Development of a Selective Peptide Macrocycle Inhibitor of Coagulation Factor XII toward the Generation of a Safe Antithrombotic Therapy.

Inhibition of coagulation factor XII (FXII) activity represents an attractive approach for the treatment and prevention of thrombotic diseases. The few existing FXII inhibitors suffer from low selectivity. Using phage display combined to rational design, we developed a potent inhibitor of FXII with more than 100-fold selectivity over related proteases. The highly selective peptide macrocycle is a promising candidate for the control of FXII activity in antithrombotic therapy and a valuable tool in hematology research.

Increased mobility of major histocompatibility complex I-peptide complexes decreases the sensitivity of antigen recognition.

CD8(+) cytotoxic T lymphocytes (CTL) can recognize and kill target cells expressing only a few cognate major histocompatibility complex (MHC) I-peptide complexes. This high sensitivity requires efficient scanning of a vast number of highly diverse MHC I-peptide complexes by the T cell receptor in the contact site of transient conjugates formed mainly by nonspecific interactions of ICAM-1 and LFA-1. Tracking of single H-2K(d) molecules loaded with fluorescent peptides on target cells and nascent conjugates with CTL showed dynamic transitions between states of free diffusion and immobility. The immobilizations were explained by association of MHC I-peptide complexes with ICAM-1 and strongly increased their local concentration in cell adhesion sites and hence their scanning by T cell receptor. In nascent immunological synapses cognate complexes became immobile, whereas noncognate ones diffused out again. Interfering with this mobility modulation-based concentration and sorting of MHC I-peptide complexes strongly impaired the sensitivity of antigen recognition by CTL, demonstrating that it constitutes a new basic aspect of antigen presentation by MHC I molecules.

Peptide modification or blocking of CD8, resulting in weak TCR signaling, can activate CTL for Fas- but not perforin-dependent cytotoxicity or cytokine production.

This study describes a form of partial agonism for a CD8+ CTL clone, S15, in which perforin-dependent killing and IFN-gamma production were lost but Fas (APO1 or CD95)-dependent cytotoxicity preserved. Cloned S15 CTL are H-2Kd restricted and specific for a photoreactive derivative of the Plasmodium berghei circumsporozoite peptide PbCS 252-260 (SYIPSAEKI). The presence of a photoactivatable group in the epitope permitted assessment of TCR-ligand binding by TCR photoaffinity labeling. Selective activation of Fas-dependent killing was observed for a peptide-derivative variant containing a modified photoreactive group. A similar functional response was obtained after binding of the wild-type peptide derivative upon blocking of CD8 participation in TCR-ligand binding. The epitope modification or blocking of CD8 resulted in an > or = 8-fold decrease in TCR-ligand binding. In both cases, phosphorylation of zeta-chain and ZAP-70, as well as calcium mobilization were reduced close to background levels, indicating that activation of Fas-dependent cytotoxicity required weaker TCR signaling than activation of perforin-dependent killing or IFN-gamma production. Consistent with this, we observed that depletion of the protein tyrosine kinase p56(lck) by preincubation of S15 CTL with herbimycin A severely impaired perforin- but not Fas-dependent cytotoxicity. Together with the observation that S15 CTL constitutively express Fas ligand, these results indicate that TCR signaling too weak to elicit perforin-dependent cytotoxicity or cytokine production can induce Fas-dependent cytotoxicity, possibly by translocation of preformed Fas ligand to the cell surface.

Development and evaluation of antibody-MHC/peptide conjugates as a new form of cancer immunotherapy

Summary One of the major goals of cancer immunotherapy is the induction of a specific and effective antitumor cytotoxic T lymphocyte (CTL) response. However, the downregulation of Class I Major Histocompatibility Complexes (MHC) expression and the low level of tumor peptide presentation on tumor cell surface, ás well as the low immunogenicity of tumor specific antigens, limit the effectiveness of anti-tumor CTL responses. On the other hand, monoclonal antibodies, which bind with high affinity to tumor cell surface markers, are powerful tumor targeting tools. However, their capacity to .kill cancer cells is limited and mAb cancer treatments usually require the addition of different form of chemotherapy. The new cancer immunotherapy strategy described herein combines the advantage of the high tumor targeting capacity of monoclonal antibodies (mAb) with the powerful cytotoxicity of CD8 T lymphocytes directed against highly antigenic peptide-MHC complexes. Monoclonal antibody Fab fragments directed against a cell surface tumor associated antigen (TAA) are chemically coupled to soluble MHC class I complexes carrying a highly antigenic peptide. Antibody guided targeting and oligomerization of numerous antigenic class IMHC/peptide complexes on tumor cell surfaces can redirect the cytotoxicity of peptide-specific CD8 T cells towards target cancer cells. After the description of the production of murine anti-tumor xMHC/peptide conjugates in the first part of this thesis, the therapeutic potential of such conjugates were sequentially investigated in different syngeneic tumor mouse models. As a first proof of principle, transgenic OT-1 mice and later CEA transgenic C57BL/6 (B6) mice, adoptively transferred with OT-1 spleen cells and immunized with ovalbumin, were used as a model of high frequency of ova peptide specific T cells. In these mice, growth inhibition and regression of palpable colon carcinoma expressing CEA, were obtained by systemic injection of anti-CEA Fab/H-2Kb/ova peptide conjugates. Next, LCMV virus and influenza virus infection of B6 mice were used as viral models to redirect natural antiviral CTL responses to tumors via conjugates loaded with viral peptides. We showed that in mice infected with the LCMV virus, subcutaneous CEA-expressing tumor cells were inhibited by the H2Db/GP33 restricted anti-viral CTL response when preincubated before grafting with anti-CEA Fab-H-2Db/GP33 peptide conjugates. In mice infected with the influenza virus, lung metastases expressing the HER2 antigen were inhibited by the H-2Db/NP366 restricted CTLs response when preincubated before injection with anti-Her2 Fab-H-2Db/NP366 peptide conjugates. In the last chapter, the stability of the peptide in the anti-CEA Fab-H-2Db/GP33 conjugates was improved by the covalent photocross-link of the GP33 peptide in the H-2Db MHC groove. Thus, LCMV immune mice could reject CEA expressing tumors when treated with systemic injections of anti-CEA FabH-2Db/GP33 cross-linked conjugates. These results are encouraging for the potential application of this strategy in clinic. Such conjugates could be used alone in patients boosted by the relevant virus, or used in combination with existing T cell based ìmmunotherapy. Résumé Une des principales approches utilisées dans l'immunothérapie contre le cancer consiste en l'induction d'une réponse T cytotoxique (CTL) spécifiquement dirigée contre la tumeur. Cependant, le faible niveau d'expression des complexes majeurs d'histocompatibilité de classe I (CMH I) et de présentation des peptides tumoraux à la surface des cellules cancéreuses ainsi que la faible immunogenicité des antigens tumoraux, limitent l'efficacité de la réponse CTL. D'autre part,. l'injection d'anticorps monoclonaux (mAb), se liant avec une haute affinité aux marqueurs de surface des cellules tumorales, a fourni des résultats cliniques encourageant. Cependant l'efficacité de ces mAbs contre des tumeur solides reste limitée et necessite souvent l'addition de chimiotherapie. La nouvelle stratégie thérapeutique décrite dans ce travail associe le fort pouvoir de localisation des anticorps monoclonaux et le fort pouvoir cytotoxique des lymphocytes T CD8+. Des fragments Fab d'anticorps monoclonaux, dirigés contre des antigènes surexprimés à la surface de cellules tumorales, ont été chimiquement couplés à des CMH I solubles, portant un peptide fortement antigénique. Le ciblage et l'oligomérisation à la surface des cellules tumorales de nombreux CMH I présentant un peptide antigénique, va réorienter la cytotoxicité des cellules T CD8+ spécifiques du peptide présenté, vers les cellules tumorales cibles. Après une description de la production de conjugé anti-tumeur x CMH Upeptide dans la première partie de cette thèse, le potentiel thérapeutique de tels conjugés a été successivement étudiés in vivo dans différents modèles de tumeur syngénéiques. Tout d'abord, des souris OT-1 transgéniques, puis des souris C57BL/6 (B6) transférées avec des cellules de rate OT-1 puis immunisées avec l'ovalbumine, ont été employées comme modèle de haute fréquence de cellules T CD8+ spécifiques du peptide ova. Chez ces souris, l'inhibition de la croissance et la régression de nodules palpables de carcinomes exprimant l'antigène caccino embryonaire (ACE), ont été obtenues par l'injection systémique de conjugés anti-ACE Fab/H-2Kb/ova. Par la suite, l'infection de souris B6 par le virus LCMV et par le virus de la grippe, ont été utilisés comme modèles viraux pour redirigées des réponses anti-virales naturelles vers les tumeurs, en utilisant des conjugés chargés avec des peptides viraux. Nous avons montré que .chez les souris infectées par le LCMV, la croissance de carcinome sous-cutané est empêchée par la réponse anti-virale, spécifique du complexe H2Db/GP33, lorsque les cellules tumorales greffées sont pré-incubées avec des conjugés anti-CEA Fab-H-2Db/GP33. Dans le cas de souris infectées par le virus de la grippe, la métastatisation de mélanomes pulmonaires exprimant l'antigène HER-2 est inhibée par la réponse anti-virale spécifique du complexe H-2Db/NP366, après pré-incubation des cellules tumorales avec des conjugés anti-Her2 FabxH-2Db/NP366. Dans le dernier chapitre, la liaison covalente du peptide GP33 dans le complexe H-2Db a amélioré la stabilité des conjugés correspondants et a permis le traitement systémique de souris greffées avec des tumeurs exprimant l'ACE et infectées par le LCMV. L'ensemble de ces résultats sont encourageant pour l'application de cette strategie en clinique. De tels conjugués pourraient être employés seuls ou en combinaison avec des protocols d'immunisation peptidique anti-tumoral. Résumé pour un large public Dans les pays industrialisés, le cancer se situe au deuxième rang des causes de mortalité après les maladies cardiovasculaires. Les principaux traitement de nombreux cancers sont la chirurgie, en association avec la radiothérapie et la chimiothérapie. L'immunothérapie est l'une des nouvelles approches mises en oeuvre pour la lutte contre le cancer. Elle peut être humorale, et s'appuyer alors sur la perfusion d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes tumoraux, par exemple les anticorps dirigés contre les protéines oncogéniques Her-2/neu dans le cancer du sein. Ces anticorps ont le grand avantage de spécifiquement se localiser à la tumeur et d'induire la lyse ou d'inhiber la proliferation des cellules tumorales exprimant l'antigène. Certains sont utilisés en clinique pour le traitement de lymphomes, de carcinomes de l'ovaire et du sein ou encore de carcinomes metastatiques du côlon. Cependant l'efficacité de ces anticorps contre des tumeurs solides reste limitée et les traitements exigent souvent d'être combiner avec de la chimiothérapie. L'immunothérapie spécifique peut également être cellulaire et reposer sur une démarche de type vaccinal, consistant à générer des lymphocytes T cytotoxiques (cytotoxic T lymphocytes :CTL) capables de détruire spécifiquement les cellules malignes. Pour obtenir une réponse lymphocytaire T cytotoxique antitumorale, la cellule T doit reconnaître un antigène associé à la tumeur, présenté sous forme de peptide dans un complexe majeur d'histocompatibilité de classe I. Or les cellules tumorales ne presentent pas efficacement les peptides antigèniques, car elles se caractérisent par une diminution ou une absence d'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe I, des molécules d'adhésion et des cytokines costimulatrices, et par une faible expression des antigènes associés aux tumeurs. C'est en partie pourquoi, malgré l'induction de fortes réponses CTL specifiquement dirigés contre des antigens tumoraux, les régressions tumorales obtenus grace à ces vaccinations sont relativement rares. Alors que chez les personnes atteintes du cancer on observe l'instauration d'une tolérance immunitaire vis-à-vis de la tumeur, à l'inverse, notre systeme immunitaire reste parfaitement capable de combattre des infection virales classiques, tels que la grippe, qui font aussi appel à une réponse T cytotoxique. Notre groupe de recherche a donc eu l'idee de développer une nouvelle approche thérapeutique où une réponse immunitaire anti-virale très efficace serait redirigée vers les tumeurs par des anticorps monoclonaux. Concrètement, nous avons chimiquement couplés des fragments d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes surexprimés à la surface de cellules tumorales, à des CMH I portant un peptide viral antigénique. Les cellules tumorales, ciblées par le fragment anticorps et couvertes d' antigènes viraux présentés par des molécules de CMH I, peuvent ainsi tromper les lymphocytes cytotoxiques anti-viraux qui vont détruire les cellules tumorales comme si elles étaient infectées par le virus. Suite à des résultats prometteurs obtenus in vitro avec différents conjugués anticorps-CMH humain de type HLA.A2/peptide Flu, le but du projet était de tester in vivo des conjugués anticorps-CMH I murins sur des modèles expérimentaux de souris. Tout d'abord, des souris transgéniques pour un recepteur T specifique du peptide ova, puis des transferts adoptifs de ces cellules T specifiques dans des souris immunocompétentes, ont été choisi comme modèle de haute fréquence des cellules T spécifiques, et ont permi de valider le principe de la strategie in vivo. Puis, deux modèles viraux ont été elaboré avec le virus LCMV et le virus Influenza, pour réorienter des réponses antivirales naturelles vers les tumeurs grâce à des conjugés chargés avec des peptides viraux. Nous avons montré la grande capacité de nos conjugués à rediriger des réponses cytotoxiques vers les tumeurs et inhiber la croissance de tumeurs syngénéiques sous cutanés et pulmonaires. Ces résultats d'inhibition tumorales obtenus dans des souris immunocompétentes, grâce à l'injection de conjugués anticorps xCMH/peptide et réorientant deux réponses antivirales différentes vers deux modèles tumoraux syngeneiques, sont encourageant pour l'application de cette nouvelle stratégie en clinique.

Novo gênero de Acanthoderini (Coleoptera, Cerambycidae)

Um novo gênero de Acanthoderini, Trichoanoreina gen. nov., e nova espécie, T. albomaculata sp. nov., são descritos do Espírito Santo e São Paulo, Brasil. O novo gênero é comparado com Anoreina Bates, 1861.

C3-symmetric peptide scaffolds are functional mimetics of trimeric CD40L.

Interaction between CD40, a member of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily, and its ligand CD40L, a 39-kDa glycoprotein, is essential for the development of humoral and cellular immune responses. Selective blockade or activation of this pathway provides the ground for the development of new treatments against immunologically based diseases and malignancies. Like other members of the TNF superfamily, CD40L monomers self-assemble around a threefold symmetry axis to form noncovalent homotrimers that can each bind three receptor molecules. Here, we report on the structure-based design of small synthetic molecules with C3 symmetry that can mimic CD40L homotrimers. These molecules interact with CD40, compete with the binding of CD40L to CD40, and reproduce, to a certain extent, the functional properties of the much larger homotrimeric soluble CD40L. Architectures based on rigid C3-symmetric cores may thus represent a general approach to mimicking homotrimers of the TNF superfamily.

Functional avidity of tumor antigen-specific CTL recognition directly correlates with the stability of MHC/peptide multimer binding to TCR.

Avidity of Ag recognition by tumor-specific T cells is one of the main parameters that determines the potency of a tumor rejection Ag. In this study we show that the relative efficiency of staining of tumor Ag-specific T lymphocytes with the corresponding fluorescent MHC class I/peptide multimeric complexes can considerably vary with staining conditions and does not necessarily correlate with avidity of Ag recognition. Instead, we found a clear correlation between avidity of Ag recognition and the stability of MHC class I/peptide multimeric complexes interaction with TCR as measured in dissociation kinetic experiments. These findings are relevant for both identification and isolation of tumor-reactive CTL.

Activation of human melanoma reactive CD8+ T cells by vaccination with an immunogenic peptide analog derived from Melan-A/melanoma antigen recognized by T cells-1.

PURPOSE: As compared with natural tumor peptide sequences, carefully selected analog peptides may be more immunogenic and thus better suited for vaccination. However, T cells in vivo activated by such altered analog peptides may not necessarily be tumor specific because sequence and structure of peptide analogs differ from corresponding natural peptides. EXPERIMENTAL DESIGN: Three melanoma patients were immunized with a Melan-A peptide analog that binds more strongly to HLA-A*0201 and is more immunogenic than the natural sequence. This peptide was injected together with a saponin-based adjuvant, followed by surgical removal of lymph node(s) draining the site of vaccination. RESULTS: Ex vivo analysis of vaccine site draining lymph nodes revealed antigen-specific CD8+ T cells, which had differentiated to memory cells. In vitro, these cells showed accelerated proliferation upon peptide stimulation. Nearly all (16 of 17) of Melan-A-specific CD8+ T-cell clones generated from these lymph nodes efficiently killed melanoma cells. CONCLUSIONS: Patient immunization with the analog peptide leads to in vivo activation of T cells that were specific for the natural tumor antigen, demonstrating the usefulness of the analog peptide for melanoma immunotherapy.

Descrição de um gênero novo e cinco espécies novas de Neocoelidiinae (Hemiptera, Auchenorrhyncha, Cicadellidae)

Um gênero novo de Neocoelidiinae, Paracoelidiana gen. nov., e cinco espécies novas - Paracoelidiana hastata sp. nov., Paracoelidiana lamellata sp. nov., Paracoelidiana longipenis sp. nov., Paracoelidiana morretensis sp. nov. e Paracoelidiana recifensis sp. nov. - são descritos. Esse gênero novo é próximo a Coelidana Oman, 1936, apresentando morfologia externa muito semelhante, sua separação sendo feita apenas com base na morfologia da genitália masculina. As fêmeas do gênero novo não são conhecidas. Todas as espécies são ilustradas, uma chave para identificação das mesmas e sua distribuição geográfica conhecida são fornecidas.

Comunidade de escarabeíneos (Coleoptera, Scarabaeidae) copro-necrófagos da região de Brejo Novo, Caruaru, Pernambuco, Brasil

Este estudo objetivou levantar preliminarmente os escarabeíneos copro-necrófagos da região de Brejo Novo, Caruaru, Pernambuco, e verificar aspectos da estrutura da comunidade como sazonalidade, diversidade, equitabilidade, riqueza e abundância das espécies. Foram realizadas 10 coletas, com intervalos de 30 dias e duração de 48 horas, de setembro de 2003 a julho de 2004. Utilizaramse 24 armadilhas de queda, com dois tipos de isca, fezes humanas e carne bovina em estado de putrefação. Foram coletados 1.540 indivíduos pertencentes a seis tribos, 12 gêneros e 28 espécies. As espécies Canthon af. carbonarius, Canthon chalybaeus, Dichotomius nisus, D. semisquamosus, Digitonthophagus gazella e Eurysternus hirtellus aparentemente são as mais adaptadas ao ambiente estudado. Foram coletados 826 indivíduos em armadilhas iscadas com fezes humanas e 714 em carne bovina apodrecida. Ocorreu um número maior de espécies consideradas "raras" (15), sendo três destas "singletons", duas "doubletons" e 10 com abundância entre três e 10 indivíduos, 13 espécies foram consideradas "comuns". Das espécies analisadas, sete apresentaram hábitos alimentares generalistas, quatro são estritamente coprófagas e uma estritamente necrófaga. Foram verificadas correlações positivas entre a precipitação mensal e a abundância e a riqueza de espécies. O levantamento preliminar das espécies de Scarabaeinae da região de Brejo Novo contribuiu para aumentar o número de espécies registradas para o estado de Pernambuco e região Nordeste do Brasil.

Coronalidia, gênero novo de Neocoelidiinae (Hemiptera, Cicadellidae) do Equador

Um gênero novo de Neocoelidiinae, Coronalidia gen. nov., e duas espécies novas, Coronalidia pictapennis sp. nov. e Coronalidia sagittata sp. nov., são descritos. Coronalidia gen. nov. pode ser separado dos demais gêneros de Neocoelidiinae pela longa sutura coronal, quase atingindo a margem anterior da coroa, pela presença de um processo alongado na base do tubo anal e margem ventral do edeago com dentículos. As fêmeas deste gênero não são conhecidas. Ilustrações e a distribuição geográfica conhecida das espécies estudadas são fornecidas.

Gestão Orçamental Pública - Caso de Câmara Municipal do Porto Novo

As organizações dinâmicas que primam pela salvaguarda do bem-estar económico e social da colectividade, necessitam de medidas assertivas que imperem por um planeamento adequado, uma gestão rigorosa dos recursos, controlo e transparência. Com esta pesquisa pretendeu-se compreender o nível de cumprimento dos princípios legais e regras na gestão orçamental do Município do Porto Novo. Os resultados atingidos mostram que o executivo reconhece a pertinência dos princípios legais, uma vez que se preocupa com o seu cumprimento. O mesmo não acontece com a rubrica “operações de tesouraria” e com o “acúmulo de documentos em cofre”. As operações de tesouraria não são transferidas na sua totalidade, muitas vezes são utilizadas para a realização de despesas e, por vezes, relacionam-se com documentos existentes em cofre. Os resultados sugerem também, que se tem seguido um procedimento correcto no estabelecimento das previsões de algumas rubricas, ao serem baseadas no histórico de execução. Noutros casos o procedimento seguido não tem sido o mais correcto. Algumas rubricas tem previsões com tendências crescentes, enquanto que a execução apresenta tendência inversa. E por fim, quanto ao nível de execução orçamental, os resultados sugerem ainda que, ao longo do tempo, se tem situado no nível considerado de bom.

Gestão dos Recursos Humanos: O caso da Delegação do MED do Porto Novo

Este trabalho denominado Gestão dos Recursos humanos com enfoque ao balanço Social visa despertar a prática da responsabilidade social das instituições/ empresas por meio de elaboração do Balanço Social, como instrumento de gestão. Ao fazer e publicar o balanço social, a empresa esta mostrando o que faz pelos seus profissionais, colaboradores, dependentes e a comunidade em geral, dando transparência das actividades que buscam qualidade de vida para todos. O presente trabalho foi elaborado a partir de um estudo de caso, feito na Delegação do Ministério da Educação e Desporto do Porto Novo, tendo sido utilizado o método de pesquisa bibliográfica e documental, com tratamento no Excel. Foram recolhidos todos os dados dos Recursos Humanos (RH) disponíveis, e assim elaborado o balanço social do ano escolar 2011/12. A análise foi feita com foco nos seguintes indicadores de gestão: Indicadores dos RH, a prestação do trabalho, os encargos, a mobilidade do pessoal, a formação, a higiene e segurança no trabalho e as relações profissionais. Teve enfase os indicadores dos RH que realçam o perfil profissional que são: o sexo, o vínculo, a faixa etária, a antiguidade, a categoria profissional, a habilitação profissional, o nível de escolaridade, os efectivos estrangeiros e os portadores de deficiência. Da análise dos dados recolhidos, conclui-se que o balanço social não é utilizado nesta instituição como instrumento de gestão.

Avaliação dos Caudais de Ar Novo Garantidos por Sistemas de Ventilação Natural ou Híbrida em Edifícios Escolares

O cumprimento dos caudais de referência impostos pela nova situação regulamentar contribui para custos de energia elevados em edifícios escolares. Daí a importância de fazer um estudo aprofundado de como a ventilação natural ou híbrida pode contribuir para reduzir esses custos. É neste âmbito que se enquadra o presente trabalho, cujo objectivo é a avaliação dos caudais de ar novo garantidos por sistemas de ventilação natural ou híbrida em edifícios escolares. Avaliou-se a contribuição da ventilação natural para o caudal de ar novo. Fez-se uma análise dos modelos que descrevem a ventilação natural que permitem obter uma estimativa da área das aberturas nas fachadas, a partir de cada estratégia da mesma (efeito da diferença de temperaturas, do vento e da sua acção conjunta). Apresentam-se duas metodologias de estimativa das áreas das aberturas nas fachadas do edifício, através da ventilação natural. A primeira consiste na utilização de uma ferramenta de cálculo simplificado ClassVent, disponibilizada no regulamento de ventilação para edifícios escolares aos projectistas ingleses, BB101 (Building Bulletin 101). Na segunda recorre-se a um modelo empírico (The Britsh Standard Method), para desenvolver um software simplificado (Ventilação Natural), que foi elaborado em linguagem Visual Basic pela autora.