Biosafety of Recombinant Adeno-associated Virus Vectors.

It is hoped that the use of gene transfer technology to treat both monogenetic and acquired diseases may soon become a common therapy option in medicine. For gene therapy to achieve this objective, any gene delivery method will have to meet several criteria, including ease of manufacturing, efficient gene transfer to target tissue, long-term gene expression to alleviate the disease, and most importantly safety in patients. Viral vectors are an attractive choice for use in gene therapy protocols due to their relative efficiency in gene delivery. Since there is inherent risk in using viruses, investigators in the gene therapy community have devoted extensive efforts toward reengineering viral vectors for enhance safety. Here we review the approaches and technologies that are being evaluated for the use of recombinant vectors based upon adeno-associated virus (AAV) in the treatment of a variety of human diseases. AAV is currently the only known human DNA virus that is non-pathogenic and AAV-based vectors are classified as Risk Group 1 agents for all laboratory and animal studies carried out in the US. Although its apparent safety in natural infection and animals appears well documented, we examine the accumulated knowledge on the biology and vectorology of AAV, lessons learned from gene therapy clinical trials, and how this information is impacting current vector design and manufacturing with an overall emphasis on biosafety.

A new class of isothiocyanate-based irreversible inhibitors of macrophage migration inhibitory factor.

Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a homotrimeric multifunctional proinflammatory cytokine that has been implicated in the pathogenesis of several inflammatory and autoimmune diseases. Current therapeutic strategies for targeting MIF focus on developing inhibitors of its tautomerase activity or modulating its biological activities using anti-MIF neutralizing antibodies. Herein we report a new class of isothiocyanate (ITC)-based irreversible inhibitors of MIF. Modification by benzyl isothiocyanate (BITC) and related analogues occurred at the N-terminal catalytic proline residue without any effect on the oligomerization state of MIF. Different alkyl and arylalkyl ITCs modified MIF with nearly the same efficiency as BITC. To elucidate the mechanism of action, we performed detailed biochemical, biophysical, and structural studies to determine the effect of BITC and its analogues on the conformational state, quaternary structure, catalytic activity, receptor binding, and biological activity of MIF. Light scattering, analytical ultracentrifugation, and NMR studies on unmodified and ITC-modified MIF demonstrated that modification of Pro1 alters the tertiary, but not the secondary or quaternary, structure of the trimer without affecting its thermodynamic stability. BITC induced drastic effects on the tertiary structure of MIF, in particular residues that cluster around Pro1 and constitute the tautomerase active site. These changes in tertiary structure and the loss of catalytic activity translated into a reduction in MIF receptor binding activity, MIF-mediated glucocorticoid overriding, and MIF-induced Akt phosphorylation. Together, these findings highlight the role of tertiary structure in modulating the biochemical and biological activities of MIF and present new opportunities for modulating MIF biological activities in vivo.

BTLA mediates inhibition of human tumor-specific CD8+ T cells that can be partially reversed by vaccination.

The function of antigen-specific CD8+ T cells, which may protect against both infectious and malignant diseases, can be impaired by ligation of their inhibitory receptors, which include CTL-associated protein 4 (CTLA-4) and programmed cell death 1 (PD-1). Recently, B and T lymphocyte attenuator (BTLA) was identified as a novel inhibitory receptor with structural and functional similarities to CTLA-4 and PD-1. BTLA triggering leads to decreased antimicrobial and autoimmune T cell responses in mice, but its functions in humans are largely unknown. Here we have demonstrated that as human viral antigen-specific CD8+ T cells differentiated from naive to effector cells, their surface expression of BTLA was gradually downregulated. In marked contrast, human melanoma tumor antigen-specific effector CD8+ T cells persistently expressed high levels of BTLA in vivo and remained susceptible to functional inhibition by its ligand herpes virus entry mediator (HVEM). Such persistence of BTLA expression was also found in tumor antigen-specific CD8+ T cells from melanoma patients with spontaneous antitumor immune responses and after conventional peptide vaccination. Remarkably, addition of CpG oligodeoxynucleotides to the vaccine formulation led to progressive downregulation of BTLA in vivo and consequent resistance to BTLA-HVEM-mediated inhibition. Thus, BTLA activation inhibits the function of human CD8+ cancer-specific T cells, and appropriate immunotherapy may partially overcome this inhibition.

Activités antidiabétiques et neuroprotectrices du jus de bleuet biostransformé

Le bleuet démontre un potentiel thérapeutique dans le traitement du cancer et des maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces effets bénéfiques sont attribuables aux composés phénoliques abondants dans le bleuet, tels que les anthocyanines et les flavonoïdes. La biotransformation du jus de bleuet avec les bactéries Serratia vaccinii augmente sa teneur en composés phénoliques et son activité anti-oxydante, et modifie ses activités physiologiques. L’objectif de la présente étude est d’évaluer l’activité neuroprotectrice et le potentiel antidiabétique du jus de bleuet biostranformé (BJ). Le BJ est étudié dans différents tests dont : 1) La protection des neurones (N2a) contre le stress oxydatif (SO) induit par le peroxyde d’hydrogène; 2) La stimulation de la prise de glucose par les cellules musculaires (C2C12) et adipeuses (3T3-L1); 3) L’activité anti-hyperglycémique chez les souris obèses diabétiques KKAy. En effet, tandis que le jus de bleuet normal n’a aucun effet, le BJ augmente l’activité des enzymes anti-oxydantes, comme la catalase et la SOD (Superoxide Dimutase) et protège les neurones contre les changements de la signalisation des MAPKs et contre la toxicité induite par le peroxyde d’hydrogène. Le BJ augmente aussi la prise de glucose de 48% dans les cellules C2C12 et de 142% dans les cellules 3T3-L1. Cette augmentation n’est pas expliquée par une augmentation du calcium cytosolique mais plutôt par une stimulation de la phosphorylation de l’AMPK. De plus, le BJ inhibe l’adipogenèse chez les 3T3-L1. Le BJ diminue également l’hyperglycémie chez les souris obèses diabétiques KKAy et protège les jeunes souris pré-diabétiques contre le développement de l’obésité et du diabète. L’activité anti-hyperglycémique du BJ pourrait impliquer les adipokines puisque le BJ augmente le niveau d’adiponectine chez les souris diabétiques. Le BJ représente ainsi une approche prometteuse pour le traitement du diabète et les maladies neurodégénératives et une source de nouveaux agents thérapeutiques contre ces maladies.

Cardiologie nucléaire du 21ième siècle : nouveautés et réalités

Les maladies cardio-vasculaires demeurent une cause majeure de mortalité et morbidité dans les sociétés développées. La recherche de déterminants prédictifs d’évènements vasculaires représente toujours un enjeu d’actualité face aux coûts croissants des dépenses reliées aux soins médicaux et à l’élargissement des populations concernées, notamment face à l’occidentalisation des pays émergeants comme l’Inde, le Brésil et la Chine. La cardiologie nucléaire occupe depuis trente ans, une place essentielle dans l’arsenal des méthodes diagnostiques et pronostiques des cardiopathies. De plus, de nouvelles percées permettront de dépister d’une façon plus précoce et précise, la maladie athérosclérotique cardiaque et périphérique chez les populations atteintes ainsi qu’en prévention primaire. Nous présenterons dans cette thèse, deux approches nouvelles de la cardiologie nucléaire. La dysfonction endothéliale est considérée comme le signal pathologique le plus précoce de l’athérosclérose. Les facteurs de risques cardiovasculaires traditionnels atteignent la fonction endothéliale et peuvent initier le processus d’athérosclérose même en l’absence de lésion endothéliale physique. La quantification de la fonction endothéliale coronarienne comporte donc un intérêt certain comme biomarqueur précoce de la maladie coronarienne. La pléthysmographie isotopique, méthodologie développée lors de ce cycle d’étude, permet de quantifier la fonction endothéliale périphérique, cette dernière étant corrélée à la fonction endothéliale coronarienne. Cette méthodologie est démontrée dans le premier manuscrit (Harel et. al., Physiol Meas., 2007). L’utilisation d’un radiomarquage des érythrocytes permet la mesure du flot artériel au niveau du membre supérieur pendant la réalisation d’une hyperémie réactive locale. Cette nouvelle procédure a été validée en comparaison à la pléthysmographie par jauge de contrainte sur une cohorte de 26 patients. Elle a démontré une excellente reproductibilité (coefficient de corrélation intra-classe = 0.89). De plus, la mesure du flot artérielle pendant la réaction hyperémique corrélait avec les mesure réalisées par la méthode de référence (r=0.87). Le deuxième manuscrit expose les bases de la spectroscopie infrarouge comme méthodologie de mesure du flot artériel et quantification de la réaction hyperémique (Harel et. al., Physiol Meas., 2008). Cette étude utilisa un protocole de triples mesures simultanées à l’aide de la pléthysmographie par jauge de contrainte, radio-isotopique et par spectroscopie infrarouge. La technique par spectroscopie fut démontrée précise et reproductible quant à la mesure des flots artériels au niveau de l’avant-bras. Cette nouvelle procédure a présenté des avantages indéniables quant à la diminution d’artéfact et à sa facilité d’utilisation. Le second volet de ma thèse porte sur l’analyse du synchronisme de contraction cardiaque. En effet, plus de 30% des patients recevant une thérapie de resynchronisation ne démontre pas d’amélioration clinique. De plus, ce taux de non-réponse est encore plus élevé lors de l’utilisation de critères morphologiques de réponse à la resynchronisation (réduction du volume télésystolique). Il existe donc un besoin urgent de développer une méthodologie de mesure fiable et précise de la dynamique cardiaque. Le troisième manuscrit expose les bases d’une nouvelle technique radio-isotopique permettant la quantification de la fraction d’éjection du ventricule gauche (Harel et. al. J Nucl Cardiol., 2007). L’étude portant sur 202 patients a démontré une excellente corrélation (r=0.84) avec la méthode de référence (ventriculographie planaire). La comparaison avec le logiciel QBS (Cedar-Sinai) démontrait un écart type du biais inférieur (7.44% vs 9.36%). De plus, le biais dans la mesure ne démontrait pas de corrélation avec la magnitude du paramètre pour notre méthodologie, contrairement au logiciel alterne. Le quatrième manuscrit portait sur la quantification de l’asynchronisme intra-ventriculaire gauche (Harel et. al. J Nucl Cardiol, 2008). Un nouveau paramètre tridimensionnel (CHI: contraction homogeneity index) (médiane 73.8% ; IQ 58.7% - 84.9%) permis d’intégrer les composantes d’amplitude et du synchronisme de la contraction ventriculaire. La validation de ce paramètre fut effectuée par comparaison avec la déviation standard de l’histogramme de phase (SDΦ) (médiane 28.2º ; IQ 17.5º - 46.8º) obtenu par la ventriculographie planaire lors d’une étude portant sur 235 patients. Ces quatre manuscrits, déjà publiés dans la littérature scientifique spécialisée, résument une fraction des travaux de recherche que nous avons effectués durant les trois dernières années. Ces travaux s’inscrivent dans deux axes majeurs de développement de la cardiologie du 21ième siècle.

Rôle de la molécule CD47 dans l’homéostasie du système immunitaire

Les travaux antérieurs du laboratoire ont démontré le rôle du CD47 dans la fonction des cellules dendritiques ainsi que dans l’induction des lymphocytes T régulateurs (Tregs) chez l’humain in vitro. Notre premier objectif était de déterminer le rôle de CD47 sur la fonction des DCs in vivo. Nos travaux démontrent que le CD47 contrôle sélectivement la migration des DCs au travers des vaisseaux lymphatiques et des barrières cellulaires endothéliales in vivo sans interférer avec celle des lymphocytes T et B. Des expériences de migration compétitive et d’ immunisation active avec des DCs myéloïdes démontrent que la migration des DCs est dépendante de l’expression du CD47 sur les DCs et non sur les cellules endothéliales. Ce défaut de migration est corrélé avec l’absence de DCs spléniques dans la zone marginale chez nos souris CD47-/-. Notre second objectif était de déterminer le rôle de CD47 dans l’homéostasie et la fonction des Tregs. Nous démontrons que l’expression du CD47 contrôle sélectivement l’homéostasie d’une sous-population de Tregs CD103+ à l’état de base. La proportion de cellules activées/mémoires (CD44hi CD62Llo ) Foxp3+ CD103+ augmente rapidement au cours du vieillissement chez nos souris CD47-/- comparée aux souris CD47+/+ du même âge, tandis que le pourcentage de cellules (CD44loCD62Lhi) Foxp3+ CD103- reste comparable entre les deux souches de souris. En conclusion, le CD47 inhibe la prolifération excessive des Tregs CD103+ empêchant ainsi l’accumulation de ces cellules en absence d’inflammation. Les DCs et les Tregs sont étroitement régulées de manière reciproque. Cette régulation croisée contribue au maintien d’un équilibre entre l’immunité protectrice et la tolérance. La perspective de nos travaux est d’approfondir nos connaissances sur le rôle du CD47 et de ses ligands dans la régulation des DCs par les Tregs et vice et versa. Les DCs et les Tregs étant impliqués dans la pathogenèse de multiples maladies telles que le cancer, les maladies infectieuses et les maladies auto-immunes. Par conséquent, nos études pourraient ouvrir des portes à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Les cellules dendritiques plasmacytoides dans le sang de cordon et après greffe de sang de cordon

La greffe de sang de cordon est de plus en plus utilisée et a permis de traiter avec succès chez l’enfant des déficits immunitaires ainsi que des hémopathies malignes comme les leucémies. Malgré d’importants avantages tels que l’absence de risque pour le donneur ou la plus faible incidence de maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), utiliser le sang de cordon comporte certains inconvénients. En effet, une reconstitution immunitaire retardée, des infections opportunistes en plus grand nombre et un risque de rechute sont des complications qui peuvent survenir et engendrer un risque pour le pronostic vital du patient. Par conséquent, de nouvelles stratégies d’immunothérapies doivent être envisagées. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes particulièrement intéressés aux cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) dont les fonctions sont importantes pour l’initiation des réponses immunitaires innée et adaptative et particulièrement pour leur capacité à activer les cellules NK. Afin d’élucider le rôle et l’impact de ces cellules dans les greffes de sang de cordon, le nombre et la fonction des pDC et des NK a été suivi longitudinalement chez des patients ayant subi une greffe de sang de cordon comparativement à des patients transplantés avec de la moelle osseuse. Nous avons ainsi démontré que les pDC et les NK apparaissent précocement suite à une greffe de sang de cordon et que ces cellules sont fonctionnelles. Ces résultats mettent donc en lumière que ces cellules pourraient être de bons outils pour l’établissement d’une immunothérapie après greffe de sang de cordon. De plus, la caractérisation fonctionnelle des pDC du greffon de sang de cordon a permis de révéler une plus faible production d’IFN-α par les pDC, comparativement aux pDC de sang d’adulte. Cette différence pourrait jouer un rôle dans la plus faible incidence de GvHD après les greffes de sang de cordon. Dans le but de préciser les mécanismes moléculaires de régulation négative de la production d’IFN-α par les pDC de sang de cordon, nous avons étudié les protéines de la voie de signalisation TLR9-IRF7. L’expression similaire de l’ARN du TLR9, MyD88, IRAK1 et IRF7 contraste avec la plus faible expression des protéines correspondantes. De plus, l’expression des MicroARNs miR-146a et miR-155 est plus élevé dans les pDC de sang de cordon comparativement aux pDC de sang d’adultes. Ensemble, ces données pointent une régulation négative post-transcriptionnelle de la voie TLR9-IRF7 qui pourrait expliquer la plus faible production d’IFN-α des pDC du sang de cordon. L’ensemble des ces travaux suggère que les pDC pourraient représenter une cible de choix dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans les greffes de sang de cordon.

Rôle du stress oxydant en période néonatale dans l'hypertension artérielle et la dysfonction vasculaire et métabolique de l'adulte

Thèse réalisée dans le cadre d'une cotutelle entre l'Université de Montréal et l'Université d'Auvergne en France

Étude de la relation entre les conformations et la signalisation des 7TMRs

L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle.

Examen de la mémoire épisodique dans le trouble cognitif léger : effet modérateur des comorbidités vasculaires

Le fardeau vasculaire (présence de maladies vasculaires et/ou cérébrovasculaires) est associé à une augmentation des troubles cognitifs chez les personnes âgées, ainsi qu’à un plus haut risque de démence vasculaire (DV) et de démence de type Alzheimer (DTA). Un nombre restreint de travaux a porté sur l’impact du fardeau vasculaire sur la cognition des personnes avec trouble cognitif léger (TCL). Pourtant, les personnes avec TCL représentent une population d’intérêt puisqu’elles sont à haut risque d’évoluer vers une démence. Cette thèse comprend trois articles de revue qui visent à exposer les connaissances entourant la santé vasculaire et la cognition des personnes âgées et trois articles empiriques (Chapitres 5, 6, 7). La première étude empirique traite de l’impact du fardeau vasculaire sur la cognition des personnes TCL et a comme objectif de spécifier quelles fonctions cognitives sont affectées par le fardeau vasculaire et dans quelle mesure le fardeau vasculaire influence l’hétérogénéité des TCL (Chapitre 5). Dans le cadre de la deuxième étude, nous avons examiné l’intégrité des processus stratégiques et non stratégiques de mémorisation des TCL avec et sans fardeau vasculaire, afin d’évaluer si ces processus diffèrent quantitativement et qualitativement entre ces deux groupes (Chapitre 6). Enfin, dans la troisième étude nous avons évalué les capacités d’association (binding) ainsi que la résistance à l’interférence des personnes TCL, les liens entre ces processus mnésiques et différents marqueurs cérébraux en plus des facteurs permettant de prédire l’évolution vers une démence (Chapitre 7). Les résultats présentés dans cette thèse appuient l’hypothèse selon laquelle le fardeau vasculaire influence le profil cognitif des TCL. Dans un premier temps, nous avons montré que le fardeau vasculaire est associé à une atteinte exécutive plus importante chez les TCL (Chapitre 5). De plus, nos résultats suggèrent que le fardeau vasculaire influence la classification clinique de ces derniers, puisque ceux dont le fardeau est élevé répondent davantage aux critères de TCL amnestique domaine multiple (trouble de mémoire plus au moins un autre déficit cognitif) tandis que ceux sans fardeau répondent davantage aux critères de TCL amnestique domaine unique (trouble isolé de la mémoire). Dans un deuxième temps, nous avons montré des différences dans la nature des processus mnésiques atteints chez les TCL avec et sans fardeau vasculaire (Chapitre 6). Alors que les premiers présentent une atteinte prédominante des processus stratégiques de mémorisation, les seconds présentent une atteinte des processus stratégiques et non stratégiques de mémorisation. Lorsque seuls les résultats des TCL ayant évolué vers une démence sont analysés, le patron d’atteinte est similaire puisque les TCL vasculaires sont quantitativement moins touchés que les TCL non-vasculaires au niveau des processus non-stratégiques de mémorisation. Enfin, tant les TCL qui progressent vers une démence que les TCL qui restent stables après un suivi de trois ans éprouvent tous des difficultés de mémoire associative et sont sensibles à l’interférence proactive (Chapitre 7). De plus, le fardeau vasculaire est associé à la sensibilité à l’interférence alors que le volume hippocampique est associé aux difficultés de mémoire associative. Enfin, nos résultats indiquent que les TCL qui éprouvent des difficultés de mémoire associative sont plus à risque d’évoluer vers une démence que les TCL ne présentant pas ces mêmes difficultés. De façon globale, les résultats de cette thèse révèlent que le fardeau vasculaire joue un rôle important dans l’hétérogénéité des TCL.

Génomique fonctionnelle des cellules corticotropes hypophysaires : contrôle génétique de la gestion systémique des stress

L'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) permet de maintenir l'homéostasie de l'organisme face à divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique, physique ou inflammatoire/infectieux, les stress provoquent la synthèse et la libération de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires perçoivent ce signal et en réaction, produisent et sécrètent l'ACTH. Ceci induit la synthèse des glucocorticoïdes (Gc) par le cortex surrénalien; ces stéroïdes mettent le système métabolique en état d’alerte pour la réponse au stress et à l’agression. Les Gc ont le rôle essentiel de contrôler les défenses de l'organisme, en plus d'exercer une rétro-inhibition sur l'axe HPA. L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un précurseur: la pro-opiomélanocortine (POMC). À cause de sa position critique dans la normalisation de l'homéostasie, le contrôle transcriptionnel du gène Pomc a fait l'objet d'études approfondies au cours des dernières décennies. Nous savons maintenant que la région promotrice du gène Pomc permet une expression ciblée dans les cellules POMC hypophysaires. L'étude du locus Pomc par des technologies génomiques m'a permis de découvrir un nouvel élément de régulation qui est conservé à travers l'évolution des mammifères. La caractérisation de cet enhancer a démontré qu'il dirige une expression restreinte à l'hypophyse, et plus particulièrement dans les cellules corticotropes. De façon intéressante, l'activité de cet élément dépend d'un nouveau site de liaison recrutant un homodimère du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est également limitée aux cellules POMC de l'hypophyse. La découverte de cet enhancer ajoute une toute nouvelle dimension à la régulation de l'expression de POMC. Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur antagonisme sur la réaction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse génomique des sites liés ii par ces deux facteurs nous a révélé une interrelation complexe et a permis de définir un code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par interaction directe avec l’ADN au niveau des séquences régulatrices, ces facteurs interagissent directement entre eux avec des résultats transcriptionnels différents. Ainsi, le recrutement de GR par contact protéine:protéine (tethering) sur Stat3 étant lié à l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement à l'ADN sur des sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les voies IL6/LIF et Gc induit une réponse innée de défense cellulaire. Ainsi lors d'un stress majeur, ce mécanisme de défense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus. En somme, les travaux présentés dans cette thèse définissent les mécanismes transcriptionnels engagés dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus particulièrement, ces mécanismes ont été décrits au niveau de la réponse globale des corticotropes et du gène Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adéquatement ces mécanismes afin de faire face aux stress et d'éviter des dérèglements comme les maladies inflammatoires et métaboliques.

Étude numérique des premières étapes d'agrégation du peptide amyloïde GNNQQNY, impliqué dans une maladie à prion.

Les protéines amyloïdes sont impliquées dans les maladies neurodégénératives comme Alzheimer, Parkinson et les maladies à prions et forment des structures complexes, les fibres amyloïdes. Le mécanisme de formation de ces fibres est un processus complexe qui implique plusieurs espèces d’agrégats intermédiaires. Parmi ces espèces, des petits agrégats, les oligomères, sont reconnus comme étant l’espèce amyloïde toxique, mais leur mécanisme de toxicité et d’agrégation sont mal compris. Cette thèse présente les résultats d’une étude numérique des premières étapes d’oligomérisation d’un peptide modèle GNNQQNY, issu d’une protéine prion, pour des systèmes allant du trimère au 50-mère, par le biais de simulations de dynamique moléculaire couplée au potentiel gros-grain OPEP. Nous trouvons que le mécanisme d’agrégation du peptide GNNQQNY suit un processus complexe de nucléation, tel qu’observé expérimentalement pour plusieurs protéines amyloïdes. Nous observons aussi que plusieurs chemins de formation sont accessibles à l’échelle du 20-mère et du 50-mère, ce qui confère aux structures un certain degré de polymorphisme et nous sommes capable de reproduire, dans nos simulations, des oligomères protofibrillaires qui présentent des caractéristiques structurelles observées expérimentalement chez les fibres amyloïdes.

Facteurs environnementaux et symptômes des troubles oculaires et cutanés chez les enfants de moins de cinq ans : cas des zones de l’Observatoire de population de Ouagadougou

Les risques liés à l’environnement immédiat, notamment le manque d’accès à l’eau potable, à l’assainissement, à un logement décent et à un milieu de vie sain constituent un des facteurs à l’origine de la mauvaise santé des enfants de moins de cinq ans dans les pays en développement. Les objectifs principaux poursuivis dans cette recherche sont de mesurer l’influence de ces risques de l’environnement immédiat sur la prévalence des symptômes des troubles oculaires et celle des symptômes des troubles cutanés chez les enfants de moins de cinq ans à Ouagadougou et de rechercher les autres déterminants sous-jacents de la prévalence de ces symptômes dans cette ville. Nous utilisons les données de l’enquête réalisée en février 2010 sur l’état de santé et le comportement sanitaire associé aux maladies et symptômes récents et les données sur les événements démographiques et sur les conditions de vie des ménages collectées en mai 2009 durant le round 1 de l’enquête ménage. L’échantillon de l’étude est constitué de 950 enfants issus de 736 ménages sélectionnés aléatoirement dans cinq quartiers périphériques de la ville de Ouagadougou. Nous avons recouru à l’analyse descriptive fondée sur les tableaux croisés et les tests du chi-2, et à l’analyse de la régression logistique multivariée ayant permis d’étudier les risques relatifs de la survenue desdits symptômes. L’analyse descriptive montre que certaines variables de l’environnement immédiat, en l’occurrence le mode d’évacuation des ordures ménagères, le type de toilette utilisé le plus souvent par la plupart des membres du ménage et le type de quartier de résidence, sont associés à la prévalence des troubles oculaires. Mais une analyse approfondie à l’aide de la régression logistique multivariée n’a confirmé que l’effet du type de quartier de résidence. Concernant la prévalence des symptômes des troubles cutanés, en analyse bi-variée, les variables de l’environnement immédiat qui y sont associées sont la nature du sol intérieur et le mode d’évacuation des eaux usées. L’analyse multivariée semble confirmer les effets de ces variables. Nous avons relevé quelques limites des données utilisées, notamment la faible taille de l’échantillon, la non-confirmation par voie médicale des données sanitaires et le caractère transversal desdites données. Toutefois, les résultats trouvés pourront être utiles aux planificateurs et décideurs qui ont la charge de la gestion de l’espace urbain dans le but de mieux concevoir de nouvelles politiques urbaines mettant l’accent sur la restructuration des quartiers précaires afin de mieux combattre les maladies évitables. En conclusion, en tenant compte des limites relevées, il serait utile de procéder à d’autres investigations afin de tirer des conclusions moins sujettes à débat du point de vue méthodologique.

Facteurs génétiques de prédisposition à la maladie coeliaque et l'oesophagite éosinophilique

Les maladies immunitaires chroniques incluant les maladies auto-immunes et inflammatoires touchent 20 à 25% de la population des pays occidentaux. La comparaison des taux de concordance chez les jumeaux ou l’histoire familiale de sujets atteints de la maladie cœliaque (maladie auto-immune de l’intestin) ou de l’œsophagite éosinophilique (maladie inflammatoire de l’œsophage) indiquent que des facteurs génétiques et environnementaux interviennent dans la susceptibilité à ces maladies. Cependant, ces études ne distinguent pas de manière claire la prédisposition génétique selon l’hétérogénéité clinique (enfants versus adultes) ou ethnique (stratification des populations). Méthodes. Les haplotypes HLA de prédisposition à la maladie cœliaque et les polymorphismes des gènes candidats IL-13 (R130Q), IL-5 (-746 T/G) et IL-5R (-80A/G) impliqués dans la physiopathologie de l’œsophagite éosinophilique, ont été caractérisés par la technique PCR-SSP sur l’ADN génomique. Résultats: Nos études familiales et cas-contrôles réalisées chez une population Québécoises avec un fond génétique très homogène nous a permis : i) d’éviter le problème de stratification des populations, ii) de confirmer que les gènes HLA sont également associés à la maladie cœliaque (enfants et adultes) au Québec comme dans les autres populations Caucasiennes, iii) de mettre en évidence le rôle du gène IL-13 dans la prédisposition à l’œsophagite éosinophilique (garçons et filles) et d’exclure les gènes IL-5 et IL-5R comme facteurs de susceptibilité dans notre population. Conclusion: Ce travail confirme pour la première fois l’impact des gènes HLA dans la prédisposition à la maladie cœliaque et le rôle du facteur génétique dans l’œsophagite éosinophilique chez une population Canadienne Française avec un fond génétique ayant un fort effet fondateur.

The anti-inflammatory properties of intravenous immunoglobulin in a murine model of allergic airway disease ; effects on the development of regulatory T-cells

Les immunoglobulines intraveineuses (IVIg) constituent une préparation polyclonale d’IgG isolée et regroupée à partir du plasma sanguin de multiples donneurs. Initialement utilisé comme traitement de remplacement chez les patients souffrant d’immunodéficience primaire ou secondaire, les IVIg sont maintenant largement utilisées dans le traitement de plusieurs conditions auto-immunes, allergiques ou inflammatoires à une dose élevée, dite immunomodulatrice. Différents mécanismes d’action ont été postulés au fil des années pour expliquer l’effet thérapeutique des IVIg dans les maladies auto-immunes et inflammatoires. Entre autre, un nombre grandissant de données issues de modèles expérimentaux chez l’animal et l’humain suggère que les IVIg induisent l’expansion et augmentent l’action suppressive des cellules T régulatrices (Tregs), par un mécanisme qui demeure encore inconnu. Également, les patients atteints de maladies auto-immunes ou inflammatoires présentent souvent un nombre abaissé de Tregs par rapport aux individus sains. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les IVIg modulent les cellules T régulatrices est requise afin de permettre un usage plus rationnel de ce produit sanguin en tant qu’alternative thérapeutique dans le traitement des maladies auto-immunes et inflammatoires. Par le biais d’un modèle expérimental d’allergie respiratoire induite par un allergène, nous avons démontré que les IVIg diminuaient significativement l’inflammation au niveau des voies aériennes ce, en association avec une différenciation des Tregs à partir des cellules T non régulatrices du tissu pulmonaire. Nous avons également démontré qu’au sein de notre modèle expérimental, l’effet anti-inflammatoire des IVIg était dépendant des cellules dendritiques CD11c+ (CDs) pulmonaires, puisque cet effet pouvait être complètement reproduit par le transfert adoptif de CDs provenant de souris préalablement traitées par les IVIg. À cet effet, il est déjà établi que les IVIg peuvent moduler l’activation et les propriétés des CDs pour favoriser la tolérance immunitaire et que ces cellules seraient cruciales pour l’induction périphérique des Tregs. C’est pourquoi, nous avons cherché à mieux comprendre comment les IVIg exercent leur effet sur ces cellules. Pour la première fois, nous avons démontré que la fraction d’IgG riche en acide sialique (SA-IVIg) (constituant 2-5% de l’ensemble des IgG des donneurs) interagit avec un récepteur dendritique inhibiteur de type lectine C (DCIR) et active une cascade de signalement intracellulaire initiée par la phosphorylation du motif ITIM qui est responsable des changements observés en faveur de la tolérance immunitaire auprès des cellules dendritiques et des Tregs. L’activité anti-inflammatoire de la composante SA-IVIg a déjà été décrite dans des études antérieures, mais encore une fois le mécanisme par lequel ce traitement modifie la fonction des CDs n’a pas été établi. Nous avons finalement démontré que le récepteur DCIR facilite l’internalisation des molécules d’IgG liées au récepteur et que cette étape est cruciale pour permettre l’induction périphérique des Tregs. En tant que produit sanguin, les IVIg constitue un traitement précieux qui existe en quantité limitée. La caractérisation des mécanismes d’action des IVIg permettra une meilleure utilisation de ce traitement dans un vaste éventail de pathologies auto-immunes et inflammatoires.