Polymeric micelles as versatile carriers for drugs and nucleic acids

Le cancer est la principale cause de mortalité au Canada. Les taxanes (e.g. le paclitaxel et le docétaxel (DCTX)) constituent des remèdes efficaces contre une série de tumeurs solides telles que les cancers du sein, du poumon et de l’ovaire. Par ailleurs, des acides nucléiques (e.g. les oligonucléotides antisens (AON) ou les petits ARN interférents (siRNAs)), capables de supprimer sélectivement certains oncogènes impliqués dans la carcinogénèse, sont actuellement étudiés pour traiter une large gamme de cancers. Bien que l’activité des taxanes et des acides nucléiques soit bien établie sur des modèles humains et/ou animaux, plusieurs aspects physico-chimiques et cliniques restent encore à améliorer. Leur solubilité limitée (pour les taxanes), leur dégradation rapide dans le sang (pour les acides nucléiques), leur élimination précoce, leur absence de sélectivité et leur toxicité envers les tissus sains sont les principaux facteurs limitant leur efficacité. C’est pourquoi de nombreux efforts ont porté sur l’élaboration de systèmes de vectorisation ciblés à base de polymères, dans le but de surmonter les problèmes associés aux thérapies actuelles. Dans cette thèse, deux types de micelles polymères ont été développés pour la vectorisation de DCTX et d’acides nucléiques. D’une part, des micelles de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(oxyde de butylène/styrène) ont été étudiées pour la première fois pour solubiliser le DCTX et le protéger de l’hydrolyse. Ces polymères se sont révélés moins toxiques que le surfactant utilisé commercialement pour solubiliser le DCTX (i.e. polysorbate 80) et ont permis une libération prolongée du principe actif. D’autre part, deux systèmes différents de micelles polyioniques (PICM) ont été mis au point pour la vectorisation d’acides nucléiques. De nouveaux conjugués de poly(éthylène glycol) (PEG)-oligonucléotide ont été proposés pour la protection et la libération contrôlée d’AON. Lorsque ces conjugués ont été formulés avec des dendrimères de poly(amidoamine) (PAMAM), des complexes de taille homogène ont été obtenus. Ces PICM ont permis de prolonger la libération de l’AON et de le protéger efficacement contre la dégradation enzymatique. De plus, des polymères de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(méthacrylate de propyle-co-acide méthacrylique) ont été incorporés afin de conférer des propriétés acido-sensibles aux PICM. Dans ces micelles, formées de ce dernier polymère formulé avec le dendrimère PAMAM, des oligonucléotides (AON et siRNA) ciblant l’oncogène Bcl-2 ont été encapsulés. L’internalisation cellulaire fut assurée par un fragment d’anticorps monoclonal (Fab’) situé à l’extrémité de la couronne de PEG. Après l’internalisation cellulaire et la protonation des unités d’acide méthacrylique sous l’effet de l’acidification des endosomes, les micelles se sont affranchies de leur couronne. Elles ont ainsi exposé leur cœur composé d’acide nucléique et de dendrimère PAMAM, qui possède une charge positive et des propriétés endosomolytiques. En effet, ces PICM acido-sensibles ciblées ont permis d’augmenter la biodisponibilité des acides nucléiques vectorisés et se sont avérées plus efficaces pour silencer l’oncoprotéine Bcl-2 que les micelles non ciblées ou que le dendrimère de PAMAM commercial seul. Finalement, les nanovecteurs polymères présentés dans cette thèse se révèlent être des systèmes prometteurs pour la vectorisation des anticancéreux et des acides nucléiques.

Inhibition de l’absorption intestinale du glucose par les produits naturels issus de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James

Le diabète de type 2 et l'obésité sont des problèmes de santé majeurs et les peuples autochtones sont particulièrement à risque. Pour remédier à ce problème largement répandu dans les populations autochtones canadiennes pour qui la médication moderne n’est pas culturellement adaptée, notre équipe s’est donné comme objectif d’étudier les activités potentielles antidiabétique et anti-obésité de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James. Le but de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle certaines plantes médicinales pourraient inhiber l'absorption intestinale du glucose, une activité anti-hyperglycémique qui, par la même occasion, contribuerait à combattre l’obésité. Les extraits éthanoliques de dix-sept plantes médicinales de la forêt boréale ont été testés dans des cellules intestinales Caco-2 et comparés à l’effet d’inhibiteurs compétitifs connus, tels que la phlorizine et la phlorétine. Ces inhibiteurs sont des composés polyphénoliques qui partagent de nombreuses caractéristiques structurelles avec des constituants moléculaires de plusieurs plantes Cri. Les résultats démontrent que treize des dix-sept extraits de plantes ont inhibé de façon significative l'absorption intestinale du 3H-D-glucose. Pour valider ces effets in vivo, quatre extraits ont été administrés à des rats Wistar par gavage intragastrique (250 mg/kg) en même temps qu’un bolus de glucose (3 g/kg). Suite à ce gavage, deux de ces extraits ont restreint l’augmentation de la glycémie d'environ 40% par rapport à un contrôle sans extrait. Ces résultats indiquent qu’une inhibition compétitive de l'absorption intestinale du glucose peut être atteinte par des extraits bruts de plantes médicinales. La prise de ces plantes durant les repas aiderait à un meilleur contrôle post-prandial de la glycémie, particulièrement chez les personnes à risque.

La PCSK9 humaine, une molécule aux multiples facettes métaboliques et une cible thérapeutique prometteuse : études de régulation in vitro et in vivo

La proprotéine convertase subtilisine/kexine-9 (PCSK9) a été identifiée comme le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie autosome dominante (ADH). Les deux autres gènes impliqués dans l’ADH encodent le récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et l’apolipoprotéine B. La PCSK9 est une convertase qui favorise la dégradation du LDLR dans les hépatocytes et augmente le niveau plasmatique de cholestérol des LDL (LDL-C). Les mutations « gain de fonction » de la PCSK9 sont associées à un phénotype d’hypercholestérolémie familiale, tandis que les variantes « perte de fonction » sont associées à un LDL-C réduit et à un risque coronarien plus faible. Pour élucider le rôle physiologique de la PCSK9, nous avons étudié sa régulation génique. En utilisant le RT-PCR quantitatif dans des hépatocytes humains, nous avons analysé la régulation de PCSK9 sous différentes conditions modulant l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol. Nous avons démontré que l’expression de la PCSK9 était induite par les statines de manière dose-dépendante et que cette induction était abolie par le mévalonate. De plus, le promoteur de PCSK9 contenait deux motifs conservés pour la régulation par le cholestérol : le sterol regulatory element (SRE) et un site Sp1. La PCSK9 circule dans le plasma sous des formes mature et clivée par la furine. Grâce à notre anticorps polyclonal, nous avons mis au point un test ELISA mesurant la PCSK9 plasmatique totale. Une étude transversale a évalué les concentrations plasmatiques de PCSK9 chez des sujets sains et hypercholestérolémiques, traités ou non par des statines ou une combinaison statine/ezetimibe. Chez 254 sujets sains, la valeur moyenne de PCSK9 (écart-type) était de 89,5 (31,9) µg/L. La concentration plasmatique de la PCSK9 corrélait avec celle de cholestérol total, du LDL-C, des triglycérides (TG), de la glycémie à jeun, l’âge et l’indice de masse corporelle. Le séquençage de PCSK9 chez des sujets aux extrêmes de la distribution des concentrations de PCSK9 de notre cohorte a révélé la présence d’une nouvelle variation « perte de fonction » : R434W. Chez 200 patients hypercholestérolémiques, la concentration de PCSK9 était plus élevée que chez les sujets sains (P<0,04). Elle a augmenté avec une dose croissante de statine (P<0,001), et a augmenté encore plus suite à l’ajout d’ezetimibe (P<0,001). Chez les patients traités, ceux présentant une hypercholestérolémie familiale (HF; due à une mutation du LDLR) avaient des concentrations plus élevées de PCSK9 que les non-HF (P<0,005), et la réduction de LDL-C corrélait positivement avec la concentration de PCSK9 atteinte de la même manière dans les deux sous-catégories (P<0,02 et P<0,005, respectivement). Par ailleurs, une incubation des cellules HepG2 (hépatocytes) et Caco-2 (entérocytes) avec de l’ezetimibe a provoqué une augmentation de l’ARNm de PCSK9 et de NPC1L1 de 1,5 à 2 fois (P<0,05), mais aucune variation significative de PCSK9 sécrétée n’a été observée, suggérant que ces lignées cellulaires ne sont pas un modèle idéal. Nous avons également mesuré le niveau de PCSK9 chez 1 739 Canadiens-français âgés de 9, 13 et 16 ans. La valeur moyenne (écart-type) de PCSK9 dans cette cohorte était de 84,7 (24,7) µg/L, légèrement plus basse que dans la cohorte d’adultes (89,5 (31,9) µg/L). Chez les garçons, la PCSK9 circulante diminuait avec l’âge, tandis que c’était l’inverse chez les filles. Il y avait des associations positives et significatives entre la PCSK9 et la glycémie à jeun, l’insulinémie, le HOMA-IR, et les paramètres lipidiques (TC, LDL-C, TG, HDL-C, apoAI et apoB). Dans l’analyse multivariée, une hausse de 10% de l’insulinémie à jeun était associée à une augmentation de 1 à 2% de PCSK9. La régulation de PCSK9 est typique de celle d’un gène impliqué dans le métabolisme des lipoprotéines et est probablement la cible du facteur de transcription «sterol regulatory element-binding protein » (SREBP-2). La concentration plasmatique de la PCSK9 est associée avec l’âge, le sexe, et de multiples marqueurs métaboliques chez les enfants et les adultes. La détection de la PCSK9 circulante chez les sujets HF et non-HF signifie que ce test ELISA spécifique à PCSK9 pourrait servir à suivre la réponse à la thérapie chez un grand éventail de sujets. PCSK9 semble être une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de l’hypercholestérolémie et de la maladie cardiovasculaire.

Caractérisation de DKK1 comme antigène tumoral et manipulation des lymphocytes T CD8 : utilisation de la voie de Wnt en immunothérapie du cancer

L’immunothérapie tumorale à médiation cellulaire est un traitement qui utilise le système immunitaire des patients afin d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette réponse est produite suite à la reconnaissance des antigènes par les T CD8+. Ces cibles sont appelées antigènes tumoraux (TAA) et définies comme des protéines exprimées par les cellules cancéreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifié Dickkopf-1 (DKK1), une protéine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothérapie à médiation cellulaire efficace requiert l’identification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothérapie pourrait également être améliorées par l’augmentation de la puissance d’action anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spécifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractérisation de l’expression de DKK1 dans les cancers communs et la détermination de son immunogénicité afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints d’un cancer commun, vers un phénotype moins différentié afin d’augmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractérisé l’expression de DKK1 dans le cancer du sein et dans d’autres cancers communs. Le profil d’expression de DKK1 a été étudié par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignées cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. L’expression de DKK1 a aussi été étudiée dans des échantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant d’un cancer du sein exprimaient DKK1. La moitié des tumeurs DKK1(+) était triple négative, donc pas de récepteurs d’œstrogène et de progestérone et était Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilités de traitements très restreintes). De plus, 50% des échantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectuées dans le cancer du poumon ont été, par la suite, corroborées par d'autres groupes qui ont montré une corrélation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Après avoir confirmée l’expression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons évalué l’immunogénicité de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectué des stimulations in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s d’un cancer du sein ou du poumon avec des peptides dérivés de DKK1 pouvant être présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont été identifiés et isolés. Par essai multiplex et cytométrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalité d’un ces clones T CD8+ spécifiques à DKK1 a été étudiée et a révélée un profil effecteur, renforçant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans cette première partie de thèse suggèrent une possible utilisation de DKK1 en immunothérapie contre les cancers communs, attribuable à son expression dans ces cancers et la possibilité de faire proliférer des T CD8+ effecteurs spécifiques à DKK1 à partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thèse, je décrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints d’un cancer commun, afin d’augmenter la force et la durée de leurs fonctions anti-tumorales. Il a été démontré que des lymphocytes moins différentiés sont capables d’une réponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons basé ce projet sur l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur conférer un phénotype moins différentié, partageant des caractéristiques de la cellule naïve et de la cellule mémoire. Des cultures de T CD8+, spécifiques à des antigènes viraux, en présence de l’inhibiteur ont permis d’augmenter la sécrétion d’interféron (IFN)- et leur activité cytotoxique. Ces résultats indiquent un effet de l’activation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportées pour la première fois chez les T CD8+ humains et suggèrent une nouvelle stratégie, applicables à l’immunothérapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activité anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont mené à la réalisation d’une étape très importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la démonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux dérivés d’organes importants. Ces travaux ont également mené à la démonstration de l’immunogénicité de DKK1, par l’identification d’un peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, l’étude de la polyfonctionnalité des T CD8+ spécifiques à DKK1 a révélée un profil effecteur favorable pour l’obtention d’une réponse anti-tumorale efficace. Ces découvertes pourraient servir à l’élaboration d’une stratégie d’immunothérapie à médiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, l’étude phénotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donné lieu à l’observation d’un phénotype encore jamais rapporté chez l’humain, conférant aux T CD8+ un aspect moins différentié avec des caractéristiques propre à un phénotype mémoire. Ces résultats sont pertinents dans l’amélioration de l’immunothérapie du cancer, passant par l’augmentation de la persistance des lymphocytes. En résumé, les résultats présentés dans cette thèse de doctorat fournissent des évidences indéniables quant à la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothérapie à médiation cellulaire des cancers communs. Ces résultats fournissent également des preuves quant à la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par l’activation de la voie de la voie de Wnt, afin de générer des lymphocytes médiateurs plus efficaces pour ce type de thérapie.

Rôles et régulation des enzymes antioxydantes paraoxonases au niveau intestinal et implication dans les maladies inflammatoires de l'intestin

Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le développement et l’évolution des maladies inflammatoires de l’intestin. Le corps humain est doté d’une panoplie d’enzymes antioxydantes ayant pour fonction de protéger l’intégrité cellulaire. De nouvelles enzymes au fort potentiel antioxydant, les paraoxonases (PON) 1, 2 et 3, ont récemment été identifiées tout au long du tube digestif, mais leurs rôles y restent inconnus. Les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées dans le présent travail pour étudier la régulation des PON. Les cellules ont été traitées avec différents effecteurs physiologiques (cytokines, LPS, stress oxydant) et pharmacologiques (fibrates, thiazolidinédiones) et l’expression des leurs gènes et protéines a été évaluée. Les résultats ont mis en lumière la modulation distincte de l’expression des PON par le stress oxydant et l’inflammation. Ceci suggère que chaque PON peut jouer un rôle différent au niveau intestinal et être impliquée dans le maintien de l’homéostasie. La régulation de l’expression des PON a également été largement explorée dans un article de revue. Pour définir le rôle de PON2, celle-ci étant potentiellement la plus importante pour l’homéostasie intestinale, les cellules Caco-2/15 ont été infectées à l’aide de lentivirus contenant des ARN d’interférence, ce qui a fortement réduit l’expression de PON2. En l’absence de PON2, les cellules Caco-2/15 étaient plus susceptibles face à un stress oxydant, la réponse inflammatoire était exacerbée et la perméabilité cellulaire paraissait altérée. Toutes ces composantes sont majeures dans le développement des maladies inflammatoires de l’intestin chez l’humain. De plus, des cellules Caco-2/15 de la PON2, ce qui a renforcé la force de la défense antioxydante cellulaire. Les résultats suggèrent que les PON jouent un rôle dans le maintien de l’homéostasie intestinale et pourraient être impliquées dans l’étiologie et la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin.

La structure de Jordan des matrices de transfert des modèles de boucles et la relation avec les hamiltoniens XXZ

Les modèles sur réseau comme ceux de la percolation, d’Ising et de Potts servent à décrire les transitions de phase en deux dimensions. La recherche de leur solution analytique passe par le calcul de la fonction de partition et la diagonalisation de matrices de transfert. Au point critique, ces modèles statistiques bidimensionnels sont invariants sous les transformations conformes et la construction de théories des champs conformes rationnelles, limites continues des modèles statistiques, permet un calcul de la fonction de partition au point critique. Plusieurs chercheurs pensent cependant que le paradigme des théories des champs conformes rationnelles peut être élargi pour inclure les modèles statistiques avec des matrices de transfert non diagonalisables. Ces modèles seraient alors décrits, dans la limite d’échelle, par des théories des champs logarithmiques et les représentations de l’algèbre de Virasoro intervenant dans la description des observables physiques seraient indécomposables. La matrice de transfert de boucles D_N(λ, u), un élément de l’algèbre de Temperley- Lieb, se manifeste dans les théories physiques à l’aide des représentations de connectivités ρ (link modules). L’espace vectoriel sur lequel agit cette représentation se décompose en secteurs étiquetés par un paramètre physique, le nombre d de défauts. L’action de cette représentation ne peut que diminuer ce nombre ou le laisser constant. La thèse est consacrée à l’identification de la structure de Jordan de D_N(λ, u) dans ces représentations. Le paramètre β = 2 cos λ = −(q + 1/q) fixe la théorie : β = 1 pour la percolation et √2 pour le modèle d’Ising, par exemple. Sur la géométrie du ruban, nous montrons que D_N(λ, u) possède les mêmes blocs de Jordan que F_N, son plus haut coefficient de Fourier. Nous étudions la non diagonalisabilité de F_N à l’aide des divergences de certaines composantes de ses vecteurs propres, qui apparaissent aux valeurs critiques de λ. Nous prouvons dans ρ(D_N(λ, u)) l’existence de cellules de Jordan intersectorielles, de rang 2 et couplant des secteurs d, d′ lorsque certaines contraintes sur λ, d, d′ et N sont satisfaites. Pour le modèle de polymères denses critique (β = 0) sur le ruban, les valeurs propres de ρ(D_N(λ, u)) étaient connues, mais les dégénérescences conjecturées. En construisant un isomorphisme entre les modules de connectivités et un sous-espace des modules de spins du modèle XXZ en q = i, nous prouvons cette conjecture. Nous montrons aussi que la restriction de l’hamiltonien de boucles à un secteur donné est diagonalisable et trouvons la forme de Jordan exacte de l’hamiltonien XX, non triviale pour N pair seulement. Enfin nous étudions la structure de Jordan de la matrice de transfert T_N(λ, ν) pour des conditions aux frontières périodiques. La matrice T_N(λ, ν) a des blocs de Jordan intrasectoriels et intersectoriels lorsque λ = πa/b, et a, b ∈ Z×. L’approche par F_N admet une généralisation qui permet de diagnostiquer des cellules intersectorielles dont le rang excède 2 dans certains cas et peut croître indéfiniment avec N. Pour les blocs de Jordan intrasectoriels, nous montrons que les représentations de connectivités sur le cylindre et celles du modèle XXZ sont isomorphes sauf pour certaines valeurs précises de q et du paramètre de torsion v. En utilisant le comportement de la transformation i_N^d dans un voisinage des valeurs critiques (q_c, v_c), nous construisons explicitement des vecteurs généralisés de Jordan de rang 2 et discutons l’existence de blocs de Jordan intrasectoriels de plus haut rang.

Stress oxydatif, fonction mitochondriale et maladie inflammatoire de l'intestin

CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rôles prépondérants dans plusieurs conditions pathologiques, ils n’ont pas été étudiés de façon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment exposé aux oxydants (provenant de l’alimentation) et à divers agents pathogènes. L’ingestion simultanée de sels ferreux et d’acide ascorbique peut causer le dommage des macromolécules par oxydation. Le ‘’Nuclear factor erythroid 2 related factor’’ (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protège contre le stress oxydant en induisant des gènes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison à l’élément de réponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont été décrites dans une variété de types cellulaires et de tissus. Cependant son rôle est très peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont d’évaluer comment la peroxydation lipidique médiée par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de déterminer l’ampleur de l’implication de Nrf2. MÉTHODES: Le stress oxydant a été induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. L’augmentation de l’expression de Nrf2 a été obtenue suite au prétraitement des cellules Caco2/15 avec 50 μM d’Olitpraz (OPZ), un puissant activateur. L’invalidation du gène de Nrf2 a été réalisée dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RÉSULTATS: Nos résultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), réduit la production d’ATP, entraîne une surcharge mitochondriale de calcium, active l’expression protéique du cytochrome C et de l’AIF (apoptotic inducing factor), réduit l’activité des complexes I, II, 2 III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages à l’ADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altère les expressions génique et protéique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que l’induction et l’activation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 résultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endogènes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une réduction du facteur nucléaire NFκβ et de TNF-α, une augmentation de la production d’ ATP et de l’activité des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1α, et une régulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de l’occludine. CONCLUSION: Dans l’ensemble, nos résultats montrent que l’exposition aigüe des cellules Caco-2/15 à la peroxydation par le FE/ASC entraîne des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et l’intégrité de l’ADN, qui sont abolis par l’induction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rôle majeur dans la protection de l’épithélium intestinal contre le stress oxydant.

Le fragment LG3 du perlécan : un nouveau régulateur de remodelage vasculaire en transplantation

L’apoptose endothéliale initie le processus menant au remodelage vasculaire et au développement de la néointima dans la vasculopathie du greffon. La formation de néointima résulte de l’accumulation de leucocytes, de matrice extracellulaire et de cellules positives pour l’actine musculaire lisse alpha (αSMA+) dans l’intima des artères, artérioles et capillaires du greffon. Les cellules αSMA+ dans la néointima sont des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) dérivées du donneur ainsi que des cellules souches dérivées du receveur, dont des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’acquisition d’un phénotype anti-apoptotique chez ces cellules est déterminante pour le développement de la néointima. Le laboratoire de Dre Hébert a démontré que les cellules endothéliales (CE) apoptotiques libèrent des médiateurs induisant une résistance à l’apoptose chez les CMLV et les fibroblastes. Notamment, les CE apoptotiques relâchent la cathepsine L qui clive le perlécan et ainsi libère un fragment C-terminal correspondant au troisième motif laminine G du domaine V du perlécan (LG3). Le LG3 est anti-apoptotique pour les fibroblastes. Nous avons donc émis l’hypothèse que le LG3 est un des médiateurs clés libéré par les CE apoptotiques favorisant le développement de la néointima via l’induction d’un phénotype anti-apoptotique chez les cellules néointimales αSMA+. Nous avons démontré que les médiateurs libérés par les CE apoptotiques induisent un phénotype anti-apoptotique chez les CSM dépendant de l’activation de la voie ERK1/2. De plus, le LG3 active la voie ERK1/2 via son interaction avec les intégrines beta 1 et induit une réponse anti-apoptotique chez ces cellules. Cependant l’activation de ERK1/2 par le LG3 est plus faible en comparaison de son activation par le milieu conditionné par des CE apoptotiques. Nos résultats suggèrent que les CE apoptotiques libèrent aussi de l’EGF qui agit de façon paracrine sur les CSM en coopération avec le LG3 pour induire un phénotype anti-apoptotique chez les CSM. Nous avons poursuivi l’étude de l’effet du LG3 in vivo sur le remodelage vasculaire en transplantation. Nous avons pour cela développé un modèle murin de rejet vasculaire qui consiste en une transplantation aortique entre des souris alloincompatibles. Nous avons ensuite injecté du LG3 chez les souris receveuses en post-transplantation. Nous avons observé dans ce modèle que des niveaux augmentés de LG3 sérique augmentent la formation de néointima, favorisent l’accumulation de cellules néointimales αSMA+ et diminuent le nombre de cellules CD31+ au niveau du greffon aortique. Parallèlement nous avons vérifié que le LG3 induit aussi un phénotype anti-apoptotique chez les CMLV et nous avons démontré un nouvel effet du LG3, soit une activité pro-migratoire, qui dépend de l’activation de la voie ERK1/2 chez les CMLV. Nous avons complété cette étude par l’analyse des niveaux de LG3 sérique dans une cohorte de patients receveurs d’allogreffe rénale. Nous avons observé chez ces patients, une association entre des niveaux élevés de LG3 sérique et un rejet vasculaire. Le LG3 contribue à la formation de néointima par son activité pro-migratoire et pro-survie chez les cellules néointimales et aussi de par son activité angiostatique. Nos résultats suggèrent que le LG3 est un nouveau médiateur important dans le remodelage vasculaire en transplantation

Les bactéries exprimant AIDA-I interagissent avec l'apolipoprotéine A-I cellulaire

AIDA-I (adhesin involved in diffuse adherence) est une importante adhésine autotransporteur exprimée par certaines souches de Escherichia. coli impliquée dans la colonisation des porcelets sevrés causant la diarrhée post-sevrage et la maladie de l’œdème. Une précédente étude de notre laboratoire a identifié l’apolipoprotéine AI (ApoAI) du sérum porcin, la protéine structurale des lipoprotéines à haute densité, comme récepteur cellulaire putatif de AIDA-I. L’interaction entre ces deux protéines doit être caractérisée. Ici, nous montrons par ELISA que AIDA-I purifiée est capable d’interagir avec l’ApoAI humaine, mais également avec les apolipoprotéines B et E2. L’ApoAI est rencontrée sous deux formes, soit libre ou associée aux lipides. Nous montrons que la forme libre n’interagit pas avec les bactéries AIDA-I+ mais s’associe spécifiquement à l’ApoAI membranaire de cellules épithéliales HEp-2. Afin d’étudier le rôle de l’ApoAI dans l’adhésion des bactéries, nous avons infecté des cellules HEp-2 en présence d’anticorps dirigés contre l’ApoAI, mais l’adhésion des bactéries AIDA I+ n’a jamais été réduite. De plus, l’induction de l’expression de l’ApoAI par fénofibrate et GW7647 chez les cellules Caco 2 polarisée et Hep G2, n’a pas permis l’augmentation de l’adhésion cellulaire des E. coli exprimant AIDA-I. Notre étude suggère davantage que l’interaction entre AIDA-I et ApoAI n’intervient pas dans les mécanismes d’adhésion cellulaire.

Effet de la mutation du gène lrpprc sur l'activité de l'AMPK dans les fibroblastes des patients atteints du syndrome de Leigh, type canadien français

Le syndrome de Leigh, type canadien français (LSFC) est une maladie infantile orpheline causée par une mutation du gène lrpprc. Elle se caractérise par une déficience tissu spécifique de cytochrome c oxydase (COX), une dysfonction mitochondriale et la survenue de crises d’acidose lactique fatales dans plus de 80% de cas. Selon les familles des patients, ces crises apparaissent lors d’une demande excessive d’énergie. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents à l’apparition des crises et notamment la physiopathologie du LSFC demeurent inconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme énergétique chez les patients LSFC, nous avons examiné la régulation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme clé de l'homéostasie énergétique, de même que certaines de ses voies cibles (SIRT1/PGC1α et Akt/mTOR) dans les fibroblastes de patients LSFC et de témoins en conditions basales et conditions de stress. En conditions basales, l’activité de l’AMPK était similaire dans les cellules LSFC et les témoins. Par contre, les cellules LSFC montraient une surexpression significative des voies Akt/mTOR et SIRT1/PGC1α comparativement aux cellules témoins. Nous avons aussi examiné ces voies de signalisation suite à une incubation de 4h avec 10 mM de lactate et 1 mM de palmitate (LP), nous permettant de mimer les conditions de « crise ». Nos résultats ont démontré que le LP augmentait les niveaux de phosphorylation de l’AMPK de 90% (p<0,01) dans les cellules témoins mais pas dans les cellules LSFC. Pourtant, l’AMPK est activée dans les cellules LSFC en réponse à une hypoxie chimique induite par le 2,4 dinitrophénol. Dans les cellules témoins, le LP augmentait aussi les niveaux d’expression de SIRT1 (57%, p<0,05), de LRPPRC (23%, p=0,045) et de COXIV (19%, p<0,05). Un prétraitement de 48h au ZMP, un activateur pharmacologique de l’AMPK, a eu un effet additif avec le LP et des augmentations de SIRT1 phosphorylée (120%, p<0,05), de SIRT1 total (75%, p<0,01), de LRPPRC (63%, p<0,001) et de COXIV (38%, p<0,001) ont été observées. Tous ces effets étaient aussi abolis dans les cellules LSFC. En conclusion, nos résultats ont démontré des altérations importantes de la régulation du métabolisme énergétique dans les fibroblastes de patients LSFC.

Intestin et défauts métaboliques dans la résistance à l'insuline

En lien avec l’augmentation constante de l’obésité, de plus en plus de personnes sont atteintes de résistance à l’insuline ou de diabète de type 2. Ce projet doctoral s’est surtout intéressé à l’une des conséquences majeures des pathologies cardiométaboliques, soit la dyslipidémie diabétique. À cet égard, les gens présentant une résistance à l’insuline ou un diabète de type 2 sont plus à risque de développer des perturbations lipidiques caractérisées essentiellement par des taux élevés de triglycérides et de LDL-cholestérol ainsi que de concentrations restreintes en HDL-cholestérol dans la circulation. Les risques de maladies cardiovasculaires sont ainsi plus élevés chez ces patients. Classiquement, trois organes sont connus pour développer l’insulino-résistance : le muscle, le tissu adipeux et le foie. Néanmoins, certaines évidences scientifiques commencent également à pointer du doigt l’intestin, un organe critique dans la régulation du métabolisme des lipides postprandiaux, et qui pourrait, conséquemment, avoir un impact important dans l’apparition de la dyslipidémie diabétique. De façon très intéressante, des peptides produits par l’intestin, notamment le GLP-1 (glucagon-like peptide-1), ont déjà démontré leur potentiel thérapeutique quant à l’amélioration du statut diabétique et leur rôle dans le métabolisme intestinal lipoprotéinique. Une autre évidence est apportée par la chirurgie bariatrique qui a un effet positif, durable et radical sur la perte pondérale, le contrôle métabolique et la réduction des comorbidités du diabète de type 2, suite à la dérivation bilio-intestinale. Les objectifs centraux du présent programme scientifique consistent donc à déterminer le rôle de l’intestin dans (i) l’homéostasie lipidique/lipoprotéinique en réponse à des concentrations élevées de glucose (à l’instar du diabète) et à des peptides gastro-intestinaux tels que le PYY (peptide YY); (ii) la coordination du métabolisme en disposant de l’AMPK (AMP-activated protein kinase) comme senseur incontournable permettant l’ajustement précis des besoins et disponibilités énergétiques cellulaires; et (iii) l’ajustement de sa capacité d’absorption des graisses alimentaires en fonction du gain ou de la perte de sa sensibilité à l’insuline démontrée dans les spécimens intestinaux humains prélevés durant la chirurgie bariatrique. Dans le but de confirmer le rôle de l’intestin dans la dyslipidémie diabétique, nous avons tout d’abord utilisé le modèle cellulaire intestinal Caco-2/15. Ces cellules ont permis de démontrer qu’en présence de hautes concentrations de glucose en basolatéral, telle qu’en condition diabétique, l’intestin absorbe davantage de cholestérol provenant de la lumière intestinale par l’intermédiaire du transporteur NPC1L1 (Niemann Pick C1-like 1). L’utilisation de l’ezetimibe, un inhibiteur du NPC1L1, a permis de contrecarrer cette augmentation de l’expression de NPC1L1 tout comme l’élévation de l’absorption du cholestérol, prouvant ainsi que le NPC1L1 est bel et bien responsable de cet effet. D’autre part, des travaux antérieurs avaient identifié certains indices quant à un rôle potentiel du peptide intestinal PYY au niveau du métabolisme des lipides intestinaux. Toutefois, aucune étude n’avait encore traité cet aspect systématiquement. Pour établir définitivement l’aptitude du PYY à moduler le transport et le métabolisme lipidique dans l’intestin, nous avons utilisé les cellules Caco-2/15. Notre étude a permis de constater que le PYY incubé du côté apical est capable de réduire significativement l’absorption du cholestérol et le transporteur NPC1L1. Puisque le rôle de l'AMPK dans l'intestin demeure inexploré, il est important non seulement de définir sa structure moléculaire, sa régulation et sa fonction dans le métabolisme des lipides, mais aussi d'examiner l'impact de l’insulino-résistance et du diabète de type 2 (DT2) sur son statut et son mode d’action gastro-intestinal. En employant les cellules Caco-2/15, nous avons été capables de montrer (i) la présence de toutes les sous-unités AMPK (α1/α2/β1/β2/γ1/γ2/γ3) avec une différence marquée dans leur abondance et une prédominance de l’AMPKα1 et la prévalence de l’hétérotrimère α1/β2/γ1; (ii) l’activation de l’AMPK par la metformine et l’AICAR, résultant ainsi en une phosphorylation accrue de l’enzyme acétylCoA carboxylase (ACC) et sans influence sur l'HMG-CoA réductase; (iii) la modulation négative de l’AMPK par le composé C et des concentrations de glucose élevées avec des répercussions sur la phosphorylation de l’ACC. D’autre part, l’administration de metformine au Psammomys obesus, un modèle animal de diabète et de syndrome métabolique, a conduit à (i) une régulation positive de l’AMPK intestinale (phosphorylation de l’AMPKα-Thr172); (ii) la réduction de l'activité ACC; (iii) l’augmentation de l’expression génique et protéique de CPT1, supportant une stimulation de la β-oxydation; (iv) une tendance à la hausse de la sensibilité à l'insuline représentée par l’induction de la phosphorylation d'Akt et l’inactivation de la phosphorylation de p38; et (v) l’abaissement de la formation des chylomicrons ce qui conduit à la diminution de la dyslipidémie diabétique. Ces données suggèrent que l'AMPK remplit des fonctions clés dans les processus métaboliques de l'intestin grêle. La preuve flagrante de l’implication de l’intestin dans les événements cardiométaboliques a été obtenue par l’examen des spécimens intestinaux obtenus de sujets obèses, suite à une chirurgie bariatrique. L’exploration intestinale nous a permis de constater chez ceux avec un indice HOMA élevé (marqueur d’insulinorésistance) (i) des défauts de signalisation de l'insuline comme en témoigne la phosphorylation réduite d'Akt et la phosphorylation élevée de p38 MAPK; (ii) la présence du stress oxydatif et de marqueurs de l'inflammation; (iii) la stimulation de la lipogenèse et de la production des lipoprotéines riches en triglycérides avec l’implication des protéines clés FABP, MTP et apo B-48. En conclusion, l'intestin grêle peut être classé comme un tissu insulino-sensible et répondant à plusieurs stimuli nutritionnels et hormonaux. Son dérèglement peut être déclenché par le stress oxydatif et l'inflammation, ce qui conduit à l'amplification de la lipogenèse et la synthèse des lipoprotéines, contribuant ainsi à la dyslipidémie athérogène chez les patients atteints du syndrome métabolique et de diabète de type 2.

The involvement of nitric oxide in bovine follicular development and ovulation

Comprendre les événements paracriniens qui régulent la fertilité chez la vache est nécessaire non seulement en raison de l'importance agricole de cette espèce, mais aussi pour son utilisation potentielle comme modèle chez l’humain. L'oxyde nitrique (NO), un gaz de radicaux libres, a été impliqué dans la croissance folliculaire et l'ovulation chez les rongeurs et d'autres espèces, mais chez la vache c’est une énigme fascinante : le NO est produit par les cellules de la granulosa bovine et est régulé par la FSH, mais la présence et le profil d'expression des enzymes responsables de la synthèse de NO (NOS) dans les cellules de la granulosa tout au long de la croissance folliculaire ne sont pas claires. Les objectifs de cette thèse sont: (1) élucider le mécanisme de contrôle des NOS et les conséquences de la production d'oxyde nitrique pour le fonctionnement des cellules de la granulosa au cours du développement folliculaire chez la vache et (2) déterminer la régulation des NOS pendant la cascade ovulatoire induite par LH chez les cellules de la granulosa bovine et si l'activité des NOS pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire chez cette espèce. Les résultats sont séparés en 2 articles. Dans le premier article, la régulation de NOS2 dans les cellules de la granulosa bovine a été explorée. L'abondance des ARNm codant pour NOS2 a été stimulée par la FSH et l’IGF1 en augmentant l’estradiol, et un blocage de l'action de l’estradiol a conséquemment réduit les niveaux d'ARNm codant pour NOS2. De plus, l'inhibition de l'activité des NOS a augmenté l'apoptose dans les cellules de la granulosa in vitro. Dans le second article, il a été démontré que le pic de LH induit une activation des NOS dans les cellules de la granulosa, et que l'activité de NOS induit la production de NO, ce qui est essentiel pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire induite par LH comme EREG/AREG/PTGS2. Ensemble, les résultats présentés dans ces 2 articles suggèrent que les niveaux physiologiques d'activité des NOS peuvent contribuer à la croissance et la survie des cellules de la granulosa et indiquent également que NO peut être essentiel pour l'ovulation chez les bovins.

Systems biology of the human MHC class I immunopeptidome

Le système de différenciation entre le « soi » et le « non-soi » des vertébrés permet la détection et le rejet de pathogènes et de cellules allogéniques. Il requiert la surveillance de petits peptides présentés à la surface cellulaire par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I). Les molécules du CMH I sont des hétérodimères composés par une chaîne lourde encodée par des gènes du CMH et une chaîne légère encodée par le gène β2-microglobuline. L’ensemble des peptides est appelé l’immunopeptidome du CMH I. Nous avons utilisé des approches en biologie de systèmes pour définir la composition et l’origine cellulaire de l’immunopeptidome du CMH I présenté par des cellules B lymphoblastoïdes dérivés de deux pairs de fratries avec un CMH I identique. Nous avons découvert que l’immunopeptidome du CMH I est spécifique à l’individu et au type cellulaire, qu’il dérive préférentiellement de transcrits abondants, est enrichi en transcrits possédant d’éléments de reconnaissance par les petits ARNs, mais qu’il ne montre aucun biais ni vers les régions génétiques invariables ni vers les régions polymorphiques. Nous avons également développé une nouvelle méthode qui combine la spectrométrie de masse, le séquençage de nouvelle génération et la bioinformatique pour l’identification à grand échelle de peptides du CMH I, dont ceux résultants de polymorphismes nucléotidiques simples non-synonymes (PNS-ns), appelés antigènes mineurs d’histocompatibilité (AMHs), qui sont les cibles de réponses allo-immunitaires. La comparaison de l’origine génomique de l’immunopeptidome de soeurs avec un CMH I identique a révélé que 0,5% des PNS-ns étaient représentés dans l’immunopeptidome et que 0,3% des peptides du CMH I seraient immunogéniques envers une des deux soeurs. En résumé, nous avons découvert des nouveaux facteurs qui modèlent l’immunopeptidome du CMH I et nous présentons une nouvelle stratégie pour l’indentification de ces peptides, laquelle pourrait accélérer énormément le développement d’immunothérapies ciblant les AMHs.

Rôle des récepteurs Toll-like et de la protéine adaptatrice MyD88 dans la régulation de l’hepcidine et le développement des hyposidérémies associées à l’inflammation

Le fer est un oligo-élément nécessaire pour le fonctionnement normal de toutes les cellules de l'organisme et joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions biologiques. Cependant, le niveau de fer dans le corps doit être bien réglé, sinon la carence en fer entraine des divers états pathologiques tels que l'anémie et la diminution de l’immunité. D'autre part, une surcharge en fer potentialise la multiplication des germes, aggrave l’infection et la formation de radicaux libres ayant des effets toxiques sur les cellules et leurs composants, ce qui favorise les maladies cardio-vasculaires, l'inflammation et le cancer. L'hepcidine (HAMP), un régulateur négatif de l'absorption du fer, induit la dégradation de la ferroportine (FPN), le seul exportateur connu de fer ce qui réduit sa libération par les macrophages et inhibe son absorption gastro-intestinale. HAMP est synthétisé principalement par les hépatocytes, mais aussi par les macrophages. Cependant, il y a très peu de données sur la façon dont HAMP est régulé au niveau des macrophages. Plus récemment, nous avons constaté que l’induction de l’hepcidin dans le foie par le polysaccharide (LPS) est dépendante de la voie de signalisation médiée par « Toll-like receptor 4 » (TLR4). Grâce au TLR4, le LPS induit l'activation des macrophages qui sécrètent de nombreuses différentes cytokines inflammatoires, y compris Interleukine 6 (IL-6), responsable de l'expression de HAMP hépatique. Dans le premier chapitre de la présente étude, nous avons étudié la régulation de HAMP dans la lignée cellulaire macrophagique RAW264.7 et dans les macrophages péritonéaux murins stimulés par différents ligands des TLRs. Nous avons constaté que TLR2 et TLR4 par l'intermédiaire de la protéine adaptatrice « myeloid differentiation primary response gene 88 » (MyD88) activent l'expression de HAMP dans les cellules RAW264.7 et les macrophages péritonéaux sauvages murins, tandis que cette expression a été supprimée dans les macrophages isolés des souris TLR2-/-, TLR4-déficiente ou MyD88-/-. En outre, nous avons constaté que la production d'IL-6 par les cellules RAW264.7 stimulées avec du LPS a été renforcée par l’ajout des quantités élevées de fer dans le milieu de culture. Au cours de l’inflammation, le niveau de HAMP est fortement augmenté. Ainsi, lorsque l'inflammation persiste, l’expression de HAMP continue à être activée par des cytokines pro-inflammatoires conduisant à une hyposidérémie. Malgré que cette dernière soit considérée comme une défense de l'hôte pour priver les micro-organismes de fer, celle ci cause un développement d'anémies nommées anémies des maladies chroniques. Ainsi, dans le deuxième chapitre de la présente étude, nous avons étudié l'implication des TLRs et leurs protéines adaptatrices MyD88 et TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) dans le développement des hyposidérémies. En utilisant des souris déficientes en MyD88 et TRIF, nous avons montré que les voies de signalisations MyD88 et TRIF sont essentielles pour l’induction de HAMP par le LPS. Malgré l'absence de HAMP, les souris déficientes ont été capables de développer une hyposidérémie, mais la réponse des souris déficientes en MyD88 a été très légère, ce qui indique l'exigence de cette protéine pour assurer une réponse maximale au LPS. En outre, nous avons constaté que la signalisation MyD88 est nécessaire pour le stockage du fer au niveau de la rate, ainsi que l'induction de lipocaline 2 (LCN2), qui est une protéine impliquée dans la fixation du fer pour limiter la croissance bactérienne. Indépendamment de MyD88 ou TRIF, l'activation de TLR4 et TLR3 a conduit, au niveau de la rate, à une diminution rapide de l’expression de FPN et du « Human hemochromatosis protein » (HFE) qui est une protéine qui limite la séquestration du fer cellulaire à partir de la circulation. Cependant, malgré cette baisse d’expression, le manque de la signalisation MyD88 a altéré de manière significative la réponse hyposidérémique. En établissant le rôle des TLRs et de la protéine adaptatrice MyD88 dans la diminution du taux du fer sérique au cours de la réponse inflammatoire, nous avons remarqué qu’en réponse au surcharge en fer les souris déficientes en MyD88 accumulent de manière significative plus de fer hépatique par rapport aux souris sauvages, et cela indépendamment des TLRs. Ainsi, dans le troisième chapitre de la présente étude, nous avons étudié le phénotype observé chez les souris déficientes en MyD88. Nous avons trouvé que l'expression de HAMP chez ces souris a été plus faible que celle des souris de type sauvage. Pour cela, nous avons exploré la signalisation à travers la voie du « Bone Morphogenetic Proteins 6 » (BMP6) qui est considérée comme étant la voie fondamentale de la régulation de HAMP en réponse aux concentrations du fer intracellulaires et extracellulaires et nous avons trouvé que l'expression protéique de Smad4, un régulateur positif de l'expression de HAMP, est significativement plus faible chez les souris MyD88-/- par rapport aux souris sauvages. En outre, on a montré que MyD88 interagit avec « mothers against decapentaplegic, Drosophila, homolog 4 » (Smad4) et que cette interaction est essentielle pour l’induction de HAMP à travers la voie BMP6. En conclusion, notre étude montre que l'expression de HAMP dans les macrophages est régulée principalement par TLR2 et TLR4 à travers la voie MyD88 et que l'accumulation du fer dans les macrophages peut affecter les niveaux des cytokines pro-inflammatoires. En outre, nos analyses démontrent que le développement d’hyposidérémie en réponse au LPS se produit par l'intermédiaire d’un mécanisme dépendant de MyD88 qui est dissociée de la production de cytokines et de HAMP. En plus, nos recherches montrent que MyD88 est nécessaire pour l'expression de Smad4 et cela pour garantir une réponse optimale à travers la signalisation BMP6, conduisant ainsi à une expression adéquate de HAMP. Enfin, la protéine MyD88 joue un rôle crucial dans, la régulation de HAMP au niveau des macrophages, la diminution du taux du fer sérique en réponse au LPS et le maintien de l'homéostasie du fer.

Le rôle du stress oxydant dans les changements épigénétiques contribuant aux complications du syndrome métabolique.

La méthylation de l'ADN est l'une des modifications épigénétiques au niveau des îlots CpG. Cette modification épigénétique catalysée par les ADN méthyltransférases (DNMTs) consiste en la méthylation du carbone 5' d’une cytosine ce qui aboutit à la formation de 5-méthylcytosine. La méthylation de l'ADN est clairement impliquée dans l'inactivation des gènes et dans l'empreinte génétique. Elle est modulée par la nutrition, en particulier par les donneurs de méthyle et par une restriction protéique. Ces modifications épigénétiques persistent plus tard dans la vie et conduisent au développement de nombreuses pathologies telles que le syndrome métabolique et le diabète de type 2. En fait, de nombreux gènes clés subissent une modification de leur état de méthylation en présence des composants du syndrome métabolique. Cela montre que la méthylation de l'ADN est un processus important dans l'étiologie du syndrome métabolique. Le premier travail de ce doctorat a porté sur la rédaction d’un article de revue qui a examiné le cadre central du syndrome métabolique et analyser le rôle des modifications épigénétiques susceptibles d'influer sur l'apparition du stress oxydant et des complications cardiométaboliques. D’autre part, les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées et traitées avec du Fer-Ascorbate pour induire un stress oxydant. Le Fer-Ascorbate a induit une augmentation significative de l’inflammation et de la peroxydation des lipides (malondialdehyde) ainsi que des altérations de de la défense antioxydante (SOD2 et GPx) accompagnées de modifications épigénétiques. De plus, la pré-incubation des cellules avec de la 5-aza-2'-désoxycytidine, un agent de déméthylation et/ou l’antioxydant Trolox a normalisé la défense antioxydante, réduit la peroxydation des lipides et prévenu l'inflammation. Ce premier travail a démontré que les modifications du redox et l’inflammation induites par le Fer-Ascorbate peuvent impliquer des changements épigénétiques, plus particulièrement des changements dans la méthylation de l’ADN. Pour mieux définir l’impact du stress oxydant au niveau nutritionnel, des cochons d’Inde âgés de trois jours ont été séparés en trois groupes : 1) Témoins: alimentation régulière; 2) Nutrition parentérale (NP) 3) H2O2 : Témoins + 350 uM H2O2. Après quatre jours, pour un groupe, les perfusions ont été stoppées et les animaux sacrifiés pour la collecte des foies. Pour l’autre groupe d’animaux, les perfusions ont été arrêtées et les animaux ont eu un accès libre à une alimentation régulière jusqu'à la fin de l’étude, huit semaines plus tard où ils ont été sacrifiés pour la collecte des foies. Ceci a démontré qu’à une semaine de vie, l'activité DNMT et les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient inférieurs pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. A neuf semaines de vie, l’activité DNMT est restée basse pour le groupe NP alors que les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient plus faibles pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. Ce travail a démontré que l'administration de NP ou de H2O2, tôt dans la vie, induit une hypométhylation de l'ADN persistante en raison d'une inhibition de l'activité DNMT. Finalement, des souris ayant reçu une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ont été utilisées comme modèle in vivo de syndrome métabolique. Les souris ont été nourris soit avec un régime standard chow (témoins), soit avec une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ou avec une diète HFHS en combinaison avec du GFT505 (30 mg/kg), un double agoniste de PPARα et de PPARδ, pendant 12 semaines. La diète HFHS était efficace à induire un syndrome métabolique étant donnée l’augmentation du poids corporel, du poids hépatique, des adiposités viscérales et sous-cutanées, de l’insensibilité à l’insuline, des lipides plasmatiques et hépatiques, du stress oxydant et de l’inflammation au niveau du foie. Ces perturbations étaient accompagnées d’une déficience dans l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ concomitant avec une hyperméthylation de leurs promoteurs respectifs. L’ajout de GFT505 à la diète HFHS a empêché la plupart des effets cardiométaboliques induits par la diète HFHS via la modulation négative de l’hyperméthylation des promoteurs, résultant en l’augmentation de l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ. En conclusion, GFT505 exerce des effets métaboliques positifs en améliorant le syndrome métabolique induit par l'alimentation HFHS via des modifications épigénétiques des gènes PPARs. Ensemble, les travaux de cette thèse ont démontré que le stress oxydant provenant de la nutrition induit d’importants changements épigénétiques pouvant conduire au développement du syndrome métabolique. La nutrition apparait donc comme un facteur crucial dans la prévention de la reprogrammation fœtale et du développement du syndrome métabolique. Puisque les mécanismes suggèrent que le stress oxydant agit principalement sur les métabolites du cycle de la méthionine pour altérer l’épigénétique, une supplémentation en ces molécules ainsi qu’en antioxydants permettrait de restaurer l’équilibre redox et épigénétique.