The role of Microsomal prostaglandin synthase-1 (mPGES-1) and Ephrin B2 in Scleroderma

La sclérodermie (sclérose systémique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractérisée  par  l’épaississement  de  la  peau,  l’apparition  spontanée de lésions cicatricielles, des maladies   des   vaisseaux   sanguins,   divers   degrés   d’inflammation,   en   association   avec   un   système   immunitaire hyperactif. La pathogénèse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement approprié   n’est   disponible.   La fibrose est un élément distinctif de la maladie de ScS et est considérée   résulter   d’une   incapacité   à   mettre   fin   de   façon   appropriée   à   la   réponse   normale   de   réparation   des   plaies.   L’analyse   histologique   du   stade   initial   de   la   ScS   révèle   une   infiltration   périvasculaire de cellules mononucléaires dans le derme, associée à une synthèse accrue de collagène dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la compréhension des moyens de contrôler le stade inflammatoire de la ScS pourrait être bénéfique pour contrôler la progression de la maladie peu après son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygénase (COX) pour catalyser spécifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1  joue  un  rôle  clé  dans  l’inflammation,  la  douleur  et  l’arthrite;;  toutefois,  le   rôle de la mPGES-1 dans les mécanismes de fibrose, spécifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a précédemment montré que les souris à mPGES-1 nulle sont résistantes à la fibrose   cutanée   induite   par   la   bléomycine,   à   l’inflammation,   à   l’épaississement  cutané,  à  la  production  de  collagène  et  à  la  formation  de  myofibroblastes.  Sur  la   base  de  ces  résultats,  j’ai  formulé  l’hypothèse  que  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1 régulera à la baisse la production de médiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie   de   ScS.   Afin   d’explorer   le   rôle   de   la   mPGES-1   dans   l’inflammation   et   la   fibrose   associées  à  la  maladie  de  ScS,  j’ai  d’abord  examiné  l’expression  de  la  mPGES-1 dans la peau normale comparativement à des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes résultats ont montré que la mPGES-1 est nettement élevée dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 dérivés de la mPGES-1 étaient également significativement plus élevés dans les fibroblastes cutanés isolés de patients  atteints  de  ScS  comparativement  aux  fibroblastes  isolés  de  témoins  sains.  J’ai  également   étudié  l’effet  de  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1  sur  l’expression  de  marqueurs  pro- fibreux.   Mes   études   ont   montré   que   l’expression   de   médiateurs   pro-fibreux clés (α-SMA, endothéline-1, collagène de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est élevée dans les fibroblastes cutanés ScS en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de réduire significativement l’expression  de  l’α-SMA,  de  l’endothéline-1, du collagène de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes  ScS,  sans  effet  significatif  sur  les  fibroblastes  normaux.  J’ai  en  outre  examiné  l’effet   de  l’inhibition  de  la  mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires clés impliquées dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1.  L’inhibition  pharmacologique  de  la  mPGES- 1 a eu pour effet de réduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lésion ScS comparativement à des fibroblastes non traités. De plus, les patients atteints de ScS ont présenté des niveaux plus élevés de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. L’inhibiteur  de  la  mPGES-1 a pu réguler à la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3,  dans  les  fibroblastes  ScS.  Ces  résultats  ont  suggéré  que  l’inhibition   de la mPGES-1 pourrait être une méthode viable pour réduire le développement de sclérose cutanée et constituent une cible thérapeutique potentielle pour contrôler les mécanismes fibreux et inflammatoires associés à la pathophysiologie de la maladie de ScS. L’un   des   autres   processus   critiques   reliés   à   l’évolution de la réponse fibreuse associée à la maladie de ScS est la différenciation des fibroblastes en des cellules activées spécialisées iii iv appelées myofibroblastes, responsables de déclencher une signalisation adhésive excessive et le dépôt excessif de matrice extracellulaire,   conduisant   à   la   destruction   de   l’architecture   de   l’organe.   Ainsi,   l’identification   des   facteurs   endogènes   qui   initient/   favorisent   la   différenciation   fibroblaste-myofibroblaste peut mener à des stratégies thérapeutiques prometteuses pour contrôler  l’excès  de  signalisation  adhésive  et  de  fibrose  associé  à  la  maladie  de  ScS.  Des  études   antérieures  dans  le  domaine  de  la  biologie  du  cancer  ont  suggéré  que  l’éphrine  B2,  une  protéine   transmembranaire appartenant à la famille des éphrines, est impliquée dans la signalisation adhésive   et   le   remodelage   extracellulaire.   Cependant,   son   rôle   dans   la   fibrose   n’a   jamais   été   exploré.   Dans   la   deuxième   partie   de   mon   étude,   j’ai   donc   étudié   le   rôle   de   l’éphrine   B2   dans   la   fibrose.   Mes   études   montrent   que   l’expression   de   l’éphrine   B2   est   significativement   augmentée   dans la peau humaine ScS comparativement à la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de   fibroblastes   de   la   peau   humaine   normale   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractéristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de  fibres  de  tension,  des  adhérences  focales,  l’activation  accrue  de  la  FAK,  un  accroissement  de   l’expression  et  de  la  migration  de  fibroblastes  et  de  leur  adhérence  à  la  fibronectine  à  la  fois  chez   les   fibroblastes   cutanés   normaux   et   ScS.   En   outre,   j’ai   traité   des   souris   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante et montré que ces souris ont développé une fibrose cutanée significative associée à une épaisseur dermique et à une synthèse de collagène augmentées, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagène) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de   l’α-SMA, une activation augmentée de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagène de type 1 et le FCTC. Dans  l’ensemble,  mes  études  ont  identifié  deux  médiateurs  endogènes  cruciaux  impliqués  dans  la   propagation  de  l’inflammation  et  de  la  fibrose  associées  à  la  maladie  de  ScS.  L’inhibition  de  la   mPGES-1   pourrait   représenter   une   bonne   stratégie   alternative   pour   contrer   l’inflammation   et   la   fibrose au moins durant les stades précoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive   de   l’éphrine B2 favorise la signalisation adhésive et fibreuse en déclenchant la différenciation   de   fibroblastes   en   myofibroblastes   par   l’activation   de   la   voie   de   signalisation   de   la  FAK.  Ainsi,  l’inhibition  d’éphrine  B2  bloquera  la  formation  de  fibroblastes-myofibroblastes et régulera à la baisse la fibrose associée à la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1  et  l’éphrine   B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont reliés.

Études de type structure fonction des mutations causant l’ataxie épisodique de type I sur les canaux potassiques dépendants du voltage

Les ataxies épisodiques (EA) d’origine génétique sont un groupe de maladies possédant un phénotype et génotype hétérogènes, mais ont en commun la caractéristique d’un dysfonctionnement cérébelleux intermittent. Les EA de type 1 et 2 sont les plus largement reconnues des ataxies épisodiques autosomiques dominantes et sont causées par un dysfonctionnement des canaux ioniques voltage-dépendants dans les neurones. La présente étude se concentrera sur les mutations causant l'EA-1, retrouvées dans le senseur de voltage (VSD) de Kv1.1, un canal très proche de la famille des canaux Shaker. Nous avons caractérisé les propriétés électrophysiologiques de six mutations différentes à la position F244 et partiellement celles des mutations T284 A/M, R297 K/Q/A/H, I320T, L375F, L399I et S412 C/I dans la séquence du Shaker grâce à la technique du ‘’cut open voltage clamp’’ (COVC). Les mutations de la position F244 situées sur le S1 du canal Shaker sont caractérisées par un décalement des courbes QV et GV vers des potentiels dépolarisants et modifient le couplage fonctionnel entre le domaine VSD et le pore. Un courant de fuite est observé durant la phase d'activation des courants transitoires et peut être éliminé par l'application du 4-AP (4-aminopyridine) ou la réinsertion de l'inactivation de type N mais pas par le TEA (tétraéthylamonium). Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la stabilisation d’un état intermédiaire, nous avons étudié séparément la neutralisation des trois premières charges positives du S4 (R1Q, R2Q et R3Q). Il en est ressorti l’existence d’une interaction entre R2 et F244. Une seconde interface entre S1 et le pore proche de la surface extracellulaire agissant comme un second point d'ancrage et responsable des courants de fuite a été mis en lumière. Les résultats suggèrent une anomalie du fonctionnement du VSD empêchant la repolarisation normale de la membrane des cellules nerveuses affectées à la suite d'un potentiel d'action.

Régulation moléculaire de la barrière hémo-encéphalique

La Sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (SNC), lors de laquelle des cellules inflammatoires du sang périphérique infiltrent le SNC pour y causer des dommages cellulaires. Dans ces réactions neuroinflammatoires, les cellules immunitaires traversent le système vasculaire du SNC, la barrière hémo-encéphalique (BHE), pour avoir accès au SNC et s’y accumuler. La BHE est donc la première entité que rencontrent les cellules inflammatoires du sang lors de leur migration au cerveau. Ceci lui confère un potentiel thérapeutique important pour influencer l’infiltration de cellules du sang vers le cerveau, et ainsi limiter les réactions neuroinflammatoires. En effet, les interactions entre les cellules immunitaires et les parois vasculaires sont encore mal comprises, car elles sont nombreuses et complexes. Différents mécanismes pouvant influencer la perméabilité de la BHE aux cellules immunitaires ont été décrits, et représentent aujourd’hui des cibles potentielles pour le contrôle des réactions neuro-immunes. Cette thèse a pour objectif de décrire de nouveaux mécanismes moléculaires opérant au niveau de la BHE qui interviennent dans les réactions neuroinflammatoires et qui ont un potentiel thérapeutique pour influencer les interactions neuro-immunologiques. Ce travail de doctorat est séparé en trois sections. La première section décrit la caractérisation du rôle de l’angiotensine II dans la régulation de la perméabilité de la BHE. La seconde section identifie et caractérise la fonction d’une nouvelle molécule d’adhérence de la BHE, ALCAM, dans la transmigration de cellules inflammatoires du sang vers le SNC. La troisième section traite des propriétés sécrétoires de la BHE et du rôle de la chimiokine MCP-1 dans les interactions entre la BHE et les cellules souches. Dans un premier temps, nous démontrons l’importance de l’angiotensinogène (AGT) dans la régulation de la perméabilité de la BHE. L’AGT est sécrété par les astrocytes et métabolisé en angiotensine II pour pouvoir agir au niveau des CE de la BHE à travers le récepteur à l’angiotensine II, AT1 et AT2. Au niveau de la BHE, l’angiotensine II entraîne la phosphorylation et l’enrichissement de l’occludine au sein de radeaux lipidiques, un phénomène associé à l’augmentation de l’étanchéité de la BHE. De plus, dans les lésions de SEP, on retrouve une diminution de l’expression de l’AGT et de l’occludine. Ceci est relié à nos observations in vitro, qui démontrent que des cytokines pro-inflammatoires limitent la sécrétion de l’AGT. Cette étude élucide un nouveau mécanisme par lequel les astrocytes influencent et augmentent l’étanchéité de la BHE, et implique une dysfonction de ce mécanisme dans les lésions de la SEP où s’accumulent les cellules inflammatoires. Dans un deuxième temps, les techniques établies dans la première section ont été utilisées afin d’identifier les protéines de la BHE qui s’accumulent dans les radeaux lipidiques. En utilisant une technique de protéomique nous avons identifié ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) comme une protéine membranaire exprimée par les CE de la BHE. ALCAM se comporte comme une molécule d’adhérence typique. En effet, ALCAM permet la liaison entre les cellules du sang et la paroi vasculaire, via des interactions homotypiques (ALCAM-ALCAM pour les monocytes) ou hétérotypiques (ALCAM-CD6 pour les lymphocytes). Les cytokines inflammatoires augmentent le niveau d’expression d’ALCAM par la BHE, ce qui permet un recrutement local de cellules inflammatoires. Enfin, l’inhibition des interactions ALCAM-ALCAM et ALCAM-CD6 limite la transmigration des cellules inflammatoires (monocytes et cellules T CD4+) à travers la BHE in vitro et in vivo dans un modèle murin de la SEP. Cette deuxième partie identifie ALCAM comme une cible potentielle pour influencer la transmigration de cellules inflammatoires vers le cerveau. Dans un troisième temps, nous avons pu démontrer l’importance des propriétés sécrétoires spécifiques à la BHE dans les interactions avec les cellules souches neurales (CSN). Les CSN représentent un potentiel thérapeutique unique pour les maladies du SNC dans lesquelles la régénération cellulaire est limitée, comme dans la SEP. Des facteurs qui limitent l’utilisation thérapeutique des CSN sont le mode d’administration et leur maturation en cellules neurales ou gliales. Bien que la route d’administration préférée pour les CSN soit la voie intrathécale, l’injection intraveineuse représente la voie d’administration la plus facile et la moins invasive. Dans ce contexte, il est important de comprendre les interactions possibles entre les cellules souches et la paroi vasculaire du SNC qui sera responsable de leur recrutement dans le parenchyme cérébral. En collaborant avec des chercheurs de la Belgique spécialisés en CSN, nos travaux nous ont permis de confirmer, in vitro, que les cellules souches neurales humaines migrent à travers les CE humaines de la BHE avant d’entamer leur différenciation en cellules du SNC. Suite à la migration à travers les cellules de la BHE les CSN se différencient spontanément en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces effets sont notés préférentiellement avec les cellules de la BHE par rapport aux CE non cérébrales. Ces propriétés spécifiques aux cellules de la BHE dépendent de la chimiokine MCP-1/CCL2 sécrétée par ces dernières. Ainsi, cette dernière partie suggère que la BHE n’est pas un obstacle à la migration de CSN vers le SNC. De plus, la chimiokine MCP-1 est identifiée comme un facteur sécrété par la BHE qui permet l’accumulation et la différentiation préférentielle de cellules souches neurales dans l’espace sous-endothélial. Ces trois études démontrent l’importance de la BHE dans la migration des cellules inflammatoires et des CSN vers le SNC et indiquent que de multiples mécanismes moléculaires contribuent au dérèglement de l’homéostasie du SNC dans les réactions neuro-immunes. En utilisant des modèles in vitro, in situ et in vivo, nous avons identifié trois nouveaux mécanismes qui permettent d’influencer les interactions entre les cellules du sang et la BHE. L’identification de ces mécanismes permet non seulement une meilleure compréhension de la pathophysiologie des réactions neuroinflammatoires du SNC et des maladies qui y sont associées, mais suggère également des cibles thérapeutiques potentielles pour influencer l’infiltration des cellules du sang vers le cerveau

La protéine accessoire Vpu du VIH-1 inhibe l'activité antivirale des pDCs à travers un processus ILT7-dépendant

Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV‐1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN‐1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN­‐1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpu‐deficient HIV-­1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-­1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with anti­‐BST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-­1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDC‐bound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-­1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN‐1 production by pDCs in response to HIV­‐1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV‐1.

The high-resolution infrared spectrum of HOF near 2700 cm-1: the ground and 2v2 states

The a/b hybrid-type ν1 fundamental and 2ν2 overtone bands of HOF were investigated by FTIR spectroscopy with a resolution close to 0.008 cm−1. Improved ground state parameters of HOF were determined from a merge of more than 3000 ground state combination differences formed from ν1 and previously measured ν2 transitions with the reported pure rotational lines. Excited state parameters of the v2 = 2 state, ν0 = 2686.924 6(1) and χ22 = −9.942 4(1) cm−1, were determined employing Watson's A-reduced Hamiltonian up to sixth order in I′ representation. The 2ν2 state was found to be unperturbed, the excited state parameters being closely related to those of ν2.

Analysis of chain and blood group type and branching pattern of sialylated oligosaccharides by negative ion electrospray tandem mass spectrometry

We previously reported sequence determination of neutral oligosaccharides by negative ion electrospray tandem mass spectrometry on a quadrupole-orthogonal time-of-flight instrument with high sensitivity and without the need of derivatization. In the present report, we extend our strategies to sialylated oligosaccharides for analysis of chain and blood group types together with branching patterns. A main feature in the negative ion mass spectrometry approach is the unique double glycosidic cleavage induced by 3-glycosidic substitution, producing characteristic D-type fragments which can be used to distinguish the type 1 and type 2 chains, the blood group related Lewis determinants, 3,6-disubstituted core branching patterns, and to assign the structural details of each of the branches. Twenty mono- and disialylated linear and branched oligosaccharides were used for the investigation, and the sensitivity achieved is in the femtomole range. To demonstrate the efficacy of the strategy, we have determined a novel complex disialylated and monofucosylated tridecasaccharide that is based on the lacto-N-decaose core. The structure and sequence assignment was corroborated by :methylation analysis and H-1 NMR spectroscopy.

Expression-system-dependent modulation of HIV-1 envelope glycoprotein antigenicity and immunogenicity.

Recombinant expression systems differ in the type of glycosylation they impart on expressed antigens such as the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) envelope glycoproteins, potentially affecting their biological properties. We performed head-to-head antigenic, immunogenic and molecular profiling of two distantly related Env surface (gp120) antigens produced in different systems: (a) mammalian (293 FreeStyle cells; 293F) cells in the presence of kifunensine, which impart only high-mannose glycans; (b) insect cells (Spodoptera frugiperda, Sf9), which confer mainly paucimannosidic glycans; (c) Sf9 cells recombinant for mammalian glycosylation enzymes (Sf9 Mimic), which impart high-mannose, hybrid and complex glycans without sialic acid; and (d) 293F cells, which impart high-mannose, hybrid and complex glycans with sialic acid. Molecular models revealed a significant difference in gp120 glycan coverage between the Sf9-derived and wild-type mammalian-cell-derived material that is predicted to affect ligand binding sites proximal to glycans. Modeling of solvent-exposed surface electrostatic potentials showed that sialic acid imparts a significant negative surface charge that may influence gp120 antigenicity and immunogenicity. Gp120 expressed in systems that do not incorporate sialic acid displayed increased ligand binding to the CD4 binding and CD4-induced sites compared to those expressed in the system that do, and imparted other more subtle differences in antigenicity in a gp120 subtype-specific manner. Non-sialic-acid-containing gp120 was significantly more immunogenic than the sialylated version when administered in two different adjuvants, and induced higher titers of antibodies competing for CD4 binding site ligand-gp120 interaction. These findings suggest that non-sialic-acid-imparting systems yield gp120 immunogens with modified antigenic and immunogenic properties, considerations that should be considered when selecting expression systems for glycosylated antigens to be used for structure-function studies and for vaccine use.

The role of protein hydrophobicity in thionin–phospholipid interactions: a comparison of α1 and α2-purothionin adsorbed anionic phospholipid monolayers

The plant defence proteins α1- and α2-purothionin (Pth) are type 1 thionins from common wheat (Triticum aestivum). These highly homologous proteins possess characteristics common amongst antimicrobial peptides and proteins, that is, cationic charge, amphiphilicity and hydrophobicity. Both α1- and α2-Pth possess the same net charge, but differ in relative hydrophobicity as determined by C18 reversed phase HPLC. Brewster angle microscopy, X-ray and neutron reflectometry, external reflection FTIR and associated surface pressure measurements demonstrated that α1 and α2-Pth interact strongly with condensed phase 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DPPG) monolayers at the air/liquid interface. Both thionins disrupted the in-plane structure of the anionic phospholipid monolayer, removing lipid during this process and both penetrated the lipid monolayer in addition to adsorbing as a single protein layer to the lipid head-group. However, analysis of the interfacial structures revealed that the α2-Pth showed faster disruption of the lipid film and removed more phospholipid (12%) from the interface than α1-Pth. Correlating the protein properties and lipid binding activity suggests that hydrophobicity plays a key role in the membrane lipid removal activity of thionins.

Environmentally-acquired bacteria influence microbial diversity and natural innate immune responses at gut surfaces

Background: Early microbial colonization of the gut reduces the incidence of infectious, inflammatory and autoimmune diseases. Recent population studies reveal that childhood hygiene is a significant risk factor for development of inflammatory bowel disease, thereby reinforcing the hygiene hypothesis and the potential importance of microbial colonization during early life. The extent to which early-life environment impacts on microbial diversity of the adult gut and subsequent immune processes has not been comprehensively investigated thus far. We addressed this important question using the pig as a model to evaluate the impact of early-life environment on microbe/host gut interactions during development. Results: Genetically-related piglets were housed in either indoor or outdoor environments or in experimental isolators. Analysis of over 3,000 16S rRNA sequences revealed major differences in mucosa-adherent microbial diversity in the ileum of adult pigs attributable to differences in earlylife environment. Pigs housed in a natural outdoor environment showed a dominance of Firmicutes, in particular Lactobacillus, whereas animals housed in a hygienic indoor environment had reduced Lactobacillus and higher numbers of potentially pathogenic phylotypes. Our analysis revealed a strong negative correlation between the abundance of Firmicutes and pathogenic bacterial populations in the gut. These differences were exaggerated in animals housed in experimental isolators. Affymetrix microarray technology and Real-time Polymerase Chain Reaction revealed significant gut-specific gene responses also related to early-life environment. Significantly, indoorhoused pigs displayed increased expression of Type 1 interferon genes, Major Histocompatibility Complex class I and several chemokines. Gene Ontology and pathway analysis further confirmed these results.

Nonpsychotropic plant cannabinoids, cannabidivarin (CBDV) and cannabidiol (CBD), activate and desensitize transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) channels in vitro: potential for the treatment of neuronal hyperexcitability

Epilepsy is the most common neurological disorder, with over 50 million people worldwide affected. Recent evidence suggests that the transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) may contribute to the onset and progression of some forms of epilepsy. Since the two nonpsychotropic cannabinoids cannabidivarin (CBDV) and cannabidiol (CBD) exert anticonvulsant activity in vivo and produce TRPV1-mediated intracellular calcium elevation in vitro, we evaluated the effects of these two compounds on TRPV1 channel activation and desensitization and in an in vitro model of epileptiform activity. Patch clamp analysis in transfected HEK293 cells demonstrated that CBD and CBDV dose-dependently activate and rapidly desensitize TRPV1, as well as TRP channels of subfamily V type 2 (TRPV2) and subfamily A type 1 (TRPA1). TRPV1 and TRPV2 transcripts were shown to be expressed in rat hippocampal tissue. When tested on epileptiform neuronal spike activity in hippocampal brain slices exposed to a Mg2+-free solution using multielectrode arrays (MEAs), CBDV reduced both epileptiform burst amplitude and duration. The prototypical TRPV1 agonist, capsaicin, produced similar, although not identical effects. Capsaicin, but not CBDV, effects on burst amplitude were reversed by IRTX, a selective TRPV1 antagonist. These data suggest that CBDV antiepileptiform effects in the Mg2+-free model are not uniquely mediated via activation of TRPV1. However, TRPV1 was strongly phosphorylated (and hence likely sensitized) in Mg2+-free solution-treated hippocampal tissue, and both capsaicin and CBDV caused TRPV1 dephosphorylation, consistent with TRPV1 desensitization. We propose that CBDV effects on TRP channels should be studied further in different in vitro and in vivo models of epilepsy.

Lifetime Overproduction of Circulating Angiotensin-(1-7) Attenuates Deoxycorticosterone Acetate-Salt Hypertension-Induced Cardiac Dysfunction and Remodeling

We evaluated the development of arterial hypertension, cardiac function, and collagen deposition, as well as the level of components of the renin-angiotensin system in the heart of transgenic rats that overexpress an angiotensin (Ang)-(1-7)-producing fusion protein, TGR(A1-7)3292 (TG), which induces a lifetime increase in circulating levels of this peptide. After 30 days of the induction of the deoxycorticosterone acetate (DOCA)-salt hypertension model, DOCA-TG rats were hypertensive but presented a lower systolic arterial pressure in comparison with DOCA-Sprague-Dawley (SD) rats. In contrast to DOCA-SD rats that presented left ventricle (LV) hypertrophy and diastolic dysfunction, DOCA-TG rats did not develop cardiac hypertrophy or changes in ventricular function. In addition, DOCA-TG rats showed attenuation in mRNA expression for collagen type I and III compared with the increased levels of DOCA-SD rats. Ang II plasma and LV levels were reduced in SD and TG hypertensive rats in comparison with normotensive animals. DOCA-TG rats presented a reduction in plasma Ang-(1-7) levels; however, there was a great increase in Ang-(1-7) (approximate to 3-fold) accompanied by a decrease in mRNA expression of both angiotensin-converting enzyme and angiotensin-converting enzyme 2 in the LV. The mRNA expression of Mas and Ang II type 1 receptors in the LV was not significantly changed in DOCA-SD or DOCA-TG rats. This study showed that TG rats with increased circulating levels of Ang-(1-7) are protected against cardiac dysfunction and fibrosis and also present an attenuated increase in blood pressure after DOCA-salt hypertension. In addition, DOCA-TG rats showed an important local increase in Ang-(1-7) levels in the LV, which might have contributed to the attenuation of cardiac dysfunction and prefibrotic lesions. (Hypertension. 2010;55:889-896.)

Blockage of Angiotensin II type 2 receptor prevents thyroxine-mediated cardiac hypertrophy by blocking Akt activation

Although most of effects of Angiotensin II (Ang II) related to cardiac remodelling can be attributed to type 1 Ang II receptor (AT(1)R), the type 2 receptor (AT(2)R) has been shown to be involved in the development of some cardiac hypertrophy models. In the present study, we investigated whether the thyroid hormone (TH) action leading to cardiac hypertrophy is also mediated by increased Ang II levels or by change on AT(1)R and AT(2)R expression, which could contribute to this effect. In addition, we also evaluated the possible contribution of AT(2)R in the activation of Akt and in the development of TH-induced cardiac hypertrophy. To address these questions, Wistar rats were treated with thyroxine (T(4), 0.1 mg/kg BW/day, i.p.), with or without AT(2)R blocker (PD123319), for 14 days. Cardiac hypertrophy was identified based on heart/body weight ratio and confirmed by analysis of atrial natriuretic factor mRNA expression. Cardiomyocyte cultures were used to exclude the influence of TH-related hemodynamic effects. Our results demonstrate that the cardiac Ang II levels were significantly increased (80%, P < 0.001) as well as the AT(2)R expression (50%, P < 0.05) in TH-induced cardiac hypertrophy. The critical involvement of AT(2)R to the development of this cardiac hypertrophy in vivo was evidenced after administration of AT(2) blocker, which was able to prevent in 40% (P < 0.01) the cardiac mass gain and the Akt activation induced by TH. The role of AT(2)R to the TH-induced cardiomyocyte hypertrophy was also confirmed after using PD123319 in the in vitro studies. These findings improve understanding of the cardiac hypertrophy observed in hyperthyroidism and provide new insights into the generation of future therapeutic strategies.

Na+-glucose transporter-2 messenger ribonucleic acid expression in kidney of diabetic rats correlates with glycemic levels: Involvement of hepatocyte nuclear factor-1 alpha expression and activity

Mutations in Na+-glucose transporters (SGLT)-2 and hepatocyte nuclear factor (HNF)-1 alpha genes have been related to renal glycosuria and maturity-onset diabetes of the young 3, respectively. However, the expression of these genes have not been investigated in type 1 and type 2 diabetes. Here in kidney of diabetic rats, we tested the hypotheses that SGLT2 mRNA expression is altered; HNF-1 alpha is involved in this regulation; and glycemic homeostasis is a related mechanism. The in vivo binding of HNF-1 alpha into the SGLT2 promoter region in renal cortex was confirmed by chromatin immunoprecipitation assay. SGLT2 and HNF-1 alpha mRNA expression (by Northern and RT-PCR analysis) and HNF-1 binding activity of nuclear proteins (by EMSA) were investigated in diabetic rats and treated or not with insulin or phlorizin (an inhibitor of SGLT2). Results showed that diabetes increases SGLT2 and HNF-1 alpha mRNA expression (similar to 50%) and binding of nuclear proteins to a HNF-1 consensus motif (similar to 100%). Six days of insulin or phlorizin treatment restores these parameters to nondiabetic-rat levels. Moreover, both treatments similarly reduced glycemia, despite the differences in plasma insulin and urinary glucose concentrations, highlighting the plasma glucose levels as involved in the observed modulations. This study shows that SGLT2 mRNA expression and HNF-1 alpha expression and activity correlate positively in kidney of diabetic rats. It also shows that diabetes-induced changes are reversed by lowering glycemia, independently of insulinemia. Our demonstration that HNF-1 alpha binds DNA that encodes SGLT2 supports the hypothesis that HNF-1 alpha, as a modulator of SGLT2 expression, may be involved in diabetic kidney disease.

Comparison of signal-to-cutoff values in first, second, and third generation enzyme immunoassays for the diagnosis of HTLV-1/2 infection in ""at-risk"" individuals from Sao Paulo, Brazil

Data obtained during routine diagnosis of human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) and 2 (HTLV-2) in ""at-risk"" individuals from Sao Paulo, Brazil using signal-to-cutoff (S/C) values obtained by first, second, and third generation enzyme immunoassay (EIA) kits, were compared. The highest S/C values were obtained with third generation EIA kits, but no correlation was detected between these values and specific antibody reactivity to HTLV-1, HTLV-2, or untyped HTLV (p = 0.302). In addition, use of these third generation kits resulted in HTLV-1/2 false-positive samples. In contrast, first and second generation EIA kits showed high specificity, and the second generation EIA kits showed the highest efficiency, despite lower S/C values. Using first and second generation EIA kits, significant differences in specific antibody detection of HTLV-1, relative to HTLV-2 (p = 0.019 for first generation and p < 0.001 for second generation EIA kits) and relative to untyped HTLV (p = 0.025 for first generation EIA kits), were observed. These results were explained by the composition and format of the assays. In addition, using receiver operating characteristics (ROC) analysis, a slight adjustment in cutoff values for third generation EIA kits improved their specificities and should be used when HTLV ""at-risk"" populations from this geographic area are to be evaluated. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

Immune Responses and Therapeutic Antitumor Effects of an Experimental DNA Vaccine Encoding Human Papillomavirus Type 16 Oncoproteins Genetically Fused to Herpesvirus Glycoprotein D

Recombinant adenovirus or DNA vaccines encoding herpes simplex virus type 1 (HSV-1) glycoprotein D (gD) genetically fused to human papillomavirus type 16 (HPV-16) oncoproteins (E5, E6, and E7) induce antigen-specific CD8(+) T-cell responses and confer preventive resistance to transplantable murine tumor cells (TC-1 cells). In the present report, we characterized some previously uncovered aspects concerning the induction of CD8(+) T-cell responses and the therapeutic anticancer effects achieved in C57BL/6 mice immunized with pgD-E7E6E5 previously challenged with TC-1 cells. Concerning the characterization of the immune responses elicited in mice vaccinated with pgD-E7E6E5, we determined the effect of the CD4(+) T-cell requirement, longevity, and dose-dependent activation on the E7-specific CD8(+) T-cell responses. In addition, we determined the priming/boosting properties of pgD-E7E6E5 when used in combination with a recombinant serotype 68 adenovirus (AdC68) vector encoding the same chimeric antigen. Mice challenged with TC-1 cells and then immunized with three doses of pgD-E7E6E5 elicited CD8(+) T-cell responses, measured by intracellular gamma interferon (IFN-gamma) and CD107a accumulation, to the three HPV-16 oncoproteins and displayed in vivo antigen-specific cytolytic activity, as demonstrated with carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)-labeled target cells pulsed with oligopeptides corresponding to the H-2D(b)-restricted immunodominant epitopes of the E7, E6, or E5 oncoprotein. Up to 70% of the mice challenged with 5 x 10(5) TC-1 cells and immunized with pgD-E7E6E5 controlled tumor development even after 3 days of tumor cell challenge. In addition, coadministration of pgD-E7E6E5 with DNA vectors encoding pGM-CSF or interleukin-12 (IL-12) enhanced the therapeutic antitumor effects for all mice challenged with TC-1 cells. In conclusion, the present results expand our previous knowledge on the immune modulation properties of the pgD-E7E6E5 vector and demonstrate, for the first time, the strong antitumor effects of the DNA vaccine, raising promising perspectives regarding the development of immunotherapeutic reagents for the control of HPV-16-associated tumors.