Die Beteiligung von wildtypischer SOD1 an der Pathogenese der SOD1-vermittelten amyotrophen Lateralsklerose (ALS1)

Bei der amyotrophen Lateralsklerose 1 (ALS1) handelt es sich um eine altersabhängige Motoneuronenerkrankung, die durch Mutationen im Gen der Cu/Zn-Superoxid Dismutase (hSOD1mut) ausgelöst wird. Die toxischen Eigen¬schaften von hSOD1mut (z. B. Aggregations- oder oxidative Stress-Hypothese) und der Einfluss wildtypischer hSOD1 (hSOD1WT) auf den Krankheitsverlauf sind weithin ungeklärt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen von hSOD1mut-hSOD1WT-Heterodimeren im Vergleich zu mutanten Homodimeren auf die Pathogenese der ALS1 zu untersuchen. Nachdem gezeigt werden konnte, dass es in humanen Zellen in der Tat zu einer Bil¬dung hetero- und homodimerer mutanter hSOD1-Spezies kommt, wurden Dimerfusionsproteine aus zwei hSOD1-Monomeren generiert, die durch einen flexiblen Peptidlinker verbunden und C-terminal mit eGFP markiert waren. Neben hSOD1WT-WT wurden hSOD1mut-mut- und hSOD1mut-WT-Dimere mit vier verschiedenen hSOD1-Mu¬tanten untersucht. Die biochemische Charakterisierung zeigte, dass alle Dimere, die wildtyp-ähnliche hSOD1mut enthielten, eine Dismutaseaktivität aufwiesen. Im Gegensatz dazu war das Homodimer aus zwei metalldefizienten hSOD1G85R inaktiv, wobei interessanterweise hSOD1G85R mit hSOD1WT ein Dismutase-aktives Dimer bilden konnte. Sowohl in Zellkultursystemen als auch in einem C. elegans-Modell bildeten alle mutanten Homodimere vermehrt Aggregate im Vergleich zu den dazugehörigen Heterodimeren. Dieses Aggregationsverhalten korrelierte aber nicht mit der Toxizität der Dimerproteine in Überlebensassays und einer C. elegans Bewe¬gungs¬analyse. In diesen funktionellen Studien assoziierte die Toxizität der dimeren Fusionsproteine mit der enzy¬matischen Aktivität. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass hSOD1WT nicht in hSOD1mut-abhängigen Aggregaten vorkommt. Die Ergebnisse dieser Studie sprechen gegen die Aggregation als primäre toxische Eigen¬schaft der hSOD1mut und unterstützen die oxidative Stress-Hypothese. Dis¬mutase-inaktive hSOD1mut können eine untypische Enzymaktivität durch die Heterodimerisierung mit hSODWT erlangen, die auf diese Weise maßgeblich an der Pathogenese der ALS1 beteiligt sein könnte.

Foliation boudinage

In this thesis foliation boudinage and related structures have been studied based on field observations and numerical modeling. Foliation boudinage occurs in foliated rocks independent of lithology contrast. The developing structures are called ‘Foliation boudinage structures (FBSs)’ and show evidence for both ductile and brittle deformation. They are recognized in rocks by perturbations in monotonous foliation adjacent to a central discontinuity, mostly filled with vein material. Foliation boudinage structures have been studied in the Çine Massif in SW-Turkey and the Furka Pass-Urseren Zone in central Switzerland. Four common types have been distinguished in the field, named after vein geometries in their boudin necks in sections normal to the boudin axis: lozenge-, crescent-, X- and double crescent- type FBSs. Lozengetype FBSs are symmetric and characterized by lozenge-shaped veins in their boudin neck with two cusps facing opposite sides. A symmetrical pair of flanking folds occurs on the two sides of the vein. Crescent-type FBSs are asymmetric with a single smoothly curved vein in the boudin neck, with vein contacts facing to one side. X- and double crescent- type FBSs are asymmetric. The geometry of the neck veins resembles that of cuspate-lobate structures. The geometry of flanking structures is related to the shape of the veins. The veins are mostly filled with massive quartz in large single crystals, commonly associated with tourmaline, feldspar and biotite and in some cases with chlorite. The dominance of large facetted single quartz crystals and spherulitic chlorite in the veins suggest that the minerals grew into open fluidfilled space. FLAC experiments show that fracture propagation during ductile deformation strongly influences the geometry of developing veins. The cusps of the veins are better developed in the case of propagating fractures. The shape of the boudin neck veins in foliation boudinage depends on the initial orientation and shape of the fracture, the propagation behaviour of the fracture, the geometry of bulk flow, and the stage at which mineral filling takes place. A two dimensional discrete element model was used to study the progressive development of foliation boudinage structures and the behavior of visco-elastic material deformed under pure shear conditions. Discrete elements are defined by particles that are connected by visco-elastic springs. Springs can break. A number of simulations was Abstract vii performed to investigate the effect of material properties (Young’s modulus, viscosity and breaking strength) and anisotropy on the developing structures. The models show the development of boudinage in single layers, multilayers and in anisotropic materials with random mica distribution. During progressive deformation different types of fractures develop from mode I, mode II to the combination of both. Voids develop along extension fractures, at intersections of conjugate shear fractures and in small pull-apart structures along shear fractures. These patterns look similar to the natural examples. Fractures are more localized in the models where the elastic constants are low and the competence contrast is high between the layers. They propagate through layers where the constants are high and the competence contrast is relatively low. Flow localize around these fractures and voids. The patterns similar to symmetric boudinage structures and extensional neck veins (e.g. lozenge type) more commonly develop in the models with lower elastic constants and anisotropy. The patterns similar to asymmetric foliation boudinage structures (e.g. X-type) develop associated with shear fractures in the models where elastic constants and anisotropy of the materials are relatively high. In these models boudin neck veins form commonly at pull-aparts along the shear fractures and at the intersection of fractures.

Understanding The Physiological, Biochemical, and Molecular Mechanisms of Salinity Tolerance in Strawberry Cultivars and in HvTPK1-Overexpressed Barley

The research was carried out to investigate of main elements of salt stress response in two strawberry cultivars, Elsanta and Elsinore. Plants were grown under 0, 10, 20 and 40 mM NaCl for 80 days. Salinity dramatically affected growth in both cultivars, although Elsinore appeared to be more impaired than Elsanta. Moreover a significant reduction of leaf photosynthesis, evaporation, and stomatal conductance was recorded 24 hrs after the stress was applied in both cultivars, whereas physiological functions were differentially restored after acclimation. However, cv. Elsanta had more efficient leaf gas exchange and water status than cv. Elsinore. In general, Fruit yield reduced upon salinization, wheares fruit quality concerning fruit taste, aroma, appearance, total soluble solids and titratable acidity, did not change but rather was enhanced under moderate salinity. On the other hand fruit quality was impaired at severe salt stress. Fruit antioxidant content and antioxidant capacity were enhanced significantly by increasing salt concentration in both cultivars. The oxidative effects of the stress were defined by the measures of some enzymatic activities and lipid peroxidation. Consistently, an increase in superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxide dismutase (POD) enzymes and higher content of proline and soluble proteins were observed in cv. Elsinore than in cv. Elsanta. The increase coincided with a decrease in lipid peroxidation. The research confirmed that although strawberry cultivars were sensitive to salinity, difference between cultivars exist; The experiment revealed that cv. Elsanta could stand severe salt stress, which was lethal to cv. Elsinore. The parameters measured in the previous experiment were proposed as early screening tools for the salt stress response in nine strawberry genotypes. The results showed that, wheares Elsanta and Elsinore cultivars had a lower dry weight reduction at 40 mM NaCl among cultivars, Naiad, Kamila, and Camarosa were the least salt-sensitive cultivars among the screened.

Einfluss von Resveratrol auf oxidative DNA-Schäden und Mutagenese in vivo

Oxidative DNA-Basenmodifikationen, wie 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), werden endogen in allen Zellen gebildet. Die beobachtbaren Spiegel ergeben sich aus dem Gleichgewicht zwischen der Bildung durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), sowie der gleichzeitigen Reparatur der DNA-Schäden. Durch ihr hohes mutagenes Potential, tragen oxidative DNA-Basenmodifikationen zur spontanen Mutationsrate bei. Der Ausfall wichtiger DNA-Reparaturmechanismen führt in Ogg1(-/-)Csb(-/-)-Knockout-Mäusen zu einem Anstieg von 8 oxoG und der spontanen Mutationsrate.rnIn dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die basalen Spiegel an oxidativen Basenmodifikationen und die spontanen Mutationsraten in vivo durch die orale Gabe von Resveratrol moduliert werden können. Resveratrol ist ein Pflanzeninhaltsstoff (u.a. aus Rotwein) mit einer Vielzahl von Wirkungen, der bereits in zahlreichen Studien ein chemopräventives Potential gezeigt hat und antioxidativ wirkt.rnAn verschiedenen Mausgenotypen wurden zum einen eine Kurzzeit-Behandlung (7 Tage mit 100 mg/kg per Gavage) und zum anderen eine Langzeit-Behandlung (3-9 Monate mit 0,04% ad libitum) mit Resveratrol durchgeführt. Die oxidativen DNA Schäden wurden in primären Maushepatozyten mit Hilfe einer modifizierten Alkalischen Elution, mit der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA Glykosylase als Sonde, bestimmt. Zur Analyse der Mutationsrate wurde der BigBlue® Mutationsassay mit anschließender Sequenzierung der Mutationen verwendet.rnDie Ergebnisse zeigen, dass die Kurzzeit- und die Langzeit-Behandlung mit Resveratrol die basalen Spiegel oxidativer DNA-Basenmodifikationen senken. Die Reduktion ist jeweils wesentlich ausgeprägter in den reparaturdefizienten Ogg1(-/-)Csb(-/-)-Mäusen zu erkennen. Auch die spontane Mutationsrate wird durch eine mehrmonatige Behandlung mit Resveratrol um ungefähr 20-30% reduziert.rnAnschließende mechanistische Untersuchungen zeigten, dass dieser Schutz wahrscheinlich auf einer Induktion der antioxidativen Schutzmechanismen begründet ist. So wurde gefunden, dass primäre Hepatozyten aus mit Resveratrol behandelten Mäusen wesentlich besser gegen exogen herbeigeführten oxidativen Stress geschützt sind, als Hepatozyten von unbehandelten Tieren. Ein weiterer Hinweis ist die Hochregulation der mRNA-Spiegel von verschiedenen antioxidativen Schutzenzymen, wie Superoxiddismutase 1 / 2, Hämoxygenase 1, Glutathionperoxidase 1, nach der Gabe von Resveratrol in Mäuselebern. Außerdem sind die oxidativen Markermutationen (GC->TA-Transversionen) stärker von der Reduktion der spontanen Mutationsrate betroffen, als andere Mutationen (z.B. GC->AT-Transitionen).rnDie Ergebnisse zeigen erstmalig, dass spontane Mutationen in vivo durch Fremdstoffe in der Nahrung reduziert werden können. Im Falle von Resveratrol wird diese Reduktion wahrscheinlich durch eine Stimulation der antioxidativen Schutzmechanismen ausgelöst.rn

Analyse immunologischer und proteomischer Aspekte im Rahmen der Glaukompathogenese

Das Glaukom stellt eine heterogene Gruppe von okularen Erkrankungen dar, deren Pathogenese sich durch einen langsamen, progradienten Untergang von retinalen Ganglienzellen und ihren Axonen auszeichnet. rnIn den letzten Jahren wurde im Kontext der Glaukompathogenese verstärkt die Beteiligung autoreaktiver Antikörper diskutiert. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in dem Vergleich solcher Autoantikörper-Reaktionen in den Serum- und Kammerwasserproben einzelner Glaukompatienten. Hierdurch sollte geklärt werden, inwieweit die Immunreaktivitäten dieser beiden Körperflüssigkeiten miteinander übereinstimmen und ob sich Hinweise auf eine lokale Antikörperproduktion im immunprivilegierten Auge finden lassen. Mittels eines etablierten Protein-Microarray-Verfahrens wurden die Immunreaktionen gegen 40 verschiedene Antigene, wie z.B. Hitzeschock-Proteine oder neuronale Strukturproteine, untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die detektierten Autoantikörper-Reaktionen gegen mehr als 80% der untersuchten Antigene in beiden Körperflüssigkeiten miteinander übereinstimmen. Verdeutlicht wird hierdurch, dass die Antikörper-basierenden immunologischen Vorgänge im Auge bzw. Kammerwasser, trotz dessen Abschottung vom Blutkreislauf durch die Blut-Retina-Schranke, denen des Serums stark ähneln. Nur vereinzelt lassen sich Hinweise auf eine lokale Antikörperproduktion im Auge finden, wodurch die Bedeutung der detektierten Serumantikörper-Reaktionen für die Glaukomerkrankung belegt wird. rnEin weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Detektion möglicher veränderter Proteinexpressionen in den Retinae und Serumproben von Glaukompatienten, die potentiell zu den neurodegenerativen Prozessen der Glaukompathogenese beitragen. Um die Analyse spezifischer Proteinexpressionen zu ermöglichen, wurde das Verfahren des Antikörper-Microarrays etabliert und auf die Fragestellung angewendet. Untersucht wurden hierbei vor allem die Abundanzen von Komplementproteinen, Zytokinen und Hitzeschock-Proteinen, aber auch die von verschiedenen neuronalen Strukturproteinen. Als Probenmaterial dienten Serum- und Retinaproben von Glaukompatienten, die vergleichend denen von gesunden Probanden gegenübergestellt wurden. Die Analyse erbrachte die Erkenntnis, dass neben der verstärkten Expression von Komplementproteinen in der Retina (z.B. C3, C6) auch im Serum der Glaukompatienten eine erhöhte Konzentration dieser Proteine vorliegt, die im Rahmen der Glaukomerkrankung möglicherweise ebenfalls eine Rolle spielen. Ähnliches konnte für verschiedene Zytokine, wie z.B. TNF-α, IFN-γ oder IL1-β beobachtet werden, die in den untersuchten Retinae von Glaukomprobanden, teilweise auch in den Serumproben der Patienten, in verstärktem Maße detektiert werden konnten. Die erhöhte Produktion von Zytokinen in der Retina ist wahrscheinlich auf die Aktivierung von Gliazellen zurückzuführen, ein Ereignis für das in dieser Arbeit zahlreiche Hinweise gefunden werden konnten. Die Gliaaktivierung wird vermutlich durch apoptotische Prozesse in der Retina ausgelöst, eventuell aber auch durch eine erfolgte Komplementaktivierung. Darüber hinaus konnten mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens weitere Expressionsunterschiede verschiedener retinaler Proteine bei Glaukompatienten festgestellt werden. Diese Veränderungen, wie z.B. geminderte Mengen von ROS-eliminierenden Proteinen, wie der Superoxid Dismutase und Peroxiredoxin-2, begünstigen bzw. verstärken sehr wahrscheinlich die neurodegenerativen Prozesse in der Retina von GlaukompatientenrnInwieweit die untersuchten Faktoren kausativ an den neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind, bleibt ungeklärt, jedoch untermauert deren Vielzahl die Notwendigkeit, die Ursache der Glaukomerkrankung als komplexe Interaktion und Wechselwirkung verschiedener Komponenten zu betrachten und nicht als einen einzelnen fehlgesteuerten Mechanismus.rn

Microglial involvement in brain physiopathology: in vitro studies using rat primary cultures

Microglial involvement in neurological disorders is well-established, being microglial activation not only associated with neurotoxic consequences, but also with neuroprotective effects. The studies presented here, based on microglia rat primary cell cultures and mainly on microglial conditioned medium (MCM), show insights into the mechanism of Superoxide dismutase 1 (SOD1) and Apolipoprotein E (ApoE) secretion by microglia as well as their neuroprotective effect towards primary cerebellar granule neurons (CGNs) exposed to the dopaminergic toxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA). SOD1 and ApoE are released respectively through non-classical lysosomal or the classical ER/Golgi-mediated secretion pathway. Microglial conditioned medium, in which SOD1 and ApoE accumulated, protected CGNs from degeneration and these effects were replicated when exogenous SOD1 or ApoE was added to a non-conditioned medium. SOD1 neuroprotective action was mediated by increased cell calcium from an external source. ApoE release is negatively affected by microglia activation, both with lipopolysaccharide (LPS) and Benzoylbenzoyl-ATP (Bz-ATP) but is stimulated by neuronal-conditioned medium as well as in microglia-neurons co-culture conditions. This neuronal-stimulated microglial ApoE release is differently regulated by activation states (i.e. LPS vs ATP) and by 6-hydroxydopamine-induced neurodegeneration. In co-culture conditions, microglial ApoE release is essential for neuroprotection, since microglial ApoE silencing through siRNA abrogated protection of cerebellar granule neurons against 6-OHDA toxicity. Therefore, these molecules could represent a target for manipulation aimed at promoting neuroprotection in brain diseases. Considering a pathological context, and the microglial ability to adopt a neuroprotective or neurotoxic profile, we characterize the microglial M1/M2 phenotype in transgenic rats (McGill-R-Thy1-APP) which reproduce extensively the Alzheimer’s-like amyloid pathology. Here, for the first time, cortical, hippocampal and cerebellar microglia of wild type and transgenic adult rats were compared, at both early and advanced stages of the pathology. In view of possible therapeutic translations, these findings are relevant to test microglial neuroprotection, in animal models of neurodegenerative diseases.

A 300 million year-long history. The metamorphic evolution of the Northern Apennine Variscan basement

The Variscan basement of Northern Apennines (Northern Italy) is a polymetamorphic portion of continental crust. This thesis investigated the metamorphic history of this basement occurring in the Cerreto Pass, in the Pontremoli well, and in the Pisani Mountains. The study comprised fieldwork, petrography and microstructural analysis, determination of the bulk rock and mineral composition, thermodynamic modelling, conventional geothermobarometry, monazite chemical dating and Ar/Ar dating of muscovite. The reconstructed metamorphic evolution of the selected samples allowed to define a long-lasting metamorphic history straddling the Variscan and Alpine orogenesis. Some general petrological issues generally found in low- to medium-grade metapelites were also tackled: (i) With middle-grade micaschist it is possible to reconstruct a complete P-T-D path by combining microstructural analysis and thermodynamic modelling. Prekinematic white mica may preserve Mg-rich cores related to the pre-peak stage. Mn-poor garnet rim records the peak metamorphism. Na-rich mylonitic white mica, the XFe of chlorite and the late paragenesis may constrain the retrograde stage. (ii) Metapelites may contain coronitic microstructures of apatite + Th-silicate, allanite and epidote around unstable monazite grains. Chemistry and microstructure of Th-rich monazite relics surrounded by this coronitic microstructure may suggest that monazite mineral was inherited and underwent partial dissolution and fluid-aided replacement by REE-accessory minerals at 500-600°C and 5-7 kbar. (iii) Fish-shaped white mica is not always a (prekinematic) mica-fish. Observed at high-magnification BSE images it may consist of several white mica formed during a mylonitic stage. Hence, the asymmetric foliation boudin is a suitable microstructure to obtain geochronological information about the shearing stage. (iv) Thermodynamic modelling of a hematite-rich metasedimentary rock fails to reproduce the observed mineral compositions when the bulk Fe2O3 is neglected or determined through titration. The mismatch between observed and computed mineral compositions and assemblage is resolved by tuning the effective ferric iron content by P-XFe2O3 diagrams.

Der Einfluss einer wildtypischen SOD1-Untereinheit auf Konformation und Stabilität mutanter SOD1-Heterodimere

Die Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist gekennzeichnet durch eine progressive Degeneration der Motoneurone. Die hierdurch im Patienten hervorgerufene fortschreitende Paralyse kann von wenigen Wochen über Monate bis zu mehreren Jahren variieren. Im Durchschnitt beträgt die Krankheitsdauer 3 - 5 Jahre. Häufig führt respiratorische Insuffizienz letztendlich zum Tod des Patienten. ALS ist bis heute unheilbar. Etwa 10 % aller ALS Fälle zeigen einen familiären Hintergrund. Hiervon werden ~20 % durch Mutationen im Gen des antioxidativen Enzyms CuZnSuperoxiddismutase (SOD1) verursacht. Mehr als 150 Mutationen im Gen der SOD1 wurden bisher als Auslöser der ALS beschrieben. Durch die Mutation erlangen SOD1 Proteine zusätzliche, bisher jedoch unbekannte toxische Eigenschaften. Ein dismutaseaktives SOD1 Enzym setzt sich aus zwei SOD1 Untereinheiten zusammen. Aufgrund der autosomal dominanten Vererbung der Krankheit kann ein SOD1 Dimer im Patienten als wildtypisches Homodimer (SOD1WT‑WT), als mutantes Homodimer (SOD1mut‑mut) oder als Heterodimer (SOD1mut-WT) vorliegen. In dieser Arbeit wurden SOD1 Dimere untersucht, deren Untereinheiten kovalent miteinander verbunden waren. Es konnte gezeigt werden, dass sich die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften mutanter SOD1 Heterodimere von mutanten SOD1 Homodimeren mit der gleichen Mutation unterschieden. Mutante SOD1 Heterodimere wiesen eine höhere Resistenz gegen einen Abbau durch Proteinase K auf als ihre korrespondierenden Homodimere. Des Weiteren verminderte eine wildtypische Untereinheit die Interaktion der Heterodimere mit Antikörpern gegen fehlgefaltete SOD1. Die Sekundärstruktur der mutanten SOD1 Heterodimere unterschied sich hierbei nicht auffällig von der Sekundärstruktur ihrer zugehörigen Homodimere. Eine wildtypische Untereinheit verändert somit möglicherweise die Tertiärstruktur seiner kovalent gebundenen mutanten SOD1 Untereinheit und/oder die Konformation des gesamten Dimerproteins. Durch die Mutation bedingte Missfaltungen werden hierdurch reduziert, die Stabilität des Dimers gegenüber proteolytischem Abbau erhöht. Nach der Aufreinigung der Dimerproteine wies das mutanten SOD1 Heterodimer diese Eigenschaften nicht mehr auf. Ein potentieller Interaktionspartner, der eine verminderte Fehlfaltung des Heterodimers oder eine verstärkte Missfaltung des Homodimers fördert, könnte hierbei während der Aufreinigungsprozedur verlorengegangen sein. Die hier nachgewiesene Konformationsänderung könnte über einen Prionen-ähnlichen Effekt übertragen werden und die erhöhte Stabilität das mutante, toxische Protein vor Degradation schützen. Dies korreliert mit der Beobachtung früherer Studien, in denen nachgewiesen wurde, dass mutante SOD1 Heterodimere potentiell toxischer sind als ihre korrespondierenden Homodimere.

Effects of maternal PETN treatment of spontaneously hypertensive rats on blood pressure in the offspring

Pentaerithrityltetranitrat (PETN) ist ein organisches Nitrat und wird in der Klinik zur Behandlung der Angina Pectoris eingesetzt. PETN hat, wenn direkt verabreicht, kaum Wirkung auf den Blutdruck. Diese Arbeit wurde konzipiert, um einen potentiellen „perinatalen Programmierung“-Effekt von PETN in spontan-hypertensiven Ratten (SHR), einem Rattenmodel der genetischen Hypertonie, zu testen. Die F0-Elterntiere wurden mit PETN (50 mg/kg/Tag) während der Schwangerschaft und der Laktation behandelt; die F1-Nachkommen bekamen nach der Ablaktation normales Haltungsfutter. Der Blutdruck wurde an den Nachkommen vom 3. Monat bis zum 8. Monat nach der Geburt gemessen. Maternale PETN-Behandlung hatte kaum Wirkung auf den Blutdruck in den männlichen SHR-Nachkommen. Dagegen zeigten die weiblichen Nachkommen der PETN-Behandlungsgruppe eine persistente Reduktion des Blutdrucks. Der systolische Blutdruck war in den weiblichen Nachkommen in der PETN-Gruppe etwa 13 mmHg niedriger im 4. Monat und etwa 10 mmHg niedriger im 8. Monat als in den Kontrolltieren. Dieser lang-anhaltende Effekt ging mit einer substanziellen Änderung der Genexpression einher, die auch beim 8. Monat noch nachzuweisen war. In den Aorten der weiblichen F1-Nachkommen wurde Veränderungen an Genexpression der α-adrenergen Rezeptoren sowie Endothelin-Rezeptoren festgestellt, die aber funktionell von minimaler Bedeutung für die PETN-Wirkung waren. Hingegen war eine klare Rolle des StickstoffmoNOXid (NO) zu sehen. Maternale PETN-Behandlung führte zur Heraufregulation der endothelialen NO-Synthase (eNOS) und der GTP-Cyclohydrolase I (GCH-1). GCH-1 ist für die Biosynthese des Tetrahydrobiopterins, eines essentiellen eNOS-Kofaktors, entscheidend, und dadurch auch für die eNOS-Funktionalität. Zusätzlich wurden auch anti-oxidative Enzyme wie die mitochondriale Superoxid-Dismutase (SOD2), die Glutathion-Peroxidase 1 (GPx1) und die Hem-Oxygenase 1 (HO-1) heraufreguliert, und die Superoxid-produzierende NADPH-Oxidase NOX1 herunterreguliert. Dies kann zur Verminderung vom oxidativen Stress und Erhöhung der NO-Bioverfügbarkeit führen. Letztlich wurde auch ~ 74 ~ die Sirtuin 1 (SIRT1) durch maternale PETN-Behandlung heraufreguliert, die auch zur Heraufregulation der SOD2, GPx1 und eNOS beitragen kann. Im Organbad-Experiment wurde die Acetylcholin-induzierte, Endothel-abhängige Vasodilatation in der Aorta der weiblichen Nachkommen der PETN-Gruppe verstärkt. Diese verbesserte Endothelfunktion, was vermutlich aus der Genexpressionsänderung resultiert, stellt sehr wahrscheinlich einen Schlüsselmechanismus der Blutdrucksenkung in den Nachkommen der PETN-behandelten F0-Tiere dar.

Blood-CNS barriers in neurodegenerative diseases

The blood-brain barrier (BBB) and the blood-spinal cord barrier (BSCB) separate the brain and the spinal cord from the circulating blood and are important for the maintenance of the CNS homeostasis. They build a physical barrier thereby protecting the CNS from pathogens and toxic agents, and their disruption plays a crucial role in the pathogenesis of several CNS disorders. In this thesis, the blood-CNS-barriers were studied via in vitro models in two case studies for neurodegenerative disorders, in particular Alzheimer’s disease (AD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The first model evaluates treatment possibilities of AD using nanotechnology-based strategies. Since the toxic amyloid-β42 (Aβ42) peptide plays a crucial role in the pathogenesis of AD, reduced generation or enhanced clearance of Aβ42 peptides are expected to modify the disease course in AD. Therefore, several Aβ42-lowering drugs like flurbiprofen had been tested in clinical trials, but most of them failed due to their low brain penetration. Here, flurbiprofen was embedded in polylactide (PLA) nanoparticles and its transport was examined in an in vitro BBB model. The embedding of flurbiprofen into the nanoparticles disguised its cytotoxic potential and enabled the administration of higher drug concentrations which resulted in a sufficient transport of the drug across an endothelial cell monolayer. These results demonstrate that non-permeable drugs can be transported efficiently via nanoparticles and that these nanotechnology-based strategies are a promising tool to generate novel therapeutic options for AD and other CNS diseases. rnThe focus of the second project was to investigate the impaired integrity of the BSCB in a mouse model for ALS. About 20% of all familial ALS cases are associated with missense mutations or small deletions in the gene that encodes Cu/Zn-superoxide dismutase 1 (SOD1). To date, the molecular mechanisms resulting in ALS are still unknown, but there is evidence that the disruption of the BSCB is one of the primary pathological events. In both familial and sporadic ALS patients, loss of endothelial integrity and endothelial cell damage was observed, and studies with SOD1 transgenic mice demonstrated that the BSCB disruption was found prior to motor neuron degeneration and neurovascular inflammation. Thus, an in vitro model for ALS endothelial cells was generated which exhibited comparable integrity characteristics and tight junction (TJ) protein expression profiles as isolated primary endothelial cells of the BSCB of SOD1 transgenic mice. In this, an alteration of the βcat/AKT/FoxO1 pathway, which regulates the expression of the TJ protein claudin-5, could be observed. These data furthermore indicate that ALS is a neurovascular disease, and understanding of the primary events in ALS pathogenesis will hopefully provide ideas for the development of new therapeutic strategies. rn

Untersuchung zur endogenen Bildung von oxidativen DNA-Schäden in vivo und in vitro

In dieser Arbeit sollte der Einfluss einer Überproduktion von humaner Superoxiddismutase 1 (hSOD1) auf die Spiegel der DNA-Schäden in verschiedenen Geweben von transgenen Mäusen untersucht werden. Tiere die eine Defizienz des Ogg1- und Csb- Proteins aufweisen und deshalb oxidative Purinmodifikationen nicht oder nur schwer reparieren können, akkumulieren 8-oxoG im Laufe ihres Lebens (Osterod, et al. 2001). Aus diesem Grund sind diese ein gutes Modell, um protektive Eigenschaften von Antioxidantien wie z.B. Substanzen oder Enzymen zu untersuchen. Fusser, et al. 2011 konnten beispielsweise zeigen, dass das pflanzliche Polyphenol Resveratrol die endogenen Spiegel an 8-oxoG sowie die spontanen Mutatiosraten im Lac I - Gen senken kann. Um den Einfluss von hSOD1 in vivo zu untersuchen, wurden in zwei Zuchtschritten 4 Mausgenotypen generiert, nämlich (Csb -/- Ogg1 -/- und Csb +/- Ogg1 +/- Mäuse jeweils mit ohne hSOD1 Überexpression). Diese wurden in verschiedenen Altersstufen auf die Basalspiegel an oxidativen Schäden (Einzelstrangbrüche und Fpg-sensitive Läsionen) in der Leber, der Niere und der Milz untersucht. Die Genotypen wurden zunächst charakterisiert und die hSOD1-Überexpression mittels qRT-PCR, Western Blot und Enzymaktivitätsbestimmung verifiziert. Es konnte an diesen Tieren erstmalig gezeigt werden, dass SOD die Generierung von DNA-Schäden in vivo mit zunehmendem Alter der Tiere senkt und dass deshalb Superoxid eine der reaktiven Sauerstoffspezies ist, die unter physiologischen Bedingungen für die DNA-Schäden verantwortlich ist. Außerdem kann ein möglicher toxischer Effekt der Überproduktion von SOD ausgeschlossen werden. Erhöhte Spiegel an oxidativen DNA-Schäden durch womöglich erhöhte Spiegel an H2O2 konnten in dieser Studie nicht beobachtet werden. Eine Messung der Genexpression anderer antioxidativer Enzyme wie Katalase, SOD2 und SOD3, GPX oder HO1 sind an diesem Effekt nicht beteiligt. Auch konnte kein Einfluss des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors Nrf2 gezeigt werden. rnUm mögliche Quellen der für die oxidativ gebildeten DNA-Schäden verantwortlichen ROS zu identifizieren, wurde der Einfluss des Dopaminstoffwechsels untersucht. Während des Dopaminmetabolismus werden intrazellulär Reaktive Sauerstoffspezies (H2O2 und O2.-) gebildet und tragen sehr wahrscheinlich zur Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson bei. In dem gängigen Parkinson-Zellkulturmodell SH-SY5Y konnte keine Erhöhung von oxidativen Schäden in nukleärer DNA nach Dopaminbehandlung nachgewiesen werden. Eine Überexpression der Dopaminmetabolisierenden Enzyme MAO-A und MAO-B zeigen bei niedrigen Dosen Dopamin eine leichte jedoch nicht signifikante Erhöhung der Fpg-sensitiven Modifikationen. Die Überproduktion des Dopamintransporters zeigte keinen Effekt nach Dopaminzugabe. Es kann geschlussfolgert werden, dass durch erhöhte MAO-A und MAO-B endogen ROS gebildet werden, die die Bildung Fpg-sensitiver Läsionen hervorrufen. Bei hohen Dosen und langer Inkubationszeit steht die Dopaminautoxidation, anschließende Neuromelaninbildung und als Konsequenz Apoptose im Vordergrund.rn

Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells

Endothelial progenitor cells (EPC) play a fundamental role in tissue regeneration and vascular repair. Current research suggests that EPC are more resistant to oxidative stress as compared to differentiated endothelial cells. Here we hypothesized that EPC not only possess the ability to protect themselves against oxidative stress but also confer this protection upon differentiated endothelial cells by release of paracrine factors. To test this hypothesis, HUVEC incubated with conditioned medium obtained from early EPC cultures (EPC-CM) were exposed to H2O2 to assess the accumulation of intracellular ROS, extent of apoptosis and endothelial cell functionality. Under oxidative stress conditions HUVEC treated with EPC-CM exhibited substantially lower levels of intracellular oxidative stress (0.2+/-0.02 vs. 0.4+/-0.03 relative fluorescence units, p<0.05) compared to control medium. Moreover, the incubation with EPC-CM elevated the expression level of antioxidant enzymes in HUVEC (catalase: 2.6+/-0.4; copper/zinc superoxide dismutase (Cu/ZnSOD): 1.6+/-0.1; manganese superoxide dismutase (MnSOD): 1.4+/-0.1-fold increase compared to control, all p<0.05). Furthermore, EPC-CM had the distinct potential to reverse the functional impairment of HUVEC as measured by their capability to form tubular structures in vitro. Finally, incubation of HUVEC with EPC-CM resulted in a significant reduction of apoptosis (0.34+/-0.01 vs. 1.52+/-0.12 relative fluorescence units, p<0.01) accompanied by an increased expression ratio of the anti/pro-apoptotic factors Bcl-2/Bax to 2.9+/-0.7-fold (compared to control, p<0.05). Most importantly, neutralization of selected cytokines such as VEGF, HGF, IL-8 and MMP-9 did not significantly reverse the cyto-protective effect of EPC-CM (p>0.05), suggesting that soluble factors secreted by EPC, possibly via broad synergistic actions, exert strong cyto-protective properties on differentiated endothelium through modulation of intracellular antioxidant defensive mechanisms and pro-survival signals.

A fluorescently labeled dendronized polymer-enzyme conjugate carrying multiple copies of two different types of active enzymes

A hybrid structure of a synthetic dendronized polymer, two different types of enzymes (superoxide dismutase and horseradish peroxidase), and a fluorescent dye (fluorescein) was synthesized. Thereby, a single polymer chain carried multiple copies of the two enzymes and the fluorescein. The entire attachment chemistry is based on UV/vis-quantifiable bis-aryl hydrazone bond formation that allows direct quantification of bound molecules: 60 superoxide dismutase, 120 horseradish peroxidase, and 20 fluorescein molecules on an average polymer chain of 2000 repeating units. To obtain other enzyme ratios the experimental conditions were altered accordingly. Moreover, it could be shown that both enzymes remained fully active and catalyzed a two-step cascade reaction.

Exercise training in normobaric hypoxia in endurance runners. III. Muscular adjustments of selected gene transcripts

We hypothesized that specific muscular transcript level adaptations participate in the improvement of endurance performances following intermittent hypoxia training in endurance-trained subjects. Fifteen male high-level, long-distance runners integrated a modified living low-training high program comprising two weekly controlled training sessions performed at the second ventilatory threshold for 6 wk into their normal training schedule. The athletes were randomly assigned to either a normoxic (Nor) (inspired O2 fraction = 20.9%, n = 6) or a hypoxic group exercising under normobaric hypoxia (Hyp) (inspired O2 fraction = 14.5%, n = 9). Oxygen uptake and speed at second ventilatory threshold, maximal oxygen uptake (VO2 max), and time to exhaustion (Tlim) at constant load at VO2 max velocity in normoxia and muscular levels of selected mRNAs in biopsies were determined before and after training. VO2 max (+5%) and Tlim (+35%) increased specifically in the Hyp group. At the molecular level, mRNA concentrations of the hypoxia-inducible factor 1alpha (+104%), glucose transporter-4 (+32%), phosphofructokinase (+32%), peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha (+60%), citrate synthase (+28%), cytochrome oxidase 1 (+74%) and 4 (+36%), carbonic anhydrase-3 (+74%), and manganese superoxide dismutase (+44%) were significantly augmented in muscle after exercise training in Hyp only. Significant correlations were noted between muscular mRNA levels of monocarboxylate transporter-1, carbonic anhydrase-3, glucose transporter-4, and Tlim only in the group of athletes who trained in hypoxia (P < 0.05). Accordingly, the addition of short hypoxic stress to the regular endurance training protocol induces transcriptional adaptations in skeletal muscle of athletic subjects. Expressional adaptations involving redox regulation and glucose uptake are being recognized as a potential molecular pathway, resulting in improved endurance performance in hypoxia-trained subjects.

Decreased infarct size after focal cerebral ischemia in mice chronically infected with Toxoplasma gondii

To determine whether Toxoplasma gondii infection could modify biological phenomena associated with brain ischemia, we investigated the effect of permanent middle cerebral artery occlusion (MCAO) on neuronal survival, inflammation and redox state in chronically infected mice. Infected animals showed a 40% to 50% decrease of infarct size compared with non-infected littermates 1, 4 and 14 days after MCAO. The resistance of infected mice may be associated with increased basal levels of anti-inflammatory cytokines and/or a marked reduction of the MCAO-related brain induction of two pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma (IFNgamma). In addition, potential anti-inflammatory/neuroprotective factors such as nerve growth factor, suppressor of cytokine signaling-3, superoxide dismutase activity, uncoupling protein-2 and glutathione (GSH) were upregulated in the brain of infected mice. Consistent with a role of GSH in central cytokine regulation, GSH depletion by diethyl maleate inhibited Toxoplasma gondii lesion resistance by increasing the proinflammatory cytokine IFNgamma brain levels. Overall, these findings indicate that chronic toxoplasmosis decisively influences both the inflammatory molecular events and outcome of cerebral ischemia.