectividad de este filtro aumenta con el número disponible de medidas, se ha propuesto obtener una medida de la localización del robot a partir de cada pareja de medidas disponibles de posición de los marcadores, haciendo uso de la Trilateración. SLAM mediante Trilateración Estadística (SLAM-ST) es como se ha denominado a esta solución propuesta en este trabajo fin de master. Al igual que con el algoritmo SLAM-EKF, ha sido realizada una implementación del algoritmo SLAM-ST en la que las medidas de los sensores y el movimiento del robot son simulados, antes de materializarla en el prototipo. La simulación se ha realizado en las mismas condiciones y con las mismas consideraciones, para comparar con los resultados obtenidos con el algoritmo SLAM-EKF. Durante la simulación, los resultados han mostrado que la localización estimada por el algoritmo SLAM-ST presenta mayor tendencia que el algoritmo SLAM-EKF a corregir la localización obtenida mediante la odometría, de modo que se alcanza una convergencia a una solución suficientemente cercana a la localización simulada del robot y los marcadores. Las conclusiones obtenidas tras la simulación han sido que, en condiciones de alta incertidumbre en la odometría y en la medida de posición de los marcadores respecto al robot, el algoritmo SLAM-ST proporciona mejores resultado que el algoritmo SLAM-EKF, y que la precisión conseguida sugiere la viabilidad de la implementación en el prototipo. La implementación del algoritmo SLAM-ST en el prototipo ha sido realizada en conjunción con la implementación del Sensor Visual Monocular, el Modelo de Odometría y el Control de Trayectoria. El Sensor Visual Monocular es el elemento del sistema SLAM encargado de proporcionar la posición con respecto al robot de los marcadores visuales externos, a partir de las imágenes obtenidas por las cámaras, mediante técnicas de procesamiento de imagen que permiten detectar e identificar los marcadores visuales que se hallen presentes en la imagen capturada, así como obtener las características visuales a partir de las cuales inferir la posición del marcador visual respecto a la cámara, mediante reconstrucción tridimensional monocular, basada en el conocimiento a-priori del tamaño real del mismo. Para tal fin, se ha utilizado el modelo matemático de cámara pin-hole, y se ha considerado las distorsiones de la cámara real mediante la calibración del sensor, en vez de utilizar la calibración de la imagen, tras comprobar el alto coste computacional que requiere la corrección de la imagen capturada, de modo que la corrección se realiza sobre las características visuales extraídas y no sobre la imagen completa. El Modelo de Odometría es el elemento del sistema SLAM encargado de proporcionar la estimación de movimiento incremental del robot en base a la información proporcionada por los sensores de odometría, típicamente los encoders de las ruedas. Por la tipología del robot utilizado en el prototipo, se ha utilizado un modelo cinemático de un robot tipo uniciclo y un modelo de odometría de un robot móvil de dos ruedas tipo diferencial, en el que la traslación y la rotación se determinan por la diferencia de velocidad de las ruedas motrices, considerando que no existe deslizamiento entre la rueda y el suelo. Sin embargo, el deslizamiento en las ruedas aparece como consecuencia de causas externas que se producen de manera inconstante durante el movimiento del robot que provocan insuficiente contacto de la rueda con el suelo por efectos dinámicos. Para mantener la validez del modelo de odometría en todas estas situaciones que producen deslizamiento, se ha considerado un modelo de incertidumbre basado en un ensayo representativo de las situaciones más habituales de deslizamiento. El Control de Trayectoria es el elemento encargado de proporcionar las órdenes de movimiento al robot móvil. El control implementado en el prototipo está basado en postura, utilizando como entrada la desviación en la posición y orientación respecto a una referencia de paso de la trayectoria. La localización del robot utilizada es siempre de la estimación proporcionada por el sistema SLAM y la trayectoria es planeada a partir del conocimiento del mapa de marcas visuales que limitan el espacio de trabajo, mapa proporcionado por el sistema SLAM. Las limitaciones del sensor visual embarcado en la velocidad de estabilización de la imagen capturada han conducido a que el control se haya implementado con la estrategia “mirar parado”, en la que la captación de imágenes se realiza en posición estática. Para evaluar el sistema de localización basado en visión del prototipo, se ha diseñado una prueba de validación que obtenga una medida cuantitativa de su comportamiento. La prueba consiste en la realización de forma completamente autónoma de la detección del espacio de trabajo, la planificación de una trayectoria de inspección que lo transite completamente, y la ejecución del recorrido de la misma, registrando simultáneamente la localización real del robot móvil junto con la localización proporcionada por el sistema SLAM Visual Monocular. Se han realizado varias ejecuciones de prueba de validación, siempre en las mismas condiciones iniciales de posición de marcadores visuales y localización del robot móvil, comprobando la repetitividad del ensayo. Los resultados presentados corresponden a la consideración de las medidas más pesimistas obtenidas tras el procesamiento del conjunto de medidas de todos los ensayos. Los resultados revelan que, considerando todo el espacio de trabajo, el error de posición, diferencia entre los valores de proporcionados por el sistema SLAM y los valores medidos de posición real, se encuentra en el entorno de la veintena de centímetros. Además, los valores de incertidumbre proporcionados por el sistema SLAM son, en todos los casos, superiores a este error. Estos resultados conducen a concluir que el sistema de localización basado en SLAM Visual, mediante un algoritmo de Trilateración Estadística, usando un sensor visual monocular y marcadores visuales externos, funciona, proporcionando la localización del robot móvil con respecto al sistema de referencia global inicial y un mapa de su situación de los marcadores visuales, con precisión limitada, pero con incertidumbre conservativa, al estar en todo momento el error real de localización por debajo del error estimado. Sin embargo, los resultados de precisión del sistema de localización no son suficientemente altos para cumplir con los requerimientos como solución robotizada aplicada a la inspección ultrasónica estructural de aeronaves en servicio. En este sentido, los resultados sugieren que la posible continuación de este trabajo en el futuro debe centrarse en la mejora de la precisión de localización del robot móvil, con líneas de trabajo encaminadas a mejorar el comportamiento dinámico del prototipo, en mejorar la precisión de las medidas de posición proporcionadas por el sensor visual y en optimizar el resultado del algoritmo SLAM. Algunas de estas líneas futuras podrían ser la utilización de plataformas robóticas de desarrollo alternativas, la exploración de técnicas de visión por computador complementarias, como la odometría visual, la visión omnidireccional, la visión estereoscópica o las técnicas de reconstrucción tridimensional densa a partir de captura monocular, y el análisis de algoritmos SLAM alternativos condicionado a disponer de una sustancial mejora de precisión en el modelo de odometría y en las medidas de posición de los marcadores.

Estudio del rendimiento bajo presión en los tiros libres en baloncesto, y su influencia sobre el porcentaje de acierto durante el último minuto de juego

El minuto final de un partido ajustado de baloncesto es un momento crítico que está sujeto a multitud de factores que influyen en su desarrollo. Así, el porcentaje de acierto en los tiros libres durante ese periodo de tiempo va a determinar, en muchas ocasiones, el resultado final del partido. La disminución de rendimiento (drop) en esta faceta de juego en condiciones de presión, puede estar relacionada con múltiples variables propias del contexto deportivo estudiado, como por ejemplo: los segundos restantes de posesión, la situación en el marcador (ir ganando, empatando o perdiendo), la localización del partido (jugar en casa o fuera), la fase de competición (fase regular o eliminatorias) o el nivel del equipo (mejores/peores equipos). Además, las características del jugador que realiza los lanzamientos tienen una gran importancia respecto a su edad y años de experiencia para afrontar los momentos críticos, así como el puesto de juego que ocupa en el equipo. En este sentido, la combinación de factores del contexto y del jugador, permiten interactuar en el rendimiento del lanzador en los momentos finales de partido durante sus lanzamientos de tiro libre. El presente trabajo de tesis doctoral tiene como objetivo encontrar aquellas variables más relacionadas con la disminución de rendimiento del jugador en los tiros libres durante el último minuto de juego, y la última serie de tiros libres en los partidos ajustados de baloncesto. Para alcanzar el objetivo del estudio se analizaron 124 partidos ajustados (diferencias iguales o inferiores a 2 puntos) de todas las competiciones (fase regular, playoff y copa del Rey) de la liga ACB durante las temporadas 2011-2012 a 2014-2015. Para el registro de variables se analizó el porcentaje de acierto en los tiros libres del lanzador en la liga regular, partido completo, último minuto y última serie. De este modo se trató de analizar qué variables del contexto y del jugador permitían explicar el rendimiento en los tiros libres durante el último minuto, y la última serie de tiros libres del partido. Por otro lado, se trató de conocer el grado de asociación entre el descenso del rendimiento (drop) en los momentos finales de partido, y las variables estudiadas del jugador: puesto de juego, edad, y años de experiencia profesional; mientras que las variables situacionales consideradas fueron: fase de competición, localización, clasificación, tiempo restante, y diferencia parcial en el marcador. Para el análisis de los datos se realizaron dos modelos estadísticos: 1º) un modelo de regresión lineal múltiple para conocer el efecto de las variables independientes en el porcentaje de aciertos del lanzador en el último minuto, y en la última serie de tiros libres del partido; y 2º) un análisis de regresión logística binomial para analizar la relación existente entre la probabilidad de tener un drop (disminución del rendimiento) y las características del lanzador, y las variables situacionales. Los resultados del modelo de regresión lineal múltiple mostraron efectos negativos significativos en el porcentaje de acierto en los tiros libres durante el último minuto, cuando los lanzadores son los pívots (-19,45%). Por otro lado, los resultados durante la última serie mostraron el efecto negativo significativo sobre la posición de pívot (- 19,30%) y la diferencia parcial en el marcador (-3,33%, para cada punto de diferencia en el marcador) en el porcentaje de acierto en los tiros libres. Las variables independientes edad, experiencia profesional, clasificación en la liga regular, fase de competición, localización, y tiempo restante, no revelaron efectos significativos en los modelos de regresión lineal. Los resultados de la regresión logística binomial revelaron que las variables experiencia profesional entre 13 y 18 años (OR = 4,63), jugar de alero (OR = 23,01), y jugar de base (OR = 10,68) están relacionadas con una baja probabilidad de disminuir el rendimiento durante el último minuto del partido; mientras que ir ganando, aumenta esta probabilidad (OR = 0,06). Además, los resultados de la última serie mostraron una menor disminución del rendimiento del jugador cuando tiene entre 13 y 18 años de experiencia (OR = 4,28), y juega de alero (OR = 8,06) o base (OR = 6,34). Por el contrario, las variables situacionales relacionadas con esa disminución del rendimiento del jugador son las fases eliminatorias (OR = 0,22) e ir ganando (OR = 0,04). Los resultados principales del estudio mostraron que existe una disminución del rendimiento del jugador en su porcentaje de acierto en los tiros libres durante el último minuto y en la última serie de lanzamientos del partido, y que está relacionada significativamente con la edad, experiencia profesional, puesto de juego del jugador, y diferencia parcial en el marcador. Encontrando relación también con la fase de competición, durante la última serie de tiros libres del partido. Esta información supone una valiosa información para el entrenador, y su aplicación en el ámbito competitivo real. En este sentido, la creación de simulaciones en el apartado de aplicaciones prácticas, permite predecir el porcentaje de acierto en los tiros libres de un jugador durante los momentos de mayor presión del partido, en base a su perfil de rendimiento. Lo que puede servir para realizar una toma de decisiones más idónea, con el objetivo de lograr el mejor resultado. Del mismo modo, orienta el tipo de proceso de entrenamiento que se ha de seguir, en relación a los jugadores más tendentes al drop, con el objetivo de minimizar el efecto de la presión sobre su capacidad para rendir adecuadamente en la ejecución de los tiros libres, y lograr de esta manera un rendimiento más homogéneo en todos los jugadores del equipo en esta faceta del juego, durante el momento crítico del final de partido. ABSTRACT. The final minute of a close game in basketball is a critical moment which is subject to many factors that influence its development. Thus, the success rate in free-throws during that period will determine, in many cases, the outcome of the game. Decrease of performance (drop) in this facet of play under pressure conditions, may be related to studied own multiple sports context variables, such as the remaining seconds of possession, the situation in the score (to be winning, drawing, or losing) the location of the match (playing at home or away), the competition phase (regular season or playoffs) or team level (best/worst teams). In addition, the characteristics of the player are very important related to his age and years of experience to face the critical moments, as well as his playing position into team. In this sense, the combination of factors in context and player, allows interact about performance of shooter in the final moments of the game during his free-throw shooting. The aim of this present doctoral thesis was find the most related variables to player´s drop in free throws in the last minute of the game and the last row of free-throws in closed games of basketball. To achieve the objective of the study, 124 closed games (less or equal than 2 points difference) were analyzed in every copetition in ACB league (regular season, playoff and cup) from 2011-2012 to 2014-2015 seasons. To record the variables, the percentage of success of the shooter in regular season, full game, last minute, and last row were analyzed. This way, it is tried to analyze which player and context variables explain the free-throw performance in last minute and last row of the game. On the other hand, it is tried to determine the degree of association between decrease of performance (drop) of the player in the final moments, and studied player variables: playing position, age, and years of professional experience; while considered situational variables considered were: competition phase, location, classification, remaining time, and score-line. For data analysis were performed two statistical models: 1) A multiple linear regression model to determine the effect of the independent variables in the succsess percentage of shooter at the last minute, and in the last row of free-throws in the game; and 2) A binomial logistic regression analysis to analyze the relationship between the probability of a drop (lower performance) and the characteristics of the shooter and situational variables. The results of multiple linear regression model showed significant negative effects on the free-throw percentage during last minute, when shooters are centers (-19.45%). On the other hand, results in the last series showed the significant negative effect on the center position (-19.30%) and score-line (-3.33% for each point difference in the score) in the free-throw percentage. The independent variables age, professional experience, ranking in the regular season, competition phase, location, and remaining time, revealed no significant effects on linear regression models. The results of the binomial logistic regression showed that the variables professional experience between 13 and 18 years (OR = 4.63), playing forward (OR = 23.01) and playing guard (OR = 10.68) are related to reduce the probability to decrease the performance during the last minute of the game. While wining, increases it (OR = 0.06). Furthermore, the results of the last row showed a reduction in performance degradation when player is between 13 and 18 years of experience (OR = 4.28), and playing forward (OR = 8.06) or guard (OR = 6.34). By contrast, the variables related to the decrease in performance of the player are the knockout phases (OR = 0.22) and wining (OR = 0.04). The main results of the study showed that there is a decrease in performance of the player in the percentage of success in free-throws in the last minute and last row of the game, and it is significantly associated with age, professional experience, and player position. Finding relationship with the competition phase, during last row of free-throws of the game too. This information is a valuable information for the coach, for applying in real competitive environment. In this sense, create simulations in the section of practical applications allows to predict the success rate of free-throw of a player during the most pressing moments of the game, based on their performance profile. What can be used to take more appropriate decisions in order to achieve the best result. Similarly, guides the type of training process must be followed in relation to the most favorable players to drop, in order to minimize the effect of pressure on their ability to perform properly in the execution of the free-throws. And to achieve, in this way, a more consistent performance in all team players in this facet of the game, during the critical moment in the final of the game.

Análisis observacional de las acciones esgrimísticas en florete masculino y florete femenino en el Campeonato del Mundo de Budapest 2013

La esgrima ha pasado de ser un arte de guerra a un deporte olímpico. Durante todas las etapas de su evolución se han ido desarrollado la técnica y la táctica que nos encontramos en la actualidad en las competiciones deportivas. En los deportes de combate, entre los que se incluye la esgrima, existen numerosas formas de realizar los movimientos que dan lugar a los tocados. De forma ofensiva o defensiva, los movimientos realizados por los deportistas tienen un mismo objetivo: subir un punto en el marcador. En la revisión bibliográfica realizada durante este estudio, se pudo realizar una clasificación de dichas acciones según sean ofensivas, defensivas o contraofensivas. Además, se pudo comprobar la existencia de artículos relacionados con los tipos de acciones, el tiempo y el espacio, y la relación establecida entre estas variables.

Revisão taxonômica e filogenia da Seção Myzorhynchella de Anopheles (Nyssorhynchus) (Diptera: Culicidae)

Anopheles é o gênero da família Culicidae mais estudado devido sua importância médica. Atualmente o gênero Anopheles compreende 472 espécies válidas que estão divididas em sete subgêneros. Os principais vetores de plasmódio da Malária no Brasil pertencem ao subgênero Nyssorhynchus, que inclui 39 espécies oficialmente reconhecidas e um número crescente de complexos de espécies crípticas que estão distribuídas em três Seções: Myzorhynchella, Albimanus e Argyritarsis. Atualmente a Seção Myzorhynchella é formada por seis espécies: An. lutzii, An. parvus, An. nigritarsis, An. guarani, An. antunesi e An. pristinus. Para o desenvolvimento da análise morfológica, observou-se material-tipo depositado em diferentes coleções, espécimes depositados na coleção entomológica da FSP/USP, além de outros obtidos em coletas realizadas durante o presente estudo em diferentes localidades do Brasil. As análises moleculares foram desenvolvidas a partir de espécimes obtidos nas coletas. Revisão taxonômica da Seção Myzorhynchella é apresentada, incluindo-se descrições de quatro novas espécies e redescrições das demais, informações sobre bionomia, importância médica, caracterização molecular, distribuição geográfica, estado de preservação do material-tipo, além de chaves de identificação de adultos, larva de quarto estádio e genitália masculina. Os resultados das análises filogenéticas utilizando sequências de ITS2, COI e Catalase indicam a existência de pelo menos doze espécies dentro da Seção Myzorhynchella, os espécimes que vêm sendo identificados como An. antunesi constitui um complexo formado por possíveis cinco espécies e aqueles de An. parvus e An. pristinus também podem representar complexos de espécies. As sequências de ITS2 podem ser utilizadas como marcador diagnóstico para espécies da Seção Myzorhynchella. Contudo, o estudo ainda demonstra que pouco se conhece sobre a diversidade de espécies de Anopheles que ocorrem em ambientes onde a malária ocorre em baixa endemicidade. Pelo número de espécies novas encontradas e pela escassez de trabalhos com espécies da Seção, fica evidente a necessidade de mais estudos.