Isufficienza Placentare nella Specie Equina

Lo sviluppo e la funzionalità della placenta influenzano direttamente la crescita ed il benessere del feto all'interno dell'utero, quindi qualsiasi problema strutturale o funzionale della placenta influenzerà lo sviluppo del feto. Lo scopo di questa tesi è stato quello di approfondire diversi aspetti clinici e clinico-patologici dell’insufficienza placentare nella specie equina, con l’intento di individuare dei parametri che possano essere di ausilio per l’identificazione precoce del puledro a rischio e della necessità di interventi terapeutici. La valutazione della concentrazione di lattato nel sangue e nel liquido amniotico potrebbe essere un utile strumento diagnostico per la diagnosi di acidosi metabolica associata ad ipossia/ischemia nel puledro e per identificare la necessità di un intervento precoce alla nascita. La risposta all’ipossia sembra essere mediata dall’HIF-1 e dall’HSF-1 anche nel puledro neonato, e se questi dati venissero confermati su un numero maggiore di animali, i due marcatori proteici e la MDA potrebbero essere utilizzati per la diagnosi di PAS nel puledro. L’esame di tutta l’unità placentare riveste un ruolo di fondamentale importanza per l’acquisizione di informazioni riguardo all’ambiente di vita intrauterino del puledro, ed è quindi auspicabile nella pratica ostetrica routinaria una maggiore attenzione all’esame della placenta, soprattutto in caso di patologie materno-fetali. Tra i parametri biochimici valutati al momento della nascita, la creatininemia e la glicemia possono fornire informazioni sull’efficienza dello scambio placentare ed essere quindi utilizzati per individuare puledri a rischio. Infine, lo sviluppo di una macro per il software ImageJ porta alla luce uno strumento nuovo, semplice da usare ed economico, per la valutazione morfometrica dell’arborizzazione dei villi placentari; tuttavia la ricerca necessità ulteriori indagini su un numero maggiore di animali per valutare le differenze morfometriche tra placente normali e patologiche.

Adipose-derived stem cells and tissue revascularization: enhancing islet survival and performance for diabetes care.

Pancreatic islet transplantation represents a fascinating procedure that, at the moment, can be considered as alternative to standard insulin treatment or pancreas transplantation only for selected categories of patients with type 1 diabetes mellitus. Among the factors responsible for leading to poor islet engraftment, hypoxia plays an important role. Mesenchymal stem cells (MSCs) were recently used in animal models of islet transplantation not only to reduce allograft rejection, but also to promote revascularization. Currently adipose tissue represents a novel and good source of MSCs. Moreover, the capability of adipose-derived stem cells (ASCs) to improve islet graft revascularization was recently reported after hybrid transplantation in mice. Within this context, we have previously shown that hyaluronan esters of butyric and retinoic acids can significantly enhance the rescuing potential of human MSCs. Here we evaluated whether ex vivo preconditioning of human ASCs (hASCs) with a mixture of hyaluronic (HA), butyric (BU), and retinoic (RA) acids may result in optimization of graft revascularization after islet/stem cell intrahepatic cotransplantation in syngeneic diabetic rats. We demonstrated that hASCs exposed to the mixture of molecules are able to increase the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF), as well as the transcription of angiogenic genes, including VEGF, KDR (kinase insert domain receptor), and hepatocyte growth factor (HGF). Rats transplanted with islets cocultured with preconditioned hASCs exhibited a better glycemic control than rats transplanted with an equal volume of islets and control hASCs. Cotransplantation with preconditioned hASCs was also associated with enhanced islet revascularization in vivo, as highlighted by graft morphological analysis. The observed increase in islet graft revascularization and function suggests that our method of stem cell preconditioning may represent a novel strategy to remarkably improve the efficacy of islets-hMSCs cotransplantation.

HIF1α regulates Mitochondrial biogenesis and Cellular senescence induced by Gamma Radiation

Cellular response to γ-rays is mediated by ATM-p53 axis. When p53 is phosphorylated, it can transactivate several genes to induce permanent cell cycle arrest (senescence) or apoptosis. Epithelial and mesenchymal cells are more resistant to radiation-induced apoptosis and respond mainly by activating senescence. Hence, tumor cells in a senescent state might remain as “dormant” malignant in fact through disruption of p53 function, cells may overcome growth arrest. Oncocytic features were acquired in the recurring neoplasia after radiation therapy in patient with colonrectal cancer. Oncocytic tumors are characterized by aberrant biogenesis and are mainly non-aggressive neoplasms. Their low proliferation degree can be explained by chronic destabilization of HIF1α, which presides to adaptation to hypoxia and also plays a pivotal role in hypoxia-related radio-resistance. The aim of the present thesis was to verify whether mitochondrial biogenesis can be induced following radiation treatment, in relation of HIF1α status and whether is predictive of a senescence response. In this study was demonstrate that mitochondrial biogenesis parameters like mitochondrial DNA copy number could be used for the prediction of hypoxic status of tissue after radiation treatment. γ-rays induce an increase of mitochondrial mass and function, in response to a genotoxic stress that pushes cells into senescence. Mitochondrial biogenesis is only indirectly regulated by p53, whose activation triggers a MDM2-mediated HIF1α degradation, leading to the release of PGC-1β inhibition by HIF1α. On the other hand, this protein blunts the mitochondrial response to γ-rays as well as the induction of p21-mediated cell senescence, indicating prevalence of the hypoxic over the genotoxic response. Finally in vivo, post-radiotherapy mtDNA copy number increase well correlates with lack of HIF1α increase in the tissue, concluding this may be a useful molecular tool to infer the trigger of a hypoxic response during radiotherapy, which may lead to failure of activation of senescence.

Effects of metal-induced oxidative stress on endothelial cells in vitro

Aseptic loosening of metal implants is mainly attributed to the formation of metal degradation products. These include particulate debris and corrosion products, such as metal ions (anodic half-reaction) and ROS (cathodic half-reaction). While numerous clinical studies describe various adverse effects of metal degradation products, detailed knowledge of metal-induced cellular reactions, which might be important for possible therapeutic intervention, is not comprehensive. Since endothelial cells are involved in inflammation and angiogenesis, two processes which are critical for wound healing and integration of metal implants, the effects of different metal alloys and their degradation products on these cells were investigated. Endothelial cells on Ti6Al4V alloy showed signs of oxidative stress, which was similar to the response of endothelial cells to cathodic partial reaction of corrosion induced directly on Ti6Al4V surfaces. Furthermore, oxidative stress on Ti6Al4V alloy reduced the pro-inflammatory stimulation of endothelial cells by TNF-α and LPS. Oxidative stress and other stress-related responses were observed in endothelial cells in contact with Co28Cr6Mo alloy. Importantly, these features could be reduced by coating Co28Cr6Mo with a TiO2 layer, thus favouring the use of such surface modification in the development of medical devices for orthopaedic surgery. The reaction of endothelial cells to Co28Cr6Mo alloy was partially similar to the effects exerted by Co2+, which is known to be released from metal implants. Co2+ also induced ROS formation and DNA damage in endothelial cells. This correlated with p53 and p21 up-regulation, indicating the possibility of cell cycle arrest. Since CoCl2 is used as an hypoxia-mimicking agent, HIF-1α-dependence of cellular responses to Co2+ was studied in comparison to anoxia-induced effects. Although important HIF-1α-dependent genes were identified, a more detailed analysis of microarray data will be required to provide additional information about the mechanisms of Co2+ action. All these reactions of endothelial cells to metal degradation products might play their role in the complex processes taking place in the body following metal device implantation. In the worst case this can lead to aseptic loosening of the implant and requirement for revision surgery. Knowledge of molecular mechanisms of metal-induced responses will hopefully provide the possibility to interfere with undesirable processes at the implant/tissue interface, thus extending the life-time of the implant and the overall success of metal implant applications.

Untersuchungen zur Expression und Lokalisation der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Säugern

Die vorliegende Dissertation beinhaltet Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Nbg) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten. rnrnUm die Expression der Globine während der Entwicklung des Säugerhirns zu untersuchen, wurden die Hirne von Maus-Embryonen ab dem Fötalstadium MF10 bis zum Tag eins nach der Geburt (T1) mit Adulttieren verglichen. Quantifiziert wurde sowohl die mRNA- als auch die Protein-Expression. Beide Globine zeigten im Verlauf der Entwicklung einen stetigen Anstieg der mRNA-Expression, wobei Ngb zu Beginn in zehnfach höherer Konzentration vorlag und im zeitlichen Verlauf einen 130-fachen Anstieg zeigte. Cygb zeigte lediglich einen 16-fachen Anstieg bis zum Adultstadium. Auf Proteinebene konnte die Expressionszunahme beider Globine im Laufe der Entwicklung bestätigt werden. Weder in den hypoxieresistenten Frühembryonalstadien noch während der mit Sauerstoff-Stress verbundenen Geburt zeigte sich ein Expressionsmaximum. Dies spricht gegen eine Globin-Funktion in der Oxidanz-Abwehr. Eher ist zumindest Ngb mit der Reifung der Neurone und dem damit einhergehenden, gesteigerten oxidativen Stoffwechsel assoziiert.rnrnDes Weiteren sollte die zelluläre und intrazelluläre Lokalisation beider Globine anhand einer primären Zellkultur aus dem Hippocampus pränataler Ratten und in immortalen Zelllinien untersucht werden. Neuroglobin wurde dabei nur in Neuronen, nicht jedoch in Gliazellen nachgewiesen. Das Färbemuster war in allen Ngb-exprimierenden Zellen zytoplasmatisch. Cytoglobin wurde in der Primärkultur in den Neuronen jedoch ebenso in den mit anti-GFAP markierten Gliazellen beobachtet. In beiden Zellpopulationen war auch der Kern durch das CyGB-Antiserum markiert. rnEine genauere Untersuchung der intrazellulären Lokalisation sollte durch die Transfektion von Globin-pEGFP-Fusionsproteinen erfolgen. Nach Transfektion der Fusionskonstrukte wurde die GFP-Färbung bei beiden Globinen sowohl im Zytoplasma als auch im Kern beobachtet. Eine rein nukleäre Lokalisation, die insbesondere für Cygb von anderen Autoren postuliert wurde, konnte somit ausgeschlossen werden. rnrnIn primären Zellkulturen aus Cerebellum und Kortex, die mit Hilfe von Paraquat oxidativem Stress ausgesetzt wurden, wurde der Verlauf der Globin-mRNA-Expression mit dem unregulierten 18s rRNA-Referenzgen und mit den Antioxidanz-Enzymen Cu-Zn-SOD und Gpx verglichen. Neuroglobin zeigte einen Expressionsverlauf ähnlich dem der beiden Antioxidanz-Enzyme, jedoch liegt seine mRNA im Hirngewebe in hundertfach niedrigerer Menge als Cu-Zn-SOD und Gpx vor. Cytoglobin zeigte keine Veränderung der Expression. Eine Funktion der Globine im Sinne einer ROS-Abwehr kann aus den Befunden nicht abgeleitet werden. rnrnUntersuchungen von Tumor und Normalgewebe mittels eines cDNA-Cancer-Arrays zeigten, dass NGB in Tumoren verschiedenen Ursprungs nicht exprimiert wird, CyGB dagegen keine Änderung seiner Expression in Tumor versus Normalgewebe erfährt. Eine Induktion der beiden Globine z.B. durch Hypoxie in soliden Tumoren kann daher ausgeschlossen werden.rn

Ruolo delle alterazioni mitocondriali indotte dall'ipossia nella patogenesi della malattia di alzheimer

Le alterazioni della funzionalità mitocondriale detengono un ruolo cruciale nella patogenesi della malattia di Alzheimer (AD), sostenendo il processo neurodegenerativo attraverso meccanismi quali la riduzione della disponibilità energetica e la iperproduzione di ROS. Alle numerose ipotesi di patogenesi dell’AD, si è recentemente affiancata la cosiddetta ipotesi vascolare. Nei soggetti AD è stata riscontrata una significativa riduzione della disponibilità di ossigeno a livello neuronale (ipossia neuronale). Da numerosi studi è poi emerso che l’ipossia gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo dell’AD contribuendo a più vie patogenetiche contemporaneamente. Tuttavia, non sono stati ancora chiariti tutti i meccanismi attraverso cui l’ipossia esplica la sua azione di danno. Lo scopo di questo studio è stato quello di contribuire a chiarire il ruolo patologico dell’ipossia nell’AD, analizzando principalmente le alterazioni della funzionalità mitocondriale indotte dalla riduzione della disponibilità di ossigeno. Nella prima fase dello studio cellule PC12 sono state coltivate in presenza di β-amiloide e ipossia. In questo modello abbiamo osservato un potenziamento dei fenomeni di deplezione dell’ATP e di generazione delle ROS indotti dalla Aβ quando anche l’ipossia era presente come fonte di danno cellulare, ipotizzando per i due fattori un effetto congiunto di tipo additivo. Nella seconda fase abbiamo esposto all’ipossia fibroblasti prelevati da pazienti AD portatori di mutazioni a carico dei geni APP e PSEN. La presenza di mutazioni predisponenti ad un fenotipo AD era in grado di determinare un danno bioenergetico e ossidativo. Le alterazioni bioenergetiche riscontrate in normossia risultavano ulteriormente potenziate quando i fibroblasti erano coltivati in ipossia, mentre lo stato di stress ossidativo veniva evidenziato solo in condizioni ipossiche. Sulla base dei risultati finora conseguiti si può ipotizzare che uno dei meccanismi attraverso cui l’ipossia esplica la sua azione di danno nella AD, possa essere dovuto alla capacità di potenziare ulteriormente le alterazioni della funzionalità mitocondriale.

Sindrome da Asfissia Perinatale nel puledro neonato: protocolli diagnostico-terapeutici

La Sindrome da Asfissia Perinatale (PAS) è una delle più comuni patologie che colpiscono il puledro neonato nelle prime 72 h di vita. È una patologia difficile da diagnosticare in quanto non esistono parametri o segni clinici specifici, la sintomatologia è molto variabile in base alla durata e all’intensità dell’insulto ipossico ischemico e al tipo di organo maggiormente colpito. Lo scopo di questo studio è la ricerca e la valutazione di alcuni parametri biochimico-clinici e di alcuni biomarkers per la diagnosi precoce e il corretto trattamento dei puledri affetti da PAS. Nei puledri neonati che presentano questa patologia è stata riscontrata un’ipermagnesiemia al momento del ricovero associata a prognosi infausta, probabilmente causata da un grave danno cellulare con rilascio in circolo del magnesio intracellulare. La PAS potrebbe essere un’ulteriore causa di Euthyroid Sick Syndrome, in quanto abbiamo riscontrato una diminuzione delle concentrazioni di T3 e T4 nei puledri malati rispetto ai sani della stessa età, come avviene in altre malattie sistemiche. Lo studio del profilo proteomico ha permesso di separare le più importanti frazioni proteiche del liquido amniotico di cavalla, mettendo in evidenza similitudini e differenze qualitative e quantitative nei ferogrammi dei puledri sani e di quelli affetti da PAS ed una maggiore variabilità è stata riscontrata nei profili dei liquidi amniotici dei puledri malati. Il glutatione è risultato poco espresso nel puledro neonato, i puledri sani presentano concentrazioni più basse sia rispetto ai malati della stessa età sia agli adulti ma con una tendenza all’aumento nelle prime 24 ore di vita per i sani ed un calo nei malati. La somministrazione della terapia antiradicalica non influisce sulle concentrazioni di glutatione totale ed i puledri deceduti presentano concentrazioni più alte.

Study of novel natural compounds as potential drugs in the treatment of acute leukemias

Introduction: Among all cancer types leukemia represents the leading cause of cancer death in man younger than 40 years. Single-target drug therapy has generally been highly ineffective in treating complex diseases such as cancer. A growing interest has been directed toward multi-target drugs able to hit multiple targets. In this context, plant products, based on their intrinsic complexity, could represent an interesting and promising approach. Aim of the research followed during my PhD was to indentify and study novel natural compounds for the treatment of acute leukemias. Two potential multi-target drugs were identified in Hemidesmus indicus and piperlongumine. Methodology/Principal Findings: A variety of cellular assays and flow cytometry were performed on different cell lines. We demonstrated that Hemidesmus modulates many components of intracellular signaling pathways involved in cell viability and proliferation and alters gene and protein expression, eventually leading to tumor cell death, mediated by a loss of mitochondrial transmembrane potential, raise of [Ca2+]i, inhibition of Mcl-1, increasing Bax/Bcl-2 ratio, and ROS formation. Moreover, we proved that the decoction causes differentiation of HL-60 and regulates angiogenesis of HUVECs in hypoxia and normoxia, by the inhibition of new vessel formation and the processes of migration/invasion. Clinically relevant observations are that its cytotoxic activity was also recorded in primary cells from acute myeloid leukemia (AML) patients. Moreover, both Hemidesmus and piperlongumine showed a selective action toward leukemic stem cell (LSC). Conclusions: Our results indicate the molecular basis of the anti-leukemic effects of Hemidesmus indicus and indentify the mitochondrial pathways, [Ca2+]i, cytodifferentiation and angiogenesis inhibition as crucial actors in its anticancer activity. The ability to selectively hit LSC showed by Hemidesmus and piperlongumine enriched the knowledge of their anti-leukemic activity. On these bases, we conclude that Hemidesmus and piperlongumine can represent a valuable strategy in the anticancer pharmacology.

Glykolytische Aktivität von Ovarialkarzinomzelllinien in vitro und in vivo und die Bedeutung von HIF-1alpha

Ovarialkarzinome stellen eine schwer zu therapierende onkologische Erkrankung mit im Durchschnitt sehr schlechter Prognose dar. Die Notwendigkeit einer weiteren Verbesserung der Therapie dieser Erkrankung ist sehr offensichtlich. Studien an anderen Tumorentitäten haben die große Bedeutung des Glukosestoffwechsels, speziell des Laktats, in der Erken- nung, Kategorisierung und Therapie von onkologischen Erkrankungen gezeigt. In der Kon- trolle des Glukosestoffwechsels, aber auch vieler anderer Funktionen, wie z. B. des Tumor- wachstums und des Zellüberlebens, hat sich der Hypoxia Inducible Factor (HIF) als beson- ders wichtig herausgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Glukosestoffwechsel in Ovarialkarzinomen und seine Beeinflussung durch eine Herunterregulierung von HIF-1α untersucht. Hierzu wurden die Ovarialkarzinomzelllinien OC 316 und IGROV1 (Wildtyp) und die Zelllinie OC 316 mit einem lentiviralen Vektor zur Herunterregulierung von HIF-1α ver- wendet. Das Wachstumsverhalten, die Laktatproduktion und der Glukoseverbrauch wurden bei diesen Zelllinien in vitro untersucht. Darüber hinaus wurden mithilfe der bildgebenden Biolumineszenz ATP, Laktat, Pyruvat und Glukose in Xenotransplantaten dieser Zelllinien gemessen. Diese in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Methode erlaubt die quantitative Er- fassung von Metaboliten in selektiven Gewebsarealen, wie z. B. in vitalen Tumorregionen, in stomatösen Arealen oder im tumornahen Normalgewebe.rnIn dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass die glykolytische Aktivität von Ovarialkarzinom- zelllinien mit dem Wachstumsverhalten positiv korreliert ist. Eine Herunterregulierung von HIF-1α führt zu einer deutlichen Verlangsamung des Zellwachstums, wobei allerdings alle HIF-Zielgene betroffen sein können. Des Weiteren wird mit den hier gezeigten Daten die prognostische Bedeutung des Laktats bestätigt. Hohe Laktatwerte in vitro waren mit schnel- lerem Wachstum korreliert. Zusätzlich zeigen die vorliegenden Daten, dass die gewonnenen Befunde in vitro nur näherungsweise auf die in vivo Situation übertragbar sind. Eine Herun- terregulierung von HIF-1α zeigt keine signifikant unterschiedlichen Laktatwerte in den Xe- notransplantaten. Allerdings spiegeln sich zelllinienspezifische Unterschiede in der metabo- lischen Aktivität in vitro im metabolischen Verhalten der entsprechenden Xenografttumoren recht gut wider.rnDie gewonnenen Ergebnisse weisen zum einen auf die prognostische Bedeutung einer Bestimmung von Laktatkonzentrationen aus Tumorbiopsien hin und bestätigen zum anderen die klinische Aussagekraft metabolischer Aktivitätsmessungen mittels PET. Solche Daten könnten dazu dienen Patienten einer individualisierten Therapie zuzuführen. Außerdem wur- de die Effektivität, aber auch die Komplexität einer gegen HIF-1α gerichteten Therapie auf Protein- und Genebene bestätigt. Somit zeigen die erzielten Resultate einerseits Möglichkei- ten einer individualisierten Therapie auf, andererseits unterstreichen sie die große Notwen- digkeit weiterer Grundlagenforschung auf diesem Gebiet.

Mitochondrial DNA rearrangements during human aging: a study on liver, muscle and adipose tissue

Aging is characterized by a chronic, low-grade inflammatory state called “inflammaging”. Mitochondria are the main source of reactive oxygen species (ROS), which trigger the production of pro-inflammatory molecules. We are interested in studying the age-related modifications of the mitochondrial DNA (mtDNA), which can be affected by the lifelong exposure to ROS and are responsible of mitochondrial dysfunction. Moreover, increasing evidences show that telomere shortening, naturally occurring with aging, is involved in mtDNA damage processes and thus in the pathogenesis of age-related disorders. Thus the primary aim of this thesis was the analysis of mtDNA copy number, deletion level and integrity in different-age human biopsies from liver, vastus lateralis skeletal muscle of healthy subjects and patients with limited mobility of lower limbs (LMLL), as well as adipose tissue. The telomere length and the expression of nuclear genes related to mitobiogenesis, fusion and fission, mitophagy, mitochondrial protein quality control system, hypoxia, production and protection from ROS were also evaluated. In liver the decrease in mtDNA integrity with age is accompanied with an increase in mtDNA copy number, suggesting the existence of a “compensatory mechanism” able to maintain the functionality of this organ. Different is the case of vastus lateralis muscle, where any “compensatory pathway” is activated and mtDNA integrity and copy number decrease with age, both in healthy subjects and in patients. Interestingly, mtDNA rearrangements do not incur in adipose tissue with advancing age. Finally, in all tissues a marked gender difference appears, suggesting that aging and also gender diversely affect mtDNA rearrangements and telomere length in the three human tissues considered, likely depending on their different metabolic needs and inflammatory status.

Funktionsaufklärung von Atmungsproteinen in Insekten

Globine sind kleine globuläre Proteine mit nahezu ubiquitärem Vorkommen in allen Tiergruppen. Sie weisen eine typische Sandwichstruktur auf, die in der Regel aus acht α-Helices mit einer zentralen prosthetischen Häm-Gruppe besteht und die Proteine zur Bindung gasförmiger Liganden befähigt. Die Funktionen der Globine reichen von O2-Transport und – Speicherung, über eine Beteiligung bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies bis hin zu sensorischen physiologischen Aufgaben. Innerhalb der Klasse der Insekten schien das Vorhandensein von Globinen zunächst auf Insekten mit offensichtlich hypoxischen Habitaten beschränkt zu sein. Die Entdeckung des Globins glob1 in Drosophila melanogaster deutete jedoch eine sehr viel weitere Verbreitung der Globine in Insekten an, die sich durch die Identifizierung von Globingenen in einer Vielzahl von normoxisch lebenden Insekten, wie z.B. Apis mellifera oder Aedes aegypti bestätigte. D. melanogaster besitzt drei Globine, glob1, glob2 und glob3. Glob1 ist eng mit anderen intrazellulären Insektenglobinen verwandt, was zu der Annahme führte, dass es sich bei glob1 um das ursprüngliche und bei glob2 und glob3 um abgeleitete D. melanogaster Globine handelt. Glob1 wird in allen Entwicklungsstadien exprimiert, wobei die Hauptexpressionsorte der Fettkörper und das Tracheensystem sind. Die Transkription des glob1 startet von zwei alternativen Promotoren (Promotor I und II), wodurch in Kombination mit alternativem Splicing vier Transkriptvarianten (Isoform A-D) entstehen, deren Translation jedoch in einer Proteinvariante (glob1) resultiert. Hypoxische Bedingungen führen zu einer vermutlich HIF (=‚hypoxia-inducible factor‘) -vermittelten Abnahme der glob1 Genexpression, wohingegen Hyperoxie eine leichte Zunahme der glob1 mRNA Menge bewirkt. Der mithilfe des UAS/Gal4- Systems erzeugte, RNAi-vermittelte glob1 Knockdown führt zu einer schlechteren Überlebensrate adulter Fliegen unter hypoxischen Bedingungen, einer verkürzten Erholungszeit nach hypoxischem Stupor in Weibchen sowie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber dem ROS (=‘reactive oxygen species‘) -generierenden Herbizid Paraquat in Larven und adulten Weibchen. Diese Beobachtungen sprechen für eine Funktion des Drosophila glob1 innerhalb der O2-Versorgung. Unter hyperoxischen Bedingungen hingegen wurde kein Unterschied zwischen Fliegen mit wildtypischer und manipulierter glob1-Expression festgestellt, wodurch eine Beteiligung des glob1 bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies als mögliche Funktion vorerst ausscheidet. Bei glob2 und glob3 handelt es sich um duplizierte Gene. Auf phylogenetischen Rekonstruktionen basierend konnte die Entstehung der Globin-Duplikate auf ein Duplikationsereignis vor der Radiation des Subgenus Sophophora vor mindestens 40 Millionen Jahren zurückgeführt werden. Die durchgeführten Analysen zur molekularen Sequenzevolution der Globin-Duplikate deuten darauf hin, dass glob2 und glob3 nach der Duplikation eine Kombination aus Sub- und Neo-Funktionalisierungsprozessen durchlaufen haben. Glob2 und glob3 zeigen eine deckungsgleiche mRNA Expression, die auf die männliche Keimbahn beschränkt ist. Aufgrund des hohen Konservierungsgrads der für die Häm- und O2-Bindung essentiellen Aminosäuren kann von der Funktionalität beider Proteine ausgegangen werden. Die streng auf die männliche Keimbahn begrenzte Expression von glob2 und glob3 deutet auf eine Rolle der Globin-Duplikate innerhalb der Spermatogenese hin, die möglicherweise in einem Schutz der Spermatogenese vor oxidativem Stress besteht. Auch eine Beteiligung beim korrekten Ablauf der Spermien-Individualisierung, beispielsweise durch Regulation von Apoptoseprozessen wäre denkbar.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Biomarkern beim Glaukom

Das Glaukom ist, nach dem Katarakt, die zweithäufigste Ursache für Erblindungen weltweit mit Milionen von Betroffenen, die von dieser zunächst weitgehend symptomfreien neurodegenerativen Erkrankung heimgesucht werden. Die Möglichkeiten auf dem Feld der Diagnose beschränken sich bislang weitestgehend auf die Messung des Augeninnendrucks und der Beurteilung des Augenhintergrundes durch einen erfahrenen Augenarzt. Eine labordiagnostische Prophylaxe ist bis heute nicht verfügbar, die Zahl unerkannter Erkrankungen dementsprechend hoch. Hierdurch geht wertvolle Zeit verloren, die man für eine effektive Therapie nutzen könnte.rnBezüglich der Pathogenese des Glaukoms geht man heute von mehreren, miteinander wechselwirkenden Pathomechanismen aus, zu denen neben mechanischen Einflüssen durch einen erhöhten IOD auch Hypoxie, verminderte Neutrophinversorgung, Exzitotoxizität, oxidativer Stress und eine Beteiligung autoimmuner Prozesse gezählt werden. Unabhängig vom Pathomechanismus folgt stets die Etablierung umfangreicher degenerativer Prozesse im Sehnervenkopf, den retinalen Ganglienzellen und den Axonen des Sehnerven, die letztlich im irreversiblen Untergang dieser Neuronen münden. Diese pathologischen Prozesse im ZNS hinterlassen auf Proteomebene Spuren, die mithilfe moderner massenspektrometrischer Methoden in Kombination mit multivariaten statistischen Methoden detektierbar und als sogenannte Biomarker-Kandidaten mit definiertem Molekulargewicht darstellbar sind. In dieser Arbeit wurde ein „Workflow“ entwickelt, der es ermöglicht, diese Biomarker-Kandidaten im Blutserum und in der Tränenflüssigkeit in einfachen, reproduzierbaren Schritten zu identifizieren und zu charakterisieren. Abweichend von der etablierten Methotik der Bottom-Up-Proteomics musste hierfür eine Methode entsprechend einer Top-Down-Philosophie entwickelt werden, die es erlaubt, die Spuren des Glaukoms im Proteom zu detektieren und zu charakterisieren.rnDies erfolgte in dieser Arbeit durch sowohl massenspektroskopischen Methoden wie SELDI-TOF® und MALDI-Tof-Tof als auch durch Bead-, Gel- und Flüssigkeits-chromatographisch-basierte Separations und Fraktionierungstechniken.rnDie erfolgreiche Kombination dieser Methoden führte zu Identifikationen einer ganzen Reihe von Biomarker-Kandidaten. Unter den identifizierten Proteinen, die bezüglich ihres korrespondierenden SELDI-Peaks im Massenbereich von Biomarker-Kandidaten liegen, finden sich Zytokine und Effektormoleküle der angeborernen Immunität, stressinduzierbare Kinasen, Faktoren, die zum Schutz der Telomeren dienen, Proliferationsmarker, neuronale Antigene und Transportproteine. Darüber hinaus wurden Komponenten identifiziert, die an der neuronalen Neutrophinversorgung beteiligt sind, neuronale Rezeptoren und Antigene, Komponenten des Komplementsystems und des MHC-I-Komplexes. All diese identifizierten Proteine sind bezüglich ihrer Funktion und möglichen Rolle innerhalb der Pathogenese des Glaukoms detailliert beschrieben und charakterisiert. Dies erlaubt einen umfassenden Einblick in alle Pathomechanismen, denen nach heutigem Kenntnisstand, eine Rolle an der Pathogenese des Glaukoms unterstellt wird.rn

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.

Untersuchungen zur Bedeutung von Histidinkinasen in Magnaporthe oryzae und zum Wirkmechanismus des Fungizids Fludioxonil

Das aus wissenschaftlicher und ökonomischer Sicht wichtigste Pflanzenpathogen M. oryzae entwickelte im Laufe der Evolution konservierte aber auch einzigartige Mechanismen zur Signaltransduktion. Das Erforschen dieser Mechanismen und Prozesse ist essenziell für das Verständnis von Differenzierungsprozessen bei der Pathogen-Wirt-Interaktion.rnIm ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Signalweg zur Osmoregulation, der „High Osmolarity Glycerol“ (HOG)-Signalweg, erstmals anhand physiologischer Experimente in entsprechenden Mutantenstämmen in M. oryzae untersucht. Dabei konnten klare Unter-schiede zum HOG-Signalweg von S. cerevisiae aufgezeigt werden. rnDas in M. oryzae bisher noch nicht beschriebene Gen MoYPD1, welches das Phosphotransferprotein MoYpd1p kodiert, wurde erfolgreich inaktiviert. Diese Inaktivierung ist in S. cerevisiae und vielen anderen Pilzen letal und resultierte bei M. oryzae in einer apathoge¬nen Albinomutante, deren Konidiogenese gestört ist. Insbesondere die Funktion des Phosphotransferproteins MoYpd1p, sowohl im Phosphorelaysystem des HOG-Signal¬wegs als auch im Wirkmechanismus des Fungizids Fludioxonil, konnte eindeutig mittels Y2H- und Western Blot-Analysen nachgewiesen werden.rnEs wurden entscheidende Fortschritte für das Verständnis des Aufbaus und der Funktion des HOG-Signalwegs sowohl als physiologisches Regulationssystem für Umweltreize als auch als Fungizidtarget im Pflanzenschutz erzielt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zweikompo-nenten-Hybrid-Histidinkinase (HIK) MoSln1p als Signalsensor für Salzstress und MoHik1p als Signalsensor für Zuckerstress fungiert. Die Beteiligung der Histidinkinasen MoHik5p und MoHik9p als Sensorproteine für Hypoxie im HOG-Signalweg ist durchaus denk¬bar und wurde durch erste Ergebnisse bekräftigt. rnSo konnte der HOG-Signalweg in mehreren Modellen dargestellt werden. Die Modelle der Signalerkennung und –transduktion von osmotischem Stress, von Hypoxie und der Wirkmecha¬nismus von Fludioxonil wurden erstmals in diesem Umfang für M. oryzae ausgearbei¬tet.rnDer zweite Teil dieser Arbeit repräsentiert die erste umfassende Untersuchung aller zehn HIK-codierender Gensequenzen, die im Genom von M. oryzae identifiziert werden konnten. Diese Signalproteine waren bisher noch nicht Gegenstand wissenschaftlicher Studien. Die Untersuchung beginnt mit einer phylogenetischen Einordnung aller untersuchten Proteinsequen¬zen in die verschiedenen Gruppen von Histidinkinasen in Pilzen. Eine ausführli-che phänotypische Charakterisierung aller HIK-codierender Gene folgt und wurde anhand von Mutanten durchgeführt, in denen diese Gene einzeln inaktiviert wurden.rnDie Beteiligung von MoHik5p und MoHik9p als mögliche Sauerstoffsensoren im HOG-Signal-weg konnte dokumentiert werden und die anschließenden Western Blot-Analysen bestätig¬ten erstmals die Aktivierung des HOG-Signalwegs bei hypoxieähnlichen Zuständen.rnDes Weiteren wurden mit MoHik5p und MoHik8p zwei neue Pathogenitätsfaktoren in M. oryzae identifiziert. Die apathogenen Mutantenstämme ΔMohik5 und ΔMohik8 sind in der Konidiogenese gestört und nicht in der Lage Appressorien zu differenzieren. Der Einsatz dieser Proteine als Fungizidtarget im protektiven Pflanzenschutz in der Zukunft ist somit denk-bar.rn

Der Einfluss von Chemotherapeutika mit Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF)-modulierendem Potential sowie eines Verlustes des HIF-Regulators von Hippel-Lindau (VHL) auf den Phänotyp und die Funktion dendritischer Zellen

Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF) gibt dem Organismus die Möglichkeit, sich auf zellulärer Ebene an unterschiedliche Sauerstoffverhältnisse anzupassen. Vor allem Tumorzellen weisen aufgrund ihres ungeregelten Wachstums und der daraus resultierenden unzureichenden Durchblutung (hypoxisches Milieu) eine erhöhte HIF-Expression auf. Die erhöhte HIF-Expression stellt somit ein interessantes Ziel in der Tumortherapie dar. Dendritische Zellen (DCs) besitzen eine bedeutende Rolle in der Generierung und Modulierung von Antitumor-Immunantworten. Aus diesem Grund ist es überaus wichtig zu wissen, welche Effekte Antitumor-Agenzien, im Besonderen HIF-Inhibitoren, auf DCs und somit auch auf die Generierung von adäquaten Immunantworten besitzen.rnIm ersten Teil dieser Arbeit wurde aus diesem Grund der Einfluss der Antitumor-Agenzien Geldanamycin (GA) und Topotecan (TPT) auf den Phänotyp und die Funktion von DCs untersucht. Hierfür wurden Monozyten aus humanen, mononukleären, peripheren Blutzellen isoliert und unter DC-differenzierenden Konditionen kultiviert. Diese immaturen monozytenabgeleiteten DCs (Mo-DCs) wurden mithilfe eines Reifungscocktails ausgereift. Die Applikation der Antitumor-Agenzien erfolgte während der Differenzierungs- bzw. Ausreifungsphase. Abhängig vom Reifungsgrad der Mo-DCs konnte ein differentieller Einfluss von GA bzw. TPT auf die DC-Aktivierung beobachtet werden. Eine Behandlung von unstimulierten Mo-DCs mit GA resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung basierend auf einem noch unbekannten Mechanismus. Ebenso führte eine Behandlung von unstimulierten Mo-DCs mit TPT zu einer funktionellen Aktivierung der DCs, die mit einer vermehrten AKT-Expression korrelierte. Die jeweilige Koapplikation der Antitumor-Agenzien mit dem DC-Reifungscocktail führte zu einer reduzierten DC-Aktivierung, die sich in einer verminderten NF-κB-Aktivierung, einer verringerten Oberflächenexpression der getesteten kostimulatorischen Moleküle, einer verringerten Migrationsfähigkeit und einem reduzierten Zellstimulierungspotential widerspiegelte.rnDie autosomal dominant vererbte Tumorerkrankung von Hippel-Lindau (VHL) wird häufig durch genetische Mutationen des als HIF-Negativregulator fungierenden VHL-Gens hervorgerufen. Patienten, die an dem VHL-Syndrom erkrankt sind, weisen oft benigne oder maligne Tumore und Zysten in den verschiedensten Organsystemen auf. Wie schon zuvor erwähnt, besitzen DCs eine essentielle Rolle in der Initiierung und Aufrechterhaltung von Antitumor-Immunantworten. Deshalb wurde im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit ein partieller Verlust von VHL Auswirkungen auf die Ausprägung desrnPhänotyps und der Funktion von DCs hat. Mittels Cre/lox-Technologie wurden transgene Mäuse mit einem heterozygoten Verlust von Exon 1 bzw. Exon 2 des VHL-Gens generiert. Aus diesen Mäusen wurden Knochenmarkszellen isoliert und unter DC-differenzierenden Konditionen kultiviert. Die immaturen knochenmarkabgeleiteten DCs (BM-DCs) wurden mit LPS ausgereift. Weder der heterozygote Verlust von Exon 1 noch von Exon 2 des VHL-Gens bewirkte eine Veränderung der Oberflächenmarkerexpression, der in vitro-Migrations- undrnEndozytosekapazität, sowie der allogenen T-Zellstimulierungskapazität. Allerdings zeigten Mäuse mit einem partiellen Verlust von Exon 2 im Vergleich zu Kontrollmäusen nach Immunisierung und Provokation mit dem Modellallergen OVA eine verminderte Atemwegshyperreaktion, die möglicherweise auf die beobachtete Abnahme der Migrationsfähigkeit in vivo und die verminderte OVA-spezifische T-Zellstimulierungskapazität der DCs zurückzuführen ist.