Profiling of signal transduction in human memory T cells

Résumé pour un large public: La vaccination a eu un impact énorme sur la santé mondiale. Mais, quel est le principe d'un vaccin? Il est basé sur la 'mémoire immunologique', qui est une particularité exclusive des systèmes immunitaires des organismes évolués. Suite à une infection par un pathogène, des cellules spécialisées de notre système immunitaire (les lymphocytes) le reconnaissent et initient une réaction immunitaire qui a pour but son élimination. Pendant cette réaction se développent aussi des cellules, appelées cellules lymphocytaires mémoire, qui persistent pour longue durée et qui ont la capacité de stimuler une réaction immunitaire très efficace immédiatement après une seconde exposition à ce même pathogène. Ce sont ces cellules mémoires (lymphocytes B et T) qui sont à la base de la 'mémoire immunologique' et qui sont stimulées lors de la vaccination. Chez l'homme, deux populations distinctes des lymphocytes T mémoires ont été identifiées: les cellules centrales (CM) et effectrices (EM) mémoires. Ces populations sont fonctionnellement hétérogènes et exercent des rôles distincts et essentiels dans l'immunité protectrice. Typiquement, les cellules effectrices mémoires sont capables de tuer immédiatement le pathogène tandis que les cellules centrales mémoires sont responsables d'initier une réponse immunitaire complète. Pourtant, les mécanismes biochimiques qui contrôlent les fonctions de ces cellules ont été jusqu'à présent peu étudiés à cause de la faible fréquence de ces cellules et de la quantité limitée de tissus humains disponibles pour les analyses. La compréhension de ces mécanismes est cruciale pour la réalisation de vaccins efficaces et pour le développement de nouveaux médicaments capables de moduler la réponse immunitaire lymphocytaire. Dans cette thèse, nous avons d'abord développé et amélioré une technologie appelée 'protéine array en phase inverse' qui possède un niveau de sensibilité beaucoup plus élevé par rapport aux technologies classiquement utilisées dans l'étude des protéines. Grâce à cette technique, nous avons pu comparer la composition protéique du système de transmission des signaux d'activation des cellules CM et EM humaines. L'analyse de 8 à 13 sujets sains a montré que ces populations des cellules mémoires possèdent un système de signalisation protéique différent. En effet, les cellules EM possèdent, par rapport aux cellules CM, des niveaux réduits d'une protéine régulatrice (appelée c-Cbl) que nous avons démontré comme étant responsable des fonctions spécifiques de ces cellules. En effet, en augmentant artificiellement l'expression de cette protéine régulatrice dans les cellules EM jusqu'au niveau de celui des cellules CM, nous avons induit dans les cellules EM des capacités fonctionnelles caractéristiques des cellules CM. En conclusion, notre étude a identifié, pour la première fois chez l'homme, un mécanisme biochimique qui contrôle les fonctions des populations des cellules mémoires. Résumé en Français: Les cellules mémoires persistent inertes dans l'organisme et produisent des réactions immunitaires rapides et robustes contre les pathogènes précédemment rencontrés. Deux populations distinctes des cellules mémoires ont été identifiées chez l'homme: les cellules centrales (CM) et effectrices (EM) mémoires. Ces populations sont fonctionnellement hétérogènes et exercent des rôles distincts et critiques dans l'immunité protectrice. Les mécanismes biochimiques qui contrôlent leurs fonctions ont été jusqu'à présent peu étudiés, bien que leur compréhension soit cruciale pour le développement des vaccins et des nouveaux traitements/médicaments. Les limites majeures à ces études sont la faible fréquence de ces populations et la quantité limitée de tissus humains disponibles. Dans cette thèse nous avons d'abord développé et amélioré la technologie de 'protéine array en phase inverse' afin d'analyser les molécules de signalisation des cellules mémoires CD4 et CD8 humaines isolées ex vivo. L'excellente sensibilité, la reproductibilité et la linéarité de la détection, ont permis de quantifier des variations d'expression protéiques supérieures à 20% dans un lysat équivalent à 20 cellules. Ensuite, grâce à l'analyse de 8 à 13 sujets sains, nous avons prouvé que les cellules mémoires CD8 ont une composition homogène de leur système de signalisation tandis que les cellules CD4 EM expriment significativement de plus grandes quantités de SLP-76 et des niveaux réduits de c-Cbl, Syk, Fyn et LAT par rapport aux cellules CM. En outre, l'expression réduite du régulateur négatif c-Cbl est corrélée avec l'expression des SLP-76, PI3K et LAT uniquement dans les cellules EM. L'évaluation des propriétés fonctionnelles des cellules mémoires a permis de démontrer que l'expression réduite du c-Cbl dans les cellules EM est associé à une diminution de leur seuil d'activation. En effet, grâce a la technique de transduction cytosolique, nous avons augmenté la quantité de c-Cbl des cellules EM à un niveau comparable à celui des cellules CM et constaté une réduction de la capacité des cellules EM à proliférer et sécréter des cytokines. Ce mécanisme de régulation dépend principalement de l'activité d'ubiquitine ligase de c-Cbl comme démontré par l'impact réduit du mutant enzymatiquement déficient de c-Cbl sur les fonctions de cellules EM. En conclusion, cette thèse identifie c-Cbl comme un régulateur critique des réponses fonctionnelles des populations de cellules T mémoires et fournit, pour la première fois chez l'homme, un mécanisme contrôlant l'hétérogénéité fonctionnelle des ces cellules. De plus, elle valide l'utilisation combinée des 'RPP arrays' et de la transduction cytosolique comme outil puissant d'analyse quantitative et fonctionnel des protéines de signalisation. Summary : Memory cells persist in a quiescent state in the body and mediate rapid and vigorous immune responses toward pathogens previously encountered. Two subsets of memory cells, namely central (CM) and effector (EM) memory cells, have been identified in humans. These subsets display high functional heterogeneity and assert critical and distinct roles in the control of protective immunity. The biochemical mechanisms controlling their functional properties remain so far poorly investigated, although their clarification is crucial for design of effective T-cell vaccine and drug development. Major limitations to these studies lie in the low frequency of memory T cell subsets and the limited amount of human specimen available. In this thesis we first implemented the innovative reverse phase protein array approach to profile 15 signalling components in human CD8 and CD4 memory T cells isolated ex vivo. The high degree of sensitivity, reproducibility and linearity achieved, allowed an excellent quantification of variations in protein expression higher than 20% in as few as 20-cell equivalent per spot. Based on the analysis of 8 to 13 healthy subjects, we showed that CD8 memory cells have a homogeneous composition of their signaling machinery while CD4 EM cells express statistically significant increased amounts of SLP-76 and reduced levels of c- Cbl, Syk, Fyn and LAT as compared to CM cells. Moreover, in EM but not CM cells, reduced expression of negative regulator c-Cbl correlated with the expression of SLP-76, PI3K and LAT. Subsequently, we demonstrated that the higher functional properties and the lower functional threshold of EM cells is associated with reduced expression of c-Cbl. Indeed, by increasing c-Cbl content of EM cells to the same level of CM cells using cytosolic transduction, we impaired their proliferation and cytokine production. This regulatory mechanism was primarily dependent on c-Cbl E3 ubiquitin ligase activity as evidenced by the weaker impact of enzymatically deficient c-Cbl C381A mutant on EM cell functions. Together, these results identify c-Cbl as a critical regulator of the functional responses of memory T cell subsets and provides, for the first time in humans, a mechanism controlling the functional heterogeneity of memory CD4 cells. Moreover it validates the combined use of RPP arrays and cytosolic transduction approaches as a powerful tool to quantitatively analyze signalling proteins and functionally assess their roles.

Similarity measure based classification

Luokittelujärjestelmää suunniteltaessa tarkoituksena on rakentaa systeemi, joka pystyy ratkaisemaan mahdollisimman tarkasti tutkittavan ongelma-alueen. Hahmontunnistuksessa tunnistusjärjestelmän ydin on luokitin. Luokittelun sovellusaluekenttä on varsin laaja. Luokitinta tarvitaan mm. hahmontunnistusjärjestelmissä, joista kuvankäsittely toimii hyvänä esimerkkinä. Myös lääketieteen parissa tarkkaa luokittelua tarvitaan paljon. Esimerkiksi potilaan oireiden diagnosointiin tarvitaan luokitin, joka pystyy mittaustuloksista päättelemään mahdollisimman tarkasti, onko potilaalla kyseinen oire vai ei. Väitöskirjassa on tehty similaarisuusmittoihin perustuva luokitin ja sen toimintaa on tarkasteltu mm. lääketieteen paristatulevilla data-aineistoilla, joissa luokittelutehtävänä on tunnistaa potilaan oireen laatu. Väitöskirjassa esitetyn luokittimen etuna on sen yksinkertainen rakenne, josta johtuen se on helppo tehdä sekä ymmärtää. Toinen etu on luokittimentarkkuus. Luokitin saadaan luokittelemaan useita eri ongelmia hyvin tarkasti. Tämä on tärkeää varsinkin lääketieteen parissa, missä jo pieni tarkkuuden parannus luokittelutuloksessa on erittäin tärkeää. Väitöskirjassa ontutkittu useita eri mittoja, joilla voidaan mitata samankaltaisuutta. Mitoille löytyy myös useita parametreja, joille voidaan etsiä juuri kyseiseen luokitteluongelmaan sopivat arvot. Tämä parametrien optimointi ongelma-alueeseen sopivaksi voidaan suorittaa mm. evoluutionääri- algoritmeja käyttäen. Kyseisessä työssä tähän on käytetty geneettistä algoritmia ja differentiaali-evoluutioalgoritmia. Luokittimen etuna on sen joustavuus. Ongelma-alueelle on helppo vaihtaa similaarisuusmitta, jos kyseinen mitta ei ole sopiva tutkittavaan ongelma-alueeseen. Myös eri mittojen parametrien optimointi voi parantaa tuloksia huomattavasti. Kun käytetään eri esikäsittelymenetelmiä ennen luokittelua, tuloksia pystytään parantamaan.

Stratification of the severity of critically ill patients with classification trees

Background: Development of three classification trees (CT) based on the CART (Classification and Regression Trees), CHAID (Chi-Square Automatic Interaction Detection) and C4.5 methodologies for the calculation of probability of hospital mortality; the comparison of the results with the APACHE II, SAPS II and MPM II-24 scores, and with a model based on multiple logistic regression (LR). Methods: Retrospective study of 2864 patients. Random partition (70:30) into a Development Set (DS) n = 1808 and Validation Set (VS) n = 808. Their properties of discrimination are compared with the ROC curve (AUC CI 95%), Percent of correct classification (PCC CI 95%); and the calibration with the Calibration Curve and the Standardized Mortality Ratio (SMR CI 95%). Results: CTs are produced with a different selection of variables and decision rules: CART (5 variables and 8 decision rules), CHAID (7 variables and 15 rules) and C4.5 (6 variables and 10 rules). The common variables were: inotropic therapy, Glasgow, age, (A-a)O2 gradient and antecedent of chronic illness. In VS: all the models achieved acceptable discrimination with AUC above 0.7. CT: CART (0.75(0.71-0.81)), CHAID (0.76(0.72-0.79)) and C4.5 (0.76(0.73-0.80)). PCC: CART (72(69- 75)), CHAID (72(69-75)) and C4.5 (76(73-79)). Calibration (SMR) better in the CT: CART (1.04(0.95-1.31)), CHAID (1.06(0.97-1.15) and C4.5 (1.08(0.98-1.16)). Conclusion: With different methodologies of CTs, trees are generated with different selection of variables and decision rules. The CTs are easy to interpret, and they stratify the risk of hospital mortality. The CTs should be taken into account for the classification of the prognosis of critically ill patients.

Prediction of crude protein and classification of the growth stage of wheat plant samples from NIR spectra

Near-infrared spectroscopy (NIRS) was used to analyse the crude protein content of dried and milled samples of wheat and to discriminate samples according to their stage of growth. A calibration set of 72 samples from three growth stages of wheat (tillering, heading and harvest) and a validation set of 28 samples was collected for this purpose. Principal components analysis (PCA) of the calibration set discriminated groups of samples according to the growth stage of the wheat. Based on these differences, a classification procedure (SIMCA) showed a very accurate classification of the validation set samples : all of them were successfully classified in each group using this procedure when both the residual and the leverage were used in the classification criteria. Looking only at the residuals all the samples were also correctly classified except one of tillering stage that was assigned to both tillering and heading stages. Finally, the determination of the crude protein content of these samples was considered in two ways: building up a global model for all the growth stages, and building up local models for each stage, separately. The best prediction results for crude protein were obtained using a global model for samples in the two first growth stages (tillering and heading), and using a local model for the harvest stage samples.

Quelle perception ont les médecins de famille en Suisse de leur rôle dans la prévention et la promotion de la santé? : comprendre les barrières à l'implémentation

Introduction: The importance of health promotion and prevention and the potential of general practitioners (GPs) to conduct individual prevention procedures have been demonstrated in several studies. Clinical recommendations for screening and prevention activities, an important condition for success, are published regularly, but their implementation into daily practice does not necessarily follow. Information is lacking about the actual conditions of how prevention is carried out on a daily basis by Swiss GPs, about their perceptions and needs, their attitudes and the present barriers they face. Such information is essential for the development of new tools and programs targeting better implementation of clinical recommendations for prevention in primary care in Switzerland. Objectives: The objectives of the study were to analyze how Swiss GPs perceive their role in prevention by obtaining information regarding the following issues: What do disease prevention and health promotion mean to them? What are the current incentives and barriers they face? What are their ideas and suggestions to deal with these barriers? What are their needs and expectations regarding prevention guidelines and tools? Methods: We conducted a qualitative research project using focus groups to examine the questions mentioned above. A total of 13 focus groups took place including GPs from eight cantons: five groups in German- speaking Switzerland and eight in French- speaking Switzerland. Each group was composed of 4-11 GPs, making in total 102 participants, who were paid expenses to cover their participation. The sessions were audio-recorded and transcribed verbatim. Data analysis: Content analysis of the transcriptions began by classifying the data according to a typology, the first level of which was developed in line with the structure of the interview guide. This typology was extended by successively regrouping similar statements. Synopsis and interpretation was then performed on each category thus obtained. This research report is based on the results from the French-speaking cantons. Results: Physicians perceive a change in their role as a consequence of changes in society and the health system. They emphasize the importance of a personalized and long lasting relationship between the family doctor and his/her patient; a privileged position allowing them to perform individualized prevention activities, considered to be more effective, as they are appropriate to the specific situation and needs of the patient. They point out their need for training and for better information concerning prevention and health promotion interventions, and stress difficulties arising from the lack of a clear political signal conferring them with a mandate for prevention. -- INTRODUCTION L'importance de la prévention et de la promotion de la santé et le potentiel des médecins de famillea à mettre en oeuvre des mesures individuelles de prévention, de dépistage et de conseils, a été démontrée dans plusieurs études. Régulièrement durant les dernières années, de nombreuses associations médicales ont publié des recommandations cliniques concernant les activités de dépistage et de prévention qui sont une condition essentielle pour le succès, mais ne sont pas forcément appliquées de manière systématique dans la pratique médicale quotidienne. Des contraintes spécifiques contribuent à l'écart entre le désir des médecins de pratiquer une médecine préventive et la réalité d'un cabinet médical. Nous n'avons que peu de données sur les conditions actuelles dans lesquelles la prévention et la promotion de la santé sont réalisées par les médecins de famille suisses dans leur travail quotidien. Des informations précises et représentatives sur leurs perceptions et leurs besoins, leurs attitudes et les contraintes auxquelles ils sont confrontés manquent. Or ces données sont essentielles dans le développement de nouveaux outils et programmes visant une meilleure implémentation des recommandations cliniques dans le domaine de la prévention et la promotion de la santé dans la médecine de famille en Suisse. OBJECTIFS Le développement de concepts pour une prévention systématique ainsi que d'outils adéquats, tout comme l'amélioration des conditions qui permettent une implémentation à grande échelle, implique, avant tout, l'analyse de la perception que les médecins de famille suisses ont de leur rôle dans la prévention. Par conséquent, cette étude a eu pour objectif d'obtenir des informations concernant les questions suivantes : ? Que signifient la prévention et la promotion de la santé pour les médecins de famille suisses ? ? Quelles sont leurs incitations et les barrières rencontrées ? ? Quelles sont leurs idées et leurs suggestions pour faire face à ces contraintes ? ? Quels sont leurs besoins et leurs attentes concernant les outils pour la prévention ? METHODES Nous avons mené un projet de recherche qualitative en utilisant la technique des focus groups pour examiner les questions mentionnées ci-dessus. Une telle technique de collecte de données est particulièrement adaptée à un domaine où l'on connaît mal les perceptions des parties prenantes. Nous avons mené 13 focus groups au total, comprenant des médecins issus de huit cantons: cinq groupes ont eu lieu en Suisse alémanique et huit groupes en Suisse romande. Chaque groupe était composé de 4 à 11 médecins de famille, avec au total 102 participants qui ont été défrayés pour leur participation. Les séances ont été audio-enregistrées et transcrites. ANALYSE DES DONNEES L'analyse du contenu des transcriptions a commencé par la classification des données selon une typologie dont le premier niveau a été développé à partir de la structure de la grille d'entretiens. Cette typologie a été affinée et élargie en regroupant successivement des propos similaires. Une synthèse a été effectuée pour chaque catégorie. Ce rapport est basé sur les résultats de l'analyse des données des cantons francophones. RESULTATS Les médecins perçoivent un changement de leur rôle dans une société et dans un système de santé qui évoluent. Ils soulignent l'importance de la relation personnalisée et durable du médecin de famille avec son patient, atout précieux, qui leur permet de réaliser des activités de prévention individualisées et adaptées à la situation et aux besoins du patient, considérées plus efficaces. Afin de surmonter leur doutes et découragement par rapport aux interventions de prévention, ils pointent la nécessité d'une formation aux nouvelles connaissances en prévention et promotion de la santé et d'une meilleure information aux médecins quant à leur efficacité et importance. Ils montrent le besoin d'un signal clair des politiques par rapport à l'attribution de ce mandat aux médecins de famille et de leur reconnaissance en tant qu'acteur de prévention dans le système de santé.

Integrating defeasible argumentation with fuzzy ART neural networks for pattern classification

Many classification systems rely on clustering techniques in which a collection of training examples is provided as an input, and a number of clusters c1,...cm modelling some concept C results as an output, such that every cluster ci is labelled as positive or negative. Given a new, unlabelled instance enew, the above classification is used to determine to which particular cluster ci this new instance belongs. In such a setting clusters can overlap, and a new unlabelled instance can be assigned to more than one cluster with conflicting labels. In the literature, such a case is usually solved non-deterministically by making a random choice. This paper presents a novel, hybrid approach to solve this situation by combining a neural network for classification along with a defeasible argumentation framework which models preference criteria for performing clustering.

Evidence-based provisional clinical classification criteria for autoinflammatory periodic fevers.

The objective of this work was to develop and validate a set of clinical criteria for the classification of patients affected by periodic fevers. Patients with inherited periodic fevers (familial Mediterranean fever (FMF); mevalonate kinase deficiency (MKD); tumour necrosis factor receptor-associated periodic fever syndrome (TRAPS); cryopyrin-associated periodic syndromes (CAPS)) enrolled in the Eurofever Registry up until March 2013 were evaluated. Patients with periodic fever, aphthosis, pharyngitis and adenitis (PFAPA) syndrome were used as negative controls. For each genetic disease, patients were considered to be 'gold standard' on the basis of the presence of a confirmatory genetic analysis. Clinical criteria were formulated on the basis of univariate and multivariate analysis in an initial group of patients (training set) and validated in an independent set of patients (validation set). A total of 1215 consecutive patients with periodic fevers were identified, and 518 gold standard patients (291 FMF, 74 MKD, 86 TRAPS, 67 CAPS) and 199 patients with PFAPA as disease controls were evaluated. The univariate and multivariate analyses identified a number of clinical variables that correlated independently with each disease, and four provisional classification scores were created. Cut-off values of the classification scores were chosen using receiver operating characteristic curve analysis as those giving the highest sensitivity and specificity. The classification scores were then tested in an independent set of patients (validation set) with an area under the curve of 0.98 for FMF, 0.95 for TRAPS, 0.96 for MKD, and 0.99 for CAPS. In conclusion, evidence-based provisional clinical criteria with high sensitivity and specificity for the clinical classification of patients with inherited periodic fevers have been developed.

A founder CEP120 mutation in Jeune asphyxiating thoracic dystrophy expands the role of centriolar proteins in skeletal ciliopathies.

Jeune asphyxiating thoracic dystrophy (JATD) is a skeletal dysplasia characterized by a small thoracic cage and a range of skeletal and extra-skeletal anomalies. JATD is genetically heterogeneous with at least nine genes identified, all encoding ciliary proteins, hence the classification of JATD as a skeletal ciliopathy. Consistent with the observation that the heterogeneous molecular basis of JATD has not been fully determined yet, we have identified two consanguineous Saudi families segregating JATD who share a single identical ancestral homozygous haplotype among the affected members. Whole-exome sequencing revealed a single novel variant within the disease haplotype in CEP120, which encodes a core centriolar protein. Subsequent targeted sequencing of CEP120 in Saudi and European JATD cohorts identified two additional families with the same missense mutation. Combining the four families in linkage analysis confirmed a significant genome-wide linkage signal at the CEP120 locus. This missense change alters a highly conserved amino acid within CEP120 (p.Ala199Pro). In addition, we show marked reduction of cilia and abnormal number of centrioles in fibroblasts from one affected individual. Inhibition of the CEP120 ortholog in zebrafish produced pleiotropic phenotypes characteristic of cilia defects including abnormal body curvature, hydrocephalus, otolith defects and abnormal renal, head and craniofacial development. We also demonstrate that in CEP120 morphants, cilia are shortened in the neural tube and disorganized in the pronephros. These results are consistent with aberrant CEP120 being implicated in the pathogenesis of JATD and expand the role of centriolar proteins in skeletal ciliopathies.