The role of the efflux mechanisms in multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis

Abstract The emergence of multi and extensively drug resistant tuberculosis (MDRTB and XDRTB) has increased the concern of public health authorities around the world. The World Health Organization has defined MDRTB as tuberculosis (TB) caused by organisms resistant to at least isoniazid and rifampicin, the main first-line drugs used in TB therapy, whereas XDRTB refers to TB resistant not only to isoniazid and rifampicin, but also to a fluoroquinolone and to at least one of the three injectable second-line drugs, kanamycin, amikacin and capreomycin. Resistance in Mycobacterium tuberculosis is mainly due to the occurrence of spontaneous mutations and followed by selection of mutants by subsequent treatment. However, some resistant clinical isolates do not present mutations in any genes associated with resistance to a given antibiotic, which suggests that other mechanism(s) are involved in the development of drug resistance, namely the presence of efflux pump systems that extrude the drug to the exterior of the cell, preventing access to its target. Increased efflux activity can occur in response to prolonged exposure to subinhibitory concentrations of anti-TB drugs, a situation that may result from inadequate TB therapy. The inhibition of efflux activity with a non-antibiotic inhibitor may restore activity of an antibiotic subject to efflux and thus provide a way to enhance the activity of current anti-TB drugs. The work described in this thesis foccus on the study of efflux mechanisms in the development of multidrug resistance in M. tuberculosis and how phenotypic resistance, mediated by efflux pumps, correlates with genetic resistance. In order to accomplish this goal, several experimental protocols were developed using biological models such as Escherichia coli, the fast growing mycobacteria Mycobacterium smegmatis, and Mycobacterium avium, before their application to M. tuberculosis. This approach allowed the study of the mechanisms that result in the physiological adaptation of E. coli to subinhibitory concentrations of tetracycline (Chapter II), the development of a fluorometric method that allows the detection and quantification of efflux of ethidium bromide (Chapter III), the characterization of the ethidium bromide transport in M. smegmatis (Chapter IV) and the contribution of efflux activity to macrolide resistance in Mycobacterium avium complex (Chapter V). Finally, the methods developed allowed the study of the role of efflux pumps in M. tuberculosis strains induced to isoniazid resistance (Chapter VI). By this manner, in Chapter II it was possible to observe that the physiological adaptation of E. coli to tetracycline results from an interplay between events at the genetic level and protein folding that decrease permeability of the cell envelope and increase efflux pump activity. Furthermore, Chapter III describes the development of a semi-automated fluorometric method that allowed the correlation of this efflux activity with the transport kinetics of ethidium bromide (a known efflux pump substrate) in E. coli and the identification of efflux inhibitors. Concerning M. smegmatis, we have compared the wild-type M. smegmatis mc2155 with knockout mutants for LfrA and MspA for their ability to transport ethidium bromide. The results presented in Chapter IV showed that MspA, the major porin in M. smegmatis, plays an important role in the entrance of ethidium bromide and antibiotics into the cell and that efflux via the LfrA pump is involved in low-level resistance to these compounds in M. smegmatis. Chapter V describes the study of the contribution of efflux pumps to macrolide resistance in clinical M. avium complex isolates. It was demonstrated that resistance to clarithromycin was significantly reduced in the presence of efflux inhibitors such as thioridazine, chlorpromazine and verapamil. These same inhibitors decreased efflux of ethidium bromide and increased the retention of [14C]-erythromycin in these isolates. Finaly, the methods developed with the experimental models mentioned above allowed the study of the role of efflux pumps on M. tuberculosis strains induced to isoniazid resistance. This is described in Chapter VI of this Thesis, where it is demonstrated that induced resistance to isoniazid does not involve mutations in any of the genes known to be associated with isoniazid resistance, but an efflux system that is sensitive to efflux inhibitors. These inhibitors decreased the efflux of ethidium bromide and also reduced the minimum inhibitory concentration of isoniazid in these strains. Moreover, expression analysis showed overexpression of genes that code for efflux pumps in the induced strains relatively to the non-induced parental strains. In conclusion, the work described in this thesis demonstrates that efflux pumps play an important role in the development of drug resistance, namely in mycobacteria. A strategy to overcome efflux-mediated resistance may consist on the use of compounds that inhibit efflux activity, restoring the activity of antimicrobials that are efflux pump substrates, a useful approach particularly in TB where the most effective treatment regimens are becoming uneffective due to the increase of MDRTB/XDRTB.

Terapêuticas antigénio-especificas no tratamento das doenças desmielinizantes: estudos sobre a vacinação com ADN e a descoberta de um novo alvo antigénico

RESUMO A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença desmielinizante crónica do Sistema Nervoso Central (SNC), provocada, em grande parte, por um ataque imuno-mediado contra diversos elementos da bainha de mielina. Dentro dos alvos antigénicos desta resposta autoimune, vários componentes proteicos e lipídicos da mielina têm vindo a ser identificados ao longo dos anos, entre os quais se destacam a proteína básica de mielina(MBP), glicoproteína ligodendrocitária da mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP) e glicoproteína associada à mielina (MAG). Com o desenvolvimento do modelo animal de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE), diversas terapias antigénio-específicas foram desenhadas, baseadas na modificação benéfica da resposta autoimune contra a mielina, tais como a administração de mielina ou seus componentes, os copolímeros terapêuticos, os ligandos peptídeos alterados e, recentemente, a vacinação com ácido desoxirribonucleico (ADN) codificador de proteínas de mielina, integrado em plasmídeos e purificado para administração parentérica. Neste trabalho, apresentamos os resultados de um extenso conjunto de experiências, subordinadas a dois temas fundamentais: 1) avaliação do potencial terapêutico, e dos mecanismos de acção, da vacinação tolerizadora com ADN codificador de proteínas de mielina (MBP, MOG, PLP, MAG) na EAE, e da associação desta vacinação com a administração de ADN de citocinas Th2, ou de oligonucleótidos imunomoduladores; 2) identificação e caracterização da resposta imune contra um novo componente da mielina com potencial antigénico, a proteína inibidora do recrescimento axonal, Nogo-A. No que respeita à vacinação com ADN, os nossos resultados comprovam a eficácia desta terapêutica antigénio-específica na prevenção e tratamento da EAE. Os seus mecanismos de acção incluem, entre outros, a supressão anérgica da proliferação antigénioespecífica dos linfócitos T anti-mielina (no modo de prevenção da doença), o enviesamento Th2 da resposta imune (quando co-administrada com a vacina de ADN codificadora da citocina IL-4, funcionando como terapia génica local), e a redução da diversificação de epítopos da resposta humoral anti-mielina, avaliada através de myelin spotted arrays. A associação das vacinas de ADN com oligonucleótidos imunomoduladores GpG, desenvolvidos para contrariar as sequências CpG imunoestimuladoras presentes no vector de vacinação, levou à melhoria da sua eficácia terapêutica, devida, provavelmente, ao efeito estimulador preferencial dos oligonucleótidos GpG sobre linfócitos Th2 e sobre células reguladoras NK-T. Com base nestes resultados a vacinação com ADN foi desenvolvida para o tratamento da EM em humanos, com ensaios clínicos a decorrerem neste momento. Em relação à proteína Nogo-A, estudos de estrutura primária e de previsão de antigenicidade identificaram a região Nogo-66 como alvo antigénico potencial para a EAE. Nas estirpes de ratinho SJL/J e C57BL/6, fomos capazes de induzir sinais clínicos e histológicos de EAE após imunização com os epítopos encefalitogénicos Nogo1-22, Nogo23- 44 e Nogo45-66, utilizando protocolos de quebra de tolerância imune. Ao mesmo tempo, identificámos e caracterizámos uma resposta linfocitária T específica contra os antigénios contidos na região Nogo-66, e uma resposta linfocitária B com diversificação intra e intermolecular a vários determinantes presentes noutras proteínas da mielina. A transferência adoptiva de linhas celulares Th2 anti-Nogo45-66, levou à melhoria clínica e histológica da EAE em animais recipientes induzidos com outros antigénios de mielina, após migração destas células para o SNC. Estes dados comprovam a importância da Nogo-66 como antigénio na EAE, e a eficácia de terapias antigénio-específicas nela baseadas. No seu conjunto, os nossos resultados confirmam o potencial terapêutico das vacinas de ADN codificadoras de proteínas de mielina, bem como a importância dos encefalitogénios contidos na proteína Nogo-A para a fisiopatologia da EAE e da EM, com eventual relevância para o desenvolvimento de novas terapias antigénio-específicas. O aperfeiçoamento futuro destas terapias poderá levar, eventualmente, a uma capacidade de manipulação da resposta imune que permita o tratamento eficaz das doenças inflamatórias desmielinizantes, como a Esclerose Múltipla. ABSTRACT Multiple Sclerosis (MS) is a chronic demyelinating disease of the Central Nervous System (CNS), caused, mainly, by an immune-mediated attack against several elements of the myelin sheath. Among the antigenic targets for this autoimmune response, several proteic and lipidic myelin components have been identified throughout the years, of which myelin basic protein (MBP), myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), proteolipidic protein (PLP), and myelin associated glycoprotein (MAG) are the best characterized. With the development of the animal model for MS, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), several antigen-specific therapies have been designed, based on beneficial modifications of the autoimmune response against myelin. These have included myelin and myelin component administration, therapeutic copolymers, altered peptide ligands and, more recently, vaccination with myelin-protein encoding deoxyribonucleic acid (DNA), integrated into plasmids and purified for parenteral administration. In this work we present the results of an extensive series of experiments, subordinate to two fundamental areas: 1) evaluating the therapeutic potential, and mechanisms of action, of tolerizing myelin protein (MBP, MOG, PLP, MAG) DNA vaccination in EAE, alone and in association with Th2 cytokine DNA administration, or immunomodulatory oligonucleotides; 2) identifying and characterizing the immuneresponse against a new myelin component with antigenic potential, the axonal regrowth inhibitor Nogo-A. Regarding DNA vaccination, our results prove the efficacy of this antigen-specific therapy for the prevention and treatment of EAE. Its mechanisms of action include, among others, anergic suppression of antigen-specific T-cell proliferation against myelin (in prevention mode), Th2 biasing of the immune response (when co-administered with the IL- 4 codifying DNA vaccine, acting as local gene therapy), and reduction of epitope spreading of the anti-myelin antibody response, assessed by myelin spotted arrays. The combination of myelin DNA vaccination with the administration of GpG immunomodulatory oligonucleotides, designed to counteract immunostimulatory CpG motifs present in the vaccination vector, led to an improvement in therapeutic efficacy, probably due to the preferential stimulatory effect of GpG oligonucleotides on Th2 lymphocytes and on regulatory NK-T cells. Based on these results, tolerizing DNA vaccination is being developed for human use, with ongoing clinical trials. As concerns the Nogo-A protein, based on studies of primary structure and prediction of antigenicity, we identified the Nogo-66 region (responsible for the most of the inhibitory capacity of this protein) as a potential antigenic target for EAE. In the SJL/Jand C57BL/6 mouse strains, we were able to induce clinical and histological signs of EAE,after immunization with the encefalitogenic epitopes Nogo1-22, Nogo23-44 and Nogo45-66,using a tolerance breakdown protocol. Concomitantly, we identified and characterized a specific T cell response against these antigens, together with a B cell response which showed extensive intra and intermolecular epitope spread to several determinants present in other myelin proteins. Adoptive transfer of nti-Nogo45-66 Th2 cell lines resulted in clinical and histological improvement of EAE in recipient animals induced with other myelin antigens, after intraparenchymal CNS migration of anti-Nogo cells. These data confirm the relevance of Nogo-66 as an antigen in EAE, as well as the efficacy of antigenspecific therapies based on the response against this protein.In conclusion, our results substantiate the therapeutic potential of myelin-encoding DNA vaccination, as well as the importance of encefalitogenic epitopes present in the Nogo-A protein for the pathophysiology of EAE and MS, with potential relevance for the creation of new antigen specific-therapies. The future development of these therapies may eventually lead to a degree of manipulation of the immune response that allows the effective treatment of autoimmune, inflammatory, demyelinating diseases, such as Multiple Sclerosis.

Bioatividade de Líquidos Iónicos derivados do Ácido Valpróico em bactérias Gram-negativa

Os Líquidos Iónicos (LIs) são sais orgânicos constituídos exclusivamente por iões e possuem pontos de fusão inferiores a 100ºC. As suas propriedades únicas e o facto de ser possível ajustar as suas propriedades físicas, químicas e biológicas, de acordo com o objetivo pretendido, tornam esta classe de compostos, um grande objeto de estudo de inúmeros investigadores. Desde os inícios da sua aplicação até à atualidade, a investigação nesta área expandiu o seu raio de ação, estando já descrito o seu potencial como agentes antimicrobianos e, mais recentemente, como compostos farmacêuticos ativos. Atualmente muitas das suas aplicações são baseadas nas suas propriedades biológicas. Esta Tese teve como objetivo avaliar a influência que os LIs podem exercer a nível do crescimento bacteriano e estudar alternativas de combater a resistência bacteriana. Todos os LIs utilizados neste trabalho tinham como anião o ácido valpróico, sendo utilizados catiões orgânicos de amónio e de imidazólio. Foram utilizadas 4 bactérias e avaliou-se a atividade biológica e a respetiva taxa de crescimento. O estudo da sua atividade biológica foi feito através da determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) e a análise das suas curvas de crescimentos na presença e ausência de composto. Com este trabalho foi possível verificar que dentro dos compostos em estudo, LIs derivados do valproato, o Valproato com o cetilperidínio [valp] [cetylpir] foi o que influenciou o crescimento de todas as bactérias estudadas. Este estudo demonstrou o potencial antibacteriano de alguns compostos, podendo desta forma vir a ser utilizados para fins farmacêuticos

Natural killer cell activity in experimental paracoccidioidomycosis of the Syrian hamster

The study evaluated the activity of NK cells during the course of experimental infection of hamsters with Paracoccidioides brasiliensis. Eigthy hamsters were infected with P. brasiliensis by intratesticular route and sacrificed at 24h, 48h, 96h, 1, 2, 4, 8 and 11 weeks of infection and compared to 40 noninfected hamsters employed as controls. These animals were submitted to the study of NK cytotoxic activity by a single-cell assay and humoral immune response by immunodiffusion and ELISA tests. The production of macrophage migration inhibitory factor in the presence of Phyto-hemagglutinin and P. brasiliensis antigen and histopathology of the lesions were evaluated at 1, 4, 8 and 11 weeks of infection. The infected animals displayed significantly high levels of NK activity during the four weeks of infection that decreased from the 8th week on when compared to controls. This impairment of NK activity was associated with depression of cell-mediated immune response and with increase in the extension of the histopathologic lesions. There was an inverse correlation between NK cell activity and specific antibody levels. The results suggest that after initial activation, NK cells were unable to control the fungus dissemination. The impairment of NK activity in the late stages of the infection might be related to immunoregulatory disturbances associated with paracoccidioidomycosis.

Modulação do estado redox em bactérias por quinoxalinas

As quinoxalinas são compostos heterocíclicos que têm, entre outras, capacidades antimicrobianas, inclusivamente contra bactérias resistentes aos antimicrobianos convencionais. Os mecanismos pelos quais estes compostos exercem a sua atividade ainda não está completamente esclarecido. O objetivo do presente estudo é avaliar o efeito redox em sinergismo/antagonismo com as quinoxalinas em modelos de bactérias com e sem resistências a antimicrobianos. No que se refere aos compostos foram utilizados a quinoxalina 1,4-dióxido (QNX), 2-metil-3-benzilquinoxalina-1,4-dióxido (2M3BQNX), 2-metilquinoxalina-1,4-dióxido (2MQNX) e a 2-amino-3-cianoquinoxalina-1,4-dióxido (2A3CQNX). Quanto aos modelos procariotas, foram utilizados a Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300, Escherichia coli TEM 201 e Escherichia coli TEM 180. Nos compostos químicos em que se verificou a Concentração Mínima Inibitória (CMI), realizou-se o estudo do comportamento do crescimento bacteriano. Relativamente ao estado redox, foi avaliado para cada estirpe sensível, através do rácio GSH/GSSG, nas doses inibitórias e não inibitórias de cada composto. Os resultados apresentam que todos os compostos testados, à exceção do 2M3BQNX, têm atividade antimicrobiana na maioria das estirpes, excetuando a E. faecalis e a S. saprophyticus. Os rácios GSH/GSSG apontam para o efeito oxidante em K. pneumoniae e S. enterica e antioxidante na E. aerogenes. A conclusão do estudo sugere que os compostos apresentam elevada capacidade antibacteriana e influência no equilíbrio redox das bactérias, podendo contribuir para o esclarecimento do mecanismo de ação dos derivados das quinoxalinas 1-4 dióxido, nas bactérias.

Functional significance of adenosine in carotid body chemosensory activity in control and chronically hypoxic animals

ABSTRACT: Carotid bodies (CB) are peripheral chemoreceptor organs sensing changes in arterial blood O2, CO2 and pH levels. Hypoxia and acidosis or hypercapnia activates CB chemoreceptor cells, which respond by releasing neurotransmitters in order to increase the action potential frequency in their sensory nerve, the carotid sinus nerve (CSN). CSN activity is integrated in the brainstem to induce a fan of cardiorespiratory reflex responses, aimed at normalising the altered blood gases. Exogenously applied adenosine (Ado) increases CSN chemosensory activity inducing hyperventilation through activation of A2 receptors. The importance of the effects of adenosine in chemoreception was reinforced by data obtained in humans, in which the intravenous infusion of Ado causes hyperventilation and dyspnoea, an effect that has been attributed to the activation of CB because Ado does not cross blood-brain barrier and because the ventilatory effects are higher the closer to the CB it is injected. The present work was performed in order to establish the functional significance of adenosine in chemoreception at the carotid body in control and chronically hypoxic rats. To achieve this objective we investigated: 1) The release of adenosine from a rat carotid body in vitro preparation in response to moderate hypoxia and the specificity of this release. We also investigated the metabolic pathways of adenosine production and release in the organ in normoxia and hypoxia; 2) The modulation of adenosine/ATP release from rat carotid body chemoreceptor cells by nicotinic ACh receptors; 3) The effects of caffeine on peripheral control of breathing and the identity of the adenosine receptors involved in adenosine and caffeine effects on carotid body chemoreceptors; 4) The interactions between dopamine D2 receptors and adenosine A2B receptors that modulate the release of catecholamines (CA) from the rat carotid body; 5) The effect of chronic caffeine intake i.e. the continuous blockage of adenosine receptors thereby simulating a caffeine dependence, on the carotid body function in control and chronically hypoxic rats. The methodologies used in this work included: molecular biology techniques (e.g. immunocytochemistry and western-blot), biochemical techniques (e.g. neurotransmitter quantification by HPLC, bioluminescence and radioisotopic methods), electrophysiological techniques (e.g. action potential recordings) and ventilatory recordings using whole-body plethysmography. It was observed that: 1) CB chemoreceptor sensitivity to hypoxia could be related to its low threshold for the release of adenosine because moderate acute hypoxia (10% O2) increased adenosine concentrations released from the CB by 44% but was not a strong enough stimulus to evoke adenosine release from superior cervical ganglia and arterial tissue; 2) Acetylcholine (ACh) modulates the release of adenosine/5’-adenosine triphosphate (ATP) from CB in moderate hypoxia through the activation of nicotinic receptors with α4 and ß2 receptor subunits, suggesting that the excitatory role of ACh in chemosensory activity includes indirect activation of purinergic receptors by adenosine and ATP, which strongly supports the hypothesis that ATP/adenosine are important mediators in chemotransduction; 3) adenosine increases the release of CA from rat CB chemoreceptor cells via A2B receptors; 4) the inhibitory effects of caffeine on CB chemoreceptors are mediated by antagonism of postsynaptic A2A and presynaptic A2B adenosine receptors indicating that chemosensory activity elicited by hypoxia is controlled by adenosine; 5) The release of CA from rat CB chemoreceptor cells is modulated by adenosine through an antagonistic interaction between A2B and D2 receptors, for the first time herein described; 6) chronic caffeine treatment did not significantly alter the basal function of CB in normoxic rats assessed as the dynamics of their neurotransmitters, dopamine, ATP and adenosine, and the CSN chemosensory activity. In contrast, the responses to hypoxia in these animals were facilitated by chronic caffeine intake because it increased the ventilatory response, slightly increased CSN chemosensory activity and increased dopamine (DA) and ATP release; 7) In comparison with normoxic rats, chronically hypoxic rats exhibited an increase in several parameters: ventilatory hypoxic response; basal and hypoxic CSN activity; tyrosine hydroxylase expression, CA content, synthesis and release; basal and hypoxic adenosine release; and in contrast a normal basal release and diminished hypoxia-induced ATP release; 8) Finally, in contrast to chronically hypoxic rats, chronic caffeine treatment did not alter the basal CSN chemosensory activity. Nevertheless, the responses to mild and intense hypoxia, and hypercapnia, were diminished. This inhibitory effect of chronic caffeine in CB output is compensated by central mechanisms, as the minute ventilation parameter in basal conditions and in response to acute hypoxic challenges remained unaltered in rats exposed to chronic hypoxia. We can conclude that adenosine both in acute and chronically hypoxic conditions have an excitatory role in the CB chemosensory activity, acting directly on adenosine A2A receptors present postsynaptically in CSN, and acting presynaptically via A2B receptors controlling the release of dopamine in chemoreceptor cells. We suggest that A2B -D2 adenosine / dopamine interactions at the CB could explain the increase in CA metabolism caused by chronic ingestion of caffeine during chronic hypoxia. It was also concluded that adenosine facilitates CB sensitisation to chronic hypoxia although this effect is further compensated at the central nervous system.-------- RESUMO: Os corpos carotídeos (CB) são pequenos orgãos emparelhados localizados na bifurcação da artéria carótida comum. Estes órgãos são sensíveis a variações na PaO2, PaCO2, pH e temperatura sendo responsáveis pela hiperventilação que ocorre em resposta à hipóxia, contribuindo também para a hiperventilação que acompanha a acidose metabólica e respiratória. As células quimiorreceptoras (tipo I ou glómicas) do corpo carotídeo respondem às variações de gases arteriais libertando neurotransmissores que activam as terminações sensitivas do nervo do seio carotídeo (CSN) conduzindo a informação ao centro respiratório central. Está ainda por esclarecer qual o neurotransmissor (ou os neurotransmissores) responsável pela sinalização hipóxica no corpo carotídeo. A adenosina é um neurotransmissor excitatório no CB que aumenta a actividade eléctrica do CSN induzindo a hiperventilação através da activação de receptores A2. A importância destes efeitos da adenosina na quimiorrecepção, descritos em ratos e gatos, foi reforçada por resultados obtidos em voluntários saudáveis onde a infusão intravenosa de adenosina em induz hiperventilação e dispneia, efeito atribuído a uma activação do CB uma vez que a adenosina não atravessa a barreira hemato-encefálica e o efeito é quanto maior quanto mais perto do CB for a administração de adenosina. O presente trabalho foi realizado com o objectivo de esclarecer qual o significado funcional da adenosina na quimiorrecepção no CB em animais controlo e em animais submetidos a hipoxia crónica mantida. Para alcançar este objectivo investigou-se: 1) o efeito da hipóxia moderada sobre a libertação de adenosina numa preparação in vitro de CB e a especificidade desta mesma libertação comparativamente com outros tecidos não quimiossensitivos, assim como as vias metabólicas de produção e libertação de adenosina no CB em normoxia e hipóxia; 2) a modulação da libertação de adenosina/ATP das células quimiorreceptoras do CB por receptores nicotínicos de ACh; 3) os efeitos da cafeína no controlo periférico da ventilação e a identidade dos receptores de adenosina envolvidos nos efeitos da adenosina e da cafeína nos quimiorreceptores do CB; 4) as interacções entre os receptores D2 de dopamina e os receptores A2B de adenosina que modulam a libertação de catecolaminas (CA) no CB de rato e; 5) o efeito da ingestão crónica de cafeína, isto é, o contínuo bloqueio e dos receptores de adenosina, simulando assim o consumo crónico da cafeína, tal como ocorre na população humana mundial e principalmente no ocidente, na função do corpo carotídeo em ratos controlo e em ratos submetidos a hipoxia crónica. Os métodos utilizados neste trabalho incluíram: técnicas de biologia molecular como imunocitoquímica e western-blot; técnicas bioquímicas, tais como a quantificação de neurotransmissores por HPLC, bioluminescência e métodos radioisotópicos; técnicas electrofisiológicas como o registro de potenciais eléctricos do nervo do seio carotídeo in vitro; e registros ventilatórios in vivo em animais não anestesiados e em livre movimento (pletismografia). Observou-se que: 1) a especificidade dos quimiorreceptores do CB como sensores de O2 está correlacionada com o baixo limiar de libertação de adenosina em resposta à hipóxia dado que a libertação de adenosina do CB aumenta 44% em resposta a uma hipóxia moderada (10% O2), que no entanto não é um estímulo suficientemente intenso para evocar a libertação de adenosina do gânglio cervical superior ou do tecido arterial. Observou-se também que aproximadamente 40% da adenosina libertada pelo CB provém do catabolismo extracelular do ATP quer em normóxia quer em hipóxia moderada, sendo que PO2 reduzidas induzem a libertação de adenosina via activação do sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) a ACh modula a libertação de adenosina /ATP do CB em resposta à hipoxia moderada sugerindo que o papel excitatório da ACh na actividade quimiossensora inclui a activação indirecta de receptores purinérgicos pela adenosina e ATP, indicando que a adenosina e o ATP poderiam actuar como mediadores importantes no processo de quimiotransducção uma vez que: a) a activação dos receptores nicotínicos de ACh no CB em normóxia estimula a libertação de adenosina (max 36%) provindo aparentemente da degradação extracelular do ATP. b) a caracterização farmacológica dos receptores nicotínicos de ACh envolvidos na estimulação da libertação de adenosina do CB revelou que os receptores nicotínicos de ACh envolvidos são constituídos por subunidades α4ß2. 3) a adenosina modula a libertação de catecolaminas das células quimiorreceptoras do CB através de receptores de adenosina A2B dado que: a)a cafeína, um antagonista não selectivo dos receptores de adenosina, inibiu a libertação de CA quer em normóxia quer em resposta a estímulos de baixa intensidade sendo ineficaz na libertação induzida por estímulos de intensidade superior; b) o DPCPX e do MRS1754 mimetizaram os efeitos da cafeína no CB sendo o SCH58621 incapaz de induzir a libertação de CA indicando que os efeitos da cafeína seriam mediados por receptores A2B de adenosina cuja presença nas células quimiorreceptoras do CB demonstramos por imunocitoquímica. 4) a aplicação aguda de cafeína inibiu em 52% a actividade quimiossensora do CSN induzida pela hipóxia sendo este efeito mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A pós-sinápticos e A2B pré-sinápticos indicando que a actividade quimiossensora induzida pela hipóxia é controlada pela adenosina. 5) existe uma interacção entre os receptores A2B e D2 que controla a libertação de CA do corpo carotídeo de rato uma vez que: a) os antagonistas dos receptores D2, domperidona e haloperidol, aumentaram a libertação basal e evocada de CA das células quimiorreceptoras confirmando a presença de autorreceptores D2 no CB de rato que controlam a libertação de CA através de um mecanismo de feed-back negativo. b) o sulpiride, um antagonista dos receptores D2, aumentou a libertação de CA das células quimiorreceptoras revertendo o efeito inibitório da cafeína sobre esta mesma libertação; c) a propilnorapomorfina, um agonista D2 inibiu a libertação basal e evocada de CA sendo este efeito revertido pela NECA, um agonista dos receptores A2B. O facto de a NECA potenciar o efeito do haloperidol na libertação de CA sugere que a interacção entre os receptores D2 e A2B poderia também ocorrer ao nível de segundos mensageiros, como o cAMP. 6) a ingestão crónica de cafeína em ratos controlo (normóxicos) não alterou significativamente a função basal do CB medida como a dinâmica dos seus neurotransmissores, dopamina, ATP e adenosina e como actividade quimiossensora do CSN. Contrariamente aos efeitos basais, a ingestão crónica de cafeína facilitou a resposta à hipóxia, dado que aumentou o efeito no volume minuto respiratórioapresentando-se também uma clara tendência para aumentar a actividade quimiossensora do CSN e aumentar a libertação de ATP e dopamina.7) após um período de 15 dias de hipóxia crónica era evidente o fenómeno de aclimatização dado que as respostas ventilatórias à hipóxia se encontram aumentadas, assim como a actividade quimiossensora do CSN basal e induzida pela hipóxia. As alterações observadas no metabolismo da dopamina, assim como na libertação basal de dopamina e de adenosina poderiam contribuir para a aclimatização durante a hipoxia crónica. A libertação aumentada de adenosina em resposta à hipóxia aguda em ratos hipóxicos crónicos sugere um papel da adenosina na manutenção/aumento das respostas ventilatórias à hipóxia aguda durante a hipóxia crónica. Observou-se também que a libertação de ATP induzida pela hipóxia aguda se encontra diminuída em hipóxia crónica, contudo a ingestão crónica de cafeína reverteu este efeito para valores similares aos valores controlo, sugerindo que a adenosina possa modular a libertação de ATP em hipóxia crónica. 8) a ingestão crónica de cafeína em ratos hipóxicos crónicos induziu o aumento do metabolismo de CA no CB, medido como expressão de tirosina hidroxilase, conteúdo, síntese e libertação de CA. 9) a ingestão crónica de cafeína não provocou quaisquer alterações na actividade quimiossensora do CSN em ratos hipóxicos crónicos no entanto, as respostas do CSN à hipóxia aguda intensa e moderada e à hipercapnia encontram-se diminuídas. Este efeito inibitório que provém da ingestão crónica de cafeína parece ser compensado ao nível dos quimiorreceptores centrais dado que os parâmetros ventilatórios em condições basais e em resposta à hipoxia aguda não se encontram modificados em ratos expostos durante 15 dias a uma atmosfera hipóxica. Resumindo podemos assim concluir que a adenosina quer em situações de hipoxia aguda quer em condições de hipoxia crónica tem um papel excitatório na actividade quimiossensora do CB actuando directamente nos receptores A2A presentes pós-sinapticamente no CSN, assim como facilitando a libertação de dopamina pré-sinapticamente via receptores A2B presentes nas células quimiorreceptoras. A interacção negativa entre os receptores A2B e D2 observadas nas células quimiorreceptoras do CB poderia explicar o aumento do metabolismo de CA observado após a ingestão crónica de cafeína em animais hipóxicos. Conclui-se ainda que durante a aclimatização à hipóxia a acção inibitória da cafeína, em termos de resposta ventilatória, mediada pelos quimiorreceptores periféricos é compensada pelos efeitos excitatórios desta xantina ao nível do quimiorreceptores centrais.------- RESUMEN Los cuerpos carotídeos (CB) son órganos emparejados que están localizados en la bifurcación de la arteria carótida común. Estos órganos son sensibles a variaciones en la PaO2, en la PaCO2, pH y temperatura siendo responsables de la hiperventilación que ocurre en respuesta a la hipoxia, contribuyendo también a la hiperventilación que acompaña a la acidosis metabólica y respiratoria. Las células quimiorreceptoras (tipo I o glómicas) del cuerpo carotídeo responden a las variaciones de gases arteriales liberando neurotransmissores que activan las terminaciones sensitivas del nervio del seno carotídeo (CSN) llevando la información al centro respiratorio central. Todavía esta por clarificar cual el neurotransmisor (o neurotransmisores) responsable por la señalización hipóxica en el CB. La adenosina es un neurotransmisor excitatório en el CB ya que aumenta la actividad del CSN e induce la hiperventilación a través de la activación de receptores de adenosina del subtipo A2. La importancia de estos efectos de la adenosina en la quimiorrecepción, descritos en ratas y gatos, ha sido fuertemente reforzada por resultados obtenidos en voluntarios sanos en los que la infusión intravenosa de adenosina induce hiperventilación y dispnea, efectos estés que han sido atribuidos a una activación del CB ya que la adenosina no cruza la barrera hemato-encefalica y el efecto es tanto más grande cuanto más cercana del CB es la administración. Este trabajo ha sido realizado con el objetivo de investigar cual el significado funcional de la adenosina en la quimiorrecepción en el CB en animales controlo y en animales sometidos a hipoxia crónica sostenida. Para alcanzar este objetivo se ha estudiado: 1) el efecto de la hipoxia moderada en la liberación de adenosina en una preparación in vitro de CB y la especificidad de esta liberación en comparación con otros tejidos no-quimiosensitivos, así como las vías metabólicas de producción y liberación de adenosina del órgano en normoxia y hipoxia; 2) la modulación de la liberación de adenosina/ATP de las células quimiorreceptoras del CB por receptores nicotínicos de ACh; 3) los efectos de la cafeína en el controlo periférico de la ventilación y la identidad de los receptores de adenosina involucrados en los efectos de la adenosina y cafeína en los quimiorreceptores del CB; 4) las interacciones entre los receptores D2 de dopamina y los receptores A2B de adenosina que modulan la liberación de catecolaminas (CA) en el CB de rata y; 5) el efecto de la ingestión crónica de cafeína, es decir, el bloqueo sostenido de los receptores de adenosina, simulando la dependencia de cafeína observada en la populación mundial del occidente, en la función del CB en ratas controlo y sometidas a hipoxia crónica sostenida. Los métodos utilizados en este trabajo incluirán: técnicas de biología molecular como imunocitoquímica y western-blot; técnicas bioquímicas, tales como la cuantificación de neurotransmissores por HPLC, bioluminescencia y métodos radioisotópicos; técnicas electrofisiológicas como el registro de potenciales eléctricos del nervio do seno carotídeo in vitro; y registros ventilatórios in vivo en animales no anestesiados y en libre movimiento (pletismografia). Se observó que: 1) la sensibilidad de los quimiorreceptores de CB esta correlacionada con un bajo umbral de liberación de adenosina en respuesta a la hipoxia ya que en respuesta a una hipoxia moderada (10% O2) la liberación de adenosina en el CB aumenta un 44%, sin embargo esta PaO2 no es un estimulo suficientemente fuerte para inducir la liberación de adenosina del ganglio cervical superior o del tejido arterial; se observó también que aproximadamente 40% de la adenosina liberada del CB proviene del catabolismo extracelular del ATP en normoxia y en hipoxia moderada, y que bajas PO2 inducen la liberación de adenosina vía activación del sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) la ACh modula la liberación de adenosina /ATP del CB en respuesta a la hipóxia moderada lo que sugiere que el papel excitatório de la ACh en la actividad quimiosensora incluye la activación indirecta de receptores purinérgicos por la adenosina y el ATP, indicando que la adenosina y el ATP pueden actuar como mediadores importantes en el proceso de quimiotransducción ya que: a) la activación de los receptores nicotínicos de ACh en el CB en normoxia estimula la liberación de adenosina (max 36%) que aparentemente proviene de la degradación extracelular del ATP. Se observó también que este aumento de adenosina en el CB en hipoxia ha sido antagonizado parcialmente por antagonistas de estos mismos receptores; b) la caracterización farmacológica de los receptores nicotínicos de ACh involucrados en la estimulación de la liberación de adenosina del CB ha revelado que los receptores nicotínicos de ACh involucrados son constituidos por sub-unidades α4ß2. 3) la adenosina modula la liberación de CA de las células quimiorreceptoras del CB a través de receptores de adenosina A2B ya que: a) la cafeína, un antagonista no selectivo de los receptores de adenosina, ha inhibido la liberación de CA en normoxia y en respuesta a estímulos de baja intensidad siendo ineficaz en la liberación inducida por estímulos de intensidad superior; b) el DPCPX y el MRS1754 ha mimetizado los efectos de la cafeína en el CB y el SCH58621 ha sido incapaz de inducir la liberación de CA lo que sugiere que los efectos de la cafeína son mediados por receptores A2B de adenosina que están localizados pré-sinapticamente en las células quimiorreceptoras del CB. 4) la aplicación aguda de cafeína ha inhibido en 52% la actividad quimiosensora del CSN inducida por la hipoxia siendo este efecto mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A pós-sinápticos y A2B pré-sinápticos lo que indica que la actividad quimiosensora inducida por la hipoxia es controlada por la adenosina. 5) existe una interacción entre los receptores A2B y D2 que controla la liberación de CA del CB de rata ya que: a) el sulpiride, un antagonista de los receptores D2, ha aumentado la liberación de CA de las células quimiorreceptoras revertiendo el efecto inhibitorio de la cafeína sobre esta misma liberación; b) los antagonistas de los receptores D2, domperidona y haloperidol, han aumentado la liberación basal e evocada de CA de las células quimiorreceptoras confirmando la presencia de autorreceptores D2 en el CB de rata que controlan la liberación de CA a través de un mecanismo de feed-back negativo; c) la propilnorapomorfina, un agonista D2, ha inhibido la liberación basal e evocada de CA sendo este efecto revertido por la NECA, un agonista de los receptores A2B. Ya que la NECA potencia el efecto del haloperidol en la liberación de CA la interacción entre los D2 y A2B puede también ocurrir al nivel de segundos mensajeros, como el cAMP. 6) la ingestión crónica de cafeína en ratas controlo (normóxicas) no ha cambiado significativamente la función basal del CB medida como la dinámica de sus neurotransmisores, dopamina, ATP y adenosina y como actividad quimiosensora del CSN. Al revés de lo que pasa con los efectos básales, la ingestión crónica de cafeína facilitó la respuesta a la hipóxia, ya que ha aumentado la respuesta ventilatória medida como volumen minuto presentando también una clara tendencia para aumentar la actividad quimiosensora del CSN y aumentar la liberación de ATP y dopamina. 7. Después de un período de 15 días de hipoxia crónica se puede observar el fenómeno de climatización ya que las respuestas ventilatórias a la hipoxia están aumentadas, así como la actividad quimiosensora del CSN basal e inducida por la hipoxia. Los cambios observados en el metabolismo de la dopamina, así como en la liberación basal de dopamina y de adenosina podrían contribuir para la climatización en hipoxia crónica. El aumento en la liberación de adenosina en respuesta a la hipoxia aguda en ratas sometidas a hipoxia crónica sugiere un papel para la adenosina en el mantenimiento/aumento de las respuestas ventilatórias a la hipoxia aguda en hipoxia crónica sostenida. Se ha observado también que la liberación de ATP inducida por la hipoxia aguda está disminuida en hipoxia crónica y que la ingestión crónica de cafeína reverte este efecto para valores similares a los valores controlo, sugiriendo que la adenosina podría modular la liberación de ATP en hipoxia crónica. 8. la ingestión crónica de cafeína ha inducido el aumento del metabolismo de CA en el CB en ratas hipóxicas crónicas, medido como expresión de la tirosina hidroxilase, contenido, síntesis y liberación de CA. 9. la ingestión crónica de cafeína no ha inducido cambios en la actividad quimiosensora del CSN en ratas hipóxicas crónicas sin embargo las respuestas do CSN a una hipoxia intensa y moderada y a la hipercapnia están disminuidas. Este efecto inhibitorio que es debido a la ingestión crónica de cafeína es compensado al nivel de los quimiorreceptores centrales ya que los parámetros ventilatórios en condiciones básales y en respuesta a la hipoxia aguda no están modificados en ratas expuestas durante 15 días a una atmósfera hipóxica. Resumiendo se puede concluir que la adenosina en situaciones de hipoxia aguda así como en hipoxia crónica tiene un papel excitatório en la actividad quimiosensora del CB actuando directamente en los receptores A2A localizados pós-sinapticamente en el CSN, así como controlando la liberación de dopamina pré-sinaptica vía receptores A2B localizados en las células quimiorreceptoras. Las interacciones entre los receptores A2B y D2 observadas en las células quimiorreceptoras del CB podrían explicar el aumento del metabolismo de CA observado después de la ingestión crónica de cafeína en animales hipóxicos. Por fin, pero no menos importante se puede concluir que durante la climatización a la hipoxia la acción inhibitoria de la cafeína, medida como respuesta ventilatória, mediada por los quimiorreceptores periféricos es compensada por los efectos excitatórios de esta xantina al nivel de los quimiorreceptores centrales.

Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae as etiological agents of conjunctivitis outbreaks in the region of Ribeirão Preto, SP, Brazil

In the study of conjunctivitis outbreaks occurring from September 1994 to September 1996 in the region of Ribeirão Preto, conjunctival exudates of 92 patients were cultivated in Instituto Adolfo Lutz Laboratory I, Ribeirão Preto. Most cases occurred in the age range 2-7 years. The etiological agents which were most frequently isolated from the analyzed cases were: Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae, in 40.22% and 21.74%, respectively. 51.35% of the S. pneumoniae isolated strains were not typable. The oxacillin-resistant S. pneumoniae strains were submitted to the minimum inhibitory concentration test (MIC) and three of them presented intermediate resistance, whereas only one was highly resistant to penicillin.

Light controlled synthesis of nucleic acids

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor em Bioquímica - especialidade Biotecnologia, pela Universidade Nova de Lisboa,Faculdade de Ciências e Tecnologia

Iron Overload Favors the Elimination of Leishmania

Iron plays a central role in host-parasite interactions, since both intervenients need iron for survival and growth, but are sensitive to iron-mediated toxicity. The host’s iron overload is often associated with susceptibility to infection. However, it has been previously reported that iron overload prevented the growth of Leishmania major, an agent of cutaneous leishmaniasis, in BALB/c mice. In order to further clarify the impact of iron modulation on the growth of Leishmania in vivo, we studied the effects of iron supplementation or deprivation on the growth of L. infantum, the causative agent of Mediterranean visceral leishmaniasis, in the mouse model. We found that dietary iron deficiency did not affect the protozoan growth, whereas iron overload decreased its replication in the liver and spleen of a susceptible mouse strain. The fact that the iron-induced inhibitory effect could not be seen in mice deficient in NADPH dependent oxidase or nitric oxide synthase 2 suggests that iron eliminates L. infantum in vivo through the interaction with reactive oxygen and nitrogen species. Iron overload did not significantly alter the mouse adaptive immune response against L. infantum. Furthermore, the inhibitory action of iron towards L. infantum was also observed, in a dose dependent manner, in axenic cultures of promastigotes and amastigotes. Importantly, high iron concentrations were needed to achieve such effects. In conclusion, externally added iron synergizes with the host’s oxidative mechanisms of defense in eliminating L. infantum from mouse tissues. Additionally, the direct toxicity of iron against Leishmania suggests a potential use of this metal as a therapeutic tool or the further exploration of iron anti-parasitic mechanisms for the design of new drugs.

S100A6 Amyloid Fibril Formation Is Calcium-modulated and Enhances Superoxide Dismutase-1 (SOD1) Aggregation

S100A6 is a small EF-hand calcium- and zinc-binding protein involved in the regulation of cell proliferation and cytoskeletal dynamics. It is overexpressed in neurodegenerative disorders and a proposed marker for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Following recent reports of amyloid formation by S100 proteins, we investigated the aggregation properties of S100A6. Computational analysis using aggregation predictors Waltz and Zyggregator revealed increased propensity within S100A6 helices HI and HIV. Subsequent analysis of Thioflavin-T binding kinetics under acidic conditions elicited a very fast process with no lag phase and extensive formation of aggregates and stacked fibrils as observed by electron microscopy. Ca2+ exerted an inhibitory effect on the aggregation kinetics, which could be reverted upon chelation. An FT-IR investigation of the early conformational changes occurring under these conditions showed that Ca2+ promotes anti-parallel β-sheet conformations that repress fibrillation. At pH 7, Ca2+ rendered the fibril formation kinetics slower: time-resolved imaging showed that fibril formation is highly suppressed, with aggregates forming instead. In the absence of metals an extensive network of fibrils is formed. S100A6 oligomers, but not fibrils, were found to be cytotoxic, decreasing cell viability by up to 40%. This effect was not observed when the aggregates were formed in the presence of Ca2+. Interestingly, native S1006 seeds SOD1 aggregation, shortening its nucleation process. This suggests a cross-talk between these two proteins involved in ALS. Overall, these results put forward novel roles for S100 proteins, whose metal-modulated aggregation propensity may be a key aspect in their physiology and function.

Heavy-metal resistance in Marinobacter aquaeolei 617 insights into copper resistance

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

Microbicidal effect of medicinal plant extracts (Psidium guajava Linn. and Carica papaya Linn.) upon bacteria isolated from fish muscle and known to induce diarrhea in children

Out of the twenty-four samples of shrimp and fish muscle used for this study, twelve were collected near a large marine sewer for waste disposal, 3 km off the coast of Fortaleza (Brazil) and used for the isolation of E. coli. Other twelve were collected at the Mucuripe fresh fish market (Fortaleza, Brazil) and used for the isolation of Staphylococcus aureus. Ethanol, water and acetone-diluted extracts of guava and papaya leaf sprouts were tested on the bacteria in order to verify their microbicidal potential. The E. coli strains used in the trials were rated LT positive. The papaya leaf extracts (Carica papaya Linn) showed no microbicidal activity while the guava sprout extracts (Psidium guajava Linn) displayed halos exceeding 13 mm for both species, an effect considered to be inhibitory by the method employed. Guava sprout extracts by 50% diluted ethanol most effectively inhibited E. coli (EPEC), while those in 50% acetone were less effective. It may be concluded that guava sprout extracts constitute a feasible treatment option for diarrhea caused by E. coli or by S. aureus-produced toxins, due to their quick curative action, easy availability in tropical countries and low cost to the consumer.

In vitro evaluation of quinidine sensitivity in brazilian Plasmodium falciparum isolates: comparative analysis to quinine and chloroquine

Falciparum malaria represents a serious and an increasing world public health problem due to the acquired parasite's resistance to the most available drugs. In some endemic areas, quinidine, a diastereoisomer of the antimalarial quinine, has been employed for replacing the latter. In order to evaluate the use of quinidine as an alternative to the increasing loss of quinine effectiveness in Brazilian P. falciparum strains, as has been observed in the Amazon area, we have assayed quinidine, quinine and chloroquine. The in vitro microtechnique was employed. All isolates showed to be highly resistant to chloroquine. Resistance to quinine was not noted although high MIC (minimal inhibitory concentration) values have been observed. These data corroborate the decreasing sensitivity to quinine in strains from Brazil. Quinidine showed IC50 from 0.053 to 4.577 mumol/L of blood while IC50 from 0.053 to 8.132 mumol/L of blood was estimated for quinine. Moreover, clearance of the parasitemia was observed in concentrations lower than that used for quinidine in antiarrhythmic therapy, confirming our previous data. The results were similar to African isolate.

In vitro susceptibility to antifungal agents of clinical and environmental Cryptococcus neoformans isolated in Southern of Brazil

The purpose of the present study was to compare the susceptibility to four antifungal agents of 69 Cryptococcus neoformans strains isolated from AIDS patients with that of 13 C. neoformans strains isolated from the environment. Based on the NCCLS M27-A methodology the Minimal Inhibitory Concentrations (MICs) obtained for amphotericin B, itraconazole and ketoconazole were very similar for clinical and environmental isolates. Clinical isolates were less susceptible to fluconazole than environmental isolates. The significance of these findings and aspects concerning the importance, role and difficulties of C. neoformans susceptibility testing are also discussed.

Anti-trypanosomal activity of pentacyclic triterpenes isolated from Austroplenckia populnea (Celastraceae)

Four pentacyclic triterpenes isolated from Austroplenckia populnea and four compounds of known anti T. cruzi or anti-malarial activity were tested. Of those triterpenes tested 20alpha-hydroxy-tingenone showed high activity, epikatonic acid was less active, while populnilic and populninic acids were inactive against the trypanosome of the subgenus Schizotrypanum tested. Benzonidazole, nifurtimox, ketoconazole and primaquine presented a remarkable dose-dependent inhibitory effect reaching practically to a total growth inhibition of the parasite at the end of incubation time. The trypanosome tested appear to be a suitable model for preliminary screen for anti T. (S.) cruzi compounds.