A study on the phylogeny and the ecology of ammonia-oxidizing bacteria using a new molecular marker based on the gene amoB

L'agricultura i la industrialització han causat un augment significatiu del nombre d'ambients rics en amoni. La presència de compostos nitrogenats redueix la qualitat de l'aigua, causant problemes de toxicitat, deteriorant el medi ambient i fins i tot afectant la salut humana. En conseqüència, la nitrificació s'ha convertit en un procés global que afecta al cicle del nitrogen a la biosfera. Els bacteris oxidadors d'amoni (AOB) són els responsables de l'oxidació de l'amoni a nitrit, i juguen un paper essencial en el cicle del nitrogen. Els primers oxidadors d'amoni foren aïllats a finals del segle XIX, però la lentitud del seu creixement i les dificultats per cultivar-los feren que fins als anys 80, amb els primers estudis emprant el gen 16SrDNA, no s'assolís un coneixement complert d'aquest grup bacterià. Actualment les bases de dades contenen multitud d'entrades amb seqüències corresponents a AOB. L'objectiu d'aquest treball era trobar, desenvolupar i avaluar eines útils i fiables per a l'estudi dels AOB en mostres ambientals. En aquest treball primer descrivim la utilització de la hibridació in situ amb fluorescència (FISH), mitjançant l'aplicació de sondes amb diana en el 16SrRNA dels AOB. La FISH ens va permetre detectar i recomptar aquest grup bacterià; no obstant, aquest mètode no permetia la detecció de noves seqüències, pel que es necessitava una nova eina. Amb aquesta intenció vam aplicar la seqüència de la sonda Nso1225 en una PCR. El fet d'amplificar específicament un fragment del 16SrDNA dels AOB va suposar el desenvolupament d'una nova eina molecular que permetia detectar la presència i diversitat d'aquests bacteris en ambients naturals. Malgrat tot, algunes seqüències pertanyents a bacteris no oxidadors d'amoni del subgrup β dels proteobacteris, eren també obtingudes amb aquesta tècnica. Així mateix, un dels inconvenients de l'ús del 16SrDNA com a marcador és la impossibilitat de detectar simultàniament els AOB que pertanyen als subgrups β i γ dels proteobacteris. El gen amoA, que codifica per la subunitat A de l'enzim amoni monooxigenasa (AMO), era aleshores àmpliament utilitzat com a marcador per a la detecció dels AOB. En aquest treball també descrivim la utilització d'aquest marcador en mostres procedents d'un reactor SBR. Aquest marcador ens va permetre identificar seqüències de AOB en la mostra, però la necessitat de detectar amoA mitjançant clonatge fa que l'ús d'aquest marcador requereixi massa temps per a la seva utilització com a eina en estudis d'ecologia microbiana amb moltes mostres. Per altra banda, alguns autors han assenyalat l'obtenció de seqüències de no AOB en utilitzar amoA en un protocol de PCR-DGGE. Amb la finalitat d'obtenir una eina ràpida i rigorosa per detectar i identificar els AOB, vam desenvolupar un joc nou d'oligonucleòtids amb diana en el gen amoB, que codifica per a la subunitat transmembrana de l'enzim AMO. Aquest gen ha demostrat ser un bon marcador molecular pels AOB, oferint, sense tenir en compte afiliacions filogenètiques, una elevada especificitat, sensibilitat i fiabilitat. En aquest treball també presentem una anàlisi de RT-PCR basada en la detecció del gen amoB per a la quantificació del gènere Nitrosococcus. El nou joc d'oligonucleòtids dissenyat permet una enumeració altament específica i sensible de tots els γ-Nitrosococcus coneguts. Finalment, vam realitzar un estudi poligènic, comparant i avaluant els marcadors amoA, amoB i 16SrDNA, i vàrem construir un arbre filogenètic combinat. Com a resultat concloem que amoB és un marcador adequat per a la detecció i identificació dels AOB en mostres ambientals, proporcionant alhora agrupacions consistents en fer inferències filogenètiques. Per altra banda, la seqüència sencera del gen 16S rDNA és indicada com a marcador en estudis amb finalitats taxonòmiques i filogenètiques en treballar amb cultius purs de AOB.

Availability and use of organic matter in stream ecosystems: the role of biofilms

La comunitat bentònica dels ecosistemes fluvials processa una gran quantitat de la matèria orgànica que arriba als rius. L'origen de les entrades de material (autòctones o al·lòctones), la seva composició química i la seva quantitat (freqüència de les entrades i concentració assolida en el riu), determinen l'estructura de la comunitat bentònica autotròfica i heterotròfica, les seves relacions tròfiques i les seves interaccions potencials (competència, sinergisme). L'objectiu d'aquesta tesi és posar de manifest la utilització de la matèria orgànica dissolta (MOD) per part dels biofilms bacterians bentònics fluvials i determinar l'eficiència del sistema fluvial en l'ús dels diferents materials que hi circulen. Amb aquesta finalitat s'han portat a terme diversos experiments, tant de camp com de laboratori, per tal de conèixer els efectes de la disponibilitat de la matèria orgànica (quantitat) i la seva qualitat (composició química i biodegradabilitat) i els efectes deguts a l'augment de temperatura de l'aigua del riu.

Contribution of antioxidant enzymes to toxicity assessment in fluvial biofilms

Per tal d’avaluar l’impacte de la contaminació en els ecosistemes aquàtics, aquesta tesi es centra en una aproximació multi-biomarcador en els biofilms. En complement dels biomarcadors clàssics, es va demostrar que les activitats dels enzims antioxidants (AEA): catalasa, ascorbat peroxidasa i glutatió reductasa eren biomarcardors d'estrès oxidatiu en els biofilms. Tot i que les AEA poden veure's influenciades amb la mateixa mesura per factors naturals (edat del biofilm, llum de colonització o d'exposició) i contaminants (herbicides i farmacèutics), aquestes AEA permeten entendre millor l'efecte dels contaminants. Cal remarcar que assajos de toxicitat aguda es poden utilitzar per comparar la capacitat antioxidant entre comunitats i conèixer la seva pre-exposició a l'estrès oxidatiu. Aquesta aproximació multi-biomarcador a nivell de comunitat és especialment interessant per avaluar la toxicitat dels contaminants emergents (β-blockers) sobre espècies no-diana. Per tal de millorar-la, també es va verificar la possibilitat de mesurar l'expressió gènica en biofilms.

Distributional patterns of diatom communities in Mediterranean rivers

Aquesta tesi tracta la jerarquia i l'heterogeneïtat dels sistemes fluvials que afecten l'estructura de les comunitats bentòniques de diatomees. A nivell regional, es van buscar diferents grups de punts i les seves espècies indicadores, es va estudiar la resposta de les comunitats de diatomees als gradients ambientals, es va avaluar la utilitat de diferents índexs de diatomees i es va buscar el millor sistema de classificació per a condicions de referència. A nivell de conca, es volien definir els factors que determinen la distribució longitudinal de la diversitat de les comunitats de diatomees. Finalment, a nivell d'hàbitat es van determinar quins factors afecten les algues i els cianobacteris a aquesta escala i es va examinar la contribució relativa de l'ambient i l'espai en la distribució de la biomassa i composició d'algues i cianobacteris. Per tant, els diferents capítols d'aquesta tesi han estat desenvolupats seguint aquest esquema.

Ecological interactions between an invasive fish (Gambusia holbrooki) and native cyprinodonts: the role of salinity

Actualment una de les principals amenaces a la biodiversitat és la introducció d'espècies. Revisant 26 variables de les 69 espècies de peixos continental de la Península Ibèrica concloem que la filogènia, variabilitat i els usos de l'home són necessaris per entendre millor les diferències entres les espècies natives i invasores. Entre les especies més afectades per la introducció de peixos es troben els ciprinodontiformes endèmics del Mediterrani. Aportem les primers dades sobre l'ús d'hàbitats ocasionalment inundats i la selecció de preses del fartet (Aphanius iberus), observant un canvi ontogenètic, clarament relacionat amb el microhàbitat. També demostrem que la salinitat influeix en l'èxit invasor de la gamúsia, afectant la seva densitat i biologia reproductiva. Per altra banda, demostrem experimentalment que amb l'increment de salinitat la gambúsia disminueix la seva agressivitat i captura menys preses, reduint la seva eficàcia competitiva respecte dels ciprinodonts natius.

Ecology of an invasive fish (Silurus glanis) in Catalan reservoirs

L'objectiu d'aquesta tesi és aportar les primeres dades sobre l'ecologia del silur (Silurus glanis) introduït a la Península Ibèrica i estimar els seu impacte ecològic sobre la biota nativa. Es van mostrejar les comunitats de peixos de 14 embassaments catalans. El silur es troba actualment introduït a quatre conques Ibèriques: a la de l'Ebre fa uns 30 anys, a les del Ter i Tajo fa uns pocs anys i recentment al Llobregat. Hem demostrat la utilitat de comparar estadis d'invasió recents i avançats per mirar d'entendre els canvis ecològics causats per espècies invasores: les introduccions recents presenten silurs més joves, de menor mida i amb taxes de creixement superiors a les de les poblacions introduïdes anteriorment i també respecte les poblacions natives; a més, depreden majoritàriament sobre peixos, en contra de les poblacions més antigues que s'alimenten sobretot de cranc. Finalment, aportem les primeres dades publicades de telemetria del silur.

Effects of priority and emerging pollutants on river biofilms

L'activitat humana representa una de les majors causes d'entrada d'una gran varietat de substàncies en els ecosistemes fluvials. L'objectiu principal d'aquest treball es investigar els efectes que els tòxics orgànics poden exercir en els biofilms fluvials. El riu Llobregat ha estat sotmès a fortes pressions, fet que l'ha portat a uns nivells molt elevats de contaminació. En aquest estudi s'ha observat una influència dels plaguicides presents al riu en la distribució de la comunitat de diatomees, així com efectes en el biofilm a nivell funcional i estructural. Experiments amb canals experimentals han mostrat que l'herbicida diuron i el bactericida triclosan poden ocasionar una cadena d'efectes en els biofilms, incloent efectes directes i també efectes indirectes en les relacions entre els components del biofilm. Experiments amb cultius algals han mostrat que aquests tòxics, aplicats en barreja, poden tenir una major toxicitat de la prevista pels models, resultant en efectes sinèrgics.

Fate and effects of copper in fluvial ecosystems: the role of periphyton

L'activitat humana és una de les majors causes d'elevades concentracions de nutrients i substàncies tòxiques en els ecosistemes fluvials. Entre la gran varietat de factors que alteren aquests ecosistemes, l'eutrofització i la contaminació per metalls pesants són dos dels principals problemes ambientals en països desenvolupats. Els biofilms fluvials (també anomenats comunitats perifítiques) representen una eina valuosa per avaluar els efectes dels contaminants (ex. nutrients i metalls) en els ecosistemes aquàtics. Aquest treball pretén investigar el destí i els efectes del Cu en els ecosistemes fluvials centrant-se en les comunitats perifítiques. Diferents metodologies han estat desenvolupades i/o adaptades per investigar específicament la dinàmica del Cu, la seva toxicitat i bioacumulació en comunitats perifítiques naturals, i la interacció entre l'eutrofització i la toxicitat del Cu en aquests ecosistemes.

Food webs of Mediterranean coastal wetlands

En aquesta tesi doctoral s'han estudiat els efectes directes i indirectes de dos tipus d'espècies claus de la comunitat aquàtica dels aiguamolls de l'Empordà (aiguamolls costaners mediterranis amb una xarxa tròfica senzilla). S'han realitzat experiments al camp utilitzant microcosmos i mesocosmos i els resultats han estat analitzats mitjançant tres aproximacions: la taxonòmica, la funcional i la de mides. S'ha comprovat que en situacions amb absència de predadors i dominància d'una única espècie en el zooplàncton (en aquest cas Calanipeda aquaedulcis i Daphnia magna), la segregació del recurs entre els diferents estadis de desenvolupament de la mateixa espècie zooplanctònica és una estratègia per evitar la competència intraespecífica en condicions de limitació de recurs. Per altra banda, la presència de diferents top-predators a la comunitat aquàtica (en aquest cas la medusa Odessia maeotica i el peix Aphanius iberus) desencadena una cascada tròfica en el plàncton però amb efectes top-down diferents segons el top-predator.

Impact of chlorophenols and heavy metals on soil microbiota: their effects on activity and community composition, and resistant strains with potential for bioremetiation

Pollution by toxic compounds is one of the most relevant environmental damages to ecosystems produced by human activity and, therefore, it must be considered in environmental protection and restoration of contaminated sites. According to this purposes, the main goal of this doctoral thesis has been to analyse the impact of several chlorophenols and heavy metals on the microbial communities of two typical Mediterranean soils. The ecological risk concentrations of each pollutant, which have been determined according to respirometric activity and changes in the microbial community composition, and the factors that influence on their effective toxic concentrations (bioavailable pollutants) have been analysed in order to predict their potential impact on different soil ecosystems and provide scientific data for the regulation of the soil protection policies. Moreover, resistant microorganisms with pollutant removal capacities have been isolated from artificially contaminated soil microcosms and tested in axenic cultures, to infer their potential usefulness for bioremediation.

Limnological characteristics and zooplankton community structure of Mediterranean coastal lagoons undergoing restoration

Entre 1999 i 2003 es va desenvolupar un projecte Life de restauració a la maresma de La Pletera, afectada per un pla urbanització, i a la llacuna del Ter Vell, amb un elevat grau d'eutròfia (aiguamolls del Baix Ter, NE Península Ibèrica). L'objectiu d'aquesta tesi és establir el funcionament d'ambdós ecosistemes, analitzar-ne la problemàtica ambiental i avaluar els efectes de la restauració. A la maresma de la Pletera, es va analitzar el paper de la hidrologia en la composició i dinàmica dels nutrients i del zooplàncton en cinc llacunes, tres de les quals havien estat creades dins el projecte de restauració com a nous refugis per una espècie de peix amenaçada (Aphanius iberus). La hidrologia es va caracteritzar per un llarg període de confinament sense entrades d'aigua, interromput de manera irregular per inundacions puntuals. La dinàmica del nitrogen inorgànic es va relacionar amb les entrades d'aigua, mentre que la del fòsfor, del nitrogen total i de la matèria orgànica es va relacionar amb els processos d'acumulació i reciclatge intern durant el confinament. El zooplàncton es va analitzar mitjançant la combinació d'aproximacions taxonòmiques i de mides. L'estructura de mides de la comunitat es va veure més afectada per les interaccions tròfiques (depredació i competència) mentre que l'estructura taxonòmica va ser més sensible a factors abiòtics (nutrients). El ràpid creixement de la població A. iberus en les noves llacunes va suggerir que aquestes havien proporcionat l'hàbitat adequat per a l'espècie, almenys a curt termini. Les actuacions de restauració a la llacuna del Ter Vell es van centrar en la millora de la qualitat de l'aigua mitjançant (1) la construcció d'uns aiguamolls per depurar l'aigua d'entrada i (2) el dragat del sediment en diversos punts. Simultàniament a la restauració, però de forma independent, la gestió agrícola de l'aigua va reduir dràsticament el cabal d'entrada d'aigua dolça a la llacuna, provocant un canvi en el règim hídric. Es van analitzar els efectes a curt termini d'aquest canvi sobre la limnologia i el zooplàncton de la llacuna. Abans del canvi, la hidrologia era artificial ja que s'havia prolongat l'entrada d'aigua dolça d'acord amb la demanda agrícola, i per tant la llacuna presentava una elevada taxa de renovació de l'aigua i majors concentracions de nutrients. Després del canvi, la hidrologia va dependre més del clima, es van reduir les entrades d'aigua i es va allargar el període de confinament. La composició y dinàmica dels nutrients va tendir a assemblar-se a l'observada a les llacunes de la maresma, mentre que la comunitat del zooplàncton no ho va fer. L'estat ecològic de la llacuna va millorar després del canvi en el règim hídric.

Nitrifying and denitrifying bacterial communities in the sediment and rhizosphere of a free water surface constructed wetland

La contínua descàrrega de nutrients, sobretot fosfats i nitrogen, és la major causa d'eutrofització dels ecosistemes aquàtics. Els sistemes de tractament basats en aiguamolls construïts s'han emprat per reduir ells nivells de nitrogen a l'aigua com a alternativa de baix cost als mètodes de depuració convencionals. L'eliminació del nitrogen a aquests sistemes depèn en bona part de la vegetació, i l'alternança de condicions aeròbiques i anaeròbiques per promoure els processos de nitrificació i desnitrificació. En aquest treball hem volgut investigar les activitats microbianes de nitrificació i desnitrificació en relació a dues espècies de plantes macròfites en un sistema d'aiguamolls de tractament de flux superficial (FS-SAC), dissenyat per minimitzar l'impacte de l'alliberament d'aigua carregada de nutrients a la reserva natural dels Aiguamolls de l'Empordà (Girona, Espanya).

Phytoplankton dynamic in permanent and temporary waters of Empordà Salt marshes (NE Spain)

Se ha estudiado la dinámica del fitoplancton en las lagunas costeras de Aiguamolls de l'Empordà. El fitoplancton esta sujeto principalmente al control "bottom-up", la variabilidad hidrológica y la disponibilidad de nutrientes tienen una mayor influencia en la composición y distribución de tamaños del fitoplancton, que el zooplancton. La concentración de materia orgánica disuelta es el factor ambiental más correlacionado con el crecimiento de la biomasa fitoplanctónica. Dada la proximidad entre las lagunas costeras y el mar, donde la ocurrencia de Proliferaciones de Algas Nocivas es cada vez más frecuente, se realizan un inventario general de las especies más abundantes del fitoplancton y se llevan a cabo análisis extensivos de la toxicidad. La mayoría de especies de dinoflagelados encontradas son potencialmente nocivas. Hay pocas especies en común entre el mar y las lagunas, sin embargo, existen especies productoras de PANs características de los ambientes lagunares.

Primary succession in man-made wetlands: biodiversity, structure and dynamics of macrofaunal assemblages

Man-made wetlands are often created to compensate for the loss or degradation of natural wetlands, but little is known about the processes taking place in these artificial environments, especially at the community level. Throughout this thesis, we have assessed the phenomena of primary succession over different time (short-, mid- and long-term) and spatial scales (local, regional, interregional levels), applying different approaches (taxonomic and functional) and subject groups (invertebrates and amphibians). Our main findings regarding time scales show a 3-phase successional pattern in Mediterranean man-made wetlands’ communities, where at the short term (1 year) colonization processes dominate; at mid term perspectives (2 to 7 years) succession signs begin to be conspicuous, and later on (≥ 10 years) parameters such as species richness reach an asymptote. At that moment, some biological strategies dominate, and biodiversity surrogates indicate that communities are indistinct between man-made and natural wetlands. Regarding spatial effects, we corroborated that both local and regional factors affect the establishing communities. Particularly, the low hydrological stability of the Mediterranean region has enhanced biological traits favoring resilience and resistance to disturbances when comparing Mediterranean and cold temperate aquatic communities. Even within the Mediterranean region, low levels of hydrological stability have significant effects on the successional dynamics. In these cases, local communities are highly nested within regional natural ones, and so are not able to make net contributions to regional richness. We also showed the influence of the regional pool of recruiters over local communities, both in the case of invertebrates and amphibians. Especially for the latter group, man-made Mediterranean temporary ponds (MTPs) can play an important role in their conservation.

The role of fungi and bacteria on the organic matter decomposition process in streams: interaction and relevance in biofilms

L'objectiu d'aquest estudi és el d'investigar sobre l'ús de matèria orgànica per part dels fongs i bacteris que colonitzen diferents substrats bentònics en rius Mediterranis i analitzar l'efecte dels factors ambientals i antròpics sobre l'estabilitat estructural i funcional de les comunitats del biofilm. La metodologia emprada en aquest estudi consisteix en: i) anàlisi de la biomassa bacteriana i fúngica, ii) anàlisi de la composició de les comunitats bentòniques (identificació d'hifomicets aquàtics i anàlisi del 16S rDNA bacterià), i iii) anàlisi de l'activitat enzimàtica extracel·lular relacionada amb el reciclatge de matèria orgànica en rius.